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CN111504886B - 一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用 - Google Patents

一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用 Download PDF

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CN111504886B CN202010373067.5A CN202010373067A CN111504886B CN 111504886 B CN111504886 B CN 111504886B CN 202010373067 A CN202010373067 A CN 202010373067A CN 111504886 B CN111504886 B CN 111504886B
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Abstract

本发明属于生物医学领域,具体涉及一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明的一组分子具体是指四种抗体,分别是抗人FITC‑CD3、FITC‑TCRγ/δ、APC/Cyanine7‑CD4和PerCP/Cyanine5.5‑CD8。利用该组分子通过流式细胞术检测新冠肺炎患者外周血,实验证实,新冠肺炎确诊患者外周血中存在一群CD4+TCRγδ+T细胞,该检测结果可用于新冠疑似患者的筛查、病情评估等辅助诊断,具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域,具体涉及一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
背景技术
流式细胞术是一种根据细胞表面或内部特异性标志对细胞进行定量分析和分选的技术。用该项技术进行人外周血淋巴细胞亚群分析可以对一群混合的淋巴细胞进行精确到单个细胞的分析,已经广泛用于免疫细胞检测。该技术成熟,检测速度快,可重复性好。
淋巴细胞是不均一的细胞群体,包括许多具有不同免疫功能的亚群。在临床最经常检测的血常规中,这些不同功能的亚群均被包括在淋巴细胞一类,并不做细分。淋巴细胞主要包括T细胞和B细胞两大类。T细胞是来源于骨髓或胚肝淋巴样干细胞分化发育的早期T细胞系前体。这一前体细胞进入胸腺皮质,发育为成熟T细胞进入外周血液和外周淋巴组织。TCR(T cell receptor)是T 细胞表面识别来自病原体或自身其他细胞的抗原的表面分子,根据其组成不同可以分为TCRαβ+T细胞和TCRγδ+T细胞。
其中TCRγδ+T细胞是一个特殊的细胞群体。其TCR由γ链和δ链组成,可直接识别靶抗原,多肽无需被处理为小分子肽段而以完整形式被识别,无 MHC限制性。病原微生物侵入机体,首先与免疫屏障系统和一些现存的效应分子发挥作用。如果病原微生物不能被清除,机体启动固有免疫应答,包括TCR γδ+T细胞在内的多种固有免疫效应细胞活化,行使清除功能。这一抗感染固有免疫应答是机体免疫系统识别和清除病原体的一系列防御性机制中最早出现的,是机体与生俱有的一种防御能力,这一阶段一般为感染后4~96小时,当病原体不能被清除时启动适应性免疫应答。
CD4是一种跨膜糖蛋白,通常表达在TCRαβ+T细胞表面。表达CD4的 TCRαβ+T细胞在识别MHCⅡ类分子提呈的抗原肽时,CD4可以和MHCⅡ类分子结合,增强T细胞与抗原提呈细胞的相互作用,并辅助TCR识别结合抗原。
既往在针对流感病毒、MERS病毒的研究中,虽然曾发现感染病毒后TCR γδ+T细胞比例的改变,但是未发现其中有CD4+TCRγδ+T细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供能够能够检测CD4+TCRγδ+T细胞的一组分子的新用途,即该组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
基于上述目的,本发明采用如下技术方案:
能够检测CD4+TCRγδ+T细胞亚群的一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用,包括抗人FITC-CD3、FITC-TCRγ/δ、APC/Cyanine 7-CD4和PerCP/Cyanine5.5-CD8。
进一步的,所述检测是指通过流式细胞术进行的检测。
更进一步的,所述检测包括如下步骤:
S1、取外周血,离心获得外周血单个核细胞,使用流式检测缓冲液重悬所获得的人外周血单个核细胞,并洗涤,得到单细胞悬液;
S2、向单细胞悬液中加入FITC-CD3、FITC-TCRγ/δ,APC/Cyanine7-CD4, PerCP/Cyanine5.5-CD8;不加抗体作为阴性对照,避光4℃孵育30分钟,使用流式检测缓冲液洗涤并重悬细胞,使用流式细胞仪检测;
S3、分析检测结果,获得外周血中TCRγδ+T细胞中CD4+细胞的百分比。
更进一步的,S1中,式检测缓冲液加有2%小牛血清的PBS。
更进一步的,S1中,洗涤方法为1500rpm/min转速下,离心5分钟,去上清后,使用流式检测缓冲液再次重悬细胞。
更进一步的,S2中,每100μL单细胞悬液中加入FITC-CD3、FITC-TCR γ/δ、APC/Cyanine7-CD4和PerCP/Cyanine5.5-CD8各0.5μL。
更进一步的,S2中,使用流式细胞仪检测时的单细胞悬液体积为200μL。
与现有技术相比,本发明具有如下技术效果:
