CN111437235B - 具有抗衰老功效的大米复合发酵产品及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法，包括：将发酵菌接种至由大米、牛蒡根、水飞蓟、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品。大米复合发酵产品具有良好的抗衰老效果，在化妆品行业具有较好的应用前景。

Description

具有抗衰老功效的大米复合发酵产品及其制备方法和应用

技术领域

本公开涉及发酵技术领域，尤其涉及一种具有抗衰老功效的大米复合发酵产品及其制备方法和应用。

背景技术

大米是稻谷经清理、砻谷、碾米、成品整理等工序后制成的成品，大米含有稻米中近64％的营养物质和90％以上的人体所需的营养元素，同时是中国大部分地区人民的主要食品。大米可提供丰富维生素、谷维素、蛋白质、花青素等营养成分。大米还有护肤用途功效，以大米提取液作为主要成分(其富含y-谷维素、稻糠甾醇、原花青素等成分)，有性质温和安全，具有较强的润白功效，并可补充肌肤所缺失水分，使肌肤光滑细腻，充满弹性功效。我国稻米资源丰富，为开发应用稻米提供有利条件。随着稻米栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对大米营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步深入。

牛蒡(Arctium lappa L.)，属桔梗目，菊科二年生草本植物。牛蒡的根含有菊糖及挥发油、牛蒡酸、多种多酚物质及醛类，并富含纤维素和氨基酸。牛蒡根含有人体必需的各种氨基酸，且含量较高，尤其是具有特殊药理作用的氨基酸含量高，如具有健脑作用的天门冬氨酸占总氨基酸的 25％-28％，精氨酸占18％-20％，且含有Ca、Mg、Fe、Mn、Zn等人体必需的宏量元素和微量元素，具有抗衰老、抗炎、抗病毒、抗癌、扩张血管、促进血液循环等作用。牛蒡根中还富含其他多种活性物质，主要有牛蒡醛、牛蒡酸、多炔物质、愈创木内酯类化合物等。新鲜牛蒡根含有的多酚化合物主要包括绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、一咖啡酰衍生物、二咖啡酰衍生物等，另外还含过氧化物酶；牛蒡根中多炔物质具有抑制细菌和抗真菌作用。

水飞蓟(Silybum marianum(L.)Gaertn.)是一年生或二年生草本植物，水飞蓟具有抗氧化、抗炎、催乳、保肝等作用。水飞蓟素主要由水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭、飞水蓟宁等组成，是强抗氧化剂，研究表明，水飞蓟素能稳定肝细胞膜，维持肝细胞之完整性，使毒素无法穿透破坏肝脏，并能加速合成肝脏细胞的DNA，可预防牛皮癣等症，同时具有肝癌、前列腺癌、乳癌及子宫颈癌细胞的生长及分化抑制作用。是目前世界上所发现最具肝疾疗效的类黄酮。目前对于水飞蓟素研究较多，但是都在口服药物和保肝等药物上，在化妆品上的应用较少，集中在如何解决因为存在水飞蓟素在化妆品基质中分布不均匀、不稳定，以及难以被皮肤吸收，长期使用容易堵塞皮肤毛孔等问题。

发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程，在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用。目前对采用发酵技术提取营养物质已多有报道，但是根据发酵底物和发酵工艺条件的不同，提取效果差别很大。有赖于研究人员继续探索更多发酵底物组合及发酵方法制备出更多、更优功效的产品以，满足消费者需求。

发明内容

在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

鉴于现有技术的上述缺陷，本公开的目的是提供具有抗衰老功效的大米复合发酵产品及其制备方法和应用。

根据本公开的一个方面，提供了一种具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法，包括：将发酵菌接种至由大米、牛蒡根、水飞蓟、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品。

本公开中采用的发酵菌为益生菌，可以维持新的皮肤环境，有益于改善皮肤的生态平衡和舒适度，强化微生物保护膜，促进皮肤微循环。优选地，所述益生菌为乳酸菌；具体为选自以下任一种或两种以上：

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp. Bulgaricus)，保藏编号为CGMCC 1.16075，可从CGMCC购买；

布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，保藏编号为CGMCC 1.15607，可从CGMCC购买；

两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，保藏编号为CGMCC 1.5029，可从CGMCC购买。

