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CN111481479A - 一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用 - Google Patents

一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物提取技术领域，公开了一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用。本发明所述方法将将中性纤维素酶加入到大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行酶解，然后向酶解后的固体中加入乙醇进行醇提，所得的醇提液为抗氧化提取物。本发明选用特定的中性纤维素酶对大麻花叶或其提取CBD后的废渣进行处理，使包裹在大麻花叶和大麻花叶废渣内部的抗氧化活性物质暴露出来，再结合醇提方式从而提高了活性物质的转化率；相比其他纤维素酶和木聚糖酶酶解方式以及单纯醇提方式，本发明方法能够获得更高抗氧化活性的抗氧化提取物，可最大程度上的利用大麻花叶资源。

Description

一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用。
背景技术
大麻(Hewp)属于木兰纲(magnoliopsida)荨麻目(Urticales)大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)大麻种(Cannabis sativa L)的一年生草本植物，又称汉麻、线麻、火麻、寒麻、魁麻等。大麻中四氢大麻酚((THC)含量低于0.3％的大麻称为工业大麻，也是目前国内外广泛应用的大麻。超纯大麻二酚(CBD)是工业大麻核心成分，能有效抗衰老、抗氧化以及提高自身免疫，具有消炎、延缓衰老、滋润干燥肌肤，处理皮肤感染、帮助愈合皮肤损伤等功效。除了CBD以外，花叶中还含有三萜类化合物、黄酮类化合物以及生物碱类。
大麻花叶传统的处理方法是醇提，乙醇属于亲水性有机溶剂，对各类化学成分的溶解度都较好，提取成分全面。目前常用醇提的乙醇浓度是70％，但是醇提转化率普遍为40％-50％，而且乙醇提取时间多为5-6小时，提取时间长，且醇提转化率不高，抗氧化活性成分含量普遍较低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法，使得所述方法获得的提取物具备较高的抗氧化活性；
本发明的另外一个目的在于提供上述方法提取的抗氧化提取物；
本发明的另外一个目的在于提供中性纤维素酶在从大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中提取抗氧化成分的应用；
本发明的另外一个目的在于提供上述方法或抗氧化提取物在制备化妆品中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法，将中性纤维素酶加入到大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行酶解，然后向酶解后的固体中加入乙醇进行醇提，所得的醇提液为抗氧化提取物。
针对目前大麻花叶醇提效果不佳的问题，本发明通过中性纤维素酶先期处理而后再醇提的方法，获得了较多的抗氧化活性物质，在ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和总还原力上具备更高的活性。
作为优选，所述大麻花叶或大麻花叶废渣与中性纤维素酶的质量体积比为1g:10mL；
作为优选，所述酶解条件为50-55摄氏度下48-72小时，每30-45min摇匀一次。
作为优选，所述中性纤维素酶由康宁木霉菌种发酵制备。该中性纤维素酶的CMCase酶活最适pH为5.6，FPase酶活最适pH为5.2，该酶最好在小于60℃的条件下使用。
作为优选，所述醇提在50-70℃下提取。所述乙醇选择为≥50％浓度的乙醇；在本发明具体实施方式中，所述酶解后的固体与乙醇的质量体积比为1:15-1:30，优选为1:20，所述醇提附加超声波提取。
本发明分别选择由不同菌种发酵获得的酸性纤维素酶AE(绿色木霉发酵制备)，中性纤维素酶BQ(康宁木霉发酵制备)，酸性纤维素酶YLWD(哈茨木霉发酵制备)，酸性木聚糖酶SSA(青霉菌发酵制备)，中性木聚糖酶YXB(米曲霉发酵制备)，酸性木聚糖酶BX(红曲霉发酵制备)对大麻花叶及其大麻花叶渣进行处理，而后再醇提；结果显示，无论在大麻花叶中还是在大麻花叶提取CBD后的废渣中，采用中性纤维素酶酶解的试验组相比其他纤维素酶和木聚糖酶酶解的试验组以及单独进行醇提的试验组，在ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和总还原力上具备更高的活性，这表明本发明所述方法能够获得活性更高的抗氧化提取物。