1、本发明首次使用流式细胞术检测出新冠肺炎患者外周血中CD4+TCRγδ+T细胞亚群,该技术检测的结果提示机体已经存在病原微生物感染,已经启动固有免疫应答。
2、本发明提供了一组分子,向待检测者外周血单细胞悬液中加入该组分子,通过流式细胞术检测,如果外周血否存在一群TCRγδ+CD4+T细胞亚群,则为新冠肺炎疑似患者。
3、本发明提供的一组分子,为新冠肺炎辅助检测提供一个新的途径。
附图说明
图1为健康人和新冠肺炎确诊患者外周血中CD4+TCRγδ+T细胞比例的统计图, 经独立样本t检验P<0.05。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明,但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明,下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例的研究方案已经合作方西安市第八医院伦理委员会通过;患者及健康对照组知情并且签署知情同意书后,清晨空腹抽取外周静脉血肝素抗凝;收集经病毒核酸检测阳性确诊患者38例,健康对照18例;
实验步骤:
1.待检测样品准备:使用密度梯度离心法获得外周血单个核细胞;使用流式检测缓冲液(2%FBS的PBS)重悬所获得的人外周血单个核细胞,并洗涤两次,洗涤方法为水平离心机转速1500rpm/min,时间5分钟,去上清后,使用流式检测缓冲液再次重悬细胞;调整细胞密度为1×107/mL;
2.每一个样本分别吸取100μL单细胞悬液加入两支流式检测管,一支不加入任何抗体,作为阴性对照管;另一只加入流式染色抗体,抗人FITC-CD3 (UCHT1,流式抗体储液浓度0.5mL/500mg),FITC-TCRγ/δ(B1,流式抗体储液浓度0.5mL/500mg),APC/Cyanine7-CD4(OKT4,流式抗体储液浓度0.5m L/500mg),PerCP/Cyanine5.5-CD8(SK1,流式抗体储液浓度0.5mL/500mg),每 100μL单细胞悬液中加入0.5μL流式细胞染色抗体;避光4℃孵育30分钟;使用流式检测缓冲液洗涤并重悬细胞,使用流式细胞仪检测,检测样单细胞悬液体积为200μL;
3.分析检测结果,获得健康对照和确诊患者外周血中TCRγδ+T细胞中CD4+细胞的百分比,如图1所示,发现新冠肺炎确诊患者外周血中存在一群 CD4+TCRγδ+T细胞。
在本申请之前,新冠肺炎检测主要使用病毒核酸检测、胸部影像学检查等。
病毒核酸检测:可能存在假阴性、有检测资质的机构较少,以及实验室条件要求高;对于体内病毒载量不高的患者,其检出率比较低,存在假阳性结果。二是阳性结果虽然可以确诊,但不能对疾病的严重程度做出评判。
胸部CT检查:该检查及时、准确、快捷、阳性率高、肺部病变程度与病情相关。其缺点一是影像学表现与其它肺部感染存在重叠,特异性差;二是早期感染或轻症患者可能沒有明显的肺部影像改变。
除了病毒核酸检测和胸部CT,临床虽然同时结合血常规中淋巴细胞水平变化确定为病毒感染疾病,但是感染者不一定有淋巴细胞变化,且血常规中未进行淋巴细胞亚群分类,不能准确反应病原体感染后淋巴细胞各亚群变化情况。
利用本发明的一组分子检测CD4+TCRγδ+T细胞亚群,特异性强、精确度高,与肺部影像、核酸检查联用,检测结果可用于新冠疑似患者的筛查、病情评估等辅助诊断,具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
需要说明的是,本发明权利要求书中涉及数值范围时,应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用,为了防止赘述,本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.能够检测CD4+TCRγδ+T细胞亚群的一组分子在制备新冠肺炎辅助诊断试剂或试剂盒中的应用,所述分子为抗体,包括抗人FITC-CD3、FITC-TCRγ/δ、APC/Cyanine7-CD4和PerCP/Cyanine5.5-CD;
所述检测是指通过流式细胞术进行的检测;
所述检测包括如下步骤:
S1、取外周血,离心获得外周血单个核细胞,使用流式检测缓冲液重悬所获得的人外周血单个核细胞,并洗涤,得到单细胞悬液;
S2、向单细胞悬液中加入FITC-CD3、FITC-TCRγ/δ、APC/Cyanine7-CD4和PerCP/Cyanine5.5-CD8;不加抗体作为阴性对照,避光4℃孵育30分钟,使用流式检测缓冲液洗涤并重悬细胞,使用流式细胞仪检测;
S3、分析检测结果,获得外周血中TCRγδ+T细胞中CD4+细胞的百分比。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,S1中,流式检测缓冲液加有2%小牛血清的PBS。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,S1中,洗涤方法为1500rpm/min转速下,离心5分钟,去上清后,使用流式检测缓冲液再次重悬细胞。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,S2中,每100μL单细胞悬液中加入FITC-CD3、FITC-TCRγ/δ、APC/Cyanine7-CD4和PerCP/Cyanine5.5-CD8各0.5μL。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,S2中,使用流式细胞仪检测时的单细胞悬液体积为200μL。
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