CN111487227A - 一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器及其荧光分析法。该方法基于平行G‑四链体诱导4'‑氨基甲基‑4,5',8‑三甲基补骨脂素（AMT）荧光猝灭，铅离子与补骨脂素竞争性结合适体，导致由AMT‑适体平行G‑四链体转变为Pb2+‑适体反平行G‑四链体从而释放出补骨脂素，构建了一种荧光增强型传感器。在最佳条件下，所开发的适体传感器在10nM~300nM的Pb2+浓度范围内检测具有高选择性和良好的准确度，通过3σ/K公式计算出检测限（LOD）为1.98 nM。将该方法应用于分析人血清中加标检测Pb2+，其灵敏度、选择性高，具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器及其荧光分析法。
背景技术
铅为重金属污染物之一，铅离子的超标严重影响了人类生活环境及健康。美国环境监测部门规定饮用水中铅离子标准为15ppb(15ng mL-1；72.4nM)(
Li,C.L.；Huang,C.-C.；Chen,W.-H.；Chiang,C.-K.；Chang,H.-T.,Peroxidasemimicking DNA–gold nanoparticles for fluorescence detection of the lead ionsin blood.Analyst 137(22),5222.)。对于检测铅离子，已经开发出的检测方法有电化学法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法，然而这些方法因耗能大、操作繁杂、不能快速检测，有一定局限性。荧光光谱法具有开发简单，灵敏，低耗时，低耗能等优点，因此被广泛应用于铅离子的检测。
研究人员利用功能核酸适体具有简易，灵敏，高选择性等优点，开发出了基于功能性核酸适体的多种多样检测铅离子的荧光传感器。但目前针对人血清样品中Pb2+含量的检测灵敏度不够理想，需要寻找更加理想的核酸适体荧光传感器。
发明内容
本发明目的在于提供一种灵敏度高、抗干扰能力强的核酸适体荧光传感器，将其用于人血清中Pb2+浓度的检测。
为实现本发明目的，技术方案如下：
由两条部分互补DNA链T30695、Z作为适体(DNA碱基序列见表1)，4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素(AMT)荧光染料作为传感指示剂。AMT自身在缓冲溶液中具有强荧光，而其与G-四连体结合后荧光极大猝灭，两条适配体在充分孵育后能够形成更加稳定的平行G-四链体，从而紧密的结合荧光染料AMT并使其荧光猝灭。向构建好的传感体系中加入目标检测物铅离子时，铅离子结合力(logK≈7)强于AMT与G-四链体结合力(logK≈5)。使得体系中加入Pb2+后，Pb2+与G-四链体特异性结合置换出G-四链体-AMT中的AMT，形成反平行G-四链体-Pb2+，同时AMT被释放，体系荧光增强，达到检测目的。本发明所构建传感体系反应机理见图1。
荧光指示剂AMT作为指示剂结构式如下：
圆二色(CD)光谱广泛用于表征DNA的二级结构。由于G-四链体具有特征CD信号，因此CD光谱用于验证假设的传感机理，图3为该体系下圆二色谱表征图。图3A中(1)为T30695圆二色谱图，该CD谱在240nm有一负峰，265nm处有一正峰，该特征峰为平行G-四链体特征峰，因此T30695特征信号为平行G-四链体；(2)为Z的圆二色谱图，在260nm处有一负峰，295nm处有一正峰，该特征信号为反平行G-四链体；由T30695和Z以3:1比例混合充分孵育后圆二色谱图在240nm有一负峰，265nm有一正峰，为平行G-四链体。
图3B可以看出，当AMT加入到0.25uM T30695/Z混合液(duplex)中，圆二色谱信号基本无变化，说明AMT与双链结合荧光猝灭不影响DNA结构，AMT嵌入双链所形成的平行G-4中使得荧光猝灭。
图3C中，加入Pb2+离子后240nm负峰逐渐减弱，平行G-四信号减弱，并且同时随着Pb2+浓度增大在295nm有一负峰强度增大，315nm处有一正峰强度增大，该特征信号为铅离子稳定的反平行G-四链体结构特征峰，CD信号由平行G-四转变为Pb2+稳定的反平行G-四，这主要是由于G-四链体与Pb2+结合能力(logK≈7)大大强于G-四链体与AMT结合能力(logK≈5)，使得体系中加入Pb2+后置换出G-四链体-AMT中的AMT，形成G-四链体-Pb2+。同时AMT被释放，体系荧光大大增强，验证了设想。