本公开中发酵底物有适量的大米、牛蒡根和水飞蓟加入适量的水中，混合、灭菌而制成。

本公开中采用的大米为是稻谷经清理、砻谷、碾米、成品整理等工序后制成的成品大米颗粒，也可以为大米粉，优选用量为0.5-3％，即发酵底物中，大米用量占水重量的0.5-3％(比如0.8％、1％、1.5％、1.8％、2.1％、 2.5％、2.8％)。

本公开中采用的牛蒡根为菊科植物牛蒡(Arctium lappa L.)的根。牛蒡根自古以来就被定位为兼具食用性和药用性的蔬菜，在南北朝的《名医别录》中就有关于牛蒡入药的记载，其主要的药用部分是牛蒡子(牛蒡的瘦果)。牛蒡根的药用价值在多本医药典籍中都有记载，如《药性论》、《名医别录》、《本草拾遗》等典籍中就记载了牛蒡的药用价值。牛蒡根的营养保健和药理作用归功于牛蒡根中所含的多种功能物质。牛蒡根中富含氨基酸、低聚糖等营养成分和牛蒡酸、醛类、含硫炔类、多炔类、多酚类、挥发油等多种小分子活性成分。

牛蒡提取物对雄性激素水平有抑制作用说明，对因雄性激素偏高引起的疾患有很好的防止作用，可用于抑制粉刺和脱发；牛蒡提取物良好的抗氧性，以及它对金属蛋白酶的抑制和对组织蛋白酶D活化，表明有抗衰活性；对核因子κB受体活化进行抑制，说明牛蒡提取物有抗炎性，结合它的抑菌作用，可用于皮肤炎症的预防。对胶原蛋白纤维的收缩作用表明，可以收敛肌肤和缩小毛孔。

本公开所用牛蒡根为片状或粉粹状干品，优选用量为0.05-0.2％，即发酵底物中，牛蒡根占水重量的0.05-0.2％(比如0.08％、0.1％、0.12％、 0.15％、0.18％)。用量比过高会导致发酵产物颜色很深，不适用于化妆品。所述牛蒡根优选粉碎至过20目筛网。

本公开中采用的水飞蓟为菊科植物水飞蓟Silybum marianum (L.)Gaerth的瘦果。全草含有黄酮类及延胡索酸；种子主要含黄酮醇类化合物，水飞蓟宾、异水飞蓟宾、脱氢水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟亭、水飞蓟宾聚合物及肉桂酸、肉豆蔻酸、棕榈烯酸、花生酸等。水飞蓟具有极强的抗氧化作用，它能有效地清除体内过多的自由基，避免体内细胞受到伤害。另一方面，它还能中和自由基，防止肝脏受到自由基的伤害。水飞蓟可以防止肌肤糖化，保持肌肤中胶原蛋白结构不变化，提升皮肤的平滑感、紧致度，减 少皱纹深度。本公开中，水飞蓟为瘦果干品，优选用量为 0.05-0.15％，即发酵底物中，水飞蓟占水重量的0.05-0.15％(比如0.08％、 0.10％、0.12％、0.14％)。水飞蓟用量比过高会导致发酵产物颜色很深，不适用于化妆品；用量不足易导致协同效应不足。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)。

进一步地，用于接种至发酵底物的德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备流程如下：

活化：将菌种接种至MRS液体培养基的试管中，35～37℃活化20～48h；

纯化：取上述活化后的液体菌种梯度稀释后，接种于MRS固体培养基平板中，35～37℃静置培养40～48h；

液体培养：取上述平板中的单菌落2～3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35～37℃活化20～48h；

扩大培养：以10％接种量取所述液体培养得到的菌液，接入到 100mLMRS液体培养基(菌液与培养基体积比为10:100)中，35～37℃培养10-14h，当菌体量达到10⁷-10¹⁰CFU/mL时，得到种子液。

