CN111413264B - 一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法 - Google Patents
一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法，涉及食品安全、体外诊断、环境监测领域，该装置包括箱体和升降机构，箱体的底部设置有若干小孔试管，箱体下方设置有若干与小孔试管相对应的样品池，小孔试管上开有颗粒入口，小孔试管的内部设置有第一电极，外部设置有第二电极，通过多个小孔试管，可以实现多个样品的同时检测；样品池内设置有电解液和待识别颗粒，每个待识别颗粒均包括绝缘微球，绝缘微球表面修饰有特异性识别分子，特异性识别分子用于与相应的待测物特异性结合；待测物包括生物标志物、药物残留物和/或细菌。本发明能够提高检测效率，降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全、体外诊断和环境监测领域，具体涉及一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法。
背景技术
目前，液体颗粒计数器在食品安全、临床诊断、生物学检测等领域都有着一定应用基础，例如在生物学检测中常用的细胞计数板，其包括带有计数网格的样品池，样品池上设置有细胞入口，在使用时，将带有细胞的培养液注入样品池中至细胞分布均匀后进行计数，但是，由于样品池的深度大于细胞尺寸，因此细胞在样品池中会出现分层叠加的现象，导致计数结果不准确。
为提高计数结果的准确性，目前通常采用流式细胞仪计数、微流控芯片计数和图像识别计数，但是，流式细胞仪采用的芯片无法重复使用，导致测量成本较高，而微流控芯片计数和图像识别计数仪器价格昂贵，限制了其使用。
同时，上述方法在使用时，每次均只能对一个样品进行检测，当样品数量较多时，需要耗费大量的时间和精力，检测效率较低。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法，能够提高检测效率，降低检测成本。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，包括相互连接的箱体和升降机构，所述箱体的底部设置有若干小孔试管，所述箱体下方设置有若干与小孔试管相对应的样品池，当所述升降机构带动箱体上下运动时，能够使多个所述小孔试管插入或离开相对应的样品池；
所述小孔试管上开有颗粒入口，所述小孔试管的内部设置有第一电极，外部设置有第二电极，所述第一电极和第二电极通过一信号转换器与信号处理器连接，所述第一电极、第二电极和信号转换器构成电极传感器，所述小孔试管的内部设置有吸液管；
所述箱体的内部设置有分流器，所述分流器的底部设置有若干分流入口，每个分流入口均通过一管道与相应的吸液管连接；所述分流器的顶部设置有第一分流出口和第二分流出口，所述第一分流出口通过清洗管道与清洗液容器连接，所述第二分流出口通过废液管道与废液容器连接；
所述样品池内设置有电解液和待识别颗粒，所述待识别颗粒均包括绝缘微球，所述绝缘微球表面修饰有特异性识别分子，所述特异性识别分子用于与相应的待测物特异性结合；所述待测物包括生物标志物、药物残留物和/或细菌。
进一步的，所述绝缘微球为高分子微球，所述高分子微球包括聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚丁二烯微球和聚异戊二烯微球。
进一步的，所述清洗管道上设置有正压蠕动泵，所述废液管道上设置有负压蠕动泵。
进一步的，所述升降机构包括升降电机和滚珠丝杆，所述升降电机通过滚珠丝杆与箱体连接。
进一步的，所述检测装置还包括控制器，所述信号处理器与所有电极传感器连接，所述控制器与升降电机、正压蠕动泵和负压蠕动泵连接。
进一步的，所述信号处理器包括相互连接的信号放大器和A/D转换器，所有所述电极传感器均通过信号放大器与A/D转换器连接；所述控制器包括微处理器、信号发送端口、存储器和触控屏，所述信号发送端口、存储器和触控屏均与微处理器连接，所述信号发送端口通过云服务器与移动客户端进行信息交互。
一种基于多通道颗粒检测装置进行检测的方法，包括以下步骤：
根据所述待测物，在相应的绝缘微球表面修饰特异性识别分子后与待测物作用后磁分离，对所得免疫复合物进行热裂解，磁分离后使用多通道颗粒检测装置对裂解得到的绝缘微球数量进行测定。