本发明基于平行G-四链体诱导AMT荧光猝灭，铅离子与补骨脂素竞争性结合适体，导致由AMT-适体平行G-四链体转变为Pb2+-适体反平行G-四链体从而释放出补骨脂素，构建了一种荧光增强型传感器。
本发明创新点及优点在于：选择经济、高水溶性和低毒性的荧光指示剂AMT作为指示剂，利用G-四链体的强淬灭能力，开发了一种新型无标记，高选择性，高灵敏度的荧光增强型适体传感器。所开发的适体传感器在10nM～300nM的Pb2+浓度范围内检测具有高选择性和良好的准确度，通过3σ/K公式计算出检测限(LOD)为1.98nM。与其它传感器相比，对Pb2+具有较高选择性。利用适体传感器成功分析了稀释人血清样品中的Pb2+。所开发的适体传感器在实际临床复杂样品中检测Pb2+具有实际应用价值。利用G-四链体的猝灭能力，通过合理的设计可以开发各种新型传感器，拓宽了其应用前景。
本发明涉及的DNA序列见序列表。
附图说明
图1为本发明基于无标记适体检测Pb2+的原理图；
图2为在10mM MES-Tris(pH＝5)的缓冲溶液、4μM AMT中不同适配体时，对Pb2+的荧光传感响应图，适配体浓度均为4μM。
图3为10mM MES-Tris(pH＝5)缓冲溶液中，加入Pb2+前后DNA的圆二色(CD)光谱图变化，其中，图A为(1)0.2μM T30695，(2)0.2μM Z，(3)0.2μM T30695+Z；图B为(1)0.2μMT30695+Z；(2)0.2μM T30695/Z+1μM AMT；(3)0.2μM T30695/Z+2μM AMT；(4)0.2μM T30695/Z+4μM AMT；图C为中(1)为0.2μM T30695+Z，(2)为0.2μM T30695/Z+4μM AMT，其他为体系中加入不同浓度的Pb2+，沿左箭头依次为：(3)T30695/Z/AMT+1μM Pb2+；(4)T30695/Z/AMT+3μMPb2+；(5)T30695/Z/AMT+5μM Pb2+；(6)T30695/Z/AMT+10μM Pb2+；(7)T30695/Z/AMT+15μMPb2+；(8)T30695/Z/AMT+20μM Pb2+。
图4为pH值及缓冲溶液浓度对传感体系的影响，图A为本发明体系中(20μM Pb2+)，不同pH值条件下测定的荧光增强F/F0变化柱状图；图B为本发明体系中(20μM Pb2+，pH＝5)，不同浓度的MES-Tris的缓冲溶液中测定的荧光增强F/F0变化曲线。
图5为本发明传感体系优化条件的选择图，其中A为K+浓度对体系传感性能的影响；B为AMT浓度对体系传感性能的影响；C为T30695与Z两条适配体的比例对体系传感性能的影响；D为T30695与Z两条适配体浓度对体系传感性能的影响。
图6为在10mM MES-Tris(pH＝5)的缓冲溶液中，加入不同浓度Pb2+的动力学响应图。
图7为本发明体传感体系对Pb2+的荧光光谱响应图，内插图：以Pb2+浓度为函数对荧光响应F/F0的关系图。
图8为本发明体传感体系中F/F0与Pb2+浓度的线性关系图。
图9为本发明体传感体系中加入Pb2+类似物的荧光响应图，检测物浓度均为5μM。其中，A为干扰物单一加入体系中，B为干扰物和Pb2+共同加入体系中。
图10中A为本发明传感体系在1％人血清中对Pb2+的荧光光谱响应图，内插图：以Pb2+浓度为函数对荧光响应(F/F0)-1＝0.4143c+0.0318的关系图。B为荧光响应(F/F0)与Pb2 +浓度的线性关系图，线性范围：10nM-7μM。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例1
1.1、实验药品及仪器。
4'-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride(AMT)，购于Sigma(中国，上海)公司；MES(C6H13O4NS·H2O)购于北京solarbio科技有限公司，Tris(hydroxymethyl)-aminomethane，分析纯，购于Serva(中国，上海)公司；KCl，MgCl2、KNO3、NaNO3、Mg(NO3)2、Al(NO3)3、Zn(NO3)2、Fe(NO3)3、Cu(NO3)2、Hg(NO3)2、Cr(NO3)3、Co(NO3)2、AgNO3、NiNO3、Mn(NO3)2、Cd(NO3)2购于国药集团化学试剂有限公司，标准Pb2+溶液购于国家标准物质商城，10mM MES溶液滴加Tris调节pH。溶液均由超纯水配制(电阻率：18.2Ω)。pH的测量采用雷磁(上海)pHS-3C酸度计。T30695，Z，PS2.M，PW17，AGRO100，EDA2，TBA为PAGE纯化，均购于生工生物工程(上海)公司。DNA序列如表1：
