Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN111471763B - 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒 - Google Patents

用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN111471763B
CN111471763B CN202010552793.3A CN202010552793A CN111471763B CN 111471763 B CN111471763 B CN 111471763B CN 202010552793 A CN202010552793 A CN 202010552793A CN 111471763 B CN111471763 B CN 111471763B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
primer
internal standard
seq
reaction buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010552793.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111471763A (zh
Inventor
魏劭
林培蕊
雷彩霞
魏超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Anpu Precision Medical Test Co ltd
XIAMEN AMPLLY BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
Nanjing Anpu Precision Medical Test Co ltd
XIAMEN AMPLLY BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Anpu Precision Medical Test Co ltd, XIAMEN AMPLLY BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical Nanjing Anpu Precision Medical Test Co ltd
Priority to CN202010552793.3A priority Critical patent/CN111471763B/zh
Publication of CN111471763A publication Critical patent/CN111471763A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111471763B publication Critical patent/CN111471763B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于α‑地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒，属于分子生物学检测技术领域；所述引物、探针和反应缓冲液组合包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；所述4种反应缓冲液包括B‑4反应缓冲液、B‑2反应缓冲液、J‑1反应缓冲液和H‑1反应缓冲液。本发明的引物、探针和反应缓冲液组合实现‑‑SEA、‑‑THAI、‑α3.7、‑α4.2长片段缺失的扩增，以及和αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα三种非缺失型同步分型检测扩增，该方法具有特异性强，灵敏度高，耗时短等特点，同时拥有同一个反应管中通过不同荧光通道进行区分不同突变型的特点。

Description

用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应 缓冲液组合及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒。
背景技术
α-地中海贫血是由位于人类16号染色体末端的α-珠蛋白基因缺陷所致，可划分为缺失型和非缺失型两大类，其中，缺失型发病率远高于非缺失型。α-地中海贫血属于常染色体单基因遗传病,高发于我国南方特别是华南、西南等地区,中国人群主要为右侧缺失型(-α3.7)，左侧缺失(-α4.2)，和东南亚型(--SEA)三种缺失型、αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα三种非缺失型以及散发病例泰国缺失型(--THAI)等α-地中海贫血基因型。-α3.7型主要缺失的是α1基因，缺失片段长3.7Kb；-α4.2型缺失的是α2基因，缺失片段长4.2Kb；而--SEA两个功能基因即α1，α2全部缺失，缺失片段长达20Kb。--THAI缺失片段比--SEA缺失的片段还要长，缺失片段包括α1，α2基因，在临床上可以形成中重度α地中海贫血。αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα三种点突变均位于α2珠蛋白基因上。
临床上将α-地中海贫血患者划分为4型：即静止型、轻型、标准型即HbH病(血红蛋白病)，以及重型(巴氏水肿胎儿，Bart's fetus)。静止型又称为地中海贫血2或α+-地中海贫血，基本无症状，无明显血液学改变，是缺失一个α-基因的携带者。轻型又称为α-地中海贫血1或α0-地中海贫血，有轻微贫血症状，表现为轻度贫血，多是因缺失2个α基因所致。中间型(HbH病)是临床上最常见的α-地中海贫血类型，有明显的甚至严重的贫血症状，患儿从1岁左右即出现贫血，严重者肝脾肿大及黄疸，面黄肌瘦并伴骨骼变化，靠输血维持生命。HbH病患者共缺失或相当于缺失三个α基因。重型地贫是最严重的一种，是α0地贫的纯合子状态，其4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，胎儿生下来就是死胎。目前，本病尚无有效治疗方法，只有通过遗传咨询、产前基因诊断来杜绝地中海贫血患儿出生，以达到优生的目的。
目前市场上用于α地中海贫血基因检测的试剂盒最常见的方法为缺口PCR(gap-PCR)技术和反向点杂交技术(RDB)。
Gap-PCR技术是设计与缺失序列两侧序列互补的引物，缺失使本来在正常DNA序列中相距很远的这对引物之间的距离因断端连接而靠近，并能扩增出特定长度的片段。再通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳片段大小检测样品的基因型，是缺失型地中海贫血检测的有效方法，但是该方法只能检测出α地贫中的缺失型。
RDB技术是在PCR扩增的基础上，将PCR产物与固定在膜条上的特异性探针杂交，再通过激发荧光或一系列显色反应观察结果，该方法灵敏度高，但是该方法只能检测出非缺失型地中海贫血。
目前缺少一种能够实现--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2长片段缺失的扩增，以及和αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα三种非缺失型同步分型检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒，本发明的引物和探针及试剂盒能够实现能够实现--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2长片段缺失的扩增，以及和αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα三种非缺失型同步分型检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合，包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；
所述8组引物和探针组合包括第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合；所述第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合分别单独包装；