进一步的，当所述待测物为生物标志物时，预先制备纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物，将过量的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物加入相应的生物标志物溶液中进行双抗夹心免疫反应后进行磁分离，对夹心复合物进行热裂解得到磁颗粒和微球的混合物，磁分离后取上清液用多通道颗粒检测装置测量微球的颗粒个数。
进一步的，当所述待测物为药物残留物时，预先制备纳米磁颗粒-药物抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，加入待测药物残留物溶液中，进行竞争免疫反应后进行磁分离，对所得免疫复合物进行热裂解得到磁颗粒和微球的混合物，磁分离后取上清液加入多通道颗粒检测装置并测量微球的颗粒个数。
进一步的，当所述待测物为细菌时，制备微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针，提取细菌DNA并进行目标基因单重PCR扩增，扩增后加入过量的微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针进行DNA杂交反应后磁分离，对所得DNA杂交复合物进行热裂解，磁分离后取上清液加入多通道颗粒检测装置测量微球的颗粒个数。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明中的用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，在使用时，清洗管道将清洗液容器中的电解液通过分流器导入小孔试管中进行清洗，再通过废液管道导出到废液容器，升降机构下降并带动小孔试管运动至插入样品池内，样品池中的待测颗粒通过颗粒入口进入小孔试管时，第一电极和第二电极之间的电阻信号发生改变并通过信号转换器转化成电压脉冲信号发送给信号放大器，信号放大器将脉冲信号放大后发送至A/D转换器转化为数字信号进行输出，完成检测，本发明每次可以同时检测多个样品，操作方法较简单，效率较高，且设备成本较低，能够降低检测成本。
(2)本发明中的用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，微处理器通过触控屏接收操作人员发出的控制指令，控制相应继电器的触点关断和闭合，从而控制升降电机正反转，实现升降电机驱动箱体升降，微处理器发出指令控制对应的继电器，从而控制正压蠕动泵和负压蠕动泵的启动和停止，实现装置自动清洗和废液回收等功能，能够实现全自动操作，降低工作强度，提高工作效率。
(3)本发明中的用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，其信号发送端口为WIFI模块：4G模块或5G模块，在实际使用时，微处理器通过WIFI模块将数据传输到云服务器，便于移动客户终端通过访问云服务器来实现远程查看检测结果的功能。
(4)本发明所使用的PS微球本身为绝缘体，其特异性结合后(与绝缘成分特异性结合)也为绝缘体，将反应后得到的免疫复合物加热裂解，磁分离取上清液中的PS微球，将其分散在电解液中，通过检测电解液中的电压脉冲峰值大小和数量，能够计算出反应后PS微球的粒径和数量，由于反应后裂解得到的PS微球的数量和待测物的含量是相关的，因此通过计算PS微球的数量，可以间接得到待检测物质的含量，这是该方法定量的原理和基础。
因此，整个方法的分析性能很大程度上取决于信号探针PS微球的性质，而PS微球本身具有良好的稳定性、粒径大小可控、价廉、易进行标记等优点，与荧光微球或者免疫标记酶相比，PS微球的稳定性更为优异，不需要避光保存，室温下可以稳定存储6个月，并且合成PS的难度也远远低于荧光微球，因此更加稳定，价格也更低。更为重要的是，合成粒径不同的PS微球的方法和技术目前已经很成熟，因此可以保证该方法的可操作性和实用性。正是由于PS微球具有如此优异的性质，所以整个方法具有稳定性好、成本低等优势。
(5)本发明中电压脉冲峰值和PS微球的粒径成三次方的关系，粒径越大，单个PS微球产生的信号就越强。因此，不同粒径PS微球在颗粒计数器中的灵敏度和脉冲信号是有显著差别的，进而可以实现对不同粒径PS微球的信号读出。基于此，以不同粒径大小的PS微球作为多元信号探针，可以实现对同一样品中不同目标物的同时检测。