因此，本发明还提供了一种本发明所述方法提取的抗氧化提取物；同时还提供了所述方法或所述抗氧化提取物在制备化妆品中的应用，所述化妆品主要应用于抗氧化方面。
此外，从本发明的对比试验可以看出，仅在酶的类型的区别下，本发明所使用的中性纤维素酶能够从大麻花叶或其废渣中提取到更多的抗氧化成分，因此本发明还提出了中性纤维素酶在从大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中提取抗氧化成分的应用；所述应用中，中性纤维素酶在酶解大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣后再进行醇提。
由以上技术方案可知，本发明选用特定的中性纤维素酶对大麻花叶或其提取CBD后的废渣进行处理，使包裹在大麻花叶和大麻花叶废渣内部的抗氧化活性物质暴露出来，再结合醇提方式从而提高了活性物质的转化率；相比其他纤维素酶和木聚糖酶酶解方式以及单纯醇提方式，本发明方法能够获得更高抗氧化活性的抗氧化提取物，可最大程度上的利用大麻花叶资源。
具体实施方式
本发明公开了一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在具体实施例中，对比试验中除应有的技术区别外，其余所用原料、试剂等试验环境保持一致；
以下就本发明所提供的一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法和应用做进一步说明。
实施例1：不同酶对大麻花叶酶解
1、酶制剂
购自希杰尤特尔(山东)生物科技有限公司的酸性纤维素酶AE(绿色木霉发酵制备)，中性纤维素酶BQ(康宁木霉发酵制备)，酸性纤维素酶YLWD(哈茨木霉发酵制备)，酸性木聚糖酶SSA(青霉菌发酵制备)，中性木聚糖酶YXB(米曲霉发酵制备)，酸性木聚糖酶BX(红曲霉发酵制备)；
2、酶处理条件
纤维素酶或木聚糖酶处理条件：55摄氏度下48小时，每30min摇匀一次。
对纤维素酶或木聚糖酶处理后的大麻花叶和大麻渣进行在8000r/min转速下离心，取离心后的渣，进行醇提处理；
3、醇提处理(单独醇提同此方式)：
固体：醇液＝1：20(质量体积比)，于50摄氏度水浴和超声辅助下60min，每10min摇匀一次。醇提三次，每次需离心后回收固体重新加入50％乙醇，最后将3次醇提液汇合再定容。
上述每种处理组做3组，后续测定结果取均值。
4、指标的测定方法
(1)DPPH自由基清除能力测定法
A.准备2mlEP管。实验组加入1ml样液+1ml 0.2mmol/L的DPPH。对照组加入1ml样液+1ml无水乙醇。空白组加入1ml无水乙醇+1ml 0.2mmol/L的DPPH。
B.于517nm下，测定实验组吸光度，记为Ai。测定对照组吸光度，记为Aj。记空白组为A0。
C.公式为：DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
(2)超氧阴离子自由基清除能力测定法
A.取10ml EP管，加入5.7ml的50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液，后加入0.2ml样液，混匀后于25℃保温10min。
B.在25℃下预热10mmol/L的邻苯三酚溶液，加入0.1ml于EP管中。
迅速摇匀，在320nm波长记录其处1min内吸光度的增加值(AS)。用等体积纯水替代样液，测定其在320nm波长下1min内吸光度的增加值(A0)。
注:同时迅速测量第一次吸光度，后接连测量3次吸光度。需消耗3min+。
C.公式：超氧阴离子自由基清除率(％)＝(A0-AS)/A0或1-AS/A0
(3)总还原力的测定法
A.取用10ml EP管。吸取1ml待测液(空白组用蒸馏水)，依次加入2.5ml 0.2ml/L的PBS(pH＝6.6)溶液和2.5ml 1％的铁氰化钾溶液。
B.混合溶液置于50℃水浴锅保温20min。
C.加入2.5ml 10％的三氯乙酸。
D.若产生浑浊，则将混合液于室温3500r/min离心10min，吸取2.5ml上清液，后吸取2.5ml纯水。若不产生沉淀，则直接吸取2.5ml上清液，加入2.5ml纯水。
E.最后加入0.5ml 0.1％的FeCl3溶液，混匀反应10min。
吸取300ul，于波长700nm下测其吸光度，吸光度与还原能力成正比；