所述4种反应缓冲液包括B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液；所述B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液分别单独包装；
所述第1组引物和探针组合包括：SEA上游引物、SEA下游引物、SEA探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述SEA上游引物、SEA下游引物和SEA探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第2组引物和探针组合包括：THAI上游引物、THAI下游引物、THAI探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述THAI上游引物、THAI下游引物和THAI探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第3组引物和探针组合包括：4.2A上游引物、4.2A下游引物、4.2A探针、内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针；所述4.2A上游引物、4.2A下游引物和4.2A探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示；所述内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.36所示；
第4组引物和探针组合包括：4.2B上游引物、4.2B下游引物、4.2B探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述4.2B上游引物、4.2B下游引物和4.2B探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；
第5组引物和探针组合包括：3.7上游引物、3.7下游引物、3.7探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述3.7上游引物、3.7下游引物和3.7探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；
第6组引物和探针组合包括：WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针、第二WS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针和第二WS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.19所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第7组引物和探针组合包括：QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针、第二QS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针和第二QS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.23所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第8组引物和探针组合包括：CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针、第二CS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针和第二CS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.27所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
所述SEA探针、THAI探针、4.2A探针、4.2B探针、3.7探针、第二WS探针、第二QS探针和第二CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述第一WS探针、第一QS探针和第一CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述内标01探针、内标02探针和内标03探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述B-4反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁、6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；
所述B-2反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁、6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、四甲基氯化铵20mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；
所述J-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾125mM、氯化镁、6.25mM、硫酸铵25mM、二甲基亚砜12.50％(体积比)、甜菜碱2.5M、7-deaza-dGTP 0.075mM、脱氧核糖核苷三磷酸1mM和脱氧尿苷三磷酸2mM；
所述H-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸50mM、硫酸铵25mM、氯化钾125mM、氯化镁7.5mM、体积百分含量为2.50％的甲酰胺2.50％、脱氧核糖核苷三磷酸0.4mM和脱氧尿苷三磷酸0.8mM。本发明还提供了一种包括上述方案所述引物、探针和反应缓冲液组合的试剂盒。
优选的，所述试剂盒还包括酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油。
优选的，所述酶混合液包括以下组分：Taq DNA聚合酶4.0U/μL、尿嘧啶糖基化酶0.004U/μL和酶储存液A(50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA·2Na，1％TritonX-100(体积比)，50％甘油(体积比))；所述稀释缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1mM，三羟甲基氨基甲烷9mM；所述TE缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.6mM、三羟甲基氨基甲烷4.4mM和乙二胺四乙酸二钠盐1mM。
优选的，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品包括生理盐水；所述阳性对照品包括：pGEM-T-Easy-SEA质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-THAI质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-4.2A质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-4.2B质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-3.7质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-WS质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-QS质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-CS质粒1.0×104copies/μL、野生型人基因组DNA。
优选的，每组引物和探针组合中，每种引物或者每种探针的使用母液浓度分别为50μM。