在此基础上，我们还可以根据目标物浓度的不同，有针对性地选择粒径不同的PS微球。对于低浓度的目标物，我们选择粒径大的PS微球作为信号探针，实现高灵敏的检测；对于浓度比较高的目标物，我们可以选择小粒径的PS微球作为信号探针，从而实现宽线性范围的可调。
因此，本方法相比于传统的检测方法，不仅灵敏度高，而且线性范围可调，同时仅仅通过改变PS微球的粒径就可以实现对同一样品中浓度高和浓度低的不同目标物进行检测。
(6)本发明在针对复杂的样品中存在复杂的蛋白质、脂肪等组分时，在相同的数量级的条件下，这些蛋白质、脂肪的粒径和PS微球的粒径相比，可以忽略不计，故样品中的蛋白质、脂肪等对信号的影响可以忽略不计，使得本发明方法的信噪比很高，几乎是零信号背景。基于此，本发明方法的抗干扰能力很强，可以实现复杂样品中的痕量目标物的检测。
(7)本发明的分析对象广泛，设备便携性好，能够实现对PS微球的定量检出，且经过处理后能够对抗生素、病毒、细菌、蛋白质等物质进行特异性结合，因此，能够对相应的抗生素、病毒、细菌、蛋白质等物质进行定量检测，其检出限较低，灵敏度高，检测范围较宽，方法简单，耗时较短，仪器设备成本较低，可以实现高通量检测，便于随身携带并实现现场和临床检测。
附图说明
图1为本发明实施例中用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置的结构示意图；
图2为小孔试管与样品池配合的结构示意图；
图3为控制机构的结构框图；
图4为本发明实施例中基于电阻微米孔多通道颗粒检测装置的分析方法同时检测多个样品的示意图；
图5为本发明实施例中不同粒径PS微球偶联HRP后信号读出方式灵敏度比较结果；
图6为本发明实施例中检测降钙素原的反应原理图；
图7为本发明实施例中检测降钙素原时PS颗粒个数随降钙素原浓度变化的示意图；
图8为本发明实施例中检测莱克多巴胺的反应原理图；
图9为本发明实施例中检测莱克多巴胺时颗粒个数随莱克多巴胺浓度变化的示意图；
图10为本发明实施例中检测沙门氏菌的反应原理图；
图11为本发明实施例中检测沙门氏菌时颗粒个数随沙门氏菌浓度变化的示意图。
图中：1-箱体，2-升降机构，3-小孔试管，4-样品池，5-颗粒入口，6-第一电极，7-第二电极，8-吸液管，9-分流器，10-分流入口，11-第一分流出口，12-第二分流出口，13-废液管道，14-废液容器，15-清洗液容器，16-正压蠕动泵，17-负压蠕动泵，18-升降电机，19-滚珠丝杆，20-清洗管道。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细说明。
参见图1所示，本发明实施例提供一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，包括相互连接的箱体1和升降机构2，升降机构2包括升降电机18和滚珠丝杆19，升降电机18通过滚珠丝杆19与箱体1连接。
箱体1的底部设置有若干小孔试管3，箱体1下方设置有若干与小孔试管3相对应的样品池4，当升降机构2带动箱体1上下运动时，能够使小孔试管3插入或离开样品池4。
参见图2所示，小孔试管3上开有颗粒入口5，小孔试管3的内部设置有第一电极6，外部设置有第二电极7，第一电极6和第二电极7通过一信号转换器与信号处理器连接，第一电极6、第二电极7和信号转换器构成电极传感器，小孔试管3的内部设置有吸液管8。
箱体1的内部设置有分流器9，分流器9的底部设置有若干分流入口10，每个分流入口10均通过一管道与相应的吸液管8连接；分流器9的顶部设置有第一分流出口11和第二分流出口12，第一分流出口11通过清洗管道20与清洗液容器15连接，第二分流出口12通过废液管道13与废液容器14连接，清洗管道20上设置有正压蠕动泵16，废液管道13上设置有负压蠕动泵17。
参见图3所示，检测装置还包括控制器和若干继电器，信号处理器与所有电极传感器连接，控制器通过相应继电器与升降电机18、正压蠕动泵16和负压蠕动泵17连接，信号处理器包括相互连接的信号放大器和A/D转换器，所有电极传感器均通过信号放大器与A/D转换器连接；控制器包括微处理器、信号发送端口、存储器和触控屏，信号发送端口、存储器和触控屏均与微处理器连接，微处理器与触控屏之间连接能够实现人机交互，信号发送端口通过云服务器与移动客户端进行信息交互。