其中，上述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分至1000mL。上述MRS固体培养基为往上述MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉。培养基灭菌条件为：115～121℃灭菌15～20min。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，用于接种至发酵底物的乳酸菌种子液的浓度为 10⁷-10¹⁰CFU/mL(比如10⁸CFU/mL、10⁹CFU/mL等)；所述发酵菌的接种比例，即所述种子液与发酵底物的体积比为1％～3％(比如1.2％、1.5％、 2％、2.5％、2.8％)。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵培养的温度为40-50℃(比如41℃、42℃、43℃、 44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃)，时间为6-10h(比如6.5h、7h、8h、9h、9.5h)。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理的温度是115～121℃(比如116℃、117℃、118℃、 119℃、120℃)，时间是15-20min(比如16min、17min、18min、19min)。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理前，还包括分离处理，最终得到所述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品，即大米复合发酵原浆。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述灭菌处理后，还包括干燥处理，最终得到所述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品，即大米复合发酵干粉。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥等。

上述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法中，作为一种优选实施方式，所述分离处理为离心处理；更优选地，所述离心处理的速度是3500-8000r/min(比如4000r/min、4500r/min、5000r/min、5500r/min、 6500r/min、7000r/min、7500r/min)，时间是20-60min(比如25min、30min、 40min、50min、55min)。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的大米复合发酵干粉。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种采用上述制备方法制备的大米复合发酵原浆。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述大米复合发酵原浆或大米复合发酵干粉在制备化妆品的应用。

根据本公开的又一个方面，还提供了一种上述大米复合发酵原浆在制备化妆品的应用。

上述化妆品可以是面膜、精华液或爽肤水等。

上述根据本公开实施例的技术方案，通过对大米、牛蒡根、水飞蓟进行复合发酵，制得了一种新型大米复合发酵原浆，具有良好的抗衰老效果。

通过以下结合附图对本公开的最佳实施例的详细说明，本公开的这些以及其他优点将更加明显。

附图说明

本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：

图1示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆和0.1％透明质酸 (0.1％HA)进行皮肤水分含量(简称“水含”)和皮肤水分流失量(即经皮水分散失，简称“水散”)测试所得结果；

图2示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆和0.1％透明质酸 (0.1％HA)进行皮肤水分含量(简称“水含”)测试所得结果，其中，A 表示使用后不同时间点与各区域使用前水分含量的变化百分比变化趋势， B表示不同时间点不同区域的水分含量中位数变化趋势；

图3示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆和0.1％透明质酸 (0.1％HA)进行皮肤水分流失量(即经皮水分散失，简称“水散”)测试所得结果，其中，A表示使用后不同时间点与各区域使用前TEWL值的变化百分比变化趋势，B表示不同时间点不同区域的TEWL值中位数变化趋势；

图4示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆进行透皮吸收性实验所得结果；

图5示出了使用实施例1制备的大米复合发酵原浆进行抗氧化清除ABTS自由基测试所得结果；

图6示出了志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆后进行皮肤皱纹及粗糙度测试所拍摄的照片，其中，从上至下依次为分析毛孔、细纹、皱纹的照片，从左至右依次为使用样品前、使用样品后5min、20min、60min 拍摄的照片；

图7为示出了图6所示志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆前后测试部位的皮肤毛孔数柱状图；

图8为示出了图6所示志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆前后测试部位的皮肤细纹深度柱状图；

图9为示出了图6所示志愿者使用实施例1制备的大米复合发酵原浆前后测试部位的皮肤皱纹深度柱状图。

具体实施方式

在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的大米来自市面销售。

下述实施例中的牛蒡根来自安徽省亳州市何欢堂农副产品购销有限公司生产的片状干品。

下述实施例中的水飞蓟来自安徽省亳州市何欢堂农副产品购销有限公司生产的瘦果干品。

下述实施例中的发酵菌为乳酸菌，具体为：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp.Bulgaricus)，保藏编号为CGMCC 1.16075，从CGMCC购买。本领域技术人员还可以使用：布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri，保藏编号为CGMCC 1.15607，可从CGMCC购买)；两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,保藏编号为CGMCC 1.5029，可从CGMCC购买)；或者上述三者中任两种或三种。

下述实施例中，MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分 1000mL。MRS固体培养基为MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉。培养基成分配置好后于115℃灭菌20min。

实施例1大米复合发酵原浆的制备

1、菌种的活化：挑取德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechiisubsp.Bulgaricus)菌落2环接种至100mL MRS液体培养基的试管中，35℃活化24h。