本发明的有益效果：本发明提供了用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合，包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；所述4种反应缓冲液包括B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液。
本发明的引物、探针和反应缓冲液组合能够实现对α-地中海贫血基因缺失型和非缺失型的纯杂合突变同步判断；对于缺失型，查找到断端的位置，在缺失片段断端的两侧设计一对引物及探针，缺失使本来在正常DNA序列中相距很远的这对引物和探针之间的距离因断端连接而靠近，进行目的片段扩增，从而发光；对于非缺失型，在非缺失型α地中海贫血的突变位点两侧设计一对引物及在SNP位点处分别设计一对野生型和突变型的探针；根据不同的荧光信号可以直接判断点突变的纯合、杂合情况；缺失片段的纯杂合缺失情况再结合点突变的ROX通道是否表现荧光特性，从而判断杂合缺失或者纯合缺失。
本发明通过在反应缓冲液增加DMSO、甜菜碱或TMAC等增强剂，提高-α4.2和-α3.7等高G+C模板的扩增效率，并添加了7-deaza-dGTP，能够提高扩增产物的特异性及高保真度。
本发明中，突变情况由FAM指示，野生型由ROX指示，内标由HEX指示；从而实现对一个样本进行同步扩增，实现右侧缺失型(-α3.7)、左侧缺失(-α4.2)、东南亚型(--SEA)、泰国缺失型(--THAI)、αCSα/αα、αQSα/αα、αWSα/αα七种类型的纯杂合突变情况的判断。
本发明的引物、探针和反应缓冲液组合具有特异性强，灵敏度高，耗时短等特点，同时拥有同一个反应管中通过不同荧光通道进行区分不同突变型的特点。
本发明的引物、探针和反应缓冲液组合能够实现α-地中海贫血基因缺失型和非缺失型荧光PCR同步检测，无需采用两种方法学进行检测，操作较为简单。与传统的缺失型gap-PCR方法相比，本方法耗时短，特异性好，灵敏度高，操作简单，安全、自动化程度高。与RDB技术方法相比，操作简单，耗时短，自动化程度高，较不容易产生污染。与gap-PCR法和RDB方法比较，全程无需开盖处理，降低对实验室污染而导致实验结果假阳性和假阴性等严重后果。
附图说明
图1为国家阴性参考-FAM通道(0001、0002、0010)；
图2为国家阴性参考-HEX通道(0001、0002、0010)；
图3为国家阴性参考-ROX通道(0001、0002、0010)；
图4为试剂盒检测范围外的其他突变类型参考品-FAM通道(0003、0004、0009)；
图5为试剂盒检测范围外的其他突变类型参考品-HEX通道(0003、0004、0009)；
图6为试剂盒检测范围外的其他突变类型参考品-ROX通道(0003、0004、0009)；
图7为国家阳性参考品(YSH2015-0005)；
图8为国家阳性参考品(YSH2015-0006)；
图9为国家阳性参考品(YSH2015-0007)；
图10为国家阳性参考品(YSH2015-0008)；
图11为国家阳性参考品(YSH2015-0013)；
图12为国家阳性参考品(YSH2015-0019)；
图13为国家阳性参考品(YSH2015-0021)；
图14为国家阳性参考品(YSH2015-0022)；
图15为国家阳性参考品(YSH2015-0029)；
图16为国家阳性参考品(YSH2015-0030)；
图17为国家阳性参考品(YSH2015-0032)。
具体实施方式
本发明提供了用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合，包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；
所述8组引物和探针组合包括第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合；所述第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合分别单独包装；
所述4种反应缓冲液包括B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液；所述B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液分别单独包装；
所述第1组引物和探针组合包括：SEA上游引物、SEA下游引物、SEA探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述SEA上游引物、SEA下游引物和SEA探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第2组引物和探针组合包括：THAI上游引物、THAI下游引物、THAI探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述THAI上游引物、THAI下游引物和THAI探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第3组引物和探针组合包括：4.2A上游引物、4.2A下游引物、4.2A探针、内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针；所述4.2A上游引物、4.2A下游引物和4.2A探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示；所述内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.36所示；
第4组引物和探针组合包括：4.2B上游引物、4.2B下游引物、4.2B探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述4.2B上游引物、4.2B下游引物和4.2B探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；
第5组引物和探针组合包括：3.7上游引物、3.7下游引物、3.7探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述3.7上游引物、3.7下游引物和3.7探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；
第6组引物和探针组合包括：WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针、第二WS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针和第二WS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.19所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第7组引物和探针组合包括：QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针、第二QS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针和第二QS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.23所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第8组引物和探针组合包括：CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针、第二CS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针和第二CS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.27所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