其中，信号发送端口为WIFI模块(4G模块或5G模块)，在实际使用时，微处理器通过WIFI模块将数据传输到云服务器，便于移动客户终端通过访问云服务器来实现远程查看检测结果的功能。
微处理器通过触控屏接收操作人员发出的控制指令，控制相对应继电器的触点关断和闭合，从而控制升降电机正反转，实现升降电机驱动箱体1升降，微处理器发出指令控制对应的继电器，从而控制正压蠕动泵、负压蠕动泵的启动和停止，实现装置自动清洗和废液回收等功能，能够实现全自动操作，降低工作强度，提高工作效率。
本发明在使用时，清洗管道20将清洗液容器15中的电解液通过分流器9导入小孔试管3中进行清洗，再通过废液管道13导出到废液容器14，升降机构2下降并带动小孔试管3运动至插入样品池4内，样品池4中的待测颗粒通过颗粒入口5进入小孔试管3时，第一电极6和第二电极7之间的电阻信号发生改变并通过信号转换器转化成电压脉冲信号发送给信号放大器，信号放大器和A/D转换器均选用多通道型号，在使用时，信号放大器可以将多个脉冲信号进行放大后发送至A/D转换器中相应的通道并转化为数字信号进行输出，完成检测，本发明每次可以检测多个样品，操作方法较简单，效率较高，且设备成本较低，能够降低检测成本。
微处理器将来自电极传感器的脉冲峰值信号与所设置的电压阈值进行比较，当电压信号高于所设置的电压阈值时，进行计数；当电压脉冲信号低于所设置的电压阈值时，微处理器不计数，同时，通过对高于电压阈值的脉冲信号宽度进行计算，从而得出颗粒的体积大小。
当颗粒物经过小孔时，两电极之间的电阻增大，电压升高，产生一个电压脉冲。当电源是恒流源时，电压脉冲的峰值正比于小孔电阻的增量，也正比于颗粒体积，在圆球假设下，可换算成颗粒直径，因此，只要准确测出每一个电压脉冲的峰值，即可得出各颗粒的大小，统计出颗粒分布。
计算公式如下：
式中：ρe为电解质溶液电阻率，d为颗粒直径，D为颗粒入口5直径。
本发明以PS微球(聚苯乙烯微球)为信号探针，通过在PS微球表面修饰识别分子(例如抗体分子/DNA探针)，与待检测的物质：生物标志物(如蛋白质)、药物残留物(如兽药)和/或细菌(如食源性致病菌)发生特异性结合。
参见图4所示，PS微球修饰特异性识别分子对应待检测物质，由于PS微球本身为绝缘体，其特异性结合后(与绝缘成分特异性结合)也为绝缘体，将裂解后的PS微球分散在上述电解液中，不同通道对应不同的待测样本，通过检测电解液中的电压脉冲峰值大小和数量，进而计算出反应后裂解得到的PS微球的粒径和数量，从而实现高通量检测。
本发明还提供一种基于上述多通道颗粒检测装置进行检测的方法，包括以下步骤：
根据所述待测物，在相应的绝缘微球表面修饰特异性识别分子后与待测物作用后磁分离，对所得免疫复合物进行热裂解，磁分离取上清液后，使用多通道颗粒检测装置对裂解得到的绝缘微球数量进行测定。
根据待测物不同，具体检测方法也不相同：
当待测物为生物标志物时，预先制备纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物，将过量的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物加入相应的生物标志物溶液中进行双抗夹心免疫反应后进行磁分离，对夹心复合物进行热裂解得到磁颗粒和微球的混合物，磁分离后取上清液，用多通道颗粒检测装置测量上清液中微球的颗粒个数。
当待测物为药物残留物时，预先制备纳米磁颗粒-药物抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，加入待测药物残留物溶液中，进行竞争免疫反应后进行磁分离，对所得免疫复合物进行热裂解得到磁颗粒和微球的混合物，磁分离后取上清液，并用多通道颗粒检测装置测量上清液中微球的颗粒个数。
当待测物为细菌时，制备微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针，提取细菌DNA并进行目标基因单重PCR扩增，扩增后加入过量的微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针进行DNA杂交反应后磁分离，对所得DNA杂交复合物进行热裂解，磁分离后取上清液加入多通道颗粒检测装置测量微球的颗粒个数。