2、菌种纯化：取上述液体菌种梯度稀释后，接种200μL涂布于MRS 固体培养基平板中，35℃静置培养48h。

3、液体培养：取上述平板中的单菌落3环，接种于100mL MRS培养基中，35℃活化48h。

4、扩大培养：以10％接种量取上述液体试管，接入到100mLMRS培养基中，37℃培养12h，当菌体量达到10⁸CFU/mL时，得到种子液。

5、发酵底物配制：取牛蒡根(粉碎过20目筛网)0.5g，大米5g，水飞蓟0.5g，加入到500g水中，得到发酵底物；其中，牛蒡根占0.1％，大米占1％，水飞蓟占0.1％。将发酵底物配置好后于115℃灭菌20min，冷却。

6、大米复合发酵原浆的获得：将15mL步骤4得到的发酵菌菌液接种到步骤5所得的506g发酵底物中，得到发酵体系；将发酵体系在45℃培养箱中发酵8小时，得到发酵产物；将发酵产物在5000r/min、离心30 min，弃沉淀，收集上清液，于115℃灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物即为大米复合发酵原浆。

实施例1所制得的大米复合发酵原浆的外观为粘稠液体，颜色为淡白色至淡黄色。pH值5.1-6.3，粘度200-700cP，可溶性固含物含量 1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此发酵提取物符合化妆品质量要求。

对该大米复合发酵原浆进行成分分析，其中，蛋白质检测方法参照 GB5009.5-2010，粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008，黄酮检测方法参照GB/T 5009.124-2003，总酚检测方法参照GB/T8313-2008；所得结果如下：实施例1制得的大米复合发酵原浆含蛋白质1.560g/kg、粗多糖 6.543g/kg、总黄酮0.051g/kg(以芦丁计)、总酚0.063g/kg。

实施例2大米复合发酵原浆在作为化妆品的应用

一、大米复合发酵原浆的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本公开根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1获得的大米复合发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象：

本试验选择选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法：

将液体样品(100％大米复合发酵原浆，无稀释)0.02mL到0.025mL 滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照 (水)，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后(等待压痕消失)，24h和48h观察皮肤的反应。人体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表1。

表1皮肤不良反应分级标准

3、试验结果：

参见表2。从表中可以看出：使用实施例1得到的大米复合发酵原浆后都是阴性反应，说明本发明提供的大米复合发酵原浆具有安全性，不会给人体带来不良反应。

表2、实施例1获得的大米复合发酵原浆的斑贴试验结果

二、大米复合发酵原浆的水含、水散测试

对实施例1获得的大米复合发酵原浆的保湿效果进行测试，具体为皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试，透明质酸(HA)普遍认为是具有较好保湿效果的阳性对照样品，本测试采用10％大米复合发酵原浆(记为10％样品，即用实施例1制备的大米复合发酵原浆配制的体积浓度为 10％的水溶液)和0.1％透明质酸(记为0.1％HA，即用透明质酸配制的体积浓度为0.1％的水溶液)进行对比实验。

1、测试环境：温度:22±1℃；湿度:50％-60％。

2、测试区域：皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试：左右前臂。

3、测试时间点：皮肤水分含量测试、皮肤水分流失量测试：使用前；使用后5min、20min、60min。

4、实验仪器：Cornemeter，CM825、Tewameter，TM300。

5、测试方法：

1)30名符合条件的志愿者参加测试。测试场所无光线直射、无风，室温22～24℃，湿度40％～60％。检测前用洗面奶清洗双侧前臂，静息 30min，取受试者双侧前臂内侧用记号笔画出面积为3.5×3.5cm正常皮肤。依次测量在使用前的皮肤水分含量及皮肤水分流失量。

2)将浸有样品的面膜分别剪成3×3cm大小，分别贴在前臂相应标记处，15min后取下，轻轻用化妆棉沾干测试部位未干的精华液，并开始计时。

3)分别在5min、20min、60min时测试3个部位角质层含水量及TEWL 值。每个部位测量3次取平均值。

6、测试结果：

图1是30名志愿者手臂测试皮肤水含和水散的离散图，从图1可以看出10％样品(即10％大米复合发酵原浆)和0.1％HA的水含水散变化趋势较相似，利用T-Test分析其显著性发现，使用后5min的水含量显著高于本底(样品p＝0.004，vs本底；HA p＝0.01,vs本底)，其他时间点水含量与本底均无显著性差异。