所述SEA探针、THAI探针、4.2A探针、4.2B探针、3.7探针、第二WS探针、第二QS探针和第二CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述第一WS探针、第一QS探针和第一CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述内标01探针、内标02探针和内标03探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述B-4反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁、6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；
所述B-2反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁、6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、四甲基氯化铵20mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；
所述J-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾125mM、氯化镁、6.25mM、硫酸铵25mM、二甲基亚砜12.50％(体积比)、甜菜碱2.5M、7-deaza-dGTP 0.075mM、脱氧核糖核苷三磷酸1mM和脱氧尿苷三磷酸2mM；
所述H-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸50mM、硫酸铵25mM、氯化钾125mM、氯化镁7.5mM、甲酰胺2.50％(体积比)、脱氧核糖核苷三磷酸0.4mM和脱氧尿苷三磷酸0.8mM。
在本发明中，所述8组引物和探针组合的核苷酸序列如表8所示。
表8本发明8组引物和探针组合的核苷酸序列
Figure SMS_1
Figure SMS_2
在本发明中，由于-α4.2缺失断端点不明确，通过临床标本验证，单独设计一对引物探针，会出现漏检现象，为避免出现漏检现象，本发明查找另一断端的位置，结合两断端位点的位置，在缺失片段断端的两侧各设计一对引物及探针，缺失使本来在正常DNA序列中相距很远的这对引物和探针之间的距离因断端连接而靠近，进行目的片段扩增，从而发光；其中-α4.2B片段(-α4.2包含-α4.2A和-α4.2B)G+C含量较高，导致PCR扩增效率低，通过在反应缓冲液中添加TMAC增强剂，提高扩增效率。
在本发明中，由于-α3.7缺失断端点不明确，且位置片段较长，因此设计引物探针进行检测时，避免不了需要进行长片段扩增，并且其中的G+C含量很高，PCR扩增过程容易出现扩增效率低，特异性差等情况，通过在反应缓冲液中添加甜菜碱和DMSO等增强剂提高扩增效率，通过添加7-deaza-dGTP增强剂提高扩增特异性。
本发明设计引物和探针依据的靶基因为包含各种突变的基因序列，根据人类基因组的特点，选择突变附近保守区域的序列作为内参基因；所述内参基因的用途是：控制假阴性，证明检测结果的可靠性。
在本发明中，所述第1引物和探针组合～第3引物和探针组合分别优选的和B-4反应缓冲液联用；所述第4引物和探针组合优选的和B-2反应缓冲液联用；所述第5引物和探针组合优选的和J-1反应缓冲液联用；所述第6引物和探针组合～第8引物和探针组合分别优选的和H-1反应缓冲液联用。
本发明还提供了一种包括上述方案所述引物、探针和反应缓冲液组合的试剂盒。
在本发明中，所述试剂盒还包括酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油；所述酶混合液包括以下组分：Taq DNA聚合酶4.0U/μL、尿嘧啶糖基化酶0.004U/μL和酶储存液A(50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA·2Na，1％Triton X-100(体积比)，50％甘油(体积比))；所述稀释缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1mM，三羟甲基氨基甲烷9mM；所述TE缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.6mM、三羟甲基氨基甲烷4.4mM和乙二胺四乙酸二钠盐1mM。所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品包括生理盐水；所述阳性对照品包括：pGEM-T-Easy-SEA质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-THAI质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-4.2A质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-4.2B质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-3.7质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-WS质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-QS质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-CS质粒1.0×104copies/μL、野生型人基因组DNA。每组引物和探针组合中，每种引物或者每种探针的使用母液浓度分别为50μM。
本发明所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物、探针和反应缓冲液组合进行多重实时荧光PCR扩增反应；所述多重实时荧光PCR扩增反应过程中，利用全自动医用PCR分析系统(厦门安普利生物工程有限公司)收集荧光信号，进行荧光素设定为FAM、ROX和HEX；荧光信号收集设在58℃30s；
取3～12个循环的荧光信号作为基线，分析出基线阈值，将阈值线调整至刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，以Ct值＝0.0为准；
3)分析检测结果；阴性对照反应孔的FAM通道、ROX通道和HEX通道应无扩增曲线，阳性对照反应孔的FAM通道、ROX通道和HEX通道应有扩增曲线且Ct值应小于38，否则该次实验视为无效；
待测样本的HEX通道应有扩增曲线，且Ct值应小于38；若HEX通道无扩增曲线则说明提取的基因组质量不符合实验要求，需重新提取基因组；
若待测样本反应孔的FAM通道无扩增曲线，判断检测结果为无α-地中海贫血突变；
若待测样本1～5号反应孔的FAM通道有一条扩增曲线，且Ct值≤38，则根据6～8号反应孔的ROX通道进行纯合缺失、杂合缺失判断。若ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤38，判断为杂合缺失；若ROX通道无扩增曲线，判断为纯合缺失；
若待测样本6～8号反应孔的FAM通道有一条扩增曲线，且Ct值≤38，则根据6～8号反应孔的ROX通道进行纯合杂合判断。若相应的ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤38，判断为对应突变的杂合突变；若相应的ROX通道无扩增曲线，判断为对应突变的纯合突变；
若待测样本FAM通道同时存在两种及以上扩增曲线，则判断为复合突变。
本发明首先提取待检测样品的基因组DNA；所述样品优选的包括a-地中海贫血突变基因的样本；本发明对所述提取待检测样品的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
得到待检测样品的基因组DNA后，本发明以所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物、探针和反应缓冲液组合进行多重实时荧光PCR扩增反应；所述多重实时荧光PCR扩增反应过程中，利用全自动医用PCR分析系统(厦门安普利生物工程有限公司)仪器收集荧光信号，进行荧光素设定为FAM、ROX和HEX；荧光信号收集设在58℃30s；取3～12个循环的荧光信号作为基线，分析出基线阈值，将阈值线调整至刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，以Ct值＝0.0为准；所述扩增的体系优选为50μL；所述扩增的程序优选为：38℃、5min；95℃、10min；95℃、15s，58℃、50s(30s后读荧光),72℃、45S，45个循环；38℃、30s。