本实施例通过在不同粒径的PS微球表面修饰辣根过氧化物酶(HRP)和抗体(Ab)后，将Ab-PS-HRP其作为一种酶标记的抗体探针，构建基于PS微球的酶催化的免疫分析方法，作为该方法的对比方法。
参见图5所示，在相同条件下，与传统的酶联免疫法相比，本实施例检测方法的响应浓度更低，即具有更高的灵敏度。
下面，通过3个实施例进行详细说明。
实施例1采用“双抗夹心法”检测生物标志物降钙素原(以下简称PCT)
S1、制备MNPs-Ab1(磁纳米颗粒-捕获抗体)偶联物，其中磁纳米颗粒是粒径为180nm
S101、取200μL浓度为10mg/mL、粒径为180nm的COOH-MNPs，用去离子水洗涤两次，再用500μL去离子水重悬，加入30μL浓度为10mg/mL的EDC和15μL浓度为10mg/mL的NHS在室温下活化15～20分钟。
S102、磁分离去除多余的EDC和NHS，用pH＝7.4的500μLPBS重悬，得到MNPs重悬液，用PBS将识别PCT的Ab1稀释至1mg/mL，取100μL1mg/mLAb1加入至MNPs重悬液中，室温下震荡反应2h后，再加入200μL浓度为3％的BSA溶液，室温下震荡反应30min，磁分离后去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到MNPs-Ab1，将MNPs-Ab1置于1mLPBS中重悬保存于4℃备用。
S2、PS微球-检测抗体偶联物(PS-Ab2)的制备，PS微球的粒径为3μm。
S201、取100μL浓度为3μmCOOH-PS，用去离子水洗涤两次，离心分离，再用100μL去离子水重悬，加入50μL浓度为10mg/mL的EDC和25μL浓度为10mg/mL的NHS活化20分钟，离心分离，去除多余的EDC和NHS，用100μLPBS重悬，得到PS重悬液。
S202、用PBS将PCT检测抗体(Ab2)稀释至1mg/mL，取100μL1mg/mLAb2加入至PS重悬液中，室温下震荡反应2h，加入50μL的3％BSA溶液于反应液中，室温下震荡反应30min进行封闭，离心分离后去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到PS-Ab2，将PS-Ab2加入1mLPBS中重悬保存于4℃备用。
S3、“双抗夹心法”检测PCT
S301、使用PBS缓冲液将浓度为1mg/mL的PCT进行梯度稀释至500、100、50、10、5、2、1、0.5ng/mL，将MNPs-Ab1偶联物重悬液稀释2倍，将PS-Ab2偶联物重悬液稀释100倍。
S302、取100μLPCT加入到100μLMNPs-Ab1偶联物重悬液中，37℃下震荡反应1小时，磁分离，去除清液，用PBST洗涤2次，得到MNPs-Ab1-PCT复合物。
S303、取100μLPS-Ab2重悬液分别加至MNPs-Ab1-PCT复合物中，37℃下震荡反应1小时，磁分离后，用PBST洗涤4次，将所得免疫复合物在60～80℃热裂解5分钟左右，磁分离后，收集清液，取100μL清液用多通道颗粒检测装置测定PS颗粒个数。
参见图6所示，为本实施例的检测示意图，根据上述步骤可知，本实施例中待测的PCT先与过量的MNPs-Ab1偶联物反应，使所有PCT均与MNPs-Ab1反应，磁分离后使MNPs-Ab1-PCT与过量的PS-Ab2反应得到MNPs-Ab1-PCT-Ab2-PS复合物，将该复合物热裂解后，经过磁分离，将PS-Ab2分离出来，并加入计数器的电解液中，测定电压脉冲峰值并确定PS颗粒数，根据PS颗粒数与加入PCT浓度之间的对应关系，即可得到PCT浓度与PS颗粒数之间的定量关系，由此可以实现对PCT的定量检测。
参见图7所示，测定的PS颗粒总数与PCT浓度的变化呈现良好的线性关系，当PCT的浓度为0.5～100ng/mL，其线性方程是Y＝617X+1850，R2＝0.998，X为PCT浓度的对数值，且检出限为0.1ng/mL。
实施例2通过竞争免疫分析反应，实现了对猪尿液中兽药残留莱克多巴胺(Rac)的检测
S1、磁纳米颗粒-莱克多巴胺抗体(MNPs-Ab)偶联物的制备，磁纳米颗粒是粒径为1μm的COOH-MNPs