进一步对数据进行分析，图2中的A为10％样品和0.1％HA的水含量变化百分比趋势图，B为10％样品和0.1％HA水含量中位数的变化趋势图。从图2中可以看出样品和HA在使用后5min的水含量中位数均达到最大，随着使用后时间的延长，样品和HA的水含量中位数均呈现降低趋势，水含量变化百分比在使用后20min后低于0，表示使用后该时间点的水含量低于本底数据，但是样品和HA数据趋势相似。

图3中的A为10％样品和0.1％HA的经皮水分散失变化百分比趋势图，B为10％样品和0.1％HA经皮水分散失量中位数的变化趋势图。由图 3可知，样品和HA的经皮水分散失量均在使用后5min达到最大，是因为此时水含量较大造成经皮水分散失也较大；随着使用后时间的延长，经皮水分散失量逐渐下降，样品在使用后60min的时间点下的TWEL变化百分比均小于0，表示该时间点下的TWEL低于皮肤本底。

可见实施例1制备的大米复合发酵原浆具有良好的补水性能，其10％样品与0.1％HA补水性能相当。

三、透皮吸收性实验

1、鼠皮的制备

将裸鼠脱颈椎处死，迅速将其背部毛用剃须刀剃净，剥离背部皮肤并除去皮下脂肪，血管，用蒸馏水反复冲洗至净，再用生理盐水冲洗数遍，置-80℃冰箱中冷藏备用(在5天内用完)。

2、Franz扩散池进行体外透皮吸收实验

实验过程：向体外渗透扩散装置恒温槽中加入适量水。开启电源和恒温槽磁力搅拌，设定恒温槽中水温为37±0.1℃。将制备好的鼠皮用铁夹子固定在两室扩散池之间，向垂直扩散池的接受池内加入5mL接受液，放入体外渗透扩散装置恒温槽中预热，设定接受池搅拌速度为400r/min。向供给池内分别加入供给液(10％样品，即用实施例1制备的大米复合发酵原浆制备成体积百分比为10％的水溶液)，以保鲜膜封住上口。开始记时，当样品(即供给液)渗透0、2、4、6、8、12、24小时时(根据实际样品确定具体时间间隔)，分别取样500μl置具塞离心管中，每次取样的同时向接受池中补充等量的接受液并排除池中的气泡。将测定样品含量。再根据以下公式计算出累积透过量Q(mg/cm²)。其中，扩散池底部直径为1.50cm，样品接触面积为1.77cm²。

式中，Q为累积透过量，S为透皮扩散面积，V为改进Franz扩散池接受室的体积，Cn为第n次取样时接受液的浓度，Ci为第i次取样时接受液的浓度，0.5为取样量。通过以上公式计算后，做出累积量与时间的曲线图。接受液浓度为0.9％的NaCl溶液(生理盐水)；供给液为10％样品，即用实施例1制备的大米复合发酵原浆制备成体积百分比为10％的水溶液。

3、实验结果

实验结果参见图4。从图中可以看出样品0到2h时透过率急速增到 0.40mg/cm³以上，随着时间的延长透过率平缓上升，表示样品可以顺利透过皮肤。

四、抗氧化清除自由基性能测试

1、实验方法

配制ABTS+·储备液：配制2.45mmol/L过硫酸钾，用过硫酸钾溶解 ABTS，配成7mmol/L ABTS储备液，在室温、避光条件下静置12～16h，这种储备液可稳定3～4d。

配制ABTS工作液：将5mL 7mmol/LABTS和88μL 140mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS工作液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734nm下的吸光度在0.70±0.02。

实验操作：取4mL ABTS工作液，加入40μL样品待测液(即事先配置的体积浓度分别为5％、10％、20％、50％、100％的大米复合发酵原浆水溶液)，准确震荡30s，测定反应6min后734nm波长下的吸光度A样品。

按照下式计算：

ABTS·+清除率/％＝(1-A样品/0.700)×100

2、实验结果

实验结果参见图5。从图中可以看出不同浓度的样品具有不同的 ABTS自由基清除能力，且呈现剂量依赖性，100％的样品清除ABTS自由基的能力在30％左右。说明实施例1制备的大米复合发酵原浆具有一定的抗氧化性能。

五、人体皮肤皱纹及粗糙度测试

1、测试方法

Antera 3D相机可发射多种波长的平行光，并通过收集所测区域内皮肤表面的反射光波长构建出皮肤图像，根据其内置复杂算法，可以准确测量皮肤皱纹、纹理、色素化程度等参数。

选10名符合条件的志愿者参加测试。测试场所无光线直射、无风，室温22～24℃，湿度40％～60％。检测前用洗面奶清洗面部，静息30min，取受试者眼角位置作为测试部位，将浸有样品(实施例1制得的100％大米复合发酵原浆)的面膜分别剪成3×3cm大小，贴在眼角处，15min后取下，轻轻用化妆棉沾干测试部位未干的精华液，并开始计时，在使用前 (本底)、5min、20min、60min时通过Antera 3D面部成像分析。测量在使用前后眼角皮肤毛孔、细纹、皱纹的变化。

2、测试结果

测试结果参见图6-图9。

图6为其中一位志愿者在使用样品过程中眼角皮肤的变化分析图片，其中，从上至下依次为分析毛孔、细纹、皱纹的照片，从左至右依次为使用前(本底)、使用样品后5min、20min、60min时的图片；从图中可以看出该志愿者在使用前的毛孔、细纹、皱纹均较为明显，使用实施例1制得的大米复合发酵原浆后有较为明显的改善。

进一步用软件捕捉数据进行变化趋势分析，得到图8～图9。

图7为志愿者所分析眼角区域中毛孔数的变化趋势，从图中可以看出相同区域本底毛孔数在160个左右，使用后5min、20min以及60min仪器扫描到的毛孔数目显著少于本底毛孔数，表明该样品具有缩小毛孔的潜在作用。

图8为志愿者所分析眼角区域中细纹平均深度的变化趋势，从图中可以看出相同区域本底皮肤细纹平均深度为0.035mm，使用后5min的细纹深度稍有降低，使用后20min和60min的皮肤细纹没有被仪器扫描出来，表示该样品具有抗细纹能力。

图9为志愿者所分析眼角区域中细纹平均深度的变化趋势，从图中可以看出相同区域本底皮肤细纹平均深度为0.06～0.07mm，使用后5min和 20min的皮肤皱纹平均深度均低于本底，使用后60min的皱纹深度有所回升，可能是由于样品用后水分散失的缘故，表示该样品具有抗皱纹能力。

综上，在根据本公开的实施例中，本公开提供了如下技术方案，但不限于此：

方案1、一种具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，包括：将发酵菌接种至由大米、牛蒡根、水飞蓟、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品。

方案2、如方案1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为乳酸菌。

方案3、如方案2所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌具体为选自以下任一种或两种以上：

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp.Bulgaricus)，保藏编号为CGMCC 1.16075；

布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，保藏编号为CGMCC 1.15607；

两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，保藏编号为CGMCC 1.5029。

方案4、如方案1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述大米为大米颗粒或大米粉，所述发酵底物中，所述大米的用量占水重量的 0.5-3％。

方案5、如方案1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述牛蒡根为片状或粉粹状干品，所述发酵底物中，所述牛蒡根占水重量的 0.05-0.2％。

方案6、如方案5所述的制备方法，其特征在于，所述牛蒡根为过20 目筛网的粉碎状干品。

方案7、如方案1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述水飞蓟为瘦果干品，所述发酵底物中，所述水飞蓟的用量占水重量的 0.05-0.15％。

方案8、如方案3-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruechii subsp.Bulgaricus)。

方案9、如方案8所述的制备方法，其特征在于，用于接种至发酵底物的所述德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备流程如下：

活化：将菌种接种至MRS液体培养基的试管中，35～37℃活化20～48h；

纯化：取活化后的液体菌种梯度稀释后，接种于MRS固体培养基平板中，35～37℃静置培养40～48h；

液体培养：取所述平板中的单菌落2～3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35～37℃活化20～48h；

扩大培养：以10％接种量取所述液体培养得到的菌液，接入到 100mLMRS液体培养基中，35～37℃培养10-14h，得到种子液。

方案10、如方案9所述的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g， K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分至1000mL，所述MRS固体培养基为往上述MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉；所述培养基灭菌条件为： 115～121℃灭菌15～20min。

方案11、如方案2-10中任一项所述的制备方法，其特征在于，用于接种至发酵底物的乳酸菌种子液的浓度为10⁷-10¹⁰CFU/mL，所述种子液与发酵底物的体积比为1％～3％。

方案12、如方案1-11中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为40-50℃，时间为6-10h。

方案13、如方案1-12中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的温度是115～121℃，时间是15-20min。

方案14、如方案1-13中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理前，还包括分离处理。

方案15、如方案14所述的制备方法，其特征在于，所述分离处理为离心处理。

方案16、如方案15所述的制备方法，其特征在于，所述离心处理的速度是3500-8000r/min，时间是20-60min。

方案17、如方案1-16中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括干燥处理。

方案18、如方案17所述的制备方法，其特征在于，所述干燥处理采用喷雾干燥或/和真空冷冻干燥。

方案19、一种采用如方案17或18所述的制备方法制备的大米复合发酵干粉。

方案20、一种采用如方案1-16中任一项所述的制备方法制备的大米复合发酵原浆。

方案21、如方案19所述的大米复合发酵干粉在制备化妆品中的应用。

方案22、如方案20所述的大米复合发酵原浆在制备化妆品中的应用。

方案23、如方案21或20所述的应用中，所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。

最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (20)

1.一种具有抗衰老功效的大米复合发酵产品的制备方法，其特征在于，包括：将发酵菌接种至由大米、牛蒡根、水飞蓟、水组成的发酵底物中进行发酵培养，然后进行灭菌处理，得到所述具有抗衰老功效的大米复合发酵产品；

所述发酵菌为乳酸菌，所述乳酸菌具体为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus），保藏编号为CGMCC1.16075。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大米为大米颗粒或大米粉，所述发酵底物中，所述大米的用量占水重量的0.5-3%。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛蒡根为片状或粉碎状干品，所述发酵底物中，所述牛蒡根占水重量的0.05-0.2%。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述牛蒡根为过20目筛网的粉碎状干品。

5.如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述水飞蓟为瘦果干品，所述发酵底物中，所述水飞蓟的用量占水重量的0.05-0.15%。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，用于接种至发酵底物的德氏乳杆菌保加利亚亚种种子液的制备流程如下：

活化：将菌种接种至MRS液体培养基的试管中，35~37℃活化20~48h；

纯化：取活化后的液体菌种梯度稀释后，接种于MRS固体培养基平板中，35~37℃静置培养40~48h；

液体培养：取所述平板中的单菌落2~3环，接种于100mL MRS液体培养基中，35~37℃活化20~48h；

扩大培养：以10%接种量取所述液体培养得到的菌液，接入到100mLMRS液体培养基中，35~37℃培养10-14h，得到种子液。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄·7H₂O 2.0g，醋酸钠·3H₂O 5.0g,柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，吐温80 1.0mL，pH6.2，补足水分至1000mL，所述MRS固体培养基为往上述MRS液体培养基中添加1.5%琼脂粉；所述MRS液体培养基和所述MRS固体培养基的灭菌条件为：115~121℃灭菌15~20min。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，用于接种至发酵底物的乳酸菌种子液的浓度为10⁷-10¹⁰CFU/mL，所述种子液与发酵底物的体积比为1%~3%。

9.如权利要求1-4、6-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为40-50℃，时间为6-10h。

10.如权利要求1-4、6-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理的温度是115~121℃，时间是15-20min。

11.如权利要求1-4、6-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理前，还包括分离处理。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述分离处理为离心处理。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述离心处理的速度是3500-8000r/min，时间是20-60min。

14.如权利要求1-4、6-8、12-13中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理后，还包括干燥处理。

15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述干燥处理采用喷雾干燥或/和真空冷冻干燥。

16.一种采用如权利要求14或15所述的制备方法制备的大米复合发酵干粉。

17.一种采用如权利要求1-4、6-8、12-13中任一项所述的制备方法制备的大米复合发酵原浆。

18.如权利要求16所述的大米复合发酵干粉在制备化妆品中的应用。

19.如权利要求17所述的大米复合发酵原浆在制备化妆品中的应用。

20.如权利要求18或19所述的应用，所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。

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