得到检测结果后，本发明对检测结果进行分析；阴性对照反应孔的FAM通道、ROX通道和HEX通道应无扩增曲线，阳性对照反应孔的FAM通道、ROX通道和HEX通道应有扩增曲线且Ct值应小于38，否则该次实验视为无效；
待测样本的HEX通道应有扩增曲线，且Ct值应小于38；若HEX通道无扩增曲线则说明提取的基因组质量不符合实验要求，需重新提取基因组；
若待测样本反应孔的FAM通道无扩增曲线，判断检测结果为无α-地中海贫血突变；
若待测样本1～5号反应孔的FAM通道有一条扩增曲线，且Ct值≤38，则根据6～8号反应孔的ROX通道进行纯合缺失、杂合缺失判断。若ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤38，判断为杂合缺失；若ROX通道无扩增曲线，判断为纯合缺失；
若待测样本6～8号反应孔的FAM通道有一条扩增曲线，且Ct值≤38，则根据6～8号反应孔的ROX通道进行纯合杂合判断。若相应的ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤38，判断为对应突变的杂合突变；若相应的ROX通道无扩增曲线，判断为对应突变的纯合突变；
若待测样本FAM通道同时存在两种及以上扩增曲线，则判断为复合突变。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、样本
地中海贫血核酸检测国家参考品(批号：360014-201701)，突变类型参见如下表2：
表2样本对应的突变类型
Figure SMS_3
Figure SMS_4
(二)实验过程
1.试剂准备(试剂准备区)
(1)取出试剂盒中的反应缓冲液、扩增液、A酶混合液、稀释缓冲液、石蜡油、TE缓冲液等室温放置，使其充分溶解，备用。
(2)扩增液的配制：各取240μL的TE缓冲液加入扩增管中，充分混合均匀，3000～5000g离心5秒，移至标本处理区。
(3)酶的配置：按照标本数量，每0.5μL酶混合液+9.5μL稀释缓冲液进行配制，充分混合均匀，3000～5000g离心5秒，移至标本处理区。
2.加样(标本处理区)
分别取8种扩增液10μL加入PCR反应管中，再各取4种反应缓冲液20μL加入相应的PCR反应管中(SEA、THAI和4.2A的检测孔加B-4反应缓冲液；4.2B的检测孔加B-2反应缓冲液；3.7的检测孔加J-1反应缓冲液；WS、QS和CS的检测孔加H-1反应缓冲液)，将步骤(3)制备的酶混合液取10μL加入PCR反应管中，按顺序将上述参考品DNA和对照品各取10μL至相应的PCR反应管，依次加入25μL石蜡油，振摇混匀，稍微离心，置入荧光PCR扩增仪内。(反应板布局如表所示)
表3反应板布局
序号 名称 1 2 … 9 10 11 12
1 SEA 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
2 THAI 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
3 4.2A 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
4 4.2B 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
5 3.7 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
6 WS 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
7 QS 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
8 CS 样本1 样本2 … 样本9 样本10 阴性对照 阳性对照
3.上机检测(扩增检测区)
(1)循环条件设置
38℃5分钟，95℃10分钟；进入以下循环：95℃15秒，58℃50秒(30秒后读荧光)，72℃45秒，45个循环；38℃30秒。
(2)仪器检测通道选择
荧光素设定为FAM、ROX和HEX，内标对照荧光信号为HEX；缺失突变的突变型荧光信号为FAM；点突变的突变型荧光信号为FAM，野生型荧光信号为ROX，荧光信号收集设在58℃30秒，具体设置方法请参考仪器使用说明书。
4.基线与阈值的设置
使用仪器进行分析时，取3～12个循环的荧光信号作为基线，仪器自动分析出基线阈值，若少数样本扩增曲线噪音太大则应手动将阈值线调整至刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值＝0.0为准。阈值循环数则为荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
(三)检验结果的解释
1.阴性对照反应孔的FAM通道、ROX通道和HEX通道应无扩增曲线，阳性对照反应孔的FAM通道、ROX通道和HEX通道应有扩增曲线且Ct值应小于38，否则该次实验视为无效。
2.待测样本的HEX通道应有扩增曲线，且Ct值应小于38。若HEX通道无扩增曲线则说明提取的基因组质量不符合实验要求，需重新提取基因组。
3.若待测样本反应孔的FAM通道无扩增曲线，判断检测结果为无α-地中海贫血突变。
4.若待测样本1～5号反应孔的FAM通道有一条扩增曲线，且Ct值≤38，则根据6～8号反应孔的ROX通道进行纯合缺失、杂合缺失判断。若ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤38，判断为杂合缺失；若ROX通道无扩增曲线，判断为纯合缺失。
5.若待测样本6～8号反应孔的FAM通道有一条扩增曲线，且Ct值≤38，则根据6～8号反应孔的ROX通道进行纯合杂合判断。若相应的ROX通道有扩增曲线，且Ct值≤38，判断为对应突变的杂合突变；若相应的ROX通道无扩增曲线，判断为对应突变的纯合突变。
6.若待测样本FAM通道同时存在两种及以上扩增曲线，则判断为复合突变。
表4 FAM通道、ROX通道和HEX通道对应的结果判定情况
Figure SMS_5
(本试剂盒1～5号反应液检测α-地中海贫血的缺失型突变，6～8号反应液检测α-地中海贫血的点突变。)
α-地贫常见突变示例：(+表示有扩增曲线，—表示无扩增曲线)
表5不同突变类型对应的突变情况
Figure SMS_6
(四)检测结果
1.实验数据分析，结果参见图1～图17(图中的字体是软件的指示性文字，对结果判断无影响)。
1)检测国家阴性参考品，结果为未检出突变。
2)检测试剂盒范围外的其他突变类型的参考品，结果为未检出突变。
3)检测α-地中海贫血基因突变的国家阳性参考品，结果为相应基因型别。
由图1～图3可知，本发明的试剂盒检测国家阴性参考品YSH2015-001、YSH2015-002、YSH2015-010检测结果FAM通道无扩增曲线；HEX通道有扩增曲线，且Ct值应小于38；ROX通道有扩增曲线，且Ct值应小于38，结果判定为阴性。
由图4～图6可知，本发明的试剂盒检测试剂盒检测范围外的其他突变类型参考品YSH2015-003、YSH2015-004、YSH2015-009检测结果FAM通道无扩增曲线；HEX通道有扩增曲线，且Ct值应小于38；ROX通道有扩增曲线，且Ct值应小于38，结果判定为阴性。
由图7～图17可知，本发明的试剂盒检测检测国家阳性参考品YSH2015-0005、YSH2015-0006、YSH2015-0007、YSH2015-0008、YSH2015-0013、YSH2015-0019、YSH2015-0021、YSH2015-0022、YSH2015-0029、YSH2015-0030、YSH2015-0032检测结果为相应的基因型别。
综上所述，本发明的试剂盒检测国家参考品可以检测出相应的基因型别。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门安普利生物工程有限公司
南京安浦精准医学检验有限公司