(4)ABTS(C18H24N6O6S4)自由基清除能力测定法
A.取0.2ml的7.4mmol/L的ABTS溶液和0.2ml的2.6mmol/L的K2S2O8,混合，黑暗下室温静置12小时。
B.用无水乙醇稀释混合液50倍，作为ABTS工作液，测量其OD值。应为A734nm＝0.7±0.02。(无水乙醇可被pH7.4磷酸盐缓冲液或95％乙醇替代，可稀释40-50倍)；
C.准备2mlEP管，加入0.8ml的ABTS工作液，再加入0.2毫升的样品溶液。振摇10s,静置6min，后吸光值记为A。对照空白将0.2ml的样品溶液替换为0.2ml的95％乙醇，吸光值记为A0。
D.吸取300ul溶液，处理结果，清除率＝(A0-A)/A0*100％
5、试验结果
见表1-表4。
表1DPPH自由基清除率(原液稀释经50％乙醇稀释10倍)
清除率(％) 平均值
YLWD酶解大麻花叶渣 45.92
YLWD酶解大麻花叶 53.54
YLMD+SSA酶解大麻花叶 39.57
YLMD+SSA酶解大麻花叶渣 39.85
YLMD+YXB酶解大麻花叶 52.08
YLMD+YXB酶解大麻花叶渣 45.71
YLMD+BX酶解大麻花叶 39.68
YLMD+BX酶解大麻花叶渣 45.00
AE酶解大麻花叶渣 35.68
AE酶解大麻花叶 61.83
BQ酶解大麻花叶 60.66
BQ酶解大麻花叶渣 50.55
醇提大麻花叶渣 7.69
醇提大麻花叶 25.13
表2超氧阴离子自由基清除率
清除率(％) 平均值
YLWD酶解大麻花叶 29.08
YLWD酶解大麻花叶渣 24.82
YLWD+SSA酶解大麻花叶 21.56
YLWD+SSA酶解大麻花叶渣 44.72
YLWD+YXB酶解大麻花叶 14.65
YLWD+YXB酶解大麻花叶渣 40.38
YLWD+BX酶解大麻花叶 19.98
YLWD+BX酶解大麻花叶渣 23.31
BQ酶解大麻花叶渣 31.75
BQ酶解大麻花叶 36.93
AE酶解大麻花叶 22.76
AE酶解大麻花叶渣 20.35
醇提大麻花叶渣 0.67
醇提大麻花叶 9.39
表3总还原力
均值
YLWD酶解大麻花叶 0.2924
YLWD酶解大麻花叶渣 0.2961
YLWD+SSA酶解大麻花叶 0.3439
YLWD+SSA酶解大麻花叶渣 0.3112
YLWD+YXB酶解大麻花叶 0.3030
YLWD+YXB酶解大麻花叶渣 0.2934
YLWD+BX酶解大麻花叶 0.3130
YLWD+BX酶解大麻花叶渣 0.3175
BQ酶解大麻花叶 0.4155
BQ酶解大麻花叶渣 0.3800
AE酶解大麻花叶 0.3837
AE酶解大麻花叶渣 0.3439
醇提大麻花叶渣 0.2779
醇提大麻花叶 0.3236
表4 ABTS自由基清除率(原液稀释经50％乙醇稀释50倍)
Figure BDA0002457714100000061
Figure BDA0002457714100000071
由表1-表4的结果可以清楚的看到，采用本发明方法提取的抗氧化提取物在ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率，超氧阴离子自由基清除率和总还原力上具备更高的活性，明显优于其他纤维素酶处理组、木聚糖酶处理组以及单纯乙醇提取组。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种从大麻花叶中提取抗氧化成分的方法，其特征在于，将中性纤维素酶加入到大麻花叶或提取CBD后的大麻花叶废渣中进行酶解，然后向酶解后的固体中加入乙醇进行醇提，所得的醇提液为抗氧化提取物。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述酶解条件为50-55摄氏度下48-72小时，每30-45min摇匀一次。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述中性纤维素酶由康宁木霉菌种发酵制备。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述醇提在50-70℃下提取。
5.权利要求1-4任意一项所述方法提取的抗氧化提取物。
6.权利要求1-4任意一项所述方法或权利要求5所述抗氧化提取物在制备化妆品中的应用。
7.中性纤维素酶在从大麻花叶或提取CB后的大麻花叶废渣中提取抗氧化成分的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述中性纤维酶由康宁木霉菌种发酵制备。
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