取200μL浓度为10mg/mL、粒径为1μm的COOH-MNPs，用纯水清洗两次，磁分离，再用500μL纯水重悬，加入50μL浓度为10mg/mL的EDC和25μL浓度为10mg/mL的NHS，在室温下活化15～20分钟后磁分离，去除多余的EDC和NHS，用pH＝7.4的500μL的PBS重悬，加入0.2mg莱克多巴胺抗体，室温下震荡反应2h，再加入200μL的3％BSA溶液于反应液中，室温下震荡反应30min进行封闭，磁分离并去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到MNPs-Ab，用1mLPBS重悬保存于4℃备用。
S2、PS微球-完全抗原偶联物的制备，PS微球的粒径为3μm
取300μL浓度为10mg/mL、粒径为3μm的COOH-PS，用纯水清洗两次，离心分离，用2mL纯水重悬，加入50μL浓度为10mg/mL的EDC和25μL浓度为10mg/mL的NHS，在室温下活化20分钟，离心分离，去除多余的EDC和NHS，用pH＝7.4的2mLPBS重悬，加入0.2mgBSA-Rac完全抗原，室温下震荡反应2h，再加入500μL的3％BSA溶液于反应液中，室温下震荡反应30min进行封闭，离心分离后去除清液，用PBST洗涤4-5次，得到PS-BSA-Rac，最后用2mLPBS重悬保存于4℃备用。
S3、一步竞争免疫法检测莱克多巴胺(Rac)
使用PBS缓冲液将Rac标准品稀释至500、200、100、10、1、0.1ng/mL；将MNPs-Ab用PBS稀释1.5倍；将PS-BSA-Rac用PBS稀释50倍，取50μLMNPs-Ab稀释液和100μLPS-BSA-Rac稀释液混合；向所有混合液中分别加入50μL不同浓度的Rac标品溶液，在37℃下震荡反应45min，磁分离后，得到复合物在60～80℃热裂解5分钟左右，磁分离后，取上清液用多通道颗粒检测装置检测颗粒个数。
参见图8所示，Rac、PS-BSA-Rac竞争与MNPs-Ab进行免疫反应，得到免疫复合物。当Rac加入量较多时，免疫复合物形成量较少；当Rac加入量较少时，免疫复合物形成量较多，即免疫复合物的形成量与Rac含量成反比。高温热裂解后磁分离得到PS-BSA-Rac微球，通过测定微球颗粒个数即可通过微球个数和Rac浓度的相关性计算得到Rac的浓度。参见图9所示，测定的颗粒总数与Rac浓度的变化呈现良好的相关性，当Rac的浓度为10～103ng/mL，PS颗粒个数和Rac浓度之间具有良好的线性关系，线性方程是Y＝－351.4X+1572.8，X为Rac浓度的对数值，R2＝0.992。
实施例3通过DNA双链杂交和磁分离检测牛奶中的沙门氏菌
S1、“PS微球-检测探针”偶联物的制备，PS微球的粒径为3μm
取300μL浓度为10mg/mL、粒径为3μmNH2-PS微球，用去离子水洗涤两次后，离心分离，用含NaHCO3浓度为10mM的PBS缓冲液重悬，加入292μg4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)在室温下反应4小时进行活化，活化后PS微球用PBS洗涤3次，备用。
在含有10mMNaOH的PBS缓冲液中加入125mM的二硫苏糖醇，再加入50nM经巯基修饰的寡核苷酸探针，室温下反应2h后加入Sulfo-SMCC活化的PS微球，在4℃下反应12h，用PBS缓冲液洗涤4-5次，得到PS微球-检测探针。
S2、“MNPs-捕获探针”偶联物的制备，磁纳米颗粒的粒径为180nm
取500μL180nmNH2-MNPs，用去离子水洗涤两次后，磁分离，用含10mMNaHCO3的PBS缓冲液重悬，加入472μgSulpho-SMCC在室温下反应4小时进行活化，活化后磁分离用PBS洗涤3次。
在含有10mMNaOH的PBS缓冲液中加入125mM的二硫苏糖醇，再加入50nM经巯基修饰的寡核苷酸探针，室温下反应2h后加经活化的MNPs在4℃下反应12h，再用PBS缓冲液洗涤4-5次，得到MNPs-捕获探针。
S3、沙门氏菌DNA的提取及目标基因单重PCR扩增
将沙门氏菌在37℃肉汤培养基中培养至生长稳定期，取3mL菌液在4℃10000rpm条件下离心5min，取沉淀物用超纯水清洗后，100μL超纯水重悬，在100℃下水浴15分钟后立即用冰水浴冷却，离心后收集上层中包含沙门氏菌DNA的清液，作为PCR反应的模板。
将10×PCR缓冲液5.0μL，5.0μL含沙门氏菌DNA的清液，上、下游引物各1.0μL(10μM)，1.0μLDNA聚合酶(5U/μL)，1.0μLdNTP(10mM)，3.0μLMgCl2和33μL超纯水混合后，在94℃预变性4min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，72℃延伸10min，完成目标基因单重PCR扩增。