<120> 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgaggacg gagcgatc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtctcggct cactgcac 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggtcaggag tccaagacca gc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtcaaagc tctcctgaca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatctgcacc tctgggtag 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcctttgac tgcatcataa ttcc 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgatctttg aatgaagtcc gag 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggattgctgt ggggcaggga 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgtccccagt gcaagtgc 18
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtcagaaca tttctctcat tct 23
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctggaagtg ctgctcg 17
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacatgagca gcacttccaa 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacctacatt ctgcaacca 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccatgcctgg cacgtttgc 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctgtccttt ccctacccag 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cactgcctgc tggtgacc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agcacggtgc tcacagaagc 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cggtgcaggc ctccctgga 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cggtgcacgc ctccctgga 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagctcctaa gccactgcct 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagcgggcag gaggaacg 18
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctccccggac aagttcctgg 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cctccctgga caagttcctg g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcaccgtgc tgacctccaa a 21
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agagaaccca ggcacacac 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taccgtcaag ctggagcctc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
taccgttaag ctggagcctc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccccttctct tctgttctcc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agtgtatccc tcccatgtga 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
accggccctt gtctccaccc c 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acctacccat ctgtcctcct 20
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atagccatcc tcatccgc 18
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccttgctctg ggctctcct 19
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaggtggtg aagcaggc 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aaggtggagg agtgggtg 18
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctcaagggca tcctgggcta cac 23

Claims (3)

1.用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的试剂盒，由用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合而成，所述组合包括8组引物和探针组合以及4种反应缓冲液；所述4种反应缓冲液包括B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液；所述8组引物和探针组合包括第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合；所述第1组引物和探针组合～第8组引物和探针组合分别单独包装；所述B-4反应缓冲液、B-2反应缓冲液、J-1反应缓冲液和H-1反应缓冲液分别单独包装；
所述第1组引物和探针组合包括：SEA上游引物、SEA下游引物、SEA探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述SEA上游引物、SEA下游引物和SEA探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第2组引物和探针组合包括：THAI上游引物、THAI下游引物、THAI探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述THAI上游引物、THAI下游引物和THAI探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第3组引物和探针组合包括：4.2A上游引物、4.2A下游引物、4.2A探针、内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针；所述4.2A上游引物、4.2A下游引物和4.2A探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示；所述内标03上游引物、内标03下游引物和内标03探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.36所示；
第4组引物和探针组合包括：4.2B上游引物、4.2B下游引物、4.2B探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述4.2B上游引物、4.2B下游引物和4.2B探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；