表1本发明用到的DNA序列
1.2、传感体系构建
传感体系使用10mM pH＝5.0MES-Tris缓冲溶液，所有DNA储备液由超纯水配制后在95℃水域保持加热10分钟后缓慢冷却至室温做退火处理，T30695与Z混合孵育一周，冷冻保存做储备液。在条件优化后选择使用4μM AMT，4μM T30695与Z混合于DNA(混合T30695与Z体积比例为3：1)。将AMT、混合DNA溶解在MES-Tris缓冲溶液中均匀混合，检测时取构建好的体系溶液500μL，再向其中加入不同浓度Pb2+溶液，充分混匀后室温下进行检测。
1.3、荧光光谱分析
荧光光谱采用日立F-7000荧光光谱仪测量。对于加入Pb2+响应的荧光检测，将不同浓度的Pb2+加入含有4μM T30695+Z(3:1),4μM AMT的10mM MES-Tris(pH＝5)缓冲溶液中，并将溶液在室温下充分搅拌。然后立即测定荧光发射光谱。激发和发射的狭缝均设定为5nm，扫描速度为中等(240nm/min)。传感体系的荧光发射波长为360nm至660nm，激发波长为340nm。
1.4、圆二色性(CD)光谱分析
CD光谱实验采集自Bio-Logic MOS-450圆二色谱仪，测试时光源始终保持在稳定的高纯氮(99.99％)气流中。光谱采集的波长范围是220-320nm，选用1cm光路的石英比色皿池，仪器的扫描速率设为100nm/min，响应时间为2s。缓冲溶液的背景信号已经从CD数据中扣除。
1.5、人血清的处理及ATP的测定
将人正常人血清(商丘市第一人民医院)与乙醇以1:1的体积比例混合震荡，混合均匀后放置于冰箱(-4℃)冷藏过夜，第二天取出后15000r/min离心10min，取上清液于超滤离心管(Amicon Ultra-0.5ml,Millipore,分子截留量3kpa)1300r/min 4℃冷冻离心20min后取过滤液，并冷冻于冰箱中待用。将4μM孵育好的T30695+Z(3:1)混合DNA和4μM AMT及不同浓度的Pb2+加入含有稀释至1％人血清的MES-Tris(pH＝5)缓冲液中，立即记录荧光发射光谱。
2、结果与讨论
2.1、反应体系条件优化
为达到传感体系最佳状态，进行了一系列实验探索最佳实验条件。首先在4-6.5的pH范围内探索pH对Pb2+检测的影响。结果如图4A中所示，与pH4.0,4.5,5.5,6.0,和6.5相比，pH 5.0时显示出20μM Pb2+测定的最高荧光增强7.315倍(F/F0)。F和F0分别为在存在与不存在Pb2+时最大荧光强度。因此，pH 5.0用于以下实验中。
缓冲溶液的浓度对传感体系的影响如图4B，在Tris-MES(pH＝5)缓冲溶液浓度为10mM时传感体系对Pb2+离子响应最佳，我们将10mM浓度作为传感体系缓冲溶液浓度。
一价阳离子(K+，Na+等)可影响G-四链体的空间结构和稳定性。因此，检测了体系中K+浓度对传感体系的影响。结果如图5A所示，在传感体系中加入不同浓度的K+，结果表明，F/F0随着K+浓度从0mM增加到50mM而降低。体系在不含有K+时传感效果最佳，这可能是由于加入K+后G-四链体过于稳定，Pb2+和适配体的结合程度较低，导致不能改变G-四链体结构并释放AMT。
紧接着，当AMT浓度高于3μM时传感体系性能趋于平稳(图5B)，选择4μM AMT用于传感体系。两条适配体的比例也影响适配体与铅离子的结合，从图5C中可以看出，当两条DNA比例为3：1时，传感性能最佳。最后，研究了分裂适配体浓度对传感性能的影响，从图5D可以看出，F/F0随着分裂适体浓度的增加而增加，并且在T30695与Z混合DNA浓度为4μM时达到最大值。
2.2动力学检测缓冲溶液中的ATP
传感体系的荧光强度与添加Pb2+的反应时间之间的关系如图6所示。在构建好的传感体系中加入20mM Pb2+，反应5分钟后荧光强度逐渐趋于稳定，因此我们选择5分钟作为系统测试的反应时间。
2.3、传感体系对Pb2+的荧光响应
在最佳实验条件下加入不同浓度的目标物Pb2+后，探究了检测的可行性。如图7所示，随着从0-10μM Pb2+浓度的逐渐增加，荧光强度逐渐增加。当Pb2+浓度超过10μM时，荧光强度趋于平稳。如图7内插图所示，当Pb2+浓度超过10μM时，F/F0对Pb2+浓度(F和F0是存在和不存在Pb2+时的荧光强度)显示出荧光约增强8倍。F/F0对Pb2+浓度的线性图(图8)显示检测Pb2+的线性范围为10nM至300nM。线性方程为F/F/F0＝0.0005c+1.0035，相关系数(r)为0.9982。根据3σ/k方程计算检测限(LOD)为1.986nM(其中σ是空白溶液的标准偏差(n＝11)，k表示校准曲线的斜率)。
2.4、传感体系对检测物选择性的考察
为了评估开发的传感系统辨别能力，在相同条件下检测了K+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Hg2+、Cr3+、Co2+、Ag+、Ni+、Mn2+、Cd2+、Pb2+对传感体系的响应。结果显示在图9A中，与Pb2+相比，在相同浓度下其他金属离子的荧光增强很弱。体系对Pb2+的高选择性可归因于铅离子与适体的强结合力。此外，将相同浓度的Pb2+及其类似物混合进行实验，结果显示相同浓度的类似物不干扰Pb2+检测(见图9B)。
应用例1实际样品检测
利用本发明所述传感体系检测稀释的人血清中的Pb2+。结果见图10。
验证了本发明在检测具有复杂基质的实际样品人血清中Pb2+的潜在应用。通过测量加标样品来评估所述方法的准确性。如表2所示，所提出方法的回收率为95％-110％，在可接受的范围内。结果表明，本发明所述的方法可用于定性或定量检测实际临床血液样品中的Pb2+。
表2在1％人血清中ATP的加标回收实验
序 列 表
< 110> 商丘师范学院
<120>一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器及其荧光分析法
<160> 7
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> T30695
<400> 1
gggtgggtgg gtgggt 16
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>Z
<400>2
aaaccctccc acccaccc 18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> PS2.M
<400>3
gtgggtaggg cgggttgg 18
<210>4
<211>17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> PW17
<400>4
gggtagggcg ggttggg 17
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> AGRO100
<400>5
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210>6
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> EDA2
<400>6
ctgggaggga gggaggga 18
<210>7
<211>15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> TBA
<400>7
ggttggtgtg gttgg 15
Claims (3)
1.一种荧光增强型传感器，其特征在于，pH=5.0 的MES-Tris缓冲溶液中，以两条部分互补DNA链T30695、Z混合孵育作为适体，4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素（AMT）荧光染料作为传感指示剂构建成传感体系；T30695、Z的DNA碱基序列见序列表中序列1和2。
2.如权利要求1所述的荧光增强型传感器，其特征在于，传感体系使用10mM MES-Tris缓冲溶液； T30695与Z体积比例为3：1；AMT选择4µM；T30695与Z混合DNA浓度为4μM。
3.如权利要求1或2所述的荧光增强型传感器的应用，其特征在于，采用荧光分析法，将其应用于人血清中Pb2+浓度的定性或定量检测。
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