其中，沙门氏菌DNA，上、下游引物，DNA聚合酶，dNTP均为现有的结构，目前公开的文献中已详细记载，此处不再赘述。
S4、DNA杂交反应检测沙门氏菌
取10μL的PCR扩增产物、20μL的PS微球-检测探针偶联物和20μL的MNPs-捕获探针偶联物，用杂交缓冲液补至200μL后于50℃下孵育30min，得到杂交复合物，使用杂交缓冲液洗涤杂交复合物5次，磁分离，将杂交复合物在60～80℃热裂解5分钟左右，磁分离后，保留上清液，用多通道颗粒检测装置测定清液中PS微球颗粒个数，即可得沙门氏菌含量。
参见图10所示可知，过量的PS微球-检测探针偶联物先与PCR扩增产物互补配对，然后与过量的MNPs-捕获探针偶联物作用，得到杂交复合物，经过磁分离去除未反应的PS微球-检测探针偶联物，得到过量的MNPs-捕获探针偶联物和杂交复合物，热裂解后，磁分离得到PS微球，通过测定PS微球的数量即可换算得到PCR扩增产物的含量。
参见图11可知，沙门氏菌的浓度与测量的颗粒数呈良好的相关性，沙门氏菌的浓度在103～107CFU/mL范围内，沙门氏菌的浓度与颗粒数呈直线关系，相关的线性方程是Y＝170.2X+590.6，X为沙门氏菌浓度的对数值，R2＝0.996，说明本实施例的方法不仅具有较高的灵敏度，且具有较宽的线性范围。
本发明实施例中使用的试剂和材料、溶液、仪器如下：
试剂和材料：
牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，USA)，1000nm羧基磁性纳米颗粒(10mg/mL)(OceanNanoTech，USA)。辣根过氧化物酶(HRP)和降钙素原(PCT)来自Sigma-Aldrich公司。粒径为1、3、10μm的羧基聚苯乙烯(PS)微球，3μm氨基PS微球(10mg/mL)来自BangsLaboratories,Inc。180nm羧基和氨基磁性纳米颗粒(10mg/mL)购自上海奥润微纳新材料科技有限公司。莱克多巴胺完全抗原、鼠抗莱克多巴胺抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG来自碧云天生物技术有限公司。吐温-20(Amresco，USA)，0.9％氯化钠生理盐水来自湖北宏远达生物科技有限公司。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活泼酯(sulfo-NHS)购自美国Sigma公司。沙门氏菌检测探针和捕获探针由武汉擎科生物有限公司设计并合成。
溶液配制：
磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00gNaCl，0.20gKCl，0.20gKH2PO4和2.90gNa2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀。
封闭液：称取1.2gBSA于40mLPBS中，摇匀，配成3％BSA封闭液。
洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液。
仪器：
磁分离架购自OceanNanoTech(USA)。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
Claims (10)
1.一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，包括相互连接的箱体(1)和升降机构(2)，其特征在于：所述箱体(1)的底部设置有若干小孔试管(3)，所述箱体(1)下方设置有若干与小孔试管(3)相对应的样品池(4)，当所述升降机构(2)带动箱体(1)上下运动时，能够使多个所述小孔试管(3)插入或离开相对应的样品池(4)；
所述小孔试管(3)上开有颗粒入口(5)，所述小孔试管(3)的内部设置有第一电极(6)，外部设置有第二电极(7)，所述第一电极(6)和第二电极(7)通过一信号转换器与信号处理器连接，所述第一电极(6)、第二电极(7)和信号转换器构成电极传感器，所述小孔试管(3)的内部设置有吸液管(8)；
所述箱体(1)的内部设置有分流器(9)，所述分流器(9)的底部设置有若干分流入口(10)，每个分流入口(10)均通过一管道与相应的吸液管(8)连接；所述分流器(9)的顶部设置有第一分流出口(11)和第二分流出口(12)，所述第一分流出口(11)通过清洗管道(20)与清洗液容器(15)连接，所述第二分流出口(12)通过废液管道(13)与废液容器(14)连接；
所述样品池(4)内设置有电解液和待识别颗粒，所述待识别颗粒均包括绝缘微球，所述绝缘微球表面修饰有特异性识别分子，所述特异性识别分子用于与相应的待测物特异性结合；所述待测物包括生物标志物、药物残留物和/或细菌。
2.如权利要求1所述的一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，其特征在于：所述绝缘微球选用高分子微球，所述高分子微球包括聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚丁二烯微球和聚异戊二烯微球。
3.如权利要求1所述的一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，其特征在于：所述清洗管道(20)上设置有正压蠕动泵(16)，所述废液管道(13)上设置有负压蠕动泵(17)。
4.如权利要求2所述的一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，其特征在于：所述升降机构(2)包括升降电机(18)和滚珠丝杆(19)，所述升降电机(18)通过滚珠丝杆(19)与箱体(1)连接。
5.如权利要求4所述的一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，其特征在于：所述检测装置还包括控制器，所述信号处理器与所有电极传感器连接，所述控制器与升降电机(18)、正压蠕动泵(16)和负压蠕动泵(17)连接。
6.如权利要求5所述的一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置，其特征在于：所述信号处理器包括相互连接的信号放大器和A/D转换器，所有所述电极传感器均通过信号放大器与A/D转换器连接；所述控制器包括微处理器、信号发送端口、存储器和触控屏，所述信号发送端口、存储器和触控屏均与微处理器连接，所述信号发送端口通过云服务器与移动客户端进行信息交互。
7.一种基于权利要求1至6中任一项所述多通道颗粒检测装置进行检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
根据所述待测物，在相应的绝缘微球表面修饰特异性识别分子后与待测物作用后磁分离，对所得免疫复合物进行热裂解，磁分离后使用多通道颗粒检测装置对裂解得到的绝缘微球数量进行测定。
8.如权利要求7所述的一种基于多通道颗粒检测装置进行检测的方法，其特征在于：当所述待测物为生物标志物时，预先制备纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物，将过量的纳米磁颗粒-捕获抗体偶联物、微球-检测抗体偶联物加入相应的生物标志物溶液中进行双抗夹心免疫反应后进行磁分离，对夹心复合物进行热裂解得到磁颗粒和微球的混合物，磁分离后取上清液用多通道颗粒检测装置测量微球的颗粒个数。
9.如权利要求7所述的一种基于多通道颗粒检测装置进行检测的方法，其特征在于：当所述待测物为药物残留物时，预先制备纳米磁颗粒-药物抗体偶联物、微球-完全抗原偶联物，加入待测药物残留物溶液中，进行竞争免疫反应后进行磁分离，对所得免疫复合物进行热裂解得到磁颗粒和微球的混合物，磁分离后取上清液加入多通道颗粒检测装置并测量微球的颗粒个数。
10.如权利要求7所述的一种基于多通道颗粒检测装置进行检测的方法，其特征在于：当所述待测物为细菌时，制备微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针，提取细菌DNA并进行目标基因单重PCR扩增，扩增后加入过量的微球-检测探针和纳米磁颗粒-捕获探针进行DNA杂交反应后磁分离，对所得DNA杂交复合物进行热裂解，磁分离后取上清液加入多通道颗粒检测装置测量微球的颗粒个数。
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