第5组引物和探针组合包括：3.7上游引物、3.7下游引物、3.7探针、内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针；所述3.7上游引物、3.7下游引物和3.7探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15所示；所述内标02上游引物、内标02下游引物和内标02探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.33所示；
第6组引物和探针组合包括：WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针、第二WS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述WS上游引物、WS下游引物、第一WS探针和第二WS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.19所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第7组引物和探针组合包括：QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针、第二QS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述QS上游引物、QS下游引物、第一QS探针和第二QS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.23所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
第8组引物和探针组合包括：CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针、第二CS探针、内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针；所述CS上游引物、CS下游引物、第一CS探针和第二CS探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.27所示；所述内标01上游引物、内标01下游引物和内标01探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30所示；
所述SEA探针、THAI探针、4.2A探针、4.2B探针、3.7探针、第二WS探针、第二QS探针和第二CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述第一WS探针、第一QS探针和第一CS探针的5’端分别标记有荧光报告基团ROX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ2；
所述内标01探针、内标02探针和内标03探针的5’端分别标记有荧光报告基团HEX，3’端分别标记有淬灭基因BHQ1；
所述B-4反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；
所述B-2反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾150mM、氯化镁6.25mM、曲拉通0.25％、硫酸铵12.5mM、四甲基氯化铵20mM、脱氧核糖核苷三磷酸0.75mM和脱氧尿苷三磷酸1.5mM；
所述J-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.8mM、三羟甲基氨基甲烷32.2mM、氯化钾125mM、氯化镁6.25mM、硫酸铵25mM、体积百分含量为12.50％的二甲基亚砜、甜菜碱2.5M、7-deaza-dGTP0.075mM、脱氧核糖核苷三磷酸1mM和脱氧尿苷三磷酸2mM；
所述H-1反应缓冲液包括以下浓度的组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸50mM、硫酸铵25mM、氯化钾125mM、氯化镁7.5mM、体积百分含量为2.50％的甲酰胺、脱氧核糖核苷三磷酸0.4mM和脱氧尿苷三磷酸0.8mM；
所述第1引物和探针组合～第3引物和探针组合分别和B-4反应缓冲液联用；
所述第4引物和探针组合和B-2反应缓冲液联用；
所述第5引物和探针组合和J-1反应缓冲液联用；
所述第6引物和探针组合～第8引物和探针组合分别和H-1反应缓冲液联用；
所述试剂盒还包括酶混合液、稀释缓冲液、TE缓冲液和石蜡油；
所述试剂盒的每组引物和探针组合中，每种引物或者每种探针的使用母液浓度分别为50μM。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括以下组分：TaqDNA聚合酶4.0U/μL、尿嘧啶糖基化酶0.004U/μL和酶储存液A，所述酶储存液A由50mMpH8.0的Tris-HCl、100mM NaCl、0.1mMEDTA·2Na、体积百分含量为1％的TritonX-100、和体积百分含量为50％的甘油组成；所述稀释缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1mM，三羟甲基氨基甲烷9mM；所述TE缓冲液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐5.6mM、三羟甲基氨基甲烷4.4mM和乙二胺四乙酸二钠盐1mM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品包括生理盐水；所述阳性对照品包括：pGEM-T-Easy-SEA质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-THAI质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-4.2A质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-4.2B质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-3.7质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-WS质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-QS质粒1.0×104copies/μL、pGEM-T-Easy-CS质粒1.0×104copies/μL、野生型人基因组DNA。
CN202010552793.3A 2020-06-17 2020-06-17 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒 Active CN111471763B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010552793.3A CN111471763B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010552793.3A CN111471763B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111471763A CN111471763A (zh) 2020-07-31
CN111471763B true CN111471763B (zh) 2023-06-02

Family

ID=71765250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010552793.3A Active CN111471763B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471763B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111961717B (zh) * 2020-08-28 2023-08-01 南方医科大学 单管同时检测缺失型和非缺失型α-地中海贫血基因的荧光PCR试剂盒
CN112553318B (zh) * 2020-11-02 2023-07-11 阅尔基因技术（苏州）有限公司 基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测方法
CN112342289B (zh) * 2020-11-04 2023-08-15 广州精科医学检验所有限公司 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102146475A (zh) * 2011-03-31 2011-08-10 深圳康美生物科技股份有限公司 一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒
CN102277419A (zh) * 2011-04-06 2011-12-14 广东省妇幼保健院 基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用
CN103898213A (zh) * 2014-03-14 2014-07-02 南方医科大学 一种检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称PCR试剂盒
CN109609628A (zh) * 2019-01-31 2019-04-12 中国科学院武汉病毒研究所 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1816215A1 (en) * 2006-02-01 2007-08-08 Academisch Ziekenhuis Leiden Disease specific ASO-probes for the detection of alpha- and beta-thalassemia mutations
CN103789420B (zh) * 2014-01-15 2015-03-25 湖南圣维尔医学检验所有限公司 一种α-地中海贫血荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
CN103981172A (zh) * 2014-03-27 2014-08-13 江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司 一种用于高gc含量基因的pcr扩增添加剂组合物及高gc含量基因的pcr扩增方法
CN105803075B (zh) * 2016-04-14 2019-09-13 亚能生物技术（深圳）有限公司 一种α-地中海贫血基因检测试剂盒
CN106399478B (zh) * 2016-08-31 2024-09-03 桂林优利特医疗电子有限公司 一种荧光探针PCR法快速检测α/β-地中海贫血的试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102146475A (zh) * 2011-03-31 2011-08-10 深圳康美生物科技股份有限公司 一种检测东南亚缺失型α地中海贫血的方法及试剂盒
CN102277419A (zh) * 2011-04-06 2011-12-14 广东省妇幼保健院 基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用
CN103898213A (zh) * 2014-03-14 2014-07-02 南方医科大学 一种检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称PCR试剂盒
CN109609628A (zh) * 2019-01-31 2019-04-12 中国科学院武汉病毒研究所 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN111471763A (zh) 2020-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111471763B (zh) 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒
US20010049102A1 (en) Methods for determining single nucleotide variations
US9481909B2 (en) Multiplex compositions and methods for quantification of human nuclear DNA and human male DNA and detection of PCR inhibitors
CN112029837A (zh) 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法
CN108441553A (zh) 一种精准检测aldh2基因多态性的试剂盒及其应用
CN108456721B (zh) 同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用
CN107760766A (zh) 多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
Ghaissani et al. Design and characterization of a SYBR Green I-based melting curve method for investigation of HER2I655V polymorphism in breast cancer
CN110564861A (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN111172273B (zh) 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法
CN111593115B (zh) 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒
CN116004775A (zh) 一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN115851973A (zh) 实时荧光PCR快速检测人类InDel遗传多态性的方法、试剂盒和应用
CN112553318B (zh) 基于Taqman探针的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒及其检测方法
CN116479116A (zh) 可排除smn2干扰的smn1基因检测的试剂盒及检测方法
CN112063701A (zh) 检测kras基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
JP2982304B2 (ja) 核酸の識別方法及び核酸の識別用検査セット
CN118291631B (zh) 一种伴bcor遗传学异常肉瘤检测引物组、试剂盒及其应用
CN114457151B (zh) 一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法
US8343722B2 (en) Method for the identification of colorectal tumors
CN111961717B (zh) 单管同时检测缺失型和非缺失型α-地中海贫血基因的荧光PCR试剂盒
CN101358245A (zh) 一种猪氟烷基因基因型的检测方法
CN108707646B (zh) 一种快速检测基因突变位点的方法及试剂盒
Hobson-Peters et al. A whole-blood homogeneous assay for the multiplex detection of the factor V G1691A and the prothrombin G20210A mutations

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant