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CN111372612A - 包含活性细胞的方法、组合物和可植入元件 - Google Patents

包含活性细胞的方法、组合物和可植入元件 Download PDF

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CN111372612A CN201880063187.6A CN201880063187A CN111372612A CN 111372612 A CN111372612 A CN 111372612A CN 201880063187 A CN201880063187 A CN 201880063187A CN 111372612 A CN111372612 A CN 111372612A
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G.卡莫纳
F.C.冈萨雷斯
R.海德布雷希特
R.J.米勒
M.A.奥伯里
D.佩里特
D.M.史密斯
O.韦塞
P.K.沃顿
J.A.休厄尔
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Sigilon Therapeutics Inc
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Sigilon Therapeutics Inc
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Abstract

本文描述了包含活性细胞(例如，工程化活性细胞，例如，工程化RPE细胞)或其衍生物的细胞组合物，以及包含活性细胞的组合物、药物产品和可植入元件，以及制备和使用这些组合物、药物产品和可植入元件的方法。这些细胞和组合物可以表达可用于治疗本文所述的疾病、病症或病状的治疗剂。

Description

包含活性细胞的方法、组合物和可植入元件
优先权要求
本申请要求2017年9月27日提交的美国临时申请号62/563,877、2018年4月4日提交的美国申请号62/652,881和2018年4月4日提交的美国申请号62/652,882的优先权。将前述申请中的每一个的披露内容通过援引以其整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且特此通过援引以其整体并入。于2018年9月26日创建的所述ASCII副本命名为S2225-7015WO_SL.txt且大小为205,145字节。
背景技术
植入的细胞、组织和装置的功能取决于许多因素，包括提供产品的能力和受者的生物免疫反应途径(Anderson等人,Semin Immunol[免疫学研讨会](2008)20:86–100；Langer,Adv Mater[先进材料](2009)21:3235–3236)。细胞的选择和免疫反应的调节可对植入的细胞、组织和装置的保真度和功能产生有益的影响。
发明内容
本文描述了包含活性细胞(例如，工程化活性细胞，例如，工程化视网膜色素上皮(RPE)细胞)或其细胞衍生物的细胞组合物，以及包含活性细胞的组合物、药物产品和可植入元件，以及制备和使用这些组合物、药物产品和可植入元件的方法。在一些实施例中，本文所述的活性细胞、组合物和可植入元件产生治疗剂(诸如替代药剂)，该治疗剂可用于例如治疗受试者的疾病、病症或病状，例如凝血障碍或溶酶体贮积病。在一些实施例中，包含活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的组合物和可植入元件能够调节受试者的免疫反应或免疫反应的作用。
一方面，本披露的特征在于一种可植入元件，该可植入元件包含产生(例如，或能够产生)治疗剂的工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。治疗剂可以是生物物质，诸如核酸(例如，核苷酸、DNA或RNA)、多肽、脂质、糖(例如，单糖、二糖、寡糖或多糖)或小分子。在一些实施例中，治疗剂是多肽并且工程化活性细胞包含与编码该多肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中该启动子基本上由与SEQ ID NO:23相同或基本上相同的核苷酸序列组成。在一些实施例中，该治疗剂是例如可用于治疗受试者的凝血障碍或溶酶体贮积病的替代疗法或替代蛋白。
在一些实施例中，可植入元件包含单个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，可植入元件包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，例如作为群集提供或置于微载体上。在一些实施例中，工程化活性细胞或活性细胞(例如工程化RPE细胞或RPE细胞)例如当植入受试者体内时或通过本领域公认的参考方法进行评价时，产生或释放治疗剂(例如，多肽)至少5天，本领域公认的参考方法例如为：针对核酸的聚合酶链反应或原位杂交；针对脂质、糖和小分子的质谱分析；针对经过荧光或发光标签修饰的药剂的显微镜检查和其他成像技术，以及针对多肽的ELISA或蛋白质印迹法(Westernblotting)。在一些实施例中，可植入元件包含包封部件(例如，在工程化活性细胞上或周围原位形成的，或在与工程化活性细胞组合之前预先形成的)。在一些实施例中，可植入元件例如用如本文所述的式(I)的化合物进行化学改性。
另一方面，本披露的特征在于一种治疗受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件。在一些实施例中，可植入元件包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，工程化活性细胞(例如，工程化活性细胞)是人细胞(例如，人RPE细胞)。在一些实施例中，可植入元件包含产生(例如，或能够产生)治疗剂诸如核酸(例如，核苷酸、DNA或RNA)、多肽、脂质、糖(例如，单糖、二糖、寡糖或多糖)或小分子的工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，该治疗剂是例如可用于治疗受试者的凝血障碍或溶酶体贮积病的替代疗法或替代蛋白。在一些实施例中，将可植入元件配制成用于植入或注射到受试者体内。在一些实施例中，将可植入元件施用、植入或提供到除中枢神经系统、脑、脊柱、眼睛或视网膜以外的部位。在一些实施例中，将可植入元件施用或植入或注射到受试者的腹膜腔(例如，小囊)、网膜或皮下脂肪中。
另一方面，本披露的特征在于一种制备或制造包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的方法。在一些实施例中，该方法包括提供工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)并将工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)置于例如本文所述的封闭部件中。在一些实施例中，可植入元件包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，可植入元件可植入元件包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，例如作为群集提供或置于微载体上。在一些实施例中，封闭部件是在一个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)、多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)上或周围原位形成的。在一些实施例中，封闭部件是在与封闭的一个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)、多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)组合之前预先形成的。在一些实施例中，封闭部件包含柔性聚合物(例如，PLA、PLG、PEG、CMC或多糖，例如藻酸盐)。在一些实施例中，封闭部件包括非柔性聚合物或金属外壳。在一些实施例中，封闭部件例如用如本文所述的式(I)的化合物进行化学改性。
另一方面，本披露的特征在于一种评价包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的方法。在一些实施例中，该方法包括提供工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)并评价包封的RPE细胞的结构或功能参数。在一些实施例中，该方法包括针对以下一项或多项评价该工程化活性细胞或多个工程化活性细胞：a)活力；b)治疗剂(例如，工程化RNA或多肽)的产生；c)营养物或氧气的摄取；或d)废产物的产生。在一些实施例中，在形成可植入元件或将可植入元件施用于受试者后至少1、5、10、20、30或60天进行评价。
另一方面，本披露的特征在于一种监测包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的方法。在一些实施例中，该方法包括例如通过对受试者或来自受试者的样品进行测试而获得参数水平；并且例如通过对受试者或来自受试者的样品进行测试，将获得的值与参考值进行比较。在一些实施例中，该参数包括：a)细胞活力；b)治疗剂(例如，工程化RNA或多肽)的产生水平；c)营养物或氧气的摄取；或d)废产物的产生。在一些实施例中，在形成可植入元件或将可植入元件施用于受试者后至少1、5、10、20、30或60天进行评价。
另一方面，本披露的特征在于多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，该多个具有预选的形状因数或本文所述的形状因数，例如工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的群集。在一些实施例中，工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的群集包含至少约5、10、25、50、75、100、200、250、300、400、500或更多个工程化活性细胞。在一些实施例中，该群集是球面或球形的。在一些实施例中，该群集不是单层。在一些实施例中，该群集的密度为约500个细胞/cm2或更高。在一些实施例中，多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)置于微载体(例如，珠粒或基质)上。
另一方面，本披露的特征在于包括多个腔室的基板，其中每个腔室均包括工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，每个腔室包括多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一些实施例中，该多个包括工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的群集和/或置于微载体(例如，珠粒或基质)上。
另一方面，本披露的特征在于微载体，例如珠粒或基质，其上设置有工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。
另一方面，本披露了的特征在于工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的制剂，其中该制剂包含至少约10,000个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，例如至少约15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000个或更多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。
本文阐述了本披露的一个或多个实施例的细节。根据具体实施方式、附图、实例和权利要求，本披露的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1是描绘在各个时间点与未包封的活性细胞相比，从包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的包封的可植入元件释放的示例性多肽的量的图表。
图2A-2B是包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的示例性的包封的可植入元件的显微镜图像。如图所示，包含表达因子VIII-BDD的活性细胞的可植入元件在整个实验持续期间显示出高活力。
图3示出了由示例性工程化RPE细胞编码的人因子VII-BDD蛋白的氨基酸序列(SEQID NO:1)，其信号序列带有下划线。
图4示出了人野生型因子IX蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图5A-5H示出了对于使用单细胞悬浮液制备的可植入元件(例如，水凝胶胶囊)而言，细胞结构对细胞包装密度、细胞活力和胶囊质量的影响。图5A-5F是由1000、1500、2000、3000、4000或5000万个细胞/ml藻酸盐溶液(M/ml)的单细胞悬浮液制备的包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的示例性的包封的可植入元件的显微镜图像，通过活/死细胞染色示出了细胞活力。图5G展示了单细胞浓度对可植入元件的整体质量的影响，并且图5H描绘了可植入元件内所含细胞的数量与其整体质量之间的关系。
图6A-6G示出了对于使用球状体细胞胶囊悬浮液制备的可植入元件(例如，水凝胶胶囊)而言，细胞结构对细胞包装密度、细胞活力和胶囊质量的影响。图6A-6E是由3000、4000、5000、7500万和1亿个细胞/ml藻酸盐溶液(M/ml)的球状体悬浮液制备的包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的示例性的包封的可植入元件的显微镜图像，通过活/死细胞染色示出了细胞活力。图6F展示了球状体浓度对可植入元件的整体质量的影响，并且图6G描绘了可植入元件内所含细胞的数量与其整体质量之间的关系。
图7A-7H示出了对于使用附着于
Figure BDA0002428472100000051
微载体的细胞悬浮液制备的可植入元件(例如，水凝胶胶囊)而言，细胞结构对细胞包装密度、细胞活力和胶囊质量的影响。图7A-7F是示例性的包封的可植入元件的显微镜图像，这些可植入元件包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，是由体积比为1:8、1:4、1:2、1:1.5、1:1和1:0.5(粒状微载体的毫升数:藻酸盐溶液的毫升数)的
Figure BDA0002428472100000052
微载体细胞悬浮液制备的，通过活/死细胞染色示出了细胞活力。图7G展示了
Figure BDA0002428472100000053
微载体浓度对可植入元件的整体质量的影响，并且图7H描绘了可植入元件内所含细胞的数量与其整体质量之间的关系。
图8A-8H示出了对于使用附着于
Figure BDA0002428472100000061
微载体的细胞悬浮液制备的可植入元件(例如，水凝胶胶囊)而言，细胞结构对细胞包装密度、细胞活力和胶囊质量的影响。图8A-8F是示例性的包封的可植入元件的显微镜图像，这些可植入元件包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，是由体积比为1:14、1:10、1:8、1:6、1:4和1:2(粒状微载体的mL:藻酸盐溶液的mL)的
Figure BDA0002428472100000062
微载体细胞悬浮液制备的，通过活/死细胞染色示出了细胞活力。图8G展示了
Figure BDA0002428472100000063
微载体浓度对可植入元件的整体质量的影响，并且图8H描绘了可植入元件内所含细胞的数量与其整体质量之间的关系。
图9示出了在工程化RPE细胞或HS27细胞中由不同外源启动子(CMV、CAP或Ubc)驱动的人因子IX多肽(F9：hFIX，野生型；F9p：hFIX-Padua)的体外表达水平。
图10是可用于产生工程化RPE细胞的PiggyBac转座子表达载体的示意图。
图11示出了相对于用天然存在的人FVIII核苷酸序列(天然的)的BDD型式工程改造的细胞对图1所示的因子VIII-BDD蛋白的表达水平，用密码子优化的编码序列(CO2、CO3或CO6)工程改造的RPE细胞对相同因子VIII-BDD蛋白的体外表达水平。
图12示出了相对于用天然存在的人FVIII核苷酸序列(天然的)的BDD型式工程改造的RPE细胞对图1所示的因子VIII-BDD蛋白的表达水平，用或未用密码子优化的FVIII-BDD编码序列工程改造的RPE细胞对不同因子VIII-BDD变体蛋白的体外表达水平。
图13示出了相对于用未优化的编码序列(天然的)工程改造的RPE细胞对FIX-Padua的表达，用密码子优化的FIX-Padua编码序列(CO2、CO3或CO5)工程改造的RPE细胞对人因子IX蛋白(FIX-Padua)的体外表达水平。
图14示出了用包含未优化的FIX编码序列(天然的)的转录单位或用除了包含密码子优化的FIX-Padua编码序列以外相同的转录单位的一个或两个拷贝工程改造的RPE细胞对人FIX-Padua的体外表达水平。
具体实施方式
本披露的特征在于包含活性细胞例如视网膜色素上皮(RPE)细胞(例如，工程化RPE细胞)或其细胞衍生物及其组合物的细胞治疗组合物，和包含其的可植入元件。在一些实施例中，活性细胞、组合物和可植入元件可用于预防或治疗疾病、病症或病状。本文所述的活性细胞表现出有利的性质，诸如在某些条件下维持细胞密度(即，接触抑制)，相邻细胞的吞噬作用，以及在可变条件下生活和生长的能力。在一些实施例中，将活性细胞工程改造为产生治疗剂(例如，治疗性多肽)，并用材料包封和/或存在于适于施用给受试者的可植入元件内。
定义
以下术语旨在具有下面与其一起呈现的含义，并且可用于理解本披露的描述和预期范围。
如本文所用的术语“获取(acquire)”或“获取(acquiring)”是指通过“直接获取”或“间接获取”值或物理实体来获得值(例如，数值)或图像或物理实体(例如，样品)的过程。“直接获取”意指执行一个过程(例如，执行分析方法或方案)来获得值或物理实体。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收值或物理实体。直接获取值或物理实体包括执行包括实物的物理变化的过程或使用机器或装置。直接获取值的实例包括从人类受试者获得样品。直接获取值包括执行使用机器或装置，例如荧光显微镜获取荧光显微镜数据的过程。
如本文所用，“活性细胞”是指具有以下特征中的一个或多个的细胞：a)包含视网膜色素上皮(RPE)细胞或由其衍生的细胞，包括由RPE细胞的原代细胞培养衍生的细胞，从天然存在的RPE细胞(例如，来自于人或其他哺乳动物)直接分离的细胞(无需长期培养，例如自分离后少于5或10代或轮的细胞分裂)，由转化的、永生的或长期的(例如，超过5或10代或轮的细胞分裂)RPE细胞培养衍生的细胞；b)已经从低分化细胞获得的细胞，例如发育、编程或重新编程(例如在体外)为RPE细胞的细胞，或除了任何基因工程外基本上与以下的一种或多种细胞相似的细胞：自然存的RPE细胞或来自RPE细胞的原代或长期培养的细胞(例如，此类活性细胞可以衍生自IPS细胞)；或c)具有以下的一种或多种特性的细胞：i)表达生物标志物CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的一种或多种；ii)不表达生物标志物CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的一种或多种；iii)天然存在于视网膜中并在布鲁赫氏膜(Bruch’s membrane)中的脉络膜血管上方形成单层；或iv)负责视网膜中的上皮转运、光吸收、分泌和免疫调节。在一个实施例中，对本文所述的活性细胞进行工程改造，例如，可以对从低分化细胞获得的活性细胞进行工程改造。在其他实施例中，活性细胞未经工程改造。
在一些实施例中，活性细胞，包括工程化活性细胞，不是胰岛细胞。如本文所定义的胰岛细胞是这样的细胞，包含任何天然存在的或任何合成产生的或经修饰的细胞，该细胞旨在部分或全部重现、模拟或以其他方式表达朗格罕氏胰岛细胞的部分或全部功能。活性细胞，包括工程化活性细胞，不能产生例如有效治疗糖尿病或可以用胰岛素治疗的另一种疾病或病状的量的胰岛素(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)。在一些实施例中，活性细胞不能以葡萄糖反应性方式产生胰岛素。活性细胞，包括工程化活性细胞，不是工程改造为分化的产生胰岛素的胰腺β细胞的诱导性多能细胞。
如本文所用，“施用(administer)”、“施用(administering)”或“施用(administration)”是指植入、吸收、摄取、注射或以其他方式引入实体(例如，活性细胞(例如工程化RPE细胞)，或其组合物，或包含活性细胞的可植入元件)，或将实体提供给受试者。
如本文所用，“细胞”是指工程化细胞，例如工程化活性细胞，或未工程化的细胞，例如非工程化活性细胞。
如本文所用，“保守性修饰的变体”或“保守性取代”是指参考肽或多肽的变体，该变体除了在其氨基酸序列中具有一个或多个保守性氨基酸取代以外与参考分子相同。在实施例中，保守性修饰的变体由与参考氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成。保守性氨基酸取代是指用具有相似特征(例如，电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的氨基酸取代氨基酸，并且对所得的经取代的肽或多肽的生物活性的影响最小。功能相似的氨基酸的保守性取代表是本领域公知的，并且按功能特征分组的示例性取代在下面的氨基酸表1中列出。
氨基酸表1.示例性的保守性氨基酸取代基团。
Figure BDA0002428472100000091
Figure BDA0002428472100000101
如在整个说明书和权利要求书中所使用的，“基本上由......组成(Consistsessentially of)”，以及诸如“基本上由......组成(consist essentially of)”或“基本上由......组成(consisting essentially of)”的变体表示包括任何列举的要素或要素组，以及可任选地包括具有与所列举的元素相似或不同的性质的其他要素(其不会实质性改变特定分子、组合物、装置或方法的基本性质或新颖性质)。作为非限制性实例，基本上由所列举的氨基酸序列组成的治疗性蛋白质还可包括一个或多个氨基酸，包括在所列举的氨基酸序列的N端、C端或内部添加一个或多个氨基酸残基，这些氨基酸分别不会实质性影响治疗性蛋白质的相关生物活性。作为另一个非限制性实例，基本上由所列举的核苷酸序列组成的启动子可以含有一个或多个不会实质性改变该启动子的相关生物活性的其他核苷酸，相关生物活性例如可操作地连接的编码序列的转录量，例如通过量化相应的RNA或蛋白质水平而测定的。
如本文所用的“有效量”是指足以引发生物反应，例如足以治疗疾病、病症或病状的活性细胞(例如工程化RPE细胞)的组合物或由活性细胞(例如工程化RPE细胞)产生的药剂(例如治疗剂)的量。如本领域普通技术人员将理解的，有效量可以根据诸如所需生物学终点，治疗剂、组合物或可植入元件的药代动力学，所治疗的病状，施用模式，以及受试者的年龄和健康状况等因素而改变。有效量涵盖治疗性和预防性治疗。例如，为了治疗纤维化病状，有效量的化合物可以减少纤维化或阻止纤维化组织的生长或扩散。
如本文所用的“内源核酸”是天然存在于受试者细胞中的核酸。
如本文所用的，“内源多肽”是天然存在于受试者细胞中的多肽。
如本文所用，“工程化细胞”是具有非天然存在的改变的细胞(例如活性细胞)，并且典型地包含在处于相似条件下的未经工程改造的其他相似细胞中不存在(或以不同水平存在)的核酸序列(例如，DNA或RNA)或多肽(外源核酸序列)。在一个实施例中，工程化细胞包含外源核酸(例如，载体或改变的染色体序列)。在一个实施例中，工程化细胞包含外源多肽。在一个实施例中，工程化细胞包含外源核酸序列，例如未经工程改造的相似细胞中不存在的序列，例如DNA或RNA。在一个实施例中，外源核酸序列是染色体的，例如，外源核酸序列是置于内源染色体序列中的外源序列。在一个实施例中，外源核酸序列是染色体或染色体外的，例如非整合的载体。在一个实施例中，外源核酸序列包含RNA序列，例如mRNA。在一个实施例中，外源核酸序列包含染色体或染色体外的外源核酸序列，其包含表达为RNA例如mRNA或调节性RNA的序列。在一个实施例中，该外源核酸序列包含染色体或染色体外的核酸序列，其包含编码多肽或表达为多肽的序列。在一个实施例中，外源核酸序列包含第一染色体或染色体外的外源核酸序列，其调节第二核酸序列的构象或表达，其中第二氨基酸序列可以是外源的或内源的。例如，工程化细胞可包含控制内源序列表达的外源核酸。在一个实施例中，工程化细胞包含以与未经工程改造的相似细胞中发现的水平不同的水平或分布存在的多肽。在一个实施例中，工程化细胞包含经工程改造以提供RNA或多肽的RPE细胞。例如，工程化细胞(例如，RPE细胞)可以包含外源核酸序列，该外源核酸序列包含染色体或染色体外的外源核酸序列，该外源核酸序列包含表达为RNA例如mRNA或调控RNA的序列。在一个实施例中，工程化细胞(例如，RPE细胞)包含外源核酸序列，该外源核酸序列包含染色体或染色体外的核酸序列，其包含编码多肽或表达为多肽的序列。在一个实施例中，多肽由密码子优化序列编码，以实现该多肽比天然存在的编码序列更高的表达。密码子优化序列可以使用可商购的算法生成，例如GeneOptimzer(赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific))、OptimumGeneTM(美国新泽西州皮斯卡塔韦的金斯瑞(GenScript,Piscataway,NJ USA))、
Figure BDA0002428472100000111
(美国加利福利亚州纽瓦克市的阿图姆公司(ATUM,Newark,CA USA))或Java密码子适配工具(JCat,www.jcat.de,Grote,A.等人,NucleicAcids Research[核酸研究],第33卷,发行增刊_2,第W526-W531页(2005)。在一个实施例中，工程化细胞(例如，RPE细胞)包含调节内源序列的构象或表达的外源核酸序列。
如本文所用，“外源核酸”是非天然存在于受试者细胞中的核酸。
如本文所用，“外源多肽”是非天然存在于受试者细胞中的多肽。
如本文所用，除非另有说明，否则“因子VII蛋白”或“FVII蛋白”意指包含天然存在的因子VII蛋白或其具有如通过本领域公认的测定法而测定的FVII生物活性(例如促进血液凝固)的变体的氨基酸序列的多肽。天然存在的FVII作为单链酶原、酶原样双链多肽和完全活化的双链形式(FVIIa)存在。在一些实施例中，对FVII的提及包括其单链和双链形式，包括酶原样形式和FVIIa。可以由本文所述的活性细胞(例如，工程化RPE细胞)表达的FVII蛋白包括野生型灵长类(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体。在一些实施例中，变体FVII蛋白能够被激活成完全活化的双链形式(因子VIIa)，该形式具有野生型因子VIIa的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的活性。FVII和FVIIa的变体是已知的，例如，marzeptacogalfa(活化的)(MarzAA)和欧洲专利号1373493、美国专利号7771996、美国专利号9476037和美国公开的申请号US20080058255中描述的变体。
除非另有说明，否则因子VII生物活性可通过本领域公认的测定法定量。例如，可以通过以下方式来定量生物流体(例如血浆)样品中的FVII生物活性：(i)测量在包含嵌入脂质膜中的TF的系统中产生的因子Xa和因子X的量(Persson等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272:19919-19924,1997)；(ii)测量水性系统中的X因子水解；(iii)使用基于表面等离子体共振的仪器测量其与TF的物理结合(Persson,FEBS Letts.[欧洲生化学会联合会快报]413:359-363,1997)；或(iv)测量合成底物的水解；和/或(v)在不依赖TF的体外系统中测量凝血酶的产生。在一个实施例中，通过可商购的显色测定法(BIOPHEN FVII,法国瓦兹河畔纳维尔HBM公司(HYPHEN BioMed Neuville sur Oise,France))评估FVII活性，其中将含有FVII的生物样品与促凝血酶原激酶钙、因子X和SXa-11(对因子Xa有特异性的显色底物)混合。
如本文所用，除非另有说明，否则“因子VIII蛋白”或“FVIII蛋白”是指包含天然存在的因子VIII多肽或其具有如通过本领域公认的测定法而测定的FVIII生物活性(例如凝结活性)的变体的氨基酸序列的多肽。可以由本文所述的活性细胞(例如，工程化RPE细胞)表达的FVIII蛋白包括野生型灵长类(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体、B结构域缺失(BDD)变体、单链变体以及前述任何野生型或变体与半衰期延长多肽的融合体。在一个实施例中，将活性细胞工程改造为编码B结构域全部或部分缺失的前体因子VIII多肽(例如，具有信号序列)。在一个实施例中，将活性细胞工程改造为编码含有变体FVIII蛋白的单链因子VIII多肽，该变体FVIII蛋白优选具有相应野生型VIII的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的凝结活性。用于测量FVIII蛋白的凝结活性的测定法包括一阶段或两阶段凝结测定(Rizza等人,1982,Coagulation assay of FVIII:C and FIXa[FVIII:C和FIXa的凝结测定],Bloom编辑,The Hemophelias[血友病].纽约丘吉尔·利文斯顿(NY ChurchillLivingston)1992)或显色底物FVIII:C测定(RRosen,S.1984.Scand J Haematol[斯堪的纳维亚血液学杂志]33:139-145,增刊)。
已知许多FVIII-BDD变体，包括例如在以下任何美国专利中披露的B结构域全部或部分缺失的变体：4,868,112(例如，第2列第2行到第19列第21行和表2)；5,112,950(例如，第2列第55-68行、图2和实例1)；5,171,844(例如，第4列第1 22行至第5列第36行)；5,543,502(例如，第2列第17-46行)；5,595,886；5,610,278；5,789,203(例如，第2列第26-51行和实例5-8)；5,972,885(例如，第1列第25行至第2列第40行)；6,048,720(例如，第6列第1-22行和实例1)；6,060,447；6,228,620；6,316,226(例如，第4列第4行至第5列第28行以及实例1-5)；6,346,513；6,458,563(例如，第4列第25-53行)和7,041,635(例如，第2列第1行至第3列第19行，第3列第40行至第4列第67行，第7列第43行至第8列第26行，以及第11列第5行至第13列第39行)。
在一些实施例中，由工程化RPE细胞(例如，ARPE-19细胞)表达的FVIII-BDD蛋白在B结构域中具有以下的一个或多个氨基酸缺失：(i)除了将初级翻译产物胞内加工成两条多肽链所必需的氨基末端B结构域序列以外的大部分B结构域(WO 91/09122)；(ii)以下氨基酸的缺失：氨基酸747-1638(Hoeben R.C.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]265(13):7318-7323(1990))；氨基酸771-1666或氨基酸868-1562(Meulien P.等人,Protein Eng.[蛋白质工程]2(4):301-6(1988)；氨基酸982-1562或760-1639(Toole等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]83:5939-5942(1986))；氨基酸797-1562(Eaton等人,Biochemistry[生物化学]25:8343-8347(1986))；741-1646(Kaufman,WO87/04187))、747-1560(Sarver等人,DNA 6:553-564(1987))；氨基酸741-1648(Pasek,WO88/00831))、氨基酸816-1598或741-1689(Lagner(贝林研究所通报(Behring Inst.Mitt.)(1988)编号82:16-25,EP 295597)；包含弗林蛋白酶识别序列中的一个或多个残基，例如氨基酸1643-1648处的LKRHQR的缺失，包括美国专利号9,956,269第10列第65行到第11列第36行中列举的任何特定缺失。
在其他实施例中，FVIII-BDD蛋白保留以下任何B结构域氨基酸或氨基酸序列：(i)B结构域中的一个或多个N-连接的糖基化位点，例如残基757、784、828、900、963或任选地943，前226个氨基酸或前163个氨基酸(Miao,H.Z.等人,Blood 103(a):3412-3419(2004),Kasuda,A.等人,J.Thromb.Haemost.[血栓形成和止血杂志]6:1352-1359(2008)，和Pipe,S.W.等人,J.Thromb.Haemost.[血栓形成和止血杂志]9:2235-2242(2011)。
在一些实施例中，FVIII-BDD蛋白是通过取代弗林蛋白酶识别序列中的一个或多个氨基酸(氨基酸1643-1648处的LKRHQR)产生的单链变体，该取代阻止这个位点处的蛋白水解切割，包括美国专利号10,023,628、9,394,353和9,670,267中描述的R1645和/或R1648位置的任何取代。
在一些实施例中，任何上述FVIII-BDD蛋白还可包含以下的一种或多种变异：F309S取代以改善FVIII-BDD蛋白的表达(Miao,H.Z.等人,Blood[血液]103(a):3412-3419(2004)；白蛋白融合体(WO 2011/020866)；和Fc融合体(WO 04/101740)。
除非另有说明，否则本文提及的所有FVIII-BDD氨基酸位置均指全长人FVIII中的位置。
如本文所用，除非另有说明，否则“因子IX蛋白”或“FIX蛋白”是指包含天然存在的因子IX蛋白或其具有如通过本领域公认的测定法而测定的FIX生物活性(例如凝结活性)的变体的氨基酸序列的多肽。FIX作为无活性酶原产生，该酶原通过因子XIa切除活化肽产生通过一个或多个二硫键保持在一起的重链和轻链而转化为活性形式。可以由本文所述的活性细胞(例如，工程化RPE细胞)表达的FIX蛋白包括野生型灵长类(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体，包括片段、突变体、具有一个或多个氨基酸取代和/或缺失的变体以及前述任何野生型或变体蛋白与半衰期延长多肽的融合体。在一个实施例中，将活性细胞工程改造为编码全长野生型人因子IX多肽(例如，具有信号序列)或其功能变体。变体FIX蛋白优选具有野生型因子VIX的至少50％、75％、90％或更高(包括>100％)的凝结活性。用于测量FIX蛋白的凝结活性的测定包括Biophen因子IX测定(Hyphen BioMed)和一阶段凝结测定(活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)(例如，如EP 2 032 607 B2中所述)，凝血酶产生时间测定(TGA)和旋转血栓弹力测定法(例如，如WO 2012/006624中所述)。
已知许多功能性FIX变体，并且可以由本披露的活性细胞表达，包括在以下国际专利出版物中描述的任何功能性FIX变体：WO 02/040544 A3，第4页第9-30行和第15页第6-31行；WO 03/020764 A2，表2和3中，第14-24页和第12页第1-27行；WO 2007/149406 A2，第4页第1行至第19页第11行；WO 2007/149406 A2，第19页第12行至第20页第9行；WO 08/118507A2，第5页第14行至第6页第5行；WO 09/051717 A2，第9页第11行至第20页第2行；WO 09/137254 A2，第2页第[006]段至第5页第[011]段和第16页第[044]段至第24页第[057]段；WO09/130198 A2，第4页第26行至第12页第6行；WO 09/140015 A2，第11页第[0043]段至第13页第[0053]段；WO 2012/006624；WO 2015/086406。
在某些实施例中，FIX多肽包含与延长FIX蛋白的半衰期的异源多肽或非多肽部分融合的野生型或变体序列。示例性的延长半衰期的部分包括Fc、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(具有4O-聚糖的人绒毛膜促性腺激素(hCG)的28氨基酸C-末端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其任何组合。示例性FIX多肽是WO 2012/006624中描述的rFIXFc蛋白，其是通过Fc铰链区中的两个二硫键结合在一起的FIXFc单链(FIXF c-sc)和Fc单链(Fc-sc)。
FIX变体还包括功能获得性和功能缺失性变体。功能获得性变体的实例是人FIX的“Padua”变体，该变体在成熟蛋白质的位置338处具有L(亮氨酸)而不是R(精氨酸)(对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置384)，并且与野生型人FIX相比具有更高的催化和凝结活性(Chang等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],273:12089-94(1998))。功能缺失性变体的实例是从成熟蛋白质的起点开始的第五个氨基酸位置上丙氨酸取代赖氨酸，该取代产生与胶原蛋白IV的结合降低(例如功能缺失)的蛋白。
如本文所用，“形状因数”是指以下的一项或多项：多个活性细胞中存在的活性细胞的数量，该多个活性细胞的形状，该多个中的活性细胞之间的接触水平，或该多个中的活性细胞之间形成的接合水平。在一个实施例中，该多个活性细胞作为群集或其他聚集体或其他多个提供，其具有关于尺寸、形状、彼此共享接触或彼此之间的接合数量的参数中的一个或多个或全部的预选值(或本文所述的值)。例如，在一个实施例中，该多个中的活性细胞具有每个活性细胞的平均最小接合数，例如，正如通过固定或显微镜检查所评价的。在一个实施例中，活性细胞可以在以下一种或多种或全部情况下表现出形状因数：在向受试者施用或提供之前、期间或之后。在一个实施例中，活性细胞可以在以下一种或多种或全部情况下表现出形状因数：在向受试者施用或提供之前、期间或之后。示例性的形状因数包括活性细胞的单层数、活性细胞的群集数或在微载体(例如，珠粒或基质)上的布置。
如本文所用，除非另有说明，否则“白细胞介素2蛋白”或“IL-2蛋白”是指包含天然存在的IL-2蛋白或其具有如通过本领域公认的测定法而测定的IL-2生物活性(例如，活化IL-2受体在Treg细胞中的信号传导)的变体的氨基酸序列的多肽。可以由本文所述的活性细胞(例如，工程化RPE细胞)表达的IL-2蛋白包括野生型灵长类(例如，人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体。变体IL-2蛋白优选具有相应野生型IL-2的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的生物活性。IL-2蛋白的生物活性测定描述于美国专利号10,035,836中，并且包括例如测量与CD4+CD25-/低T细胞或NK细胞相比Treg细胞中磷酸化STAT5蛋白的水平。可由本披露的活性细胞(例如，工程化RPE细胞)产生的变体IL-2蛋白包括具有以下的一种或多种氨基酸取代的蛋白：N88R、N88I、N88G、D20H、Q126L、Q126F和C125S或C125A。
如本文所用，“可植入元件”包括活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞的群集)，其中一个或多个活性细胞全部或部分地置于封闭部件内(该封闭部件是除了活性细胞以外的)，例如，该封闭部件包含非细胞组分。在一个实施例中，封闭部件抑制对封闭的一个或多个活性细胞的免疫攻击或免疫攻击的作用。在一个实施例中，封闭部件包含半透膜或半透聚合物基质或涂层。典型地，封闭部件允许小分子例如营养物和废产物通过。典型地，封闭部件允许由置于封闭部件内的活性细胞释放的治疗性产物(例如，治疗性多肽)通过。在一个实施例中，例如与未置于可植入元件内的相似活性细胞相比，放置在封闭部件内使受试者针对可植入元件(例如，针对可植入元件内的活性细胞)的免疫反应(例如纤维化反应)的作用减到最小。在一个实施例中，封闭部件包含下述部分，例如本文所述的部分(例如化合物表1中的化合物)，例如与缺乏该部分的相似可植物元件相比，该部分将受试者针对可植入元件(例如，针对可植入元件内的封闭部件或活性细胞)的免疫反应(例如纤维化反应)的作用减到最小。在一些实施例中，封闭部件包含聚合物水凝胶。在一些实施例中，聚合物水凝胶包含用化合物表1中的化合物(例如，化合物101)化学改性的藻酸盐；在一个实施例中，藻酸盐的分子量<75kDa。在一个实施例中，封闭部件是水凝胶胶囊，其包含化学改性的藻酸盐和未改性的藻酸盐的混合物；在一个实施例中，未改性的藻酸盐的分子量为150kDa–250kDa。在一个实施例中，在化学改性和未改性的藻酸盐中的每一种中，藻酸盐的G:M比>1。
在一个实施例中，可植入元件包括封闭部件，该封闭部件在或可以在活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞群集)或在包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)上的细胞上或周围原位形成(在本文中称为“原位包封的可植入元件”)。
在一个实施例中，可植入元件包括封闭部件，该封闭部件包含柔性聚合物，例如藻酸盐(例如，化学改性的藻酸盐)、PLA、PLG、PEG、CMC或其混合物(在本文中称为“聚合物包封的可植入装置”)。
原位包封的可植入装置和聚合物包封的可植入装置(其类别不是互相排斥的)在本文中统称为包封的可植入元件。
示例性的包封的可植入元件包括活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞群集)或包含一个或多个活性细胞的微载体(例如珠粒或基质)，以及包含衍生化藻酸盐涂层的封闭部件。在一些实施例中，包封的可植入元件的最大线性尺寸不超过约1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm6mm、7mm或8mm。
在一个实施例中，可植入元件包括在与封闭的活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞群集)或包含活性细胞的微载体(例如珠粒或基质)组合之前预先形成的封闭部件(在本文中称为基于装置的可植入元件或DB可植入元件)。在一个实施例中，可植入装置的元件包括包含聚合物或金属的封闭部件。示例性的可植入装置的元件包括置于包含预先形成的外壳(例如非柔性聚合物或金属外壳或柔性外壳，例如半透膜)的封闭部件内的活性细胞，例如多个活性细胞，例如活性细胞群集，或包含一个或多个活性细胞的微载体(例如珠粒)。在实施例中，可植入装置的元件的最大线性尺寸为至少1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm 6mm、7mm或8mm。
如本文所用，“甲状旁腺激素蛋白”或“PTH蛋白”意指包含天然存在的甲状旁腺激素多肽或其具有例如通过本领域公认的测定法而测定的PTH生物活性的变体的氨基酸序列的多肽。可以由本文所述的活性细胞(例如，工程化RPE细胞)表达的PTH多肽包括野生型灵长类(例如，人)、猪、犬和鼠多肽，以及此类野生型多肽的变体。此类PTH多肽可以基本上由前PTH多肽原(115个氨基酸)、PTH多肽原(90个氨基酸)、成熟的84个氨基酸的肽(PTH(1-84))及其生物活性变体(例如截短的变体肽PTH(1-34))的野生型人序列组成。在人野生型序列中具有一个或多个氨基酸取代的PTH肽变体已经例如在美国专利号7410948和8563513以及美国公开的专利申请US20130217630中进行了描述。PTH变体优选具有相应野生型PTH的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的生物活性。在美国专利8383417中描述了通过串联质谱法检测某些PTH变体的测定法。美国专利7410948中描述了PTH肽变体的生物活性测定-通过测量cAMP水平测定腺苷酸环化酶的刺激。
如本文所用，“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并且具有至少两个氨基酸残基，并且在一些实施例中，具有至少10、50、75、100、150、200个或更多个氨基酸残基的聚合物。术语“多肽”旨在包括任何一条或多条具有两个或更多个氨基酸的链，并且包括但不限于肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一种或与其互换使用。术语“多肽”还旨在指由工程化细胞内的外源核苷酸序列编码的多肽的翻译后修饰产物，这些翻译后修饰包括但不限于：蛋白水解切割(例如将前体多肽加工成成熟形式)；形成二硫键；糖基化；脂化；乙酰化；磷酸化；和酰胺化。
如本文所用，“预防(prevention)”、“预防(prevent)”和“预防(preventing)”是指一种治疗，包括在疾病、病症或病状发作之前应用一种疗法，例如施用活性比，例如工程化RPE细胞(例如，如本文所述)，以便阻止所述疾病、病症或病状的物理表现。在一些实施例中，“预防(prevention)”、“预防(prevent)”和“预防(preventing)”需要疾病、病症或病状的体征或症状尚未发展或尚未被观察到。在一些实施例中，治疗包括预防，而在其他实施例中，治疗不包括预防。
“替代疗法”或“替代蛋白”是治疗性蛋白或其功能片段，其在患有与蛋白的减少、改变或缺乏有关的疾病或病症的受试者中替代或增加减少的、以不足的量存在的、改变的(例如突变的)或缺乏的蛋白。实例是某些凝血障碍中的某些血液凝结因子或某些溶酶体贮积病中的某些溶酶体酶。在实施例中，替代疗法或替代蛋白提供内源蛋白的功能。在一个实施例中，替代疗法或替代蛋白具有与被替代蛋白的天然存在的变体，例如野生型等位基因或与病症不相关的等位基因相同的氨基酸序列。在一个实施例中，替代疗法或替代蛋白在氨基酸序列上与天然存在的变体，例如野生型等位基因或与病症不相关的等位基因，例如受试者所携带的等位基因的差异不超过约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％或20％的氨基酸残基。
“序列同一性”或“相同百分比”，当在本文中用于指两个核苷酸序列或两个氨基酸序列时，意指对两个序列进行比较和比对以在比较窗口或指定区域上获得最大对应时，两个序列在特定区域内相同，或在特定区域内在特定百分比的核苷酸或氨基酸位置具有相同核苷酸或氨基酸。序列同一性可以使用本领域已知的标准技术测定，包括但不限于US2017/02334455 A1中描述的任何算法。在实施例中，相同核苷酸或氨基酸位置的特定百分比为至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
如本文所用，“受试者”是指人或非人动物。在一个实施例中，受试者是人(即，例如，任何年龄段的男性或女性，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成年受试者(例如，年轻成人、中年成人或老年成人))。在一个实施例中，受试者是非人动物，例如哺乳动物(例如，灵长类动物(例如，食蟹猴或恒河猴))。在一个实施例中，受试者是商业相关的哺乳动物(诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或鸟类(例如，商业相关的鸟类，诸如鸡、鸭、鹅或火鸡)。在某些实施例中，动物是哺乳动物。该动物可以是雄性的或雌性的并且可以处于任何发育阶段。非人动物可以是转基因动物。在一个实施例中，该受试者是人。
“转录单位”意指例如存在于外源核酸中的DNA序列，其包含至少一个与编码序列可操作地连接的启动子序列，并且还可以包含控制或增强编码序列转录成RNA分子或RNA分子翻译成多肽分子的一个或多个附加元件。在一些实施例中，转录单位还包含聚腺苷酸化(聚A)信号序列和聚A位点。在一个实施例中，转录单位存在于外源的染色体外表达载体中，例如，如图5所示，或作为整合在本文所述的工程化活性细胞的染色体中的外源序列存在。
如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指减轻、逆转、缓解、延迟疾病、病症或病状的一种或多种症状、表现或潜在病因的发作或抑制其进展中的一种或多种。在一个实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、延迟疾病、病症或病状的症状的发作或抑制其进展。在一个实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、延迟疾病、病症或病状的表现的发作或抑制其进展。在一个实施例中，治疗包括减轻、逆转、缓解、减轻或延迟疾病、病症或病状的潜在病因的发作。在一些实施例中，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”需要已经发展或已经观察到疾病、病症或病状的体征或症状。在其他实施例中，可以在不存在疾病或病状的体征或症状的情况下，例如在预防性治疗中施用治疗。例如，可以在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，根据症状史和/或根据遗传因素或其他易感性因素)。症状已经消退后也可以继续治疗，例如，以延迟或防止复发。在一些实施例中，治疗包括预防，而在其他实施例中，治疗不包括预防。
除非另有说明，否则如本文所用，“血管性血友病因子(Von Willebrand Factor)蛋白”或“vWF蛋白”意指包含天然存在的vWF多肽或其具有如本领域公认的测定法而测定的vWF生物活性(例如，FVIII结合活性)的变体的氨基酸序列的多肽。可以通过本文所述的工程化活性细胞表达的vWF蛋白包括野生型灵长类(例如人)、猪、犬和鼠蛋白，以及此类野生型蛋白的变体。可以将活性细胞(例如，ARPE-19细胞)工程改造为编码以下任何vWF多肽：2813个氨基酸的前体vWF，缺少22个氨基酸的信号肽和任选地缺少741个氨基酸的前原肽(prepropeptide)的vWF，具有2050个氨基酸的成熟vWF蛋白及其截短变体，诸如足以稳定vWF缺陷小鼠中的内源性FVIII水平的vWF片段，例如含有D′D3区(氨基酸764-1247)或D1D2D′D3区的截短变体；以及如美国专利号9458223中所述，例如在D′区中具有一个或多个氨基酸取代的vWF变体。变体vWF蛋白优选具有相应野生型vWF蛋白的至少50％、75％、90％或更多(包括>100％)的生物活性。本领域公认的用于测定vWF生物活性的测定法包括瑞斯托霉素(ristocetin)辅助因子活性(Federici AB等人2004.Haematologica[血液学]89:77-85)，vWF与血小板糖蛋白复合物Ib-V-IX的GP Ibα的结合(Sucker等人2006.Clin ApplThromb Hemost[临床及应用血栓/止血].12:305-310)，以及胶原蛋白结合(Kallas和Talpsep.2001.Annals of Hematology[血液学年鉴]80:466-471)。
在一些实施例中，由本披露的工程化活性细胞产生的vWF蛋白包含与延长vWF蛋白的半衰期的异源多肽或非多肽部分融合的天然存在的或变体的vWF氨基酸序列。示例性的延长半衰期的部分包括Fc、白蛋白、PAS序列、转铁蛋白、CTP(具有4O-聚糖的人绒毛膜促性腺激素(hCG)的28氨基酸C-末端肽(CTP))、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合多肽、白蛋白结合小分子或其任何组合。
选定的化学定义
下面更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。化学元素根据PeriodicTable of the Elements[化学元素周期表],CAS版,Handbook of Chemistry and Physics[化学和物理手册],第75版,内封面鉴定，并且特定官能团总体上如本文所述来定义。另外，有机化学的通用原理以及特定的官能部分和反应性描述于Thomas Sorrell,OrganicChemistry[有机化学],University Science Books[大学科学书籍],索萨利托(Sausalito),1999；Smith和March，March’s Advanced Organic Chemistry[March高级有机化学],第5版,约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations[综合有机转化],VCH出版社公司(VCHPublishers,Inc.),纽约,1989；和Carruthers,Some Modern Methods of OrganicSynthesis[一些现代有机合成方法],第3版,剑桥大学出版社(Cambridge UniversityPress),剑桥,1987。
本文所用的缩写具有它们在化学和生物学领域中的常规含义。本文示出的化学结构和化学式是根据化学领域已知的化学价标准规则构建的。
当列出数值范围时，意图涵盖该范围内的每个数值和子范围。例如，“C1-C6烷基”旨在涵盖C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-C6、C1-C5、C1-C4、C1-C3、C1-C2、C2-C6、C2-C5、C2-C4、C2-C3、C3-C6、C3-C5、C3-C4、C4-C6、C4-C5和C5-C6烷基。
如本文所用，“烷基”是指具有1至24个碳原子的直链或支链饱和烃基团(“C1-C24烷基”)。在一些实施例中，烷基具有1至12个碳原子(“C1-C12烷基”)、1至8个碳原子(“C1-C8烷基”)、1至6个碳原子(“C1-C6烷基”)、1至5个碳原子(“C1-C5烷基”)、1至4个碳原子(“C1-C4烷基”)、1至3个碳原子(“C1-C3烷基”)、1至2个碳原子(“C1-C2烷基”)或1个碳原子(“C1烷基”)。在一些实施例中，烷基具有2至6个碳原子(“C2-C6烷基”)。C1-C6烷基的实例包括甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、异丙基(C3)、正丁基(C4)、叔丁基(C4)、仲丁基(C4)、异丁基(C4)、正戊基(C5)、3–戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3–甲基–2–丁基(C5)、叔戊基(C5)以及正己基(C6)。烷基的另外的实例包括正庚基(C7)、正辛基(C8)等。烷基的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未取代的(“未取代的烷基”)或经一个或多个取代基(例如，例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代的(“经取代的烷基”)。
如本文所用，“烯基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳-碳双键并且没有三键的直链或支链烃基团(“C2-C24烯基”)。在一些实施例中，烯基具有2至10个碳原子(“C2-C10烯基”)、2至8个碳原子(“C2-C8烯基”)、2至6个碳原子(“C2-C6烯基”)、2至5个碳原子(“C2-C5烯基”)、2至4个碳原子(“C2-C4烯基”)、2至3个碳原子(“C2-C3烯基”)或2个碳原子(“C2烯基”)。该一个或多个碳-碳双键可以是内部的(诸如在2-丁烯基中)或末端的(诸如在1-丁烯基中)。C2-C4烯基的实例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯(C4)等。C2-C6烯基的实例包括前面提到的C2-4烯基，以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)等。烯基的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未取代的(“未取代的烯基”)或经一个或多个取代基(例如，例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代的(“经取代的烯基”)。
如本文所用，术语“炔基”是指具有2至24个碳原子、一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃基团(“C2-C24烯基”)。在一些实施例中，炔基具有2至10个碳原子(“C2-C10炔基”)、2至8个碳原子(“C2-C8炔基”)、2至6个碳原子(“C2-C6炔基”)、2至5个碳原子(“C2-C5炔基”)、2至4个碳原子(“C2-C4炔基”)、2至3个碳原子(“C2-C3炔基”)或2个碳原子(“C2炔基”)。该一个或多个碳-碳三键可以是内部的(诸如在2-丁炔基中)或末端的(诸如在1-丁炔基中)。C2-C4炔基的实例包括乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)等。炔基的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未取代的(“未取代的炔基”)或经一个或多个取代基(例如，例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代的(“经取代的炔基”)。
如本文所用，术语“杂烷基”是指包括至少一个碳原子和至少一个选自由O、N、P、Si和S组成的组的杂原子的非环状稳定的直链或支链或其组合，并且其中氮和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、P、S和Si可被置于杂烷基的任意位置处。示例性的杂烷基包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3和-O-CH2-CH3。多达两个或三个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。当列举“杂烷基”然后列举特定的杂烷基诸如-CH2O、-NRCRD等时，应理解术语杂烷基和-CH2O或-NRCRD不是冗余或相互排斥的。相反，列举特定杂烷基是为了更加清楚。因此，术语“杂烷基”在本文中不应解释为排除特定杂烷基，诸如–CH2O、–NRCRD等。
除非另有说明，否则术语“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”或“亚杂烷基”单独或作为另一取代基的一部分分别意指衍生自烷基、烯基、炔基或杂烷基的二价基团。亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚杂烷基可描述为例如C1-C6元亚烷基、C1-C6元亚烯基、C1-C6元亚炔基或C1-C6元亚杂烷基，其中术语“元”是指该部分内的非氢原子。在亚杂烷基的情况下，杂原子还可以占据链末端的任何一端或两端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团而言，书写连接基团化学式的方向并不暗示该连接基团的取向。例如，式-C(O)2R’-可以表示-C(O)2R’-和–R’C(O)2-。
如本文所用，“芳基”是指单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳香族环系(例如，在环阵列中具有6、10或14个π电子)的基团，在该芳香族环系中提供有6–14个环原子和零个杂原子(“C6-C14芳基”)。在一些实施例中，芳基具有六个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施例中，芳基具有十个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，诸如1-萘基和2-萘基)。在一些实施例中，芳基具有十四个环碳原子(“C14芳基”；例如，蒽基)。芳基可以描述为例如C6-C10元芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。芳基包括苯基、萘基、茚基和四氢萘基。芳基的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未取代的(“未取代的芳基”)或经一个或多个取代基取代的(“经取代的芳基”)。
如本文所用，“杂芳基”是指5–10元单环或双环的4n+2芳香族环系(例如，在环阵列中具有6或10个π电子)的基团，在该芳香族环系中提供有环碳原子和1–4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5–10元杂芳基”)。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，附接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂芳基双环环系可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂芳基”也包括环系，其中如以上定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合，其中附接点在芳基上或在杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数量指定了该稠合(芳基/杂芳基)环系中的环成员的数量。在其中一个环不含杂原子的双环杂芳基(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)中附接点可以是在任一个环上，即带杂原子的环(例如，2–吲哚基)或不含杂原子的环(例如，5–吲哚基)上。杂芳基可以描述为例如6-10元杂芳基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。
在一些实施例中，杂芳基是5-10元芳香族环系，在该芳香族环系中提供有环碳原子和1–4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-10元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基是5-8元芳香族环系，在该芳香族环系中提供有环碳原子和1–4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-8元杂芳基”)。在一些实施例中，杂芳基是5-6元芳香族环系，在该芳香族环系中提供有环碳原子和1–4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-6元杂芳基”)。在一些实施例中，该5–6元杂芳基具有1–3个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，该5–6元杂芳基具有1-2个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，该5–6元杂芳基具有1个选自氮、氧和硫的环杂原子。杂芳基的每个实例可以是独立地任选经取代地，即，未取代的(“未取代的杂芳基”)或经一个或两个取代基取代的(“经取代的杂芳基”)。
含有一个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于吡咯基、呋喃基和苯硫基。含两个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。含三个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于三唑基、噁二唑基和噻二唑基。含四个杂原子的示例性5元杂芳基包括但不限于四唑基。含一个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于吡啶基。含两个杂原子的示例性6元杂芳基包括但不限于哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。含三个或四个杂原子的示例性6元杂芳基分别包括但不限于三嗪基和四嗪基。含一个杂原子的示例性7元杂芳基包括但不限于氮杂卓基、氧杂卓基和硫杂卓基。示例性的5,6-双环杂芳基包括但不限于吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、异苯并苯硫基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、吲嗪基和嘌呤基。示例性的6,6-双环杂芳基包括但不限于萘啶基、蝶啶基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。其他示例性的杂芳基包括血红素和血红素衍生物。
如本文所用，术语“亚芳基”和“亚杂芳基”(单独或作为另一取代基的一部分)分别意指衍生自芳基和杂芳基的二价基团。
如本文所用，“环烷基”是指非芳香族环状烃基，在该非芳香族环系中具有3至10个环碳原子(“C3-C10环烷基”)和零个杂原子。在一些实施例中，环烷基具有3至8个环碳原子(“C3-C8环烷基”)，3至6个环碳原子(“C3-C6环烷基”)或5至10个环碳原子(“C5-C10环烷基”)。环烷基可以描述为例如C4-C7元环烷基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子。示例性C3-C6环烷基包括但不限于环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环己二烯基(C6)等。示例性C3-C8环烷基包括但不限于前面提到的C3-C6环烷基以及环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)、环辛基(C8)、环辛烯基(C8)、立方烷基(C8)、双环[1.1.1]戊烷基(C5)、双环[2.2.2]辛烷基(C8)、双环[2.1.1]己烷基(C6)、双环[3.1.1]庚烷基(C7)等。示例性C3-C10环烷基包括但不限于前面提到的C3-C8环烷基以及环壬基(C9)、环壬烯基(C9)、环癸基(C10)、环癸烯基(C10)、八氢-1H-茚基(C9)、十氢萘基(C10)、螺[4.5]癸烷基(C10)等。如前述实例所展示的，在某些实施例中，环烷基是单环的(“单环环烷基”)或含有稠环、桥环或螺环环系诸如双环环系(“双环环烷基”)并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。“环烷基”还包括其中如以上所定义的环烷基环与一个或多个芳基稠合的环系，其中附接点在环烷基环上，并且在此类情况下，碳的数量继续指定该环烷基环系中的碳的数量。环烷基的每个实例可以是独立地任选经取代的，即，未取代的(“未取代的环烷基”)或经一个或多个取代基取代的(“经取代的环烷基”)。
如本文所用，“杂环基”是指具有环碳原子以及1至4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅)的3-至10元非芳香族环系的基团(“3-10元杂环基”)。在含有一个或多个氮原子的杂环基中，附接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂环基可以是单环的(“单环杂环基”)或者是稠环、桥环或螺环环系诸如双环环系(“双环杂环基”)，并且可以是饱和的或可以是部分不饱和的。杂环基双环环系可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如以上所定义的杂环基环与一个或多个环烷基稠合，其中附接点在环烷基或杂环基环上的环系，或者其中如以上所定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中附接点在杂环基环上的环系，并且在此类情况下，环成员的数量继续指定杂环基环系中的环成员的数量。杂环基可以描述为例如3-7元杂环基，其中术语“元”是指该部分内的非氢环原子，即碳、氮、氧、硫、硼、磷和硅。杂环基的每个实例可以是独立地任选经取代地，即，未取代的(“未取代的杂环基”)或经一个或两个取代基取代的(“经取代的杂环基”)。在某些实施例中，杂环基是未取代的3-10元杂环基。在某些实施例中，杂环基是经取代的3-10元杂环基。
在一些实施例中，杂环基是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅)的5-10元非芳香族环系(“5-10元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-8元非芳香族环系(“5-8元杂环基”)。在一些实施例中，杂环基是具有环碳原子以及1-4个环杂原子(其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫)的5-6元非芳香族环系(“5-6元杂环基”)。在一些实施例中，5-6元杂环基具有1–3个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，5-6元杂环基具有1-2个选自氮、氧和硫的环杂原子。在一些实施例中，5-6元杂环基具有一个选自氮、氧和硫的环杂原子。
含有一个杂原子的示例性3元杂环基包括但不限于氮杂环丙烷基(azirdinyl)、环氧乙烷基(oxiranyl)、环硫乙烷基(thiorenyl)。含有一个杂原子的示例性4元杂环基包括但不限于氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基以及硫杂环丙烷基。含有一个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢苯硫基、二氢苯硫基、吡咯烷基、二氢吡咯基以及吡咯基-2,5-二酮。含有两个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于二氧戊环基、氧杂硫杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基以及噁唑烷-2-酮。含有三个杂原子的示例性5元杂环基包括但不限于三唑啉基、噁二唑啉基以及噻二唑啉基。含有一个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、二氢吡啶基以及硫杂环己烷基(thianyl)。含有两个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二氧杂环己烷基。含有两个杂原子的示例性6元杂环基包括但不限于三嗪基或硫代吗啉基-1,1-二氧化物。含有一个杂原子的示例性7元杂环基包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。含有一个杂原子的示例性8元杂环基包括但不限于氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。稠合至C6芳基环的示例性5元杂环基(本文也称为5,6-双环杂环)包括但不限于吲哚啉基、异吲哚啉基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮基等。融合至芳基环的示例性6元杂环基(本文也称为6,6-双环杂环)包括但不限于四氢喹啉基、四氢异喹啉基等。
如本文所用，“氨基”是指基团-NR70R71，其中R70和R71各自独立地是氢、C1-C8烷基、C3-C10环烷基、C4-C10杂环基、C6-C10芳基和C5-C10杂芳基。在一些实施例中，氨基是指NH2。
如本文所用，“氰基”是指基团-CN。
除非另有说明，否则如本文所用的“卤代”或“卤素”独立地或作为另一取代基的一部分，是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)原子。
如本文所用，“羟基”是指基团–OH。
如本文所定义的烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基是任选取代的(例如，“经取代的”或“未取代的”烷基、“经取代的”或“未取代的”烯基、“经取代的”或“未取代的”炔基、“经取代的”或“未取代的”杂烷基、“经取代的”或“未取代的”环烷基、“经取代的”或“未取代的”杂环基、“经取代的”或“未取代的”芳基或“经取代的”或“未取代的”杂芳基)。一般而言，术语“经取代的”，无论是否前面有术语“任选地”，都意指基团(例如，碳或氮原子)上存在的至少一个氢被允许的取代基置换，该取代基例如，取代后产生稳定的化合物(例如，不会自发地诸如通过重排、环化、消除或其他反应进行转化的化合物)的取代基。除非另作说明，否则“经取代的”基团在该基团的一个或多个可取代的位置具有取代基，并且当在任何给出结构中多于一个位置被取代时，在每个位置的取代基是相同的或不同的。设想术语“经取代的”包括被有机化合物的所有允许的取代基，诸如本文描述的导致形成稳定化合物的取代基中的任何一个取代。本披露设想到了任何和所有此类组合以便获得稳定的化合物。出于本披露的目的，杂原子(诸如氮)可以具有氢取代基和/或如本文描述的满足杂原子的化合价并且导致形成稳定部分的任何合适的取代基。
两个或更多个取代基可任选地连接形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环基。发现此类所谓的成环取代基通常但不一定与环状基础结构附接。在一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的相邻成员上。例如，附接到环状基础结构的相邻成员上的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施例中，成环取代基附接到基础结构的单一成员上。例如，附接到环状基础结构的单一成员上的两个成环取代基产生螺环结构。在又一个实施例中，成环取代基附接至基础结构的非相邻成员。
本文所述的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且因此能够以各种异构体形式存在，例如，对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述的化合物可以呈单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或可以呈立体异构体混合物的形式，这些立体异构体混合物包括外消旋混合物以及富含一种或多种立体异构体的混合物。可以通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离出异构体，这些方法包括手性高压液相色谱法(HPLC)和手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可以通过不对称合成来制备。参见例如Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions[对映异构体、外消旋体和拆分](威利国际科学出版社(Wiley Interscience),纽约,1981)；Wilen等人,Tetrahedron[四面体]33:2725(1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds[碳化合物的立体化学](麦格劳希尔公司(McGraw-Hill),纽约,1962)；和Wilen,Tables of Resolving Agentsand Optical Resolutions[拆分剂表和光学拆分]第268页(E.L.Eliel编辑,巴黎圣母院大学出版社(Univ.of Notre Dame Press),印第安纳州巴黎圣母院(Notre Dame,IN)1972)。另外，本披露涵盖如本文描述的呈单一异构体(基本上不含其他异构体)，并且替代性地，呈各种异构体的混合物的化合物。
如本文所用，纯对映异构体化合物基本上不含化合物的其他对映异构体或立体异构体(即，对映异构体过量)。换句话说，化合物的“S”形式基本上不含该化合物的“R”形式，因此是“R”形式对映异构体过量的。术语“对映异构体纯的”或“纯的对映异构体”表示该化合物包含大于75重量％、大于80重量％、大于85重量％、大于90重量％、大于91重量％、大于92重量％、大于93重量％、大于94重量％、大于95重量％、大于96重量％、大于97重量％、大于98重量％、大于99重量％、大于99.5重量％或大于99.9重量％的对映异构体。在某些实施例中，重量基于化合物的所有对映异构体或立体异构体的总重量。
本文所述的化合物还可包含一个或多个同位素取代。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D或氘)和3H(T或氚)；C可以是任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等等。
术语“药学上可接受的盐”意在包括根据本文所述化合物上存在的特定取代基，用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本披露的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的纯净的或在合适的惰性溶剂中的所需碱接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似的盐。当本披露的化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的纯净的或在合适的惰性溶剂中的所需酸接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸的那些酸加成盐，这些无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等；以及衍生自有机酸的盐，这些有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲基磺酸等。还包括氨基酸的盐(诸如精氨酸盐等)，及有机酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐(参见例如Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science[药物科学杂志]66:1-19(1977))。本披露的某些特定化合物含有允许化合物转化成碱加成盐或酸加成盐的碱性和酸性官能团。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。本领域技术人员已知的其他药学上可接受的载体适于本披露。
除盐形式外，本披露提供了前药形式的化合物。本文描述的化合物的前药是在生理条件下容易进行化学变化以提供本披露的化合物的那些化合物。另外，可以在离体环境中通过化学或生化方法将前药转化为本披露的化合物。
本披露的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化形式等效并且涵盖在本披露的范围中。本披露的某些化合物可以以多种结晶或无定形形式存在。一般而言，所有物理形式对于本披露所设想到的用途是等效的，并且旨在属于本披露的范围内。
术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合的化合物形式。这种物理缔合可以包括氢键结合。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可以制备为例如结晶形式，并且可以是溶剂化的。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物并且还包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。
术语“水合物”是指与水缔合的化合物。典型地，在化合物的水合物中所含的水分子的数量与水合物中的化合物分子的数量呈一定比率。因此，化合物的水合物可以例如用通式R×x H2O表示，其中R是化合物并且其中x是大于0的数字。
如本文所用的术语“互变异构体”是指是特定化合物结构的可互换形式并且在氢原子和电子位移方面不同的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的运动处于平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们通过用酸或碱的处理而快速地相互转化。互变异构形式可以与获得目标化合物的最优化学反应性和生物活性相关。
如本文所用，符号
Figure BDA0002428472100000311
是指与实体的连接，该实体例如为聚合物(例如，形成水凝胶的聚合物，诸如藻酸盐)或可植入元件(例如，装置或材料)。用
Figure BDA0002428472100000312
表示的连接可以指与实体(例如聚合物或可植入元件)的直接附接，可以指通过附接基团与实体的连接。如本文所述，“附接基团”是指用于将式(II)的化合物与实体(例如，如本文所述的聚合物或可植入元件)连接的部分，并且可以包含本领域已知的任何附接化学结构。示例性附接基团的列表概述在Bioconjugate Techniques[生物缀合技术](第3版，Greg T.Hermanson,马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA):爱思唯尔公司(Elsevier,Inc),2013)，其通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，附接基团包括烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–C(O)–、–OC(O)–、–N(RC)–、–N(RC)C(O)–、–C(O)N(RC)–、–N(RC)N(RD)–、–NCN–、–C(＝N(RC)(RD))O–、–S–、–S(O)x–、–OS(O)x–、–N(RC)S(O)x–、–S(O)xN(RC)–、–P(RF)y–、–Si(ORA)2–、–Si(RG)(ORA)–、–B(ORA)–或金属，其中RA、RC、RD、RF、RG、x和y中的每一个独立地如本文所述。在一些实施例中，附接基团包含胺、酮、酯、酰胺、烷基、烯基、炔基或硫醇。在一些实施例中，附接基团是交联剂。在一些实施例中，附接基团是–C(O)(C1-C6-亚烷基)–，其中亚烷基被R1取代，并且R1如本文所述。在一些实施例中，附接基团是–C(O)(C1-C6-亚烷基)–，其中亚烷基被1-2个烷基(例如1-2个甲基)取代。在一些实施例中，附接基团是–C(O)C(CH3)2-。在一些实施例中，附接基团是–C(O)(亚甲基)–，其中亚烷基被1-2个烷基(例如1-2个甲基)取代。在一些实施例中，附接基团是–C(O)CH(CH3)-。在一些实施例中，附接基团是–C(O)C(CH3)-。
活性细胞
本文披露了包含活性细胞，例如视网膜色素上皮(RPE)细胞或衍生自RPE细胞的细胞(包括工程化RPE细胞或衍生自RPE细胞的工程化细胞)的细胞组合物，其组合物、包含这些活性细胞的可植入元件，以及制备或制造和使用此类细胞、组合物和可植入元件的方法。在一个实施例中，活性细胞，例如RPE细胞，是工程化活性细胞，例如工程化RPE细胞。
由于RPE细胞天然存在于体内中，因此构成了眼上皮细胞的基础层，从而在视网膜内感光细胞正后方的布鲁赫氏膜内或布鲁赫氏膜上构成了单层立方细胞。RPE细胞通过运输营养物和调节离子平衡，在视网膜下空间的维持中起着关键作用，并通过捕获散射光和促进类维生素A的储存来防止对周围视网膜组织的损害(Sparrow,J.R.等人(2010)CurrMol Med[当今分子医学]10:802-823)。RPE细胞的功能异常牵涉几种疾病的病理，诸如黄斑变性、中央性浆液性脉络膜视网膜病变和色素性视网膜炎(Sato,R.等人(2013)InvestOphthalmol Vis Sci[眼科研究与视力学]54:1740-1749)。
工程化活性细胞，例如工程化RPE细胞或衍生自RPE细胞的工程化细胞，在本文中有描述并且具有可用于本披露的有利特性。例如，在实施例中，活性细胞可表现出接触抑制，并且在实施例中能够吞噬相邻细胞，或两者兼有。在实施例中，这些特性之一或两者均提供稳态功能；例如，在实施例中，接触抑制作用防止或抑制了可能损害包封的活性细胞的功能或完整性的有害生长，而吞噬能力为细胞分裂和死的活性细胞的置换提供了更宽松的环境。在一个实施例中，包封的活性细胞在体外培养或植入人体内的预选时间段内，例如在约1、2、3、4、5、10、20、30、45、60或90天内，维持细胞密度或数量变化不超过约10％、20％、30％、40％或50％。
在一个实施例中，活性细胞是自体、同种异体或异种细胞(这些术语是指细胞与施用该细胞的受试者之间的亲缘关系)。
在一个实施例中，活性细胞是永生化细胞或衍生自永生化细胞。
在一个实施例中，活性细胞是非永生化细胞或衍生自非永生化细胞。
在一个实施例中，活性细胞衍生自低分化细胞(例如，比RPE细胞分化程度低)的细胞，例如多能细胞、专能细胞、干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞；重编程细胞、重编程干细胞或衍生自重编程干细胞的细胞。低分化细胞可以是天然存在的细胞、低分化细胞或诱导型低分化细胞，分别例如干细胞或诱导干细胞。
在一个实施例中，活性细胞衍生自天然衍生的来源、异种组织、同种异体组织、尸体、细胞系或原代细胞。
活性细胞可以是工程化细胞，诸如工程改造为表达蛋白质或核酸的细胞，或工程改造为产生代谢产物的细胞。活性细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞。工程化活性细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞。
在一个实施例中，工程化活性细胞是包含至少一个外源转录单位的RPE细胞(或衍生自RPE细胞)，该外源转录单位可以存在于染色体外表达载体中或整合到细胞中的一个或多个染色体位点中。在一个实施例中，转录单位包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子，其中该启动子基本上由或由SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:23基本上相同，例如与SEQID NO:23至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列组成。在一个实施例中，该启动子由SEQ ID NO:23组成。在一个实施例中，多肽编码序列是天然存在的序列(例如，天然的野生型)或密码子优化序列。在一个实施例中，转录单位还包含紧邻多肽编码序列中的ATG起始密码子上游的科扎克(Kozak)翻译序列(例如，SEQ ID NO:26的核苷酸2094-2099中所示的科扎克序列)。在一个实施例中，转录单位还包含基本上由或由SEQ ID NO:24或与SEQ ID NO:24基本上相同，例如与SEQ ID NO:24至少95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的核苷酸序列组成的聚A序列。在一个实施例中，转录单位存在于染色体外的表达载体中。在一个实施例中，工程化细胞包含两个、三个、四个或更多个拷贝的外源转录单位，这些拷贝串联地整合在细胞基因组的相同位点中。在一个实施例中，转录单位基本上由或由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28组成。
在一个实施例中，活性细胞衍生自培养物，其中培养物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、79％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是活性细胞(例如，RPE细胞)或工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。在一个实施例中，培养物包含活性细胞(例如，RPE细胞或工程化RPE细胞)和第二细胞类型(例如，饲养细胞或污染细胞)。在一个实施例中，活性细胞是RPE细胞，例如衍生自个体(例如，对其施用细胞的相同或不同个体)的工程化或非工程化RPE细胞。
活性细胞可以衍生自多种品系中的任何一种。RPE细胞的示例性品系包括ARPE-19细胞、ARPE-19-SEAP-2-neo细胞、RPE-J细胞和hTERT RPE-1细胞。在一些实施例中，活性细胞是ARPE-19细胞或衍生自ARPE-19细胞。在一些实施例中，活性细胞是衍生自ARPE-19(
Figure BDA0002428472100000331
CRL-2302TM)细胞系的工程化ARPE-19细胞。
在一个实施例中，活性细胞表达生物标志物，例如抗原，该生物标志物是RPE细胞例如天然存在的RPE细胞特有的。在一些实施例中，生物标志物(例如，抗原)是蛋白质。示例性的生物标志物包括CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白。在一个实施例中，活性细胞表达CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的至少一种。在一个实施例中，活性细胞表达CRALBP和RPE-65中的至少一种。
在一个实施例中，多个活性细胞(例如，RPE细胞)，例如工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，具有预选形状因数或本文所述的形状因数或以预选形状因数或本文所述的形状因数提供。在一个实施例中，形状因数是单层或群集。如本文所用，“活性细胞群集，例如RPE细胞群集”是指多个活性细胞或活性细胞的聚集体，典型地该形状因数的细胞数与表面积的比率低于单层的比率。在一些实施例中，活性细胞群集包含至少约2、3、4、5、10、50、100、200、300、400、500、1,000、2,000、3,000、4,000或5,000个活性细胞。在一些实施例中，活性细胞群集包括2至5,000个细胞、2至1,000个细胞、5至1,000个细胞、5至500个细胞、10至500个细胞。在一些实施例中，活性细胞群集包括2至10个细胞、5至10个细胞、约5至20个细胞、5至50个细胞或10至100个细胞。在一些实施例中，活性细胞群集包括50至100个细胞、50至250个细胞、100至500个细胞、100至1,000个细胞或500至1,000个细胞。在一个实施例中，细胞数量范围的下端点、上端点或两个端点是平均值，并且可以变化5％。在一个实施例中，细胞数量范围的下端点、上端点或两个端点是平均值，并且可以变化10％。
在一个实施例中，活性细胞群集具有球状体、球面或椭圆体形状，或具有弯曲表面的任何其他形状。在一些实施例中，活性细胞群集具有球状体形状，其中活性细胞群集中至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞符合球状体形状。在一些实施例中，活性细胞群集具有球面形状，其中活性细胞群集中至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞符合球面形状。在一些实施例中，活性细胞群集具有椭圆体形状，其中活性细胞群集中至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞符合椭圆体形状。
在一个实施例中，活性细胞群集包括某些维度，例如，在x维度、y维度或z维度的每一个中具有一定范围的大小。在一些实施例中，x、y或z维度中的至少一个的长度独立地大于约10μm(例如，大于约15μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约75μm、约100μm、约250μm、约500μm、约750μm、约1mm、约1.1mm、约1.2mm、约1.3mm、约1.4mm、约1.5mm或更大)。在一些实施例中，活性细胞群集的x、y或z维度中的至少一个的长度独立地小于约2mm(例如，小于约1.5mm、约1.4mm、约1.3mm、约1.2mm、约1.1mm、约1.0mm、约750μm、约500μm、约250μm、约100μm、约75μm、约50μm、约40μm、约30μm、约20μm或更小)。
在一些实施例中，活性细胞群集的x、y或z维度中的至少一个的长度大小独立地在约10μm至约5mm之间(例如，在约20μm至约4mm，约50μm至约2mm，或约100μm至约1.5mm之间)。在一些实施例中，活性细胞群集的x、y或z维度中的至少两个的长度大小独立地在约10μm至约5mm之间(例如，在约20μm至约4mm，约50μm至约2mm，或约100μm至约1.5mm之间)。在一些实施例中，活性细胞群集的x、y或z维度中所有三个的长度大小独立地在约10μm至约5mm之间(例如，在约20μm至约4mm，约50μm至约2mm，或约100μm至约1.5mm之间)。
在一些实施例中，活性细胞群集的每个维度独立地在其他维度的约5％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％)以内。例如，RPE细胞群集的x维度可以是y维度和z维度两者的约5％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％约60％、约70％、约80％、约90％或约95％)。在一些实施例中，活性细胞群集的y维度可以是x维度和z维度两者的约5％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％约60％、约70％、约80％、约90％或约95％)。在其他实施例中，活性细胞群集的z维度可以是x维度和y维度两者的约5％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％约60％、约70％、约80％、约90％或约95％)。
活性细胞群集可以嵌入基质中，例如由活性细胞(例如，嵌入的活性细胞群集)分泌的细胞外基质。在一些实施例中，活性细胞群集被基质包封，例如，活性细胞(例如，包封的活性细胞群集)分泌的细胞外基质。在一些实施例中，细胞外基质包含蛋白质，例如胶原蛋白(例如，结构性胶原蛋白或血管抑制性胶原蛋白，例如胶原蛋白IV、胶原蛋白III、胶原蛋白V、胶原蛋白VI、胶原蛋白XVIII)、层粘连蛋白、弹性蛋白、整联蛋白或纤连蛋白。细胞外基质或其组分可以是天然存在的或非天然存在的。在一些实施例中，细胞外基质或其组分是天然存在的并且补充有非天然存在的组分。在其他实施例中，细胞外基质或其组分是非天然存在的并且补充有天然存在的组分。
用于本文所述的组合物和方法中，例如用于包封在水凝胶胶囊中或具有预选形状因数或本文所述的形状因数的多个活性细胞(例如，活性细胞群集)中的活性细胞，可以处于细胞周期的不同阶段。在一些实施例中，该多个活性细胞或活性细胞群集中的至少一个活性细胞正在进行细胞分裂。可以使用本领域已知的任何方法来测量细胞分裂，例如，如DeFazio A等人(1987)J Histochem Cytochem[组织化学与细胞化学杂志]35:571-577和Dolbeare F等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]80:5573-5577，其中每一个通过援引以其全文并入本文。在一个实施例中，例如，正如通过5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法或5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法所测定的那样，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞正在进行细胞分裂。在一些实施例中，通过显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))或流式细胞术观察或定量细胞增殖。在一些实施例中，该多个活性细胞或活性细胞群集中没有活性细胞正在进行细胞分裂而是静止的。在一个实施例中，通过5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)或流式细胞术测定，少于1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞正在进行细胞分裂。
在一些实施例中，多个活性细胞或活性细胞群集中的活性细胞能够自我吞噬。可以使用本领域中已知的任何方法来测量自我吞噬作用，例如，如Barth等人(2010)J.Pathol[病理学杂志]221:117-124或Zhang,Z.等人(2016)Curr Protoc Toxicol.[毒理学现有方案]69:20.12.1-20.1.26所述，其中每一个通过援引以其全文并入本文。例如，可以通过5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法、阳离子两亲示踪剂(CAT)测定法来测定或定量自我吞噬作用，其中染料迅速分配进入细胞并选择性标记与自我吞噬途径相关的液泡。在一些实施例中，通过显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))观察或定量自我吞噬作用。在一些实施例中，通过以下的一种或多种方式分析自我吞噬作用：对LC3和p62的免疫印迹分析，通过荧光显微镜术检测自噬小体的形成，以及通过串联mRFP-GFP荧光显微镜术监测自噬小体的成熟，例如，如Zhang等人所述。在一个实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞能够自我吞噬，例如，正如通过5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法、阳离子两亲示踪剂(CAT)测定法或显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))所测定的那样。
在一些实施例中，该多个RPE细胞或RPE细胞群集中的RPE细胞能够吞噬。可以使用本领域中已知的任何方法来测量吞噬作用，例如，如Oda T和Maeda H(1986)J ImmunolMethods[免疫学方法杂志]88:175-183以及Nuutila J和Lilius EM(2005)Cytometry A[细胞计数法A](2005)65:93-102中所述，其中每一个通过援引以其全文并入。例如，吞噬作用可以通过荧光素标记的抗体测定法来测量，其中监测了标记物质经由吞噬途径的摄取量。在一些实施例中，通过显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))或流式细胞术观察或定量吞噬作用。在一个实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞能够吞噬，例如，正如通过荧光素标记的抗体测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，时或纺锤体形成的评价)或流式细胞术测定的那样。
在一个实施例中，该多个或群集中的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、40％或80％的RPE细胞是有活力的。可以使用本领域中已知的任何方法来测量细胞活力，例如，如Riss,T.等人(2013)“Cell Viability Assays[细胞活力测定]”在Assay GuidanceManual[测定指导手册](Sittapalam,G.S.等人编辑)中所述。例如，可以通过ATP测定法、5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法来测量或定量细胞活力。在一些实施例中，通过显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价))或流式细胞术观察或定量细胞活力。在一个实施例中，该多个或群集中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、40％或80％的RPE细胞是有活力的，例如，正如通过ATP测定法、5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)或流式细胞术所测定的那样。
可以使用本领域技术人员已知的标准技术，诸如组织学方法、显微镜检查和各种功能测定法来评估本文所述的任何参数。
在一些实施例中，具有形状因数，例如在活性细胞群集中的活性细胞彼此形成紧密接合。在一个实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的细胞与该形状因数的至少一个其他活性细胞具有紧密接合，例如，正如通过本领域已知的方法，例如本领域已知的染色和显微镜检查测定法所测定的那样。在一些实施例中，具有形状因数，例如在活性细胞群集中的活性细胞未彼此形成紧密接合。在一个实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的活性细胞与该形状因数的另一活性细胞不具有紧密接合，例如，正如通过本领域已知的方法，例如本领域已知的染色和显微镜检查测定法所测定的那样。在一些实施例中，具有形状因数(例如在活性细胞群集中)的活性细胞表现出极性。例如，具有形状因数的活性细胞可以在眼睛(例如，视网膜)中原位表现出极性特征。在一个实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的活性细胞表现出极性，例如，正如通过本领域已知的方法，例如本领域已知的染色和显微镜检查测定法所测定的那样。在一些实施例中，具有形状因数(例如在活性细胞群集中)的活性细胞未表现出极性。在一个实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％或20％的活性细胞表现出极性，例如，正如通过本领域已知的方法，例如本领域已知的染色和显微镜检查测定法所测定的那样。
活性细胞，例如RPE细胞(例如，工程化RPE细胞)可以置于非细胞载体(例如，微载体)上。在一些实施例中，微载体是珠粒。在一些实施例中，微载体包含聚合物(例如塑料(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚酯、聚丙烯))、玻璃、丙烯酰胺、二氧化硅、硅橡胶、纤维素、葡聚糖、胶原蛋白(例如，明胶)或糖胺聚糖。微载体可以是任何形状或构造，包括球体(例如，珠粒)、平圆片、纤维、编织圆片或立方体。在一些实施例中，微载体可具有极性表面或带电荷的表面(例如，负电荷或正电荷)。在一些实施例中，微载体可具有光滑的表面或带纹理的表面。在一些实施例中，通过将细胞表面蛋白(例如，糖蛋白，例如纤连蛋白)吸附到微载体表面，使活性细胞(例如，工程化活性细胞)附于微载体上。微载体的大小范围可以为约10μm至约5mm(例如，在约10μm至约3mm，10μm至约1mm，50μm至约1mm，100μm至约1mm，100μm至500μm之间)。
可以使用本领域中已知的任何方法将活性细胞(例如，RPE细胞)置于微载体(例如珠粒，例如聚苯乙烯珠粒，例如
Figure BDA0002428472100000391
1微载体)上(参见例如Nilsson,K.(1988)Biotechnol Engineering Rev[生物技术工程综述]6:404-439。例如，可以称出少量(例如，约1g、约5g)的微载体，用缓冲液洗涤，并灭菌(例如，通过高压釜灭菌)。然后可以在引入活性细胞群体(例如，约1000万个活性细胞、约2500万个活性细胞、约4000万个活性细胞、约1亿个活性细胞)之前，用缓冲液和培养基洗涤无菌微载体几次。然后可以将微载体和活性细胞的混合物轻轻混合并在指定温度下(例如，在25℃下、在37℃下)孵育(例如，在固定培养箱中)。孵育后，可将细胞和微载体混合物转移至烧瓶中并轻轻搅拌直至掺入可植入元件(例如，本文所述的可植入元件)中或其内部。
治疗剂
本披露的特征在于一种产生或能够产生用于预防或治疗本文所述的疾病、病症或病状的治疗剂的活性细胞(例如，RPE细胞)。在一个实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)是工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞、工程化的ARPE-19细胞)。治疗剂可以是任何生物物质，诸如核酸(例如，核苷酸、DNA或RNA)、多肽、脂质、糖(例如，单糖、二糖、寡糖或多糖)或小分子，下面将进一步详细阐述其中的每一种。
在一些实施例中，活性细胞(例如，工程化RPE细胞)产生核酸。由本文所述的活性细胞产生的核酸大小可以不同并且包含一个或多个核苷或核苷酸，例如大于2、3、4、5、10、25、50个或更多个核苷或核苷酸。在一些实施例中，核酸是例如RNA或DNA的短片段，并且可以用作报告因子或用于诊断目的。示例性的核酸包括单个核苷或核苷酸(例如，腺苷、胸苷、胞苷、鸟苷、单磷酸尿苷、单磷酸肌苷)、RNA(例如，mRNA、siRNA、miRNA、RNAi)和DNA(例如，载体、染色体DNA)。在一些实施例中，核酸的平均分子量为约0.25kD、0.5kD、1kD、1.5kD、2kD、2.5kD、5kD、10kD、25kD、50kD、100kD、150kD、200kD或更高。
在一些实施例中，治疗剂是肽或多肽(例如，蛋白质)，诸如激素、酶、细胞因子(例如，促炎细胞因子或抗炎细胞因子)、生长因子、血液凝结因子或脂蛋白。由RPE细胞产生的肽或多肽(例如，蛋白质)可以具有天然存在的氨基酸序列，或者可以相对于天然存在的序列含有氨基酸突变、缺失或添加。另外，可以以某种方式，例如通过化学或酶促修饰(例如，糖基化、磷酸化)，修饰用于本披露的肽或多肽(例如，蛋白质)。在一些实施例中，肽具有约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。在一些实施例中，蛋白质的平均分子量为5kD、10kD、25kD、50kD、100kD、150kD、200kD、250kD、500kD或更高。
在一些实施例中，蛋白质是激素。示例性激素包括抗利尿激素(ADH)、催产素、生长激素(GH)、催乳素、生长激素释放激素(GHRH)、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促黄体激素释放激素(LHRH)、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素、醛固酮、皮质醇、肾上腺素、胰高血糖素、胰岛素、雌激素、黄体酮和睾酮。在一些实施例中，蛋白质是胰岛素(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)。在一些实施例中，蛋白质是生长激素，诸如人生长激素(hGH)、重组人生长激素(rhGH)、牛生长激素、甲硫氨酸-人生长激素、去苯丙氨酸人生长激素和猪生长激素。在一些实施例中，蛋白质不是胰岛素(例如，胰岛素A链，胰岛素B链或胰岛素原)。
在一些实施例中，蛋白质是生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)。
在一些实施例中，蛋白质是凝结因子或凝结因子，例如血液凝结因子或血液凝结因子。在一些实施例中，该蛋白质是参与凝结(即，血液从液体转化为固体或凝胶的过程)的蛋白质。示例性凝结因子和凝结因子包括因子I(例如，纤维蛋白原)、因子II(例如，凝血酶原)、因子III(例如，组织因子)、因子V(例如，促凝血球蛋白原，不稳定因子)、因子VI，因子VII(例如，稳定因子，转变加速因子前体)、因子VIII(例如，抗血友病因子A)、因子VIIIC、因子IX(例如，抗血友病因子B)、因子X(例如，图亚特因子(Stuart-Prower factor))、因子XI(例如，血浆促凝血酶原激酶前体)、因子XII(例如，哈格曼因子(Hagerman factor))、因子XIII(例如，纤维蛋白稳定因子)、血管性血友病因子、前激肽释放酶、肝素辅因子II、高分子量激肽原(例如，菲兹杰拉尔德因子(Fitzgerald factor))、抗凝血酶III和纤连蛋白。在一些实施例中，蛋白质是抗凝因子，诸如蛋白质C。
在一些实施例中，蛋白质是抗体分子。如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”包括例如单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)。在一个实施例中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链。在一个实施例中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段。在一个实施例中，抗体分子是单特异性抗体分子并结合单个表位，例如具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个免疫球蛋白可变结构域序列结合相同的表位。
在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，该抗体分子包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一个实施例中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
本文所述的活性细胞可以产生各种类型的抗体分子，包括任何种类的完整免疫球蛋白、其片段以及至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白。抗体分子可以是抗体，例如IgG抗体，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。抗体分子可以是抗原结合片段的形式，包括Fab片段、F(ab')2片段、单链可变区等。抗体可以是多克隆或单克隆(mAb)。单克隆抗体可包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其余部分是与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们特异性结合靶抗原和/或表现出所需的生物活性即可。在一些实施例中，抗体分子是单结构域抗体(例如，纳米抗体)。所述抗体也可以通过重组方法，例如通过氨基酸的缺失、添加或取代修饰，以增加抗体介导所需功能的功效。示例性抗体包括抗β-半乳糖苷酶、抗胶原蛋白、抗CD14、抗CD20、抗CD40、抗HER2、抗IL-1、抗IL-4、抗IL6、抗IL-13、抗IL17、抗IL18、抗IL-23、抗IL-28、抗IL-29、抗IL-33、抗EGFR、抗VEGF、抗CDF、抗鞭毛蛋白、抗-IFN-α、抗IFN-β、抗IFN-γ、抗甘露糖受体、抗VEGF、抗TLR1、抗TLR2、抗TLR3、抗TLR4、抗TLR5、抗TLR6、抗TLR9、抗PDF、抗PD1、抗PDL-1或抗神经生长因子抗体。在一些实施例中，抗体是抗神经生长因子抗体(例如，富拉单抗(fulranumab)、法希姆单抗(fasinumab)、他尼珠单抗(tanezumab))。
在一些实施例中，蛋白质是：细胞因子或细胞因子受体，或嵌合蛋白，包括细胞因子或其受体，包括例如肿瘤坏死因子α和β、其受体及其衍生物，肾素；脂蛋白；秋水仙碱；促肾上腺皮质激素；加压素；生长抑素；赖氨酸加压素；促胰酶素；亮丙瑞林；α-1-抗胰蛋白酶；心房利钠因子；肺表面活性剂；除组织型纤溶酶原激活物(t-PA)以外的纤溶酶原激活物，例如尿激酶；铃蟾肽；凝血酶；脑啡肽酶；RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；苗勒抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；绒毛膜促性腺激素；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活素；激素或生长因子受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5)；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；干扰素，诸如干扰素-α(例如，干扰素α2A)、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ和复合干扰素；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；促衰变因子；转运蛋白；归巢受体；地址素；生育抑制剂，诸如前列腺素；生育促进剂；调节蛋白；抗体(包括其片段)和嵌合蛋白，诸如免疫粘附素；这些化合物的前体、衍生物、前药和类似物，以及这些化合物或其前体、衍生物、前药和类似物的药学上可接受的盐。合适的蛋白质或肽可以是天然的或重组的，并且包括例如融合蛋白，例如与非治疗性序列例如Fc氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:34)或白蛋白氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:35)融合的治疗性多肽的氨基酸序列。此类融合蛋白可以在治疗性和非治疗性氨基酸序列之间包含间隔区氨基酸序列。
由活性细胞(例如，RPE细胞)产生的多肽(例如，蛋白质)的实例包括CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1(KC)、CXCL2(SDF1a)、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8(IL8)、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1、XCL2、TNFA、TNFB(LTA)、TNFC(LTB)、TNFSF4、TNFSF5(CD40LG)、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF13B、EDA、IL2、IL15、IL4、IL13、IL7、IL9、IL21、IL3、IL5、IL6、IL11、IL27、IL30、IL31、OSM、LIF、CNTF、CTF1、IL12a、IL12b、IL23、IL27、IL35、IL14、IL16、IL32、IL34、IL10、IL22、IL19、IL20、IL24、IL26、IL29、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IL28、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21、IFNB1、IFNK、IFNW1、IFNG、IL1A(IL1F1)、IL1B(IL1F2)、IL1Ra(IL1F3)、IL1F5(IL36RN)、IL1F6(IL36A)、IL1F7(IL37)、IL1F8(IL36B)、IL1F9(IL36G)、IL1F10(IL38)、IL33(IL1F11)、IL18(IL1G)、IL17、KITLG、IL25(IL17E)、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、SPP1、TGFB1、TGFB2、TGFB3、CCL3L1、CCL3L2、CCL3L3、CCL4L1、CCL4L2、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、AIMP1(SCYE1)、MIF、Areg、BC096441、Bmp1、Bmp10、Bmp15、Bmp2、Bmp3、Bmp4、Bmp5、Bmp6、Bmp7、Bmp8a、Bmp8b、C1qtnf4、Ccl21a、Ccl27a、Cd70、Cer1、Cklf、Clcf1、Cmtm2a、Cmtm2b、Cmtm3、Cmtm4、Cmtm5、Cmtm6、Cmtm7、Cmtm8、Crlf1、Ctf2、Ebi3、Edn1、Fam3b、Fasl、Fgf2、Flt3l、Gdf10、Gdf11、Gdf15、Gdf2、Gdf3、Gdf5、Gdf6、Gdf7、Gdf9、Gm12597、Gm13271、Gm13275、Gm13276、Gm13280、Gm13283、Gm2564、Gpi1、Grem1、Grem2、Grn、Hmgb1、Ifna11、Ifna12、Ifna9、Ifnab、Ifne、Il17a、Il23a、Il25、Il31、Iltifb、Inhba、Lefty1、Lefty2、Mstn、Nampt、Ndp、Nodal、Pf4、Pglyrp1、Prl7d1、Scg2、Scgb3a1、Slurp1、Spp1、Thpo、Tnfsf10、Tnfsf11、Tnfsf12、Tnfsf13、Tnfsf13b、Tnfsf14、Tnfsf15、Tnfsf18、Tnfsf4、Tnfsf8、Tnfsf9、Tslp、Vegfa、Wnt1、Wnt2、Wnt5a、Wnt7a、Xcl1、肾上腺素、褪黑激素、三碘甲腺原氨酸、前列腺素、白细胞三烯、前列环素、血栓烷、胰岛淀粉样多肽、苗勒抑制因子或激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素、血管加压素、精氨酸血管加压素、心房肽激素、脑利钠肽、降钙素、缩胆囊素、皮质抑素、脑啡肽、内皮素、促红细胞生成素、促卵泡激素、甘丙肽、胃抑制多肽、胃泌素、饥饿素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1、促性腺激素释放激素、铁调素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、抑制素、生长调节素、瘦素、促脂素、促黑素细胞激素、、胃动素、食欲素、催产素、胰腺多肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、松弛素、肾素、分泌素、生长激素抑制素、血栓形成素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、雄激素、α-葡糖苷酶(也称为酸性麦芽糖酶)、糖原磷酸化酶、糖原脱支酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、乳酸脱氢酶、肉碱棕榈酰基转移酶、肉碱和肌腺苷酸脱氨酶。
在一些实施例中，蛋白质是替代疗法或替代蛋白。在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白是凝结因子或凝结因子，例如vWF(包含天然存在的人因子vWF或其变体)、因子VII(例如，包含天然存在的人因子VII氨基酸序列VII或其变体)、因子VIII(例如，包含天然存在的人因子VIII氨基酸序列或其变体)或因子IX(例如，包含天然存在的人因子IX氨基酸序列或其变体)。
在一些实施例中，将活性细胞(例如，RPE细胞)工程改造为表达人因子VIII蛋白，例如重组因子VIII蛋白。在一些实施例中，重组因子VIII蛋白是B结构域缺失的重组因子VIII蛋白(FVIII-BDD)或其变体。在一些实施例中，活性细胞是工程化RPE细胞(例如，衍生自ARPE-19细胞系)，并且包含编码图3所示的FVIII-BDD氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，或编码SEQ ID NO:3、4、5和6中所示单链FVIII-BDD氨基酸序列之一的外源核酸序列。
在一些实施例中，将活性细胞(例如，ARPE-19细胞)工程改造为表达因子IX蛋白，例如野生型人因子IX(FIX)蛋白或其天然存在的多态变体(例如，丙氨酸取代图4中所示的成熟蛋白的氨基酸位置148处的苏氨酸，该位置对应于SEQ ID NO:2中所示的前体FIX序列的氨基酸位置194)。
在一些实施例中，将活性细胞(例如，ARPE-19细胞)工程改造为表达野生型FIX蛋白的功能获得(GIF)变体(FIX-GIF)，其中GIF变体具有比相应野生型FIX更高的比活性。在一些实施例中，活性细胞是工程化RPE细胞(例如，衍生自ARPE-19细胞系)，并且包含编码SEQ ID NO:2中所示的变体氨基酸序列(因子IX Padua)的外源核酸序列。
在一些实施例中，将活性细胞(例如，ARPE-19细胞)工程改造为表达vWF的截短变体，例如，该截短变体由结构域D1-D3(例如，SEQ ID NO:33)组成或由D′D3(例如，SEQ IDNO:32)组成。
在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白是酶，例如α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)或N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)。在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白是酶，例如α-半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶A)。在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白是细胞因子(例如，白细胞介素2，例如SEQ ID NO:29)或抗体。在一些实施例中，替代疗法或替代蛋白是甲状旁腺激素多肽(例如，SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31)。
在一些实施例中，治疗剂是糖，例如单糖、二糖、寡糖或多糖。在一些实施例中，糖包含丙糖、丁糖、戊糖、己糖或庚糖部分。在一些实施例中，糖包含线性单糖或环化单糖。在一些实施例中，糖包含葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、甘露糖胺、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸或古洛糖醛酸部分。在一些实施例中，糖与蛋白质附接(例如，N-连接的聚糖或O-连接的聚糖)。示例性的糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、核糖、木糖、唾液酸、麦芽糖、直链淀粉、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、甘露聚糖、凝集素、果胶、淀粉、纤维素、肝素、透明质酸、几丁质、支链淀粉或糖原。在一些实施例中，治疗剂是糖醇。
在一些实施例中，治疗剂是脂质。脂质可以是疏水性的或两亲性的，并且可以形成三级结构，诸如脂质体、囊泡或膜，或插入脂质体、囊泡或膜中。脂质可包含脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、甾醇脂质、异戊二烯脂质、鞘脂、糖脂、聚酮化合物或鞘脂。由包封的细胞产生的脂质的实例包括花生四烯乙醇胺、二十二碳六烯酸、前列腺素、白三烯、血栓素、类花生酸、甘油三酯、大麻素、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂、雌激素、雄酮、睾酮、胆固醇、类胡萝卜素、醌、氢醌或泛醌。
在一些实施例中，治疗剂是小分子。小分子可包括由细胞产生的天然产物。在一些实施例中，小分子具有较差的可用性或不符合里宾斯基五规则(Lipinski rule of five)(用于估计小分子在人中是否可能是口服活性药物的一套指南；参见例如Lipinski,C.A.等人(2001)Adv Drug Deliv[先进药物输送评论]46:2-36)。示例性的小分子天然产物包括抗菌药物(例如卡卢莫南(carumonam)、达托霉素(daptomycin)、非达霉素(fidaxomicin)、磷霉素(fosfomycin)、伊帕米星(ispamicin)、硫酸小诺霉素(micronomicinsulfate)、美欧卡霉素(miocamycin)、莫匹罗星(mupiocin)、硫酸奈替米星(netilmicin sulfate)、替考拉宁(teicoplanin)、沙纳霉素(thienamycin)、利福霉素(rifamycin)、红霉素(erythromycin)、万古霉素(vancomycin))、抗寄生虫药物(例如，青蒿素(artemisinin)、伊维菌素(ivermectin))、抗癌药物(例如，阿霉素(doxorubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、氨基酮戊酸、阿加来必(arglabin)、高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、罗米地辛(romidepsin)、他比特定(trabectdin)、放线菌素D(actinomycinD)、博来霉素(bleomycin)、色霉素A(chromomycinA)、柔红霉素(daunorubicin)、曲甲酰四氢叶酸(leucovorin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、链脲佐菌素(streptozocin)、曲贝替定(trabectedin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine))、抗糖尿病药物(例如，伏格列波糖(voglibose))、中枢神经系统药物(例如，左旋多巴(L-dopa)、加兰他敏(galantamine)、齐考诺肽(zicontide))、他汀类(例如，美伐他汀(mevastatin))、抗真菌药物(例如，烟曲霉素(fumagillin)、环孢菌素(cyclosporin))、1-脱氧野尻霉素和茶碱、固醇类(胆固醇、雌激素、睾丸酮)。另外的小分子天然产物描述于Newman,D.J.和Cragg,M.(2016)J Nat Prod[天然产物杂志]79:629-661和Butler,M.S.等人(2014)Nat Prod Rep[天然产物报道]31:1612-1661，其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，将活性细胞(例如，RPE细胞)工程改造为合成非蛋白质或非肽小分子。例如，在一个实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)可以产生他汀类(例如，牛磺他汀(taurostatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)或阿托伐他汀(atorvastatin))。
在一些实施例中，治疗剂是抗原(例如，病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、植物抗原、环境抗原或肿瘤抗原)。本领域技术人员认为抗原具有免疫刺激性，即，能够刺激免疫反应或对生物或衍生自生物的分子提供有效免疫。抗原可以是核酸、肽、蛋白质、糖、脂质或其组合。
活性细胞(例如工程化活性细胞，例如本文所述的工程化RPE细胞)可以产生单一治疗剂或多种治疗剂。在一些实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)产生单一治疗剂。在一些实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)群集包含产生单一治疗剂的活性细胞。在一些实施例中，群集中至少约1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性细胞(例如，RPE细胞)产生单一治疗剂(例如，本文所述的治疗剂)。在一些实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)产生多种治疗剂，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种治疗剂。在一些实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)群集包括产生多种治疗剂的活性细胞。在一些实施例中，群集中至少约1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性细胞(例如，RPE细胞)产生多种治疗剂(例如，本文所述的治疗剂)。
这些治疗剂可以是相关的或者可以形成复合物。在一些实施例中，治疗剂以活性形式从活性细胞(例如，RPE细胞)中分泌或释放。在一些实施例中，治疗剂以非活性形式，例如作为前药从活性细胞(例如，RPE细胞)中分泌或释放。在后一种情况下，治疗剂可以被下游试剂(诸如酶)活化。在一些实施例中，治疗剂不从活性细胞(例如，RPE细胞)中分泌或释放，而是保持在细胞内。例如，治疗剂可以是参与有害物质的解毒或代谢的酶，并且有害物质的解毒或代谢在细胞内发生。
可植入元件
本披露包括全部或部分置于可植入元件内或其上的活性细胞(例如，工程化活性细胞，例如工程化RPE细胞)。可植入元件可包括部分或全部包封或涂覆活性细胞(例如，RPE细胞)的封闭元件。在一个实施例中，可植入元件包括封闭部件，该封闭部件在或可以在活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞群集)上或周围，或在包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)上原位形成(在本文中称为“原位包封的可植入元件”)。
示例性的可植入元件和封闭部件包括诸如金属、金属合金、陶瓷、聚合物、纤维、惰性材料及其组合的材料。可植入元件可用于包封活性细胞(例如，工程化活性细胞，例如，工程化RPE细胞)或活性细胞(例如，工程化活性细胞，例如，工程化RPE细胞)群集。可植入元件可以完全由一种类型的材料制成，或者可以仅仅指一个表面或可植入元件的表面(例如，外表面或内表面)。在一些实施例中，可植入元件例如用本文所述的化合物进行化学改性。
在一些实施例中，材料是金属或金属合金。示例性的金属或金属合金包括钛和钛族合金(例如，镍钛诺、镍钛合金、热记忆合金材料)、铂、铂族合金、不锈钢、钽、钯、锆、铌、钼、镍铬合金、铬钼合金或某些钴合金(例如，钴-铬和钴-铬-镍合金，例如
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和
Figure BDA0002428472100000484
)。例如，金属材料可以是316级不锈钢(SS 316L)(由Fe、<0.3％C、16-18.5％Cr、10-14％Ni、2-3％Mo、<2％Mn、<1％Si、<0.45％P和<0.03％S组成)。
在一些实施例中，材料是陶瓷。示例性陶瓷材料包括过渡元素的氧化物、碳化物或氮化物，诸如氧化钛、氧化铪、氧化铱、氧化铬、氧化铝和氧化锆。也可以使用硅基材料，诸如二氧化硅。
在一些实施例中，材料是聚合物。聚合物可以是直链、支链或交联聚合物，或具有选择的分子量范围、聚合度、粘度或熔体流动速率的聚合物。支链聚合物可包括以下一种或多种类型：星形聚合物、梳形聚合物、刷状聚合物、树枝化聚合物、梯状和树枝状聚合物。聚合物可以是温敏性聚合物，例如凝胶(例如，在暴露于热或一定温度时变成固体或液体)或光交联聚合物。示例性聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙炔、聚(氯乙烯)(PVC)、聚烯烃共聚物、聚(氨酯)、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚酯、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚醚、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(羟基链烷酸酯)、聚氟烃、
Figure BDA0002428472100000481
(聚四氟乙烯，PTFE)、PEEK、硅酮、环氧树脂、
Figure BDA0002428472100000482
(由乙二醇和对苯二甲酸得到的缩聚物)、聚乙二醇、尼龙、聚烯烃、酚醛树脂、天然和合成弹性体、粘合剂和密封剂、聚烯烃、聚砜、聚丙烯腈、生物聚合物诸如多糖和天然乳胶、胶原蛋白、纤维素聚合物(例如，烷基纤维素等)、聚乙二醇和甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、多糖、聚(乙醇酸)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乳酸乙醇酸)(PLGA)、聚二噁烷酮(PDA)或外消旋聚(乳酸)、聚碳酸酯(例如，聚酰胺(例如尼龙))、氟塑料、碳纤维、琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖及其共混物或共聚物。
在一些实施例中，材料是聚乙烯。示例性的聚乙烯包括超低密度聚乙烯(ULDPE)(例如，密度范围为0.890至0.905g/cm3、含有共聚单体的聚合物)；极低密度聚乙烯(VLDPE)(例如，密度范围为0.905至0.915g/cm3、含有共聚单体的聚合物)；线性低密度聚乙烯(LLDPE)(例如，密度范围为0.915至0.935g/cm3、含有共聚单体的聚合物)；低密度聚乙烯(LDPE)(例如，密度范围为约0.915-0.935g/m3的聚合物)；中密度聚乙烯(MDPE)(例如，密度范围为0.926-0.940g/cm3、可含有或不含共聚单体的聚合物)；高密度聚乙烯(HDPE)(例如，密度范围为0.940-0.970g/cm3、可含有或不含共聚单体的聚合物)。
在一些实施例中，材料是聚丙烯。示例性的聚丙烯包括均聚物、无规共聚物(同相共聚物)和抗冲共聚物(多相共聚物)，例如McKeen,Handbook of Polymer Applicationsin Medicine and Medical Devices[医药和医疗器械中的聚合物应用手册],3-PlasticsUsed inMedical Devices[3-医疗器械中使用的塑料](2014):21-53中所述，其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，材料是聚苯乙烯。示例性的聚苯乙烯包括通用的或晶体的(PS或GPPS)、高抗冲击性(HIPS)和间同立构(SPS)聚苯乙烯。
在一些实施例中，材料是热塑性弹性体(TPE)。示例性的TPE包括：(i)TPA-聚酰胺TPE，其包含交替的硬链段和软链段的嵌段共聚物，在硬嵌段中具有酰胺化学连键而在软嵌段中具有醚和/或酯连键；(ii)TPC-共聚酯TPE，其由交替的硬链段和软链段的嵌段共聚物组成，主链中的化学连键为酯和/或醚；(iii)TPO-烯烃TPE，其由聚烯烃和常规橡胶的共混物组成，共混物中的橡胶相几乎没有交联；(iv)TPS-苯乙烯TPE，其至少由苯乙烯和特定二烯的三嵌段共聚物组成，其中两个末端嵌段(硬嵌段)是聚苯乙烯而内部嵌段(一个或多个软嵌段)是聚二烯或氢化聚二烯；(v)TPU－氨甲酸乙酯TPE，其由交替的硬链段和软链段组成的嵌段共聚物组成，硬嵌段中具有氨基甲酸酯化学连键，而软嵌段中具有醚、酯或碳酸酯连键或它们的混合；(vi)TPV-热塑性硫化橡胶，其由热塑性材料和常规橡胶的共混物组成，其中已在共混和混合步骤期间通过动态硫化过程使橡胶交联；以及(vii)TPZ-未分类的TPE，其包含除TPA、TPC、TPO、TPS、TPU和TPV中分组的那些以外的任何组成或结构。
在一些实施例中，材料是聚合物，并且该聚合物是藻酸盐。藻酸盐是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)组成的多糖。在一些实施例中，藻酸盐是高古洛糖醛酸(G)藻酸盐，并且包含大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的古洛糖醛酸(G)。在一些实施例中，藻酸盐是高甘露糖醛酸(M)藻酸盐，并且包含大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多的甘露糖醛酸(M)。在一些实施例中，M:G比率为约1。在一些实施例中，M:G比率小于1。在一些实施例中，M:G比率大于1。
聚合物可以与可植入元件的封闭部件(例如，表面)共价或非共价缔合。在一些实施例中，聚合物与可植入元件的封闭部件(例如，在可植入元件的内表面或外表面上)共价缔合。在一些实施例中，聚合物与可植入元件的封闭部件(例如，在可植入元件的内表面或外表面上)非共价缔合。可以通过本领域中的多种技术来施加聚合物，包括但不限于喷涂、润湿、浸没、浸渍(例如浸涂(例如术中浸涂))、涂抹，或以其他方式将疏水性聚合物施加到封闭部件的表面或可植入元件本身。
本文所述的活性细胞(例如，RPE细胞)可以部分或全部包封或包含在封闭部件或包含一种材料或多种组分或材料的可植入装置内。示例性组分或材料可以是纯结构性的、治疗性的或两者兼顾。封闭部件或可植入元件可包含生物分子组分，例如碳水化合物，例如多糖，例如海洋多糖，例如藻酸盐、琼脂、琼脂糖、角叉菜胶、纤维素和直链淀粉、几丁质和壳聚糖；例如通过二丙烯酸酯交联的交联多糖；或例如在Laurienzo(2010),Mar.Drugs.[海洋药物]8.9:2435-65中所述的其多糖或衍生物/修饰物。
在一个实施例中，可植入元件包括封闭部件，该封闭部件包含柔性聚合物，例如藻酸盐(例如，化学改性的藻酸盐)、PLA、PLG、PEG、CMC或其混合物(在本文中称为“聚合物包封的可植入装置”)。
在一个实施例中，可植入元件包括封闭部件，该封闭部件在或可以在活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞群集)上或周围，或在包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)上原位形成(在本文中称为“原位包封的可植入元件”)。
在一个实施例中，可植入元件包括在与封闭的活性细胞(例如多个活性细胞，例如活性细胞群集)或包含活性细胞的微载体(例如珠粒或基质)组合之前预先形成的封闭部件(在本文中称为基于装置的可植入元件)。
可植入元件可以包括蛋白质或多肽，例如抗体、蛋白质、酶或生长因子。可植入元件可以包括蛋白质或多肽的活性或非活性片段，该蛋白质或多肽例如葡萄糖氧化酶(例如，用于葡萄糖感受器)、激酶、磷酸酶、加氧酶、氢化酶、还原酶。
可植入元件可以包括任何材料，诸如本文所述的材料。在一些实施例中，可植入元件由一种材料或多种类型的材料制成。在一些实施例中，可植入元件包含聚合物(例如，水凝胶、塑料)组分。示例性聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酯(例如，PLA、PLG或PGA、聚羟基烷酸酯(PHA)或其他可生物吸收的塑料)、聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚醚砜(PES)、聚丙烯酸酯(例如，丙烯酸或PMMA)、水凝胶(例如，丙烯酸聚合物或丙烯酸聚合物与硅酮聚合物的共混物)、聚砜、聚醚醚酮、热塑性弹性体(TPE或TPU)、热固性弹性体(例如，硅酮(例如硅酮弹性体))、聚对二甲苯(Parylene)、含氟聚合物(例如，PTFE)和聚丙烯酸化物(诸如聚(丙烯酸)和/或聚(丙烯酰胺))或其混合物。
可植入元件可以包含非有机或金属部件或材料，例如钢(例如，不锈钢)、钛、其他金属或合金。可植入元件可以包括非金属部件或材料，例如陶瓷或羟磷灰石元件。
可植入元件可以包括由导电材料(例如，金、铂、钯、钛、铜、铝、银、金属、这些的任何组合等)制成的部件或材料。
可植入元件可以包括一种以上的组分，例如本文披露的一种以上的组分，例如金属、塑料、陶瓷、复合材料或混合材料中的一种以上。
在含金属的可植入元件中，金属的量(例如，以重量％，实际重量计)可以为至少5％，例如至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高，例如w/w；少于20％，例如少于20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％或更少。
在含塑料的可植入元件中，塑料的量(例如，以重量％，实际重量计)可以为至少5％，例如至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高(w/w)；或少于20％，例如少于20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％或更少。
在含陶瓷的可植入元件中，陶瓷的量(例如，以重量％，实际重量计)可以为至少5％，例如至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高(w/w)；或少于20％，例如少于20％、15％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％或更少。
本文所包括的可植入元件包括配置有内腔(例如具有一个、两个或多个开口的内腔)的可植入元件，例如管状装置。典型的支架是配置有内腔并且具有两个开口的装置的实例。其他实例包括分流器。
本文中包括的可植入元件包括例如被配置为符合身体形状的柔性可植入元件。
本文中包括的可植入元件包括稳定可植入元件的位置的部件，例如粘合物或紧固件，例如基于扭矩或基于摩擦的紧固件，例如螺钉或销。
本文中包括的可植入元件可以被配置用于监测物质，例如外源物质(例如治疗剂或毒素)，或内源性身体产物(例如胰岛素)。在一些实施例中，可植入元件是诊断器。
本文中包括的可植入元件可以被配置用于释放物质，例如外源物质，例如治疗剂。在一些实施例中，治疗剂是具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，治疗剂是生物材料。在一些实施例中，治疗剂是细胞、细胞产物、组织、组织产物、蛋白质、激素、酶、抗体、抗体片段、抗原、表位、药物、疫苗或其任何衍生物。
本文中的可植入元件可以被配置为响应于身体(例如人工关节，例如膝关节、髋关节或其他人工关节)的信号或运动来改变构象。
示例性的可植入元件包括支架、分流器、敷料、眼用装置、端口、传感器、骨科固定装置、植入物(例如，牙植入物、眼用植入物、硅树脂植入物、角膜植入物、皮肤植入物、胃内植入物、面部植入物、髋部植入物、骨植入物、耳蜗植入物、阴茎植入物、用于控制失禁的植入物)、皮肤覆盖装置、透析介质、药物递送装置、人工或工程器官(例如，脾脏、肾脏、肝脏或心脏)、引流装置(例如，膀胱引流设备)、细胞选择系统、粘合物(例如，粘固剂、夹具、夹子)、避孕器具、宫内节育器、除颤器、剂量计、电极、泵(例如，输液泵)过滤器、栓塞装置、紧固件、填充物、固定物、移植物、助听器、心脏或心脏相关设备(例如，起搏器、心脏瓣膜)、电池或电源、止血剂、失禁装置、椎体融合装置、口内装置、晶状体、网、针、神经系统刺激器、贴片、腹膜进入装置、板、塞、压力监测装置、环、应答器和瓣膜。还包括用于以下一项或多项中的装置：麻醉学、心脏病学、临床化学、耳鼻喉科学、牙科学、胃肠病学、泌尿学、血液学、免疫学、微生物学、神经病学、产科学/妇科学、眼科学、矫形外科学、病理学、物理医学、放射学、一般或整形外科学、兽医、精神病学、外科学和/或临床毒理学。
在一些实施例中，可植入元件包括包封或截留的细胞或组织。这些细胞或组织可以包封或截留在聚合物中。在一些实施例中，可植入元件包括活性细胞(例如，RPE细胞)，例如置于聚合物封闭部件(例如，藻酸盐)内的活性细胞(例如，RPE细胞)。
在一些实施例中，可植入元件靶向或被设计用于身体的某一系统，例如神经系统(例如，外周神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS))、血管系统、骨骼系统、呼吸系统、内分泌系统、淋巴系统、生殖系统或胃肠道。在一些实施例中，可植入元件靶向CNS。在一些实施例中，可植入元件靶向或被设计用于身体的某一部分，例如血液、眼睛、脑、皮肤、肺、胃、口、耳、腿、足、手、肝、心脏、肾、骨、胰腺、脾脏、大肠、小肠、脊髓、肌肉、卵巢、子宫、阴道或阴茎。
本文包括的可植入元件包括FDA 1级、2级或3级装置，例如未分类或未被分类或被分类为人道主义使用装置(HUD)的装置。
可植入元件的特征
可植物元件中使用的组分或材料(或整个可植物元件)可针对以下的一项或多项进行优化：生物相容性(例如，将免疫排斥或纤维化减到最小；耐热性；弹性；拉伸强度；化学耐受性(例如，对装置的生产、使用、清洁、灭菌和消毒中使用的油、油脂、消毒剂、漂白剂、加工助剂或其他化学品的耐受性)；电气性能；表面和体积电导率或电阻率、介电强度；相比漏电起痕指数；机械性能；保质期，长期耐久性灭菌能力(例如，能够承受灭菌过程，诸如蒸汽、干热、环氧乙烷(EtO)、电子束和/或伽马射线，例如，同时保持装置预期用途的性能)，例如，对高压灭菌器/蒸汽条件的耐热性，对蒸汽灭菌的水解稳定性，对EtO的化学耐受性，对高能辐射(例如，电子束、紫外线和伽玛射线)的耐受性；或晶体结构。
可植入元件可以体内组装(例如，在体内，例如在体温下形成结构化形状的可注射物质)或离体组装。
可植入元件可以具有纳米尺寸，例如可以包含纳米颗粒，例如由本文所述的聚合物例如PLA制成的纳米颗粒。纳米颗粒可以是化学改性的纳米颗粒，例如，进行改性是为了防止被巨噬细胞和库普弗细胞(Kupfer cell)摄取(例如，称为调理作用的过程)；或改变纳米颗粒的循环半衰期。纳米颗粒可以包括(可注射的)铁纳米颗粒(例如，先进的磁性纳米铁颗粒)。示例性纳米颗粒在Veiseh等人(2010)Adv Drug Deliv Rev[先进药物输送评论]62:284-304中有描述，该文献通过援引以其全文并入本文。
可植入元件可以被配置用于植入，或者可以被植入或置于：受试者的网膜内、受试者的皮下脂肪内、受试者的肌肉内。可植入元件可以被配置用于植入，或者可以被植入或置于以下部位之上或其内部：皮肤；粘膜表面、体腔、腹膜腔(例如小囊)；CNS，例如脑或脊髓；器官，例如心脏、肝、肾、脾、肺、淋巴系统、脉管系统、口腔、鼻腔、牙齿、牙龈、胃肠道；骨；髋部；脂肪组织；肌肉组织；循环血液；眼睛(例如，眼内)；乳房、阴道；子宫、关节，例如膝关节或髋关节，或脊柱。在一些实施例中，可植入元件被配置用于植入，或被植入或置于腹膜腔(例如，小囊)中。
可植入元件可以包括电化学传感器，例如，包括工作电极和参比电极的电化学传感器。例如，电化学传感器包括与分析物反应以产生与可眼戴装置所暴露的流体中的分析物的浓度有关的传感器测量值的工作电极和参比电极。可植入元件可包括例如具有凹面和凸面的透明聚合物材料的窗口，以及例如至少部分地嵌入透明聚合物材料中的基板。可植入元件还可以包括包含一根或多根天线的电子模块；以及电连接到电化学传感器和天线的控制器，其中该控制器被配置用于控制电化学传感器以获得与可植入元件(例如可安装的可植入元件)所暴露的流体中的分析物的浓度有关的传感器测量值并使用天线指示该传感器的测量值。
在一些实施例中，可植入元件的平均直径或大小大于1mm，优选为1.5mm或更大。在一些实施例中，可植入元件的直径或大小可以大到8mm。例如，本文所述的可植入元件在以下大小范围内：1mm至8mm、1mm至6mm、1mm至5mm、1mm至4mm、1mm至3mm、1mm至2mm、1mm至1.5mm、1.5mm至8mm、1.5mm至6mm、1.5mm至5mm、1.5mm至4mm、1.5mm至3mm、1.5mm至2mm、2mm至8mm、2mm至7mm、2mm至6mm、2mm至5mm、2mm至4mm、2mm至3mm、2.5mm至8mm、2.5mm至7mm、2.5mm至6mm、2.5mm至5mm、2.5mm至4mm、2.5mm至3mm、3mm至8mm、3mm至7mm、3mm至6mm、3mm至5mm、3mm至4mm、3.5mm至8mm、3.5mm至7mm、3.5mm至6mm、3.5mm至5mm、3.5mm至4mm、4mm至8mm、4mm至7mm、4mm至6mm、4mm至5mm、4.5mm至8mm、4.5mm至7mm、4.5mm至6mm、4.5mm至5mm、5mm至8mm、5mm至7mm、5mm至6mm、5.5mm至8mm、5.5mm至7mm、5.5mm至6mm、6mm至8mm、6mm至7mm、6.5mm至8mm、6.5mm至7mm、7mm至8mm或7.5mm至8mm。在一些实施例中，可植入元件的平均直径或大小在1mm至8mm之间。在一些实施例中，可植入元件的平均直径或大小在1mm至4mm之间。在一些实施例中，可植入元件的平均直径或大小在1mm至2mm之间。
在一些实施例中，可植入元件包括至少一个孔或开口，例如，以允许材料自由流动。在一些实施例中，可植入元件的平均孔径在约0.1μm至约10μm之间。例如，平均孔径可以在0.1μm至10μm、0.1μm至5μm、0.1μm至2μm、0.15μm至10μm、0.15μm至5μm、0.15μm至2μm、0.2μm至10μm、0.2μm至5μm、0.25μm至10μm、0.25μm至5μm、0.5μm至10μm、0.75μm至10μm、1μm至10μm、1μm至5μm、1μm至2μm、2μm至10μm、2μm至5μm或5μm至10μm之间。在一些实施例中，可植入元件的平均孔径在约0.1μm至10μm之间。在一些实施例中，可植入元件的平均孔径在约0.1μm至5μm之间。在一些实施例中，可植入元件的平均孔径在约0.1μm至1μm之间。
在一些实施例中，可植入元件能够防止超过一定尺寸的材料通过孔或开口。在一些实施例中，可植入元件能够防止大于50kD、75kD、100kD、125kD、150kD、175kD、200kD、250kD、300kD、400kD、500kD、750kD、1,000kD的材料通过。
可植入元件(例如，本文所述的可植入元件)可以作为用于向受试者植入或施用的制剂或组合物提供。在一些实施例中，制剂或组合物中至少20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的可植入元件具有如本文所述的特征，例如平均孔径。
在一些实施例中，可植入元件可以使用几分钟到几年的范围的不同时间段。例如，可植入元件可以使用约1小时至约10年。在一些实施例中，可植入元件的使用时间长于约1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、1天、48小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、10个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长。可植入元件可以被配置用于植入的持续时间，例如，被配置为在全部或部分预期持续时间内抵抗由于纤维化引起的纤维化失活。
在一些实施例中，可植入元件可容易地从受试者取回，例如，不会对受试者造成伤害或不会造成周围组织的明显破坏。在一个实施例中，可以在可植入元件与周围组织最小限度的手术分离或没有手术分离的情况下，例如经由微创手术切口、提取或切除，将可植入元件取回。
可植入元件可以被配置用于有限暴露(例如，小于2天，例如小于2天、1天、24小时、20小时、16小时、12小时、10小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或更短时间)。可植入元件可以被配置用于长期暴露(例如，至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年或更长时间)。可植入元件可以被配置用于永久暴露(例如，至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、1年、1.5年、2年、2.5年、3年、3.5年、4年或更长时间)。在一些实施例中，可植入元件不是WO2012/112982、WO2012/167223、WO2014/153126、WO2016/019391、US2012-0213708、US2016-0030359和US 2016-0030360中的任何一个中披露的可植入元件。
在一个实施例中，可植入元件包含本文所述的活性细胞(例如，RPE细胞)。在一个实施例中，可植入元件包含活性细胞(例如，RPE细胞)，以及提供物质(例如，本文所述的治疗剂)的另一种细胞(例如，重组细胞或干细胞)。
在一个实施例中，活性细胞是人RPE细胞(或由其衍生的细胞，例如ARPE-19细胞)，并且多肽是人多肽。在一个实施例中，活性细胞(例如，RPE细胞)提供减轻疾病、病症或病状(例如，如本文所述)的物质。
可植入元件的化学改性
本披露的特征在于一种包含活性细胞(例如，RPE细胞)的可植入元件，其中该可植入元件经化学改性。与未改性的可植入元件相比，当施用给受试者时，化学改性可以赋予可植入元件改善的性质，例如，调节受试者中的免疫反应。
在一些实施例中，将包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的表面用化合物化学改性。在一些实施例中，表面包括可植入元件的外表面或内表面。在一些实施例中，将包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的表面(例如，外表面)用化合物化学改性。在一些实施例中，表面(例如，外表面)与化合物共价连接。在一些实施例中，该化合物包含至少一个杂芳基部分。
在一些实施例中，该化合物是式(I)的化合物：
Figure BDA0002428472100000571
或其药学上可接受的盐，其中：
A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–、–N(RC)–、–N(RC)C(O)–、–C(O)N(RC)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、–N(RC)N(RD)–、–NCN–、–C(＝N(RC)(RD))O–、–S–、–S(O)x–、–OS(O)x–、–N(RC)S(O)x–、–S(O)xN(RC)–、–P(RF)y–、–Si(ORA)2–、–Si(RG)(ORA)–、–B(ORA)–或金属，其中每个烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基连接至附接基团(例如，本文定义的附接基团)，并且任选地被一个或多个R1取代；
L1和L3中的每一个独立地是键、烷基或杂烷基，其中每个烷基和杂烷基任选地被一个或多个R2取代；
L2是键；
M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R3取代；
P是不存在、环烷基、杂环基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R4取代；
Z是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、–ORA、–C(O)RA、–C(O)ORA、–C(O)N(RC)(RD)、–N(RC)C(O)RA、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R5取代；
每个RA、RB、RC、RD、RE、RF和RG独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、叠氮基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R6取代；
或RC和RD与它们所附接的氮原子合在一起形成任选地被一个或多个R6取代的环(例如5-7元环)；
每个R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1、–C(O)N(RC1)、SRE1、S(O)xRE1、–OS(O)xRE1、–N(RC1)S(O)xRE1、–S(O)xN(RC1)(RD1)、–P(RF1)y、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个RA1、RB1、RC1、RD1、RE1和RF1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基或杂环基；
x是1或2；并且
y是2、3或4。
在一些实施例中，式(I)的化合物是式(I-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000591
或其药学上可接受的盐，其中：
A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–、–N(RC)–、–N(RC)C(O)–、–C(O)N(RC)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、–N(RC)N(RD)–、–NCN–、–C(＝N(RC)(RD))O–、–S–、–S(O)x–、–OS(O)x–、–N(RC)S(O)x–、–S(O)xN(RC)–、–P(RF)y–、–Si(ORA)2–、–Si(RG)(ORA)–、–B(ORA)–或金属，其中每个烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基连接至附接基团(例如，本文定义的附接基团)，并且任选地被一个或多个R1取代；
L1和L3中的每一个独立地是键、烷基或杂烷基，其中每个烷基和杂烷基任选地被一个或多个R2取代；
L2是键；
M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R3取代；
P是任选地被一个或多个R4取代的杂芳基；
Z是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R5取代；
每个RA、RB、RC、RD、RE、RF和RG独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、叠氮基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R6取代；
或RC和RD与它们所附接的氮原子合在一起形成任选地被一个或多个R6取代的环(例如5-7元环)；
每个R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1、–C(O)N(RC1)、SRE1、S(O)xRE1、–OS(O)xRE1、–N(RC1)S(O)xRE1、–S(O)xN(RC1)(RD1)、–P(RF1)y、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个RA1、RB1、RC1、RD1、RE1和RF1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基或杂环基；
x是1或2；并且
y是2、3或4。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–、–N(RC)C(O)-、–N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、–N(RC)C(O)(C1-C6-亚烯基)–或–N(RC)–。在一些实施例中，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–或–N(RC)–。在一些实施例中，A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O–或–N(RC)–。在一些实施例中，A是烷基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)或–N(RC)–。在一些实施例中，A是–N(RC)C(O)-、–N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–或–N(RC)C(O)(C1-C6-亚烯基)–。在一些实施例中，A是–N(RC)–。在一些实施例中，A是–N(RC)–，并且RC和RD独立地是氢或烷基。在一些实施例中，A是–NH–。在一些实施例中，A是–N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、其中亚烷基被R1取代。在一些实施例中，A是–N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、并且R1是烷基(例如甲基)。在一些实施例中，A是–N(RC)C(O)(亚甲基)–，并且R1是烷基(例如甲基)。在一些实施例中，A是–NHC(O)CH(CH3)-。在一些实施例中，A是–NHC(O)C(CH3)-。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，L1是键、烷基或杂烷基。在一些实施例中，L1是键或烷基。在一些实施例中，L1是键。在一些实施例中，L1是烷基。在一些实施例中，L1是C1-C6烷基。在一些实施例中，L1是–CH2–、–CH(CH3)–、–CH2CH2CH2或–CH2CH2–。在一些实施例中，L1是–CH2–或–CH2CH2–。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，L3是键、烷基或杂烷基。在一些实施例中，L3是键。在一些实施例中，L3是烷基。在一些实施例中，L3是C1-C6烷基。在一些实施例中，L3是–CH2–。在一些实施例中，L3是杂烷基。在一些实施例中，L3是任选地被一个或多个R2(例如，氧代)取代的C1-C6杂烷基。在一些实施例中，L3是–C(O)OCH2–、–CH2(OCH2CH2)2–、–CH2(OCH2CH2)3–、CH2CH2O–或–CH2O–。在一些实施例中，L3是–CH2O–。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，M是不存在、烷基、杂烷基、芳基或杂芳基。在一些实施例中，M是杂烷基、芳基或杂芳基。在一些实施例中，M是不存在。在一些实施例中，M是烷基(例如C1-C6烷基)。在一些实施例中，M是-CH2–。在一些实施例中，M是杂烷基(例如C1-C6杂烷基)。在一些实施例中，M是(–OCH2CH2–)z，其中z是选自1至10的整数。在一些实施例中，z是选自1至5的整数。在一些实施例中，M是–OCH2CH2–、(–OCH2CH2–)2、(–OCH2CH2–)3、(–OCH2CH2–)4或(–OCH2CH2–)5。在一些实施例中，M是–OCH2CH2–、(–OCH2CH2–)2、(–OCH2CH2–)3或(–OCH2CH2–)4。在一些实施例中，M是(–OCH2CH2–)3。在一些实施例中，M是芳基。在一些实施例中，M是苯基。在一些实施例中，M是未取代的苯基。在一些实施例中，M是
Figure BDA0002428472100000611
在一些实施例中，M是被R7(例如1个R7)取代的苯基。在一些实施例中，M是
Figure BDA0002428472100000612
在一些实施例中，R7是CF3。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，P是不存在、杂环基或杂芳基。在一些实施例中，P是不存在。在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，P是三环、双环或单环杂芳基。在一些实施例中，P是单环杂芳基。在一些实施例中，P是含氮杂芳基。在一些实施例中，P是单环的含氮杂芳基。在一些实施例中，P是5元杂芳基。在一些实施例中，P是5元含氮杂芳基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基、吡咯基、噁唑基或噻唑基。在一些实施例中，P是四唑基、咪唑基、吡唑基或三唑基或吡咯基。在一些实施例中，P是咪唑基。在一些实施例中，P是
Figure BDA0002428472100000621
在一些实施例中，P是三唑基。在一些实施例中，P是1,2,3-三唑基。在一些实施例中，P是
Figure BDA0002428472100000622
在一些实施例中，P是杂环基。在一些实施例中，P是5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，P是咪唑啉酮。在一些实施例中，P是
Figure BDA0002428472100000623
在一些实施例中，P是硫代吗啉基-1,1-二氧化物。在一些实施例中，P是
Figure BDA0002428472100000624
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。在一些实施例中，Z是杂环基。在一些实施例中，Z为单环或双环杂环基。在一些实施例中，Z是含氧杂环基。在一些实施例中，Z是4元杂环基、5元杂环基或6元杂环基。在一些实施例中，Z是6元杂环基。在一些实施例中，Z是6元含氧杂环基。在一些实施例中，Z是四氢吡喃基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0002428472100000625
在一些实施例中，Z是4元含氧杂环基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0002428472100000626
在一些实施例中，Z是双环含氧杂环基。在一些实施例中，Z是邻苯二甲酸酐。在一些实施例中，Z是含硫杂环基。在一些实施例中，Z是6元含硫杂环基。在一些实施例中，Z是含有氮原子和硫原子的6元杂环基。在一些实施例中，Z是硫代吗啉基-1,1-二氧化物。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0002428472100000631
在一些实施例中，Z是含氮杂环基。在一些实施例中，Z是6元含氮杂环基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0002428472100000632
在一些实施例中，Z是双环杂环基。在一些实施例中，Z是任选地被一个或多个R5取代的双环含氮杂环基。在一些实施例中，Z是2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬基。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0002428472100000633
在一些实施例中，Z是1-氧杂-3,8-二氮杂螺[4.5]癸-2-酮。在一些实施例中，Z是
Figure BDA0002428472100000634
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是芳基。在一些实施例中，Z是单环芳基。在一些实施例中，Z是苯基。在一些实施例中，Z是单取代的苯基(例如，被1个R5取代)。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是含氮基团。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是NH2。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是含氧基团。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是含氧杂烷基。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5是OCH3。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5在邻位。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5在间位。在一些实施例中，Z是单取代的苯基，其中1个R5在对位。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是烷基。在一些实施例中，Z是C1-C12烷基。在一些实施例中，Z是C1-C10烷基。在一些实施例中，Z是C1-C8烷基。在一些实施例中，Z是被1-5个R5取代的C1-C8烷基。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基，其中R5是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1或–N(RC1)(RD1)。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基，其中R5是-ORA1或–C(O)ORA1。在一些实施例中，Z是被1个R5取代的C1-C8烷基，其中R5是-ORA1或–C(O)OH。在一些实施例中，Z是-CH3。
在一些实施例中，对于式(I)和(I-a)，Z是杂烷基。在一些实施例中，在一些实施例中，Z是C1-C12杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C10杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C8杂烷基。在一些实施例中，Z是C1-C6杂烷基。在一些实施例中，Z是任选地被一个或多个R5取代的含氮杂烷基。在一些实施例中，Z是被1-5个R5取代的含氮和含硫杂烷基。在一些实施例中，Z是N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺基。
在一些实施例中，Z是-ORA或-C(O)ORA。在一些实施例中，Z是-ORA(例如-OH或-OCH3)。在一些实施例中，Z是-C(O)ORA(例如–C(O)OH)。
在一些实施例中，Z是氢。
在一些实施例中，L2是键且P和L3独立地不存在。在一些实施例中，L2是键，P是杂芳基，L3是键，并且Z是氢。在一些实施例中，P是杂芳基，L3是杂烷基，并且Z是烷基。
在一些实施例中，式(I)的化合物是式(II)的化合物：
Figure BDA0002428472100000641
或其药学上可接受的盐，其中环M1是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被1-5个R3取代；环Z1是任选地被1-5个R5取代的环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地为氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤基、氰基、硝基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，或者R2a和R2b或R2c和R2d中的每一个合在一起形成氧代基团；X是不存在、N(R10)(R11)、O或S；RC是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基中的每一个任选地被1-6个R6取代；每个R3、R5和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1、–C(O)N(RC1)、SRE1、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R10和R11中的每一个独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–C(O)N(RC1)、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的每一个任选地被1-6个R7取代；每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基或杂环基；每个m和n独立地为1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000653
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(II)的化合物是式(II-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000651
或其药学上可接受的盐，其中环M2是任选地被一个或多个R3取代的芳基或杂芳基；环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b或R2c和R2d中的每一个合在一起形成氧代基团；X是不存在、O或S；每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；或两个R5合在一起形成与环Z2稠合的5-6元环；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000654
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(II-a)的化合物是式(II-b)的化合物：
Figure BDA0002428472100000652
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；p和q中的每一个独立地是0、1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000664
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(II-a)的化合物是式(II-c)的化合物：
Figure BDA0002428472100000661
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2c和R2d中的每一个合在一起形成氧代基团；每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；m是1、2、3、4、5或6；p和q中的每一个独立地是0、1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000665
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(I)的化合物是式(II-d)的化合物：
Figure BDA0002428472100000662
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；X是不存在、O或S；R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b或R2c和R2d中的每一个合在一起形成氧代基团；每个R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；m和n中的每一个独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000666
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(I)的化合物是式(III)的化合物：
Figure BDA0002428472100000663
或其药学上可接受的盐，其中M是烷基或芳基，其中每一个任选地被一个或多个R3取代；L3是任选地被一个或多个R2取代的烷基或杂烷基；Z是烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R5取代；R2a和R2b中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b合在一起形成氧代基团；每个R2、R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；n独立地是1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000673
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(III)的化合物是式(III-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000671
或其药学上可接受的盐，其中L3是烷基或杂烷基，其中每一个任选地被一个或多个R2取代；Z是烷基或杂烷基，其中每一个任选地被一个或多个R5取代；R2a和R2b中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b合在一起形成氧代基团；每个R2、R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；n独立地是1、2、3、4、5或6；并且
Figure BDA0002428472100000674
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(I)的化合物是具有式(IV)的化合物：
Figure BDA0002428472100000672
或其药学上可接受的盐，其中Z1是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被1-5个R5取代；R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤基、氰基、硝基、氨基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者R2a和R2b或R2c和R2d合在一起形成氧代基团；RC是氢、烷基、烯基，其中烷基和烯基中的每一个任选地被1-6个R6取代；R3、R5和R6中的每一个独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；q是0至25的整数；并且
Figure BDA0002428472100000683
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，具有式(IV)的化合物是具有式(IV-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000681
或其药学上可接受的盐，其中环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基、杂烷基、卤基；或者R2a和R2b或R2c和R2d合在一起形成氧代基团；R3和R5中的每一个独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；o和p各自独立地是0、1、2、3、4或5；q是0至25的整数；并且
Figure BDA0002428472100000684
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，式(IV-a)的化合物是式(IV-b)的化合物：
Figure BDA0002428472100000682
或其药学上可接受的盐，其中X是C(R’)(R”)、N(R’)或S(O)x；R'和R”中的每一个独立地是氢、烷基、卤素或环烷基；R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基、杂烷基或卤基；或者R2a和R2b或R2c和R2d合在一起形成氧代基团；R3和R5中的每一个独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；p是0、1、2、3、4或5；q是0至25的整数；x是0、1或2；并且
Figure BDA0002428472100000685
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
在一些实施例中，该化合物是式(I)的化合物。在一些实施例中，L2是键且P和L3独立地不存在。在一些实施例中，L2是键，P是杂芳基，L3是键，并且Z是氢。在一些实施例中，P是杂芳基，L3是杂烷基，并且Z是烷基。在一些实施例中，L2是键且P和L3独立地不存在。在一些实施例中，L2是键，P是杂芳基，L3是键，并且Z是氢。在一些实施例中，P是杂芳基，L3是杂烷基，并且Z是烷基。
在一些实施例中，该化合物是式(II-b)的化合物。在式(II-b)的一些实施例中，R2c和R2d中的每一个独立地是氢，m是1，q是0，p是0，并且Z是杂环基(例如，含氧杂环基)。在一些实施例中，式(II-b)的化合物是化合物100。
在一些实施例中，该化合物是式(II-c)的化合物。在式(II-c)的一些实施例中，R2c和R2d中的每一个独立地是氢，m是1，p是1，q是0，R5是–CH3，并且Z是杂环基(例如，含氮杂环基)。在一些实施例中，式(II-c)的化合物是化合物113。
在一些实施例中，该化合物是式(II-d)的化合物。在式(II-d)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢，m是1，n是3，X是O，p是0，并且Z是杂环基(例如，含氧杂环基)。在一些实施例中，式(II-d)的化合物是化合物110或化合物114。
在一些实施例中，该化合物是式(III-a)的化合物。在式(III-a)的一些实施例中，R2a和R2b中的每一个独立地是氢，n是1，q是0，L3是–CH2(OCH2CH2)2-，并且Z是–OCH3。在一些实施例中，式(III-a)的化合物是化合物112。
在一些实施例中，该化合物是式(IV-a)的化合物。在式(IV-a)的一些实施例中，R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢，m和n中的每一个独立地是1，p是0，q是3，o是0或1，R5如果存在，则是-NH2，并且Z是芳基或杂环基(例如，含氮杂环基)。在一些实施例中，式(IV-a)的化合物是化合物101或化合物102。
在一些实施例中，式(I)的化合物不是WO2012/112982、WO2012/167223、WO2014/153126、WO2016/019391、WO 2017/075630、US2012-0213708、US 2016-0030359或US 2016-0030360中披露的化合物。
在一些实施例中，式(I)的化合物包含化合物表1所示的化合物或其药学上可接受的盐。
化合物表1：示例性化合物
Figure BDA0002428472100000701
Figure BDA0002428472100000711
Figure BDA0002428472100000721
在一些实施例中，式(I)(例如式(I-a)、(II)、(II-b)、(II-c)、(II-d)、(III)、(III-a)、(IV)、(IV-a)或(IV-b))的化合物或其药学上可接受的盐选自：
Figure BDA0002428472100000722
Figure BDA0002428472100000723
或其盐。
在一些实施例中，本文所述的式(I)的化合物选自：
Figure BDA0002428472100000724
或任一化合物的药学上可接受的盐。
化学改性的可植入元件的特征
可植入元件可以用式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，或包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的材料涂覆。在一个实施例中，式(I)的化合物置于可植入元件的表面，例如内表面或外表面上。在一些实施例中，式(I)的化合物置于与可植入元件缔合的封闭部件的表面，例如内表面或外表面上。在一个实施例中，式(I)的化合物均匀地分布在表面上。在一个实施例中，式(I)的化合物不均匀地分布在表面上。
在一些实施例中，用式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的材料，或该化合物的药学上可接受的盐涂覆(例如，部分或完全覆盖)可植入元件(例如，或其封闭部件)。在一些实施例中，可植入元件(例如，或其封闭部件)涂覆有单层的式(I)化合物。在一些实施例中，装置涂覆有多层的式(I)化合物，例如至少2层、3层、4层、5层、10层、20层、50层或更多层。
在一个实施例中，可植入元件的表面的第一部分包含调节(例如下调或上调)生物学功能的式(I)化合物，而可植入元件的第二部分缺乏该化合物，或具有大大降低的化合物密度。
在一个实施例中，可植入元件的表面的第一部分包含调节(例如下调)免疫反应的式(I)化合物，并且该表面的第二部分包含例如上调免疫反应的式(I)的第二化合物，可植入元件的第二部分缺乏该化合物，或具有大大降低的化合物密度。
在一些实施例中，以对称方式用式(I)的化合物，或包含式(I)的化合物的材料，或该化合物的药学上可接受的盐涂覆或化学衍生化可植入元件。在一些实施例中，以非对称方式用式(I)的化合物，或包含式(I)的化合物的材料，或该化合物的药学上可接受的盐涂覆或化学衍生化可植入元件。例如，示例性的可植入元件可以部分涂覆(例如，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.9％涂覆)式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的材料，或该化合物的药学上可接受的盐。
用式(I)的化合物，或包含式(I)的化合物的材料，或该化合物的药学上可接受的盐涂覆或化学衍生化的示例性可植入元件可以使用本领域已知的任何方法来制备，诸如通过自我组装(例如，经由嵌段共聚物、吸附(例如，竞争性吸附)、相分离、微型制造或掩蔽)。
在一些实施例中，可植入元件包括表现出两种或更多种不同的物理化学性质(例如3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种物理化学性质)的表面。
在一些实施例中，将用式(I)的化合物、包含式(I)的化合物的材料或该化合物的药学上可接受的盐涂覆或化学衍生化示例性可植入元件的表面描述为：每个给定面积上附着的化合物的平均数量，例如密度。例如，示例性可植入元件的涂覆或化学衍生化的密度可以是例如在所述可植入元件的表面或内部，每平方微米或平方毫米0.01、0.1、0.5、1、5、10、15、20、50、75、100、200、400、500、750、1,000、2,500或5,000个化合物。
与不包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件相比，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件可以具有降低的免疫反应(例如，免疫反应的标志物)。免疫反应的标志物是以下一种或多种：例如通过ELISA测量的组织蛋白酶水平或免疫反应的标志物(例如TNF-α、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-4、CCL2或CCL4)的水平。在一些实施例中，与不包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件相比，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件具有降低约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％的免疫反应(例如，免疫反应的标志物)。在一些实施例中，降低的免疫反应(例如，免疫反应的标志物)是在约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月或更长时间后测量的。在一些实施例中，包含式(I)的化合物的可植入元件用式(I)的化合物涂覆或用式(I)的化合物包封。
与不包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件相比，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件可以具有提高的免疫反应(例如，免疫反应的标志物)。免疫反应的标志物是以下一种或多种：例如通过ELISA测量的组织蛋白酶活性或免疫反应的标志物(例如TNF-α、IL-13、IL-6、G-CSF、GM-CSF、IL-4、CCL2或CCL4)的水平。在一些实施例中，与不包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的可植入元件相比，包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的装置具有提高约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％或约1000％的免疫反应(例如，免疫反应的标志物)。在一些实施例中，提高的免疫反应(例如，免疫反应的标志物)是在约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月或更长时间后测量的。在一些实施例中，包含式(I)的化合物的可植入元件用式(I)的化合物涂覆或用式(I)的化合物包封。
可植入元件可具有光滑表面，或者可包括突起、凹陷、孔、狭缝或洞，或其任何组合。所述突起、凹陷、孔、狭缝或洞可以是任何大小，例如，从10μm至约1nm、约5μm至约1nm、约2.5μm至约1nm、1μm至约1nm、500nm至约1nm或约100nm至约1nm。该光滑表面或突起、凹陷、孔、狭缝或洞或其任何组合可以用式(I)的化合物、包含式(I)的化合物的材料或该化合物的药学上可接受的盐涂覆或化学衍生化。
可植入元件可以呈任何合适的形状，诸如球形、球状体、椭圆体、盘形、圆柱体、环形、立方体、stadiumoid、圆锥形、金字塔形、三角形、矩形、正方形或杆形，或者可以包括弯曲或平坦的截面。任何形状、弯曲或平坦的可植入元件都可以用式(I)的化合物，包含式(I)的化合物的材料或该化合物的药学上可接受的盐涂覆或化学衍生化。
治疗方法
本文描述了通过施用或植入例如被本文所述的材料或装置包封的RPE细胞来预防或治疗受试者的疾病、病症或病状的方法。在一些实施例中，本文所述的方法直接或间接地减少或减轻疾病、病症或病状的至少一种症状。在一些实施例中，本文所述的方法预防或减缓疾病、病症或病状的发作。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状影响身体系统，例如神经系统(例如，外周神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS))、血管系统、骨骼系统、呼吸系统、内分泌系统、淋巴系统、生殖系统或胃肠道。在一些实施例中，该疾病、病症或病状影响身体的一部分，例如血液、眼睛、脑、皮肤、肺、胃、口、耳、腿、足、手、肝、心脏、肾、骨、胰腺、脾脏、大肠、小肠、脊髓、肌肉、卵巢、子宫、阴道或阴茎。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是神经变性疾病、糖尿病、心脏病、自身免疫性疾病、癌症、肝病、溶酶体贮积病、凝血障碍或凝结障碍、矫形外科病状、氨基酸代谢紊乱。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是神经变性疾病。示例性的神经变性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、亨廷顿病(Huntington's disease)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、多发性硬化(MS)和脑瘫(CP)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubro-pallidoluysian atrophy，DRPLA)、神经元核内透明包涵体疾病(NIHID)、路易体痴呆、唐氏综合征(Down's syndrome)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、朊病毒病、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(cortocobasal degeneration)、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、库贾氏病(Jakob-Creutzfeldtdisease)、尼曼－皮克病(Niemann-Pick disease)3型、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、脊髓小脑共济失调、皮克氏病(Pick's disease)和齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是自身免疫疾病，例如硬皮病、多发性硬化、狼疮或过敏。
在一些实施例中，该疾病是肝脏疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、NASH。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是癌症。示例性的癌症包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肺癌、脑癌(例如，胶质母细胞瘤)、肉瘤、胰腺癌、肾癌、肝癌、睾丸癌、前列腺癌或子宫癌。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是骨科病症。示例性的骨科病症包括骨质疏松症、骨坏死、佩吉特病(Paget’s disease)或骨折。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是溶酶体贮积病。示例性的溶酶体贮积病包括戈谢病(Gaucher disease)(例如，I型、II型、III型)、泰-萨二氏病(Tay-Sachsdisease)、法布里病(Fabry disease)、法伯病(Farber disease)、贺勒氏综合征(Hurlersyndrome)(也称为黏多糖贮积症I型(MPS I))、亨特氏综合征(Hunter syndrome)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、尼曼－皮克病(Niemann-Pick disease)、萨拉病(Salla disease)、沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)(也称为黏多糖贮积症IIIA型(MPS3A))、多种硫酸酯酶缺乏症、马-拉综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)、异染性脑白质营养不良、克拉伯病(Krabbe disease)、施艾氏综合征(Scheie syndrome)、贺勒氏-施艾氏综合征(Hurler-Scheie syndrome)、史莱氏综合征(Sly syndrome)、透明质酸酶缺乏症、蓬佩病(Pompedisease)、Danon病、神经节苷脂贮积病或莫奎欧氏综合征(Morquio syndrome)。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是凝血障碍或凝结障碍。示例性的凝血障碍或凝结障碍包括血友病(例如，血友病A或血友病B)、冯维勒布兰德病(Von Willebranddisease)、血小板减少症、尿毒症、Bernard-Soulier综合征、因子XII缺乏症、维生素K缺乏症或先天性无纤维蛋白原血症。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是氨基酸代谢障碍，例如苯丙酮尿症、酪氨酸血症(例如，1型或2型)、尿黑酸尿症、高胱氨酸尿症、高同型半胱氨酸血症、枫糖尿病。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是脂肪酸代谢障碍，例如高脂血症、高胆固醇血症、半乳糖血症。
在一些实施例中，该疾病、病症或病状是嘌呤或嘧啶代谢障碍，例如莱施-尼汉综合征(Lesch-Nyhan syndrome)。
本披露进一步包括用于鉴定患有或怀疑患有本文所述的疾病、病症或病状的受试者，并且在此类鉴定之后，向受试者施用包含活性细胞(例如，RPE细胞)的可植入元件或其组合物的方法，该活性细胞例如，任选地被封闭部件包封，并且任选地被本文所述的式(I)的化合物改性。
药物组合物、试剂盒以及施用
本披露进一步包括包含活性细胞(例如，RPE细胞)的可植入元件，以及包含活性细胞的药物组合物及其试剂盒。
在一些实施例中，药物组合物包含活性细胞(例如，RPE细胞)和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞、包封工程化RPE细胞的水凝胶胶囊)和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，在药物组合物中提供有效量的活性细胞(例如，RPE细胞)。在一些实施例中，该有效量是治疗有效量。在一些实施例中，该有效量是预防有效量。
本文描述的药物组合物可以通过药理学领域中已知的任何方法来制备。一般而言，此类制备方法包括以下步骤：使活性细胞(例如，RPE细胞或包封这些RPE细胞的水凝胶胶囊，即“活性成分”)与载体和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后，如果需要和/或期望，则将产品成形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
药物组合物可以呈散装、呈单一单位剂量和/或呈多个单一单位剂量进行制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用给受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的适宜分数，例如此类剂量的一半或三分之一。
本披露的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量将根据所治受试者的特性、大小和/或状况，并进一步根据施用组合物的途径而变化。举例来说，该组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指不会破坏与其一起配制的化合物的药理学活性的一种无毒的载体、佐剂、稀释剂或媒介物。可用于制造本披露的药物组合物的药学上可接受的赋形剂是药物配制领域中公知的任何赋形剂，包括惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。可用于制造本披露的药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
活性细胞(例如，RPE细胞)、可植入元件及其组合物可以口服、经胃肠外(包括皮下、肌内和皮内)、局部、直肠、鼻、肿瘤内、鞘内、颊、阴道或经由植入贮库施用。在一些实施例中，提供的化合物或组合物皮下施用或通过植入物施用。
在一些实施例中，可以将活性细胞(例如，RPE细胞)、可植入元件(例如，包封RPE细胞的水凝胶胶囊)及其组合物施用或植入于身体某一区域(诸如粘膜表面或体腔)内部或其上。施用或植入的示例性部位包括腹膜腔(例如，小囊)、脂肪组织、心脏、眼睛、肌肉、脾脏、淋巴结、食道、鼻、窦、牙齿、牙龈、舌、口、喉、小肠、大肠、甲状腺、骨骼(例如，髋部或关节)、乳房、软骨、阴道、子宫、输卵管、卵巢、阴茎、睾丸、血管、肝脏、肾脏、中枢神经系统(例如，脑、脊髓、神经)或耳朵(例如，耳蜗)。
在一些实施例中，在除中枢神经系统(例如，脑、脊髓、神经)以外的部位施用或植入活性细胞(例如，RPE细胞)、可植入元件及其组合物。在一些实施例中，在除眼睛(例如，视网膜)以外的部位施用或植入活性细胞(例如，RPE细胞)、可植入元件及其组合物。
本披露的这些组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域中已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的载体以及溶剂有水、林格氏溶液以及等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。
对于眼科用途，提供的药学上可接受的组合物可以配制成微粉化悬浮液或软膏如矿脂。
为了延长活性成分的作用，可能需要减慢皮下或肌内注射药物的吸收。
在一些实施例中，将活性细胞(例如，RPE细胞)置于微载体(例如珠粒，例如聚苯乙烯珠粒)上。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适于对人类进行施用的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适于向各种动物施用。为了使组合物适于向各种动物施用，对适于向人施用的药物组合物的修饰得到很好的理解，并且普通技术的兽医药理师可以通过普通的实验来设计和/或进行此类修饰。
为了便于施用和剂量均一性，可以将活性细胞(例如RPE细胞)、可植入元件及其组合物配制成单位剂型，例如单一单位剂型。然而应该理解，本披露的组合物的总剂量和使用方案将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定受试者或生物体的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和病症的严重程度；所用特定活性成分的活性；所用的特定组合物；受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所用特定活性成分的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所用特定活性成分组合使用或同时使用的药物；以及医学领域公知的因素。
达到有效量所需的本文所述的组合物的确切量将因受试者而异，例如取决于受试者的物种、年龄和总体状况，副作用或病症的严重程度，特定化合物的特性，施用模式等。可以递送所需剂量一天三次、一天两次、一天一次、隔天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每三个月一次、每六个月一次、每年一次或更低频率递送。在某些实施例中，可以使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所需剂量。在某些实施例中，在去除所有或基本上所有先前施用的水凝胶胶囊之后递送包封工程化RPE细胞的水凝胶胶囊的所需剂量。
应当理解的是，如本文所述的组合物可以与一种或多种另外的药学试剂组合施用。这些化合物或组合物可以与另外的药学试剂结合施用，这些药学试剂提高化合物或组合物的生物利用率，减少和/或改善它们的新陈代谢，抑制它们的排泄和/或改善它们在身体内的分布。也应当认识到的是，所用的疗法对于相同病症可以达到所需效果，和/或可以达到不同的效果。
该组合物可以与一种或多种另外的药学试剂同时，在其之前或之后施用，这些药学试剂可以用作例如组合疗法。药学试剂包括治疗活性剂。药学试剂也包括预防活性剂。每种另外的药学试剂可以按对于该药学试剂确定的剂量或时间计划表进行施用。另外的药学试剂也可以互相一起和/或与本文所述的化合物或组合物一起以单剂量施用或以不同的剂量单独施用。方案中采用的特定组合将考虑本发明化合物与另外的药学试剂的相容性和/或要达到的所需治疗和/或预防效果。一般而言，期望组合利用的另外的药学试剂的利用水平不超过其单独利用时的水平。在一些实施例中，组合利用的水平将会低于其单独利用时的水平。
示例性的另外的药学试剂包括但不限于抗增殖剂、抗癌剂、抗糖尿病剂、抗炎剂、免疫抑制剂和疼痛缓解剂。药学试剂包括有机小分子诸如药物化合物(例如，Code ofFederal Regulations(CFR)[美国联邦法规]所提供的由美国食品和药物管理局(U.S.Foodand Drug Administration)批准的化合物)、肽、蛋白质、碳水化合物、单糖、寡糖、多糖、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白质、与蛋白质连接的小分子、糖蛋白、类固醇、核酸、DNA、RNA、核苷酸、核苷、寡核苷酸、反义寡核苷酸、脂质、激素、维生素和细胞。
本披露还涵盖了试剂盒(例如，药物包)。本发明的试剂盒可用于预防和/或治疗本文所述的任何疾病、病症或病状。提供的试剂盒可包含本发明的药物组合物或装置和容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分配器包装，或其他合适的容器)。在一些实施例中，提供的试剂盒可任选地进一步包括第二容器，该第二容器包含用于稀释或悬浮本发明药物组合物或装置的药物赋形剂。在一些实施例中，将容器和第二容器中提供的本发明药物组合物或装置组合形成一个单位剂型。
列举的示例性实施例
1.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个工程化活性细胞产生或释放治疗剂(例如，核酸(例如核苷酸、DNA或RNA)、多肽、脂质、糖(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)或小分子)，其中：
a)该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该可植入元件例如当植入受试者体内时或通过本文所述的参考方法进行评价时，产生或释放治疗剂至少5天、至少10天、至少一个月或至少3个月，参考方法例如：针对核酸的聚合酶链反应或原位杂交；针对脂质、糖和小分子的质谱分析；针对经过荧光或发光标签修饰的药剂的显微镜检查和其他成像技术，以及针对多肽的ELISA或蛋白质印迹法；
b)该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该可植入元件例如当在体外培养时，或当植入受试者体内或当通过参考方法(例如，以上a)部分中列出的适用参考方法)进行评价时，每天产生或释放至少10皮克的治疗剂，例如每天产生至少10皮克的治疗剂，持续至少5天；
c)例如，正如通过以上部分a)中列出的适用参考方法进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该可植入元件，以例如每天至少10皮克治疗剂的速率产生或释放治疗剂，该速率是对照细胞在例如未包封在可植入元件中或未嵌入或植入受试者体内时产生的速率的至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)；
d)例如，正如通过以上部分a)中列出的适用参考方法进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该可植入元件产生或释放治疗剂至少5天，并且每天释放的量变化不超过50％(例如，至少约40％、约30％、约20％、约10％、约5％或更少)；
e)例如，正如通过以上部分a)中列出的适用参考方法进行评价的那样，在将该可植入元件引入受试者体内后，该多个工程化活性细胞或该可植入元件产生或释放足够的治疗剂，使得距所引入的元件至少约5cm、约10cm、约25cm、约50cm、约75cm、约100cm或约150cm的位置接收到有效浓度(例如，治疗有效浓度)的治疗剂(例如，在胰腺、肝脏、血液中或眼睛外部发现的治疗有效浓度)；
f)例如，正如通过以上部分a)中列出的适用参考方法进行评价的那样，该多个工程化活性细胞或该可植入元件产生或释放足够的治疗剂，使得当该元件嵌入或植入受试者的腹膜腔时，例如在距工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)至少5cm、10cm、25cm、约50cm、75cm、100cm或150cm的位置发现可检测水平的治疗剂(例如，10皮克)；
g)例如，正如通过以上部分a)中列出的适用参考方法进行评价的那样，引入受试者体内后，该多个工程化活性细胞或该可植入元件产生或释放足够的治疗剂，使得产生或释放的约50％的治疗剂(产生或释放的约60％、约70％、约80％、约90％或约99％的治疗剂)进入受试者的循环(例如，外周循环)；
h)例如，正如通过荧光素标记的抗体测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)或流式细胞术进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)能够吞噬，例如与参考非工程化活性细胞(例如，非工程化RPE细胞)相比，能够具有约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、70％、约60％或约50％的吞噬作用水平；
i)例如，正如通过5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法、阳离子两亲示踪剂(CAT)测定法或显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)、对LC3和p62的免疫印迹分析、通过荧光显微镜术检测自噬小体的形成，以及通过串联mRFP-GFP荧光显微镜术监测自噬小体的成熟进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)能够自我吞噬，例如与参考非工程化活性细胞(例如，非工程化RPE细胞)相比，能够具有约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、70％、约60％或约50％的自我吞噬作用水平；
j)该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)具有本文所述的形状因数，例如，作为工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的群集、球状体或聚集体；
k)例如，正如通过固定、显微镜检查进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)具有或能够具有每个细胞的平均最小数量的接合(例如，紧密接合)；
l)该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)置于非细胞载体(例如，微载体，例如珠粒，例如聚酯、聚苯乙烯或聚合物珠粒)上；
m)例如，正如通过显微镜检查(例如，5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU)测定法)进行确定的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)在包封在可植入元件中后增殖或能够增殖；
n)例如，正如通过显微镜检查(例如，5-乙炔基-2’脱氧尿苷(EdU)测定法)进行确定的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)在包封在可植入元件中后不增殖或不能够增殖；或者
o)在引入、施用或植入受试者体内后，该多个工程化活性细胞或该可植入元件产生或释放足够的治疗剂，使得在外周血流中发现有效浓度(例如，治疗有效浓度)的治疗剂(例如，在胰腺、肝脏、血液中或眼睛外部发现治疗有效浓度)。
2.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)例如当植入受试者体内时或当通过参考方法(例如，ELISA或蛋白质印迹法)进行评价时产生或释放多肽至少5天。
3.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)例如当植入受试者体内时或当通过参考方法(例如，ELISA或蛋白质印迹法)进行评价时，每天产生或释放至少10皮克多肽，例如每天产生至少10皮克多肽，持续至少5天。
4.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过ELISA或蛋白质印迹法进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)以每天至少10皮克多肽的速率产生或释放多肽，该速率是未包封在可植入元件中或未嵌入或植入受试者体内的参考细胞的速率的至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％)。
5.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过ELISA或蛋白质印迹法进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)产生或释放多肽至少5天并且每天释放的量变化不超过50％(例如，至少约40％、约30％、约20％、约10％、约5％或更少)。
6.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中在将该元件引入受试者体内后，产生或释放足够的多肽，使得距该元件至少约5cm、约10cm、约25cm、约50cm、约75cm、约100cm或约150cm的位置接收到有效浓度(例如，治疗有效浓度)的多肽(例如，在胰腺、肝脏、血液中或眼睛外部发现的治疗有效浓度)。
7.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中在产生或释放足够的多肽，使得在将该元件嵌入或植入受试者的腹膜腔时，例如在距该元件至少5cm、10cm、25cm、50cm、75cm、100cm或150cm的位置发现可检测水平的多肽(例如，10皮克)。
8.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中在将该元件引入受试者体内后，产生或释放足够的多肽，使得产生或释放的约50％的多肽(产生或释放的约60％、约70％、约80％、约90％或约99％的治疗性多肽)进入受试者的循环(例如，外周循环)。
9.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过荧光素标记的抗体测定法、显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)或流式细胞术进行评价的那样，该工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)能够吞噬，例如与参考非工程化活性细胞(例如，非工程化RPE细胞)相比，能够具有约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、70％、约60％或约50％的吞噬作用水平。
10.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过5-乙炔基-2'脱氧尿苷(EdU)测定法、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)测定法、阳离子两亲示踪剂(CAT)测定法或显微镜检查(例如，荧光显微镜检查(例如，纺锤体形成的延时或评价)、对LC3和p62的免疫印迹分析、通过荧光显微镜术检测自噬小体的形成，以及通过串联mRFP-GFP荧光显微镜术监测自噬小体的成熟进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)能够自我吞噬，例如与参考非工程化活性细胞(例如，非工程化RPE细胞)相比，能够具有约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、70％、约60％或约50％的自我吞噬作用水平。
11.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中提供的该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)具有本文所述的形状因数，例如，作为工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的群集、球状体或聚集体。
12.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过固定、显微镜检查进行评价的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)具有或能够具有每个细胞的平均最小数量的接合(例如，紧密接合)。
13.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)置于非细胞载体(例如，微载体，例如珠粒，例如聚酯、聚苯乙烯或聚合物珠粒)上。
14.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过显微镜检查进行测定的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)在包封在该可植入元件中后增殖或能够增殖。
15.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中例如，正如通过显微镜检查进行测定的那样，该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)在包封在该可植入元件中后不增殖或不能够增殖。
16.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含促进和/或调节多肽(例如治疗性多肽)的产生的外源核酸，其中在引入、施用或植入受试者体内后，产生或释放足够的多肽，使得在外周血流中发现有效浓度(例如，治疗有效浓度)的多肽(例如，在胰腺、肝脏、血液中或眼睛外部发现治疗有效浓度)。
17.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个工程化活性细胞产生或释放治疗剂(例如，核酸(例如核苷酸、DNA或RNA)、多肽、脂质、糖(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)或小分子)。
18.实施例2至17中任一项，其中该外源核酸是RNA(例如，mRNA)分子或DNA分子。
19.实施例1至18中任一项，其中该多肽或治疗剂选自由因子I、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XIII多肽组成的组。
20.如实施例1至19中任一项所述的可植入元件，其中该多肽或治疗剂是胰岛素多肽(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)。
21.如实施例1至18中任一项所述的可植入元件，其中该多肽或治疗剂不是胰岛素多肽(例如，不是胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原中的任一种)。
22.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含编码因子VIII-BDD(FVIII-BDD)氨基酸序列的外源核酸。
23.如实施例22所述的可植入元件，其中该FVIII-BDD氨基酸序列选自由以下序列组成的组：
a)SEQ ID NO:1；
b)SEQ ID NO:3；
c)SEQ ID NO:4；
d)SEQ ID NO:5；
e)SEQ ID NO:6；
f)SEQ ID NO:7；
g)在位置787处具有丙氨酸而不是精氨酸并且在位置790处具有丙氨酸而不是精氨酸的SEQ ID NO:7；
h)(a)、(b)、(c)、(d)、(f)或(g)中序列的保守性取代变体；以及
i)与(a)、(b)、(c)、(d)、(f)、(g)或(h)中的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
24.如实施例22所述的可植入元件，其中该外源核酸包含编码序列，该编码序列
a)选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27；或者
b)与a)中列出的任何序列具有至少98％、99％或更高序列同一性的核苷酸序列。
25.如实施例25所述的可植入元件，其中该外源核酸包含选自由SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27组成的组的编码序列。
26.如实施例22至25中任一项所述的可植入元件，其中该外源核酸包含SEQ IDNO:16或SEQ ID NO:27。
27.一种包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件，该多个中的每个细胞均包含编码因子IX(FIX)氨基酸序列的外源核酸。
28.如实施例24所述的可植入元件，其中该FIX氨基酸序列是SEQ ID NO:2或其保守性取代变体，或与SEQ ID NO:2或该保守性取代变体具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
28a.如实施例24所述的可植入元件，其中该FIX氨基酸序列是SEQ ID NO:36或其保守性取代变体，或与SEQ ID NO:36或其保守性取代变体具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
29.如实施例27或28中任一项所述的可植入元件，其中该外源核酸包含编码序列，该编码序列
a)选自由SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:28组成的组；或者
b)与(a)中的任何序列具有至少98％、99％或更高序列同一性。
30.如实施例27至29中任一项所述的可植入元件，其中该外源核酸包含SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:28。
31.一种工程化活性细胞，例如RPE细胞，或包含该活性细胞的可植入元件，其中该活性细胞包含外源核酸，该外源核酸包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该启动子序列基本上由或由SEQ ID NO:23组成，或者与SEQ ID NO:23具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
32.如实施例30所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成，该氨基酸序列是：
a)FVIII-BDD氨基酸序列，例如选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和在位置787和790中的每一处具有丙氨酸而不是精氨酸的SEQ ID NO:7组成的组的序列；
b)FIX氨基酸序列，例如SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；
c)白细胞介素2氨基酸序列，例如SEQ ID NO:29或与SEQ ID NO:29具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；
d)甲状旁腺激素氨基酸序列，例如SEQ ID NO:30或与SEQ ID NO:30具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列；或者
e)血管性血友病因子氨基酸序列，例如SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33或与SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:33具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
33.如实施例31或32中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽包含SEQ ID NO:10，并且该编码序列包含SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16具有至少99％序列同一性的序列。
34.如实施例30或32中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:2，并且该编码序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19具有至少99％序列同一性的序列。
35.如实施例30-34中任一项所述的活性细胞或可植入元件，其中该多肽还包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35。
36.如实施例30至35中任一项所述的活性细胞或可植入元件，其中该外源核酸包含紧邻该编码序列上游的科扎克序列。
37.如实施例36所述的活性细胞或可植入元件，其中该科扎克序列是SEQ ID NO:26的核苷酸2094-2099。
38.如实施例30至37中任一项所述的活性细胞或可植入元件，其中该启动子序列是SEQ ID NO:23。
39.一种工程化RPE细胞(例如，工程化ARPE-19细胞)或包含该工程化RPE细胞的可植入元件，其中该工程化RPE细胞包含外源核酸，其中该外源核酸包含选自由以下序列组成的组的编码序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
40.如实施例39所述的工程化RPE细胞或可植入元件，其中该外源核酸包含与所选编码序列可操作地连接的SEQ ID NO:23。
41.如实施例40所述的工程化RPE细胞或可植入元件，其中该外源核酸包含紧邻该编码序列上游的科扎克序列。
42.如实施例39至41中任一项所述的工程化RPE细胞或可植入元件，其中该外源核酸包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28。
43.如前述实施例中任一项所述的可植入元件或工程化细胞，其被提供作为疾病的治疗。
44.如实施例43所述的可植入元件或工程化细胞，其中该疾病是凝血疾病或溶酶体贮积病(例如，血友病(例如，血友病A或血友病B)、法布里病、高雪氏病、庞贝病或MPS I)。
45.如前述实施例中任一项所述的可植入元件或工程化细胞，其被提供作为预防性治疗。
46.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其配制成用于注射到受试者体内(例如，腹膜内、肌内或皮下注射)或配制成用于植入受试者体内(例如，植入腹膜腔，例如小囊)。
47.如前述实施例中任一项所述的可植入元件或工程化细胞，其植入或注射到受试者的小囊、网膜或皮下脂肪中。
48.如前述实施例中任一项所述的可植入元件或工程化细胞，将其施用于第一受试者，例如通过验血测定的那样，相对于第二个受试者(例如，健康受试者)，该第一受试者具有少于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％或1％的多肽(例如，凝血因子，例如因子I、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI或因子XIII)。
49.如前述实施例中任一项所述的可植入元件或工程化细胞，其中监测受试者中生物标志物(例如，血清生物标志物)的水平，例如以测定治疗功效的水平。
50.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其包含工程化活性细胞群集(例如，工程化RPE细胞群集)或微载体(例如，包含一个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的珠粒或基质)。
51.如实施例50所述的可植入元件，其中该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该微载体(例如，包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的珠粒或基质)产生多个多肽。
52.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其中该可植入元件包含封闭部件。
53.如实施例52所述的可植入元件，其中该封闭部件是在一个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)、多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)上或周围原位形成的。
54.如权利要求52所述的可植入元件，其中该封闭部件是在与封闭的一个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)、多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或包含一个或多个活性细胞的微载体(例如，珠粒或基质)组合之前预先形成的。
55.如实施例52-54中任一项所述的可植入元件，其中该封闭部件包含柔性聚合物(例如，PLA、PLG、PEG、CMC或多糖，例如藻酸盐)。
56.如实施例52-54中任一项所述的可植入元件，其中该封闭部件包含非柔性聚合物或金属外壳。
57.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其经化学改性。
58.如实施例52-57中任一项所述的可植入元件，其中该封闭部件经化学改性。
59.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其中该可植入元件或其封闭部件用式(I)的化合物：
Figure BDA0002428472100000911
或其盐改性，其中：
A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–、–N(RC)–、–N(RC)C(O)–、–C(O)N(RC)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、–N(RC)N(RD)–、–NCN–、–C(＝N(RC)(RD))O–、–S–、–S(O)x–、–OS(O)x–、–N(RC)S(O)x–、–S(O)xN(RC)–、–P(RF)y–、–Si(ORA)2–、–Si(RG)(ORA)–、–B(ORA)–或金属，其中每个烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基连接至附接基团(例如，本文定义的附接基团)，并且任选地被一个或多个R1取代；
L1和L3中的每一个独立地是键、烷基或杂烷基，其中每个烷基和杂烷基任选地被一个或多个R2取代；
L2是键；
M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R3取代；
P是不存在、环烷基、杂环基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R4取代；
Z是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、–ORA、–C(O)RA、–C(O)ORA、–C(O)N(RC)(RD)、–N(RC)C(O)RA、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R5取代；
每个RA、RB、RC、RD、RE、RF和RG独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、叠氮基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R6取代；
或RC和RD与它们所附接的氮原子合在一起形成任选地被一个或多个R6取代的环(例如5-7元环)；
每个R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1、–C(O)N(RC1)、SRE1、S(O)xRE1、–OS(O)xRE1、–N(RC1)S(O)xRE1、–S(O)xN(RC1)(RD1)、–P(RF1)y、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个RA1、RB1、RC1、RD1、RE1和RF1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基或杂环基；
x是1或2；以及
y是2、3或4。
60.如实施例59所述的可植入元件，其中所述式(I)的化合物是式(II)的化合物：
(II)，
或其药学上可接受的盐，其中：
环M1是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被1-5个R3取代；
环Z1是任选地被1-5个R5取代的环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤基、氰基、硝基、氨基、氧代、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
X是不存在、N(R10)(R11)、O或S；
RC是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基中的每一个任选地被1-6个R6取代；
R3、R5和R6中的每一个独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1、–C(O)N(RC1)、SRE1、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R10和R11中的每一个独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–C(O)N(RC1)、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的每一个任选地被1-6个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基或杂环基；
m和n中的每一个独立地是0、1、2、3、4、5或6；
并且
Figure BDA0002428472100000932
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
61.如实施例60所述的可植入元件，其中所述式(II)的化合物是式(II-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000931
或其药学上可接受的盐，其中：
环M2是芳基或杂芳基；
环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基、杂烷基或氧代；
X是不存在、O或S；
每个R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1或–C(O)N(RC1)；
或两个R5合在一起形成与环Z2稠合的5-6元环；
每个RA1、RB1、RC1、RD1和RE1独立地是氢、烷基、杂烷基；
m和p各自独立地是0、1、2、3、4、5或6；以及
Figure BDA0002428472100000941
是指与可植入元件或其封闭部件(例如，可植入元件或其封闭部件)的连接。
62.如实施例60所述的可植入元件，其中所述式(II-a)的化合物是式(II-b)的化合物：
Figure BDA0002428472100000942
或其药学上可接受的盐，其中：
环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；
每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；
p和q中的每一个独立地是0、1、2、3、4、5或6；
并且
Figure BDA0002428472100000943
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
63.如实施例60所述的可植入元件，其中所述式(II-a)的化合物是式(II-c)的化合物：
Figure BDA0002428472100000944
或其药学上可接受的盐，其中：
环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2c和R2d中的每一个合在一起形成氧代基团；
每个R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；
每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；
m是1、2、3、4、5或6；
p和q中的每一个独立地是0、1、2、3、4、5或6；
并且
Figure BDA0002428472100000951
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
64.如实施例60所述的可植入元件，其中所述式(II-a)的化合物是式(II-d)的化合物：
Figure BDA0002428472100000952
或其药学上可接受的盐，其中：
环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
X是不存在、O或S；
R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b或R2c和R2d中的每一个合在一起形成氧代基团；
每个R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；
每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；
m和n中的每一个独立地是1、2、3、4、5或6；
p是0、1、2、3、4、5或6；
并且
Figure BDA0002428472100000953
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
65.如实施例59所述的可植入元件，其中所述式(I)的化合物是式(III-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000954
或其药学上可接受的盐，其中
L3是烷基或杂烷基，其中每一个任选地被一个或多个R2取代；
Z是烷基或杂烷基，其中每一个任选地被一个或多个R5取代；
R2a和R2b中的每一个独立地是氢、烷基或杂烷基，或者R2a和R2b合在一起形成氧代基团；
每个R2、R3和R5独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；
每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；
n独立地是1、2、3、4、5或6；
并且
Figure BDA0002428472100000961
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
66.如实施例59所述的可植入元件，其中所述式(I)的化合物是式(IV-a)的化合物：
Figure BDA0002428472100000962
或其药学上可接受的盐，其中
环Z2是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2a、R2b、R2c和R2d中的每一个独立地是氢、烷基、杂烷基、卤基；或者R2a和R2b或R2c和R2d合在一起形成氧代基团；
R3和R5中的每一个独立地是烷基、杂烷基、卤素、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1或–C(O)RB1；每个RA1和RB1独立地是氢、烷基或杂烷基；
m和n各自独立地是1、2、3、4、5或6；
o和p各自独立地是0、1、2、3、4或5；
q是0至25的整数；
并且
Figure BDA0002428472100000963
是指与本文所述的附接基团或聚合物的连接。
67.如实施例59至66中任一项所述的可植入元件，其中所述式(I)的化合物是化合物表1中所示的化合物。
68.如实施例59至67中任一项所述的可植入元件，其中该化合物选自：
Figure BDA0002428472100000971
Figure BDA0002428472100000972
或其盐。
69.如实施例59至67中任一项所述的可植入元件，其中该化合物选自化合物表1中的化合物110、化合物112、化合物113或化合物114。
70.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其中该可植入元件在植入受试者体内后至少30天、2个月、3个月、6个月、9个月或12个月基本上不降解。
71.如前述实施例中任一项所述的可植入元件，其中该可植入元件可以例如在植入后约5天后从受试者体内移除而对周围组织无明显损伤。
72.一种治疗受试者或向受试者提供产品(例如，治疗产品)的方法，其包括：
向该受试者施用或提供如实施例1至69中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞，从而治疗该受试者或向该受试者提供产品(例如，治疗产品)。
73.如实施例72所述的方法，其包括治疗该受试者。
74.如实施例73所述的方法，其包括向该受试者提供产品(例如，治疗产品)。
75.如实施例72至74中任一项所述的方法，其中该受试者是人。
76.如实施例72至75中任一项所述的方法，其中该工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)是人细胞(例如，人RPE细胞)。
77.如实施例72至76中任一项所述的方法，其中该多肽是抗体(例如，抗神经生长因子抗体)、酶(例如，α-半乳糖苷酶)或凝结因子(例如凝血因子，例如活化凝血因子)。
78.如实施例72至77中任一项所述的方法，其中该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该可植入元件被提供作为疾病的治疗。
79.如实施例78所述的方法，其中该疾病是凝血疾病或溶酶体贮积病(例如，血友病(例如，血友病A或血友病B)、法布里病、高雪氏病、庞贝病或MPS I)。
80.如实施例78所述的方法，其中该疾病是糖尿病。
81.如实施例78所述的方法，其中该疾病不是糖尿病。
82.如实施例72至77中任一项所述的方法，其中将该可植入元件施用于第一受试者，例如通过验血测定的那样，相对于第二个受试者(例如，健康受试者)，该第一受试者具有少于约50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％或1％的多肽(例如，凝血因子，例如因子I、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI或因子XIII)。
83.如实施例72至82中任一项所述的方法，其中监测受试者中生物标志物(例如，血清生物标志物)的水平，例如以测定治疗功效的水平。
84.如实施例72至83中任一项所述的方法，其中将该可植入元件施用、植入或提供到除中枢神经系统、脑、脊柱、眼睛或视网膜以外的部位。
85.如实施例72至83中任一项所述的方法，其中将该可植入元件施用、植入或提供到距中枢神经系统、脑、脊柱、眼睛或视网膜至少约1、2、5或10厘米的部位。
86.一种制备或制造包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的方法，其包括：
提供多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，例如本文所述的工程化活性细胞，并且
将该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)置于封闭部件，例如本文所述的封闭部件中，
从而制备或制造该可植入元件。
87.一种评价包含多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件的方法，其包括：
提供包含多个本文所述的工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的可植入元件；并且
评价该可植入元件或该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的结构或功能参数，
从而评价该可植入元件。
88.如实施例87所述的方法，其包括在体外培养该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或在动物例如非人类动物或人类受试者体内培养该工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)或该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。
89.如实施例87或88所述的方法，其包括针对以下一项或多项评价该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)：
活力；
工程化多肽的产生；
工程化RNA的产生；
营养物或氧气的摄取；或者
废产物的产生。
90.如实施例87至89中任一项所述的方法，其还包括：如果以下一项或多项满足预定值，则将该可植入元件配制成药品：活力；工程化多肽的产生；工程化RNA的产生；营养物或氧气的摄取；或废弃物的产生。
91.如实施例87至90中任一项所述的方法，其包括评价与形状因数例如本文所述的形状因数有关的细胞参数。
92.如实施例87至91中任一项所述的方法，其中在将该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)置于该可植入元件中之后至少1、5、10、20、30或60天进行评价。
93.如实施例72-79中任一项所述的方法，其中在开始培养这些工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)后至少1、5、10、20、30或60天进行评价。
94.如实施例1至70中任一项所述的监测可植物元件的方法，其包括：
例如，通过测试该受试者或来自该受试者的样品，获得该受试者中该多个工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)释放的组分(例如，多肽)的水平，或
例如，通过测试该受试者或来自该受试者的样品，获得取决于该组分活性的产物水平，
从而监测或评价该可植入元件。
95.如实施例94所述的方法，其中测量外周循环中，例如外周血中的该组分。
96.如实施例91至95中任一项所述的方法，其中将该组分(例如，多肽)的水平与参考值进行比较。
97.如实施例91至96中任一项所述的方法，其中响应于该水平或比较，将该受试者分类为例如需要或不需要另外的可植入元件或另外的工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。
98.如实施例91至97中任一项所述的方法，该方法包括(例如，响应于该水平或比较)，从该受试者中取回该可植入元件或这些工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。
99.如实施例91至98中任一项所述的方法，该水平是在施用(例如，植入或注射)可植入元件或工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)之后约1小时至约30天或在预先评价之后约1小时至约30天获得的。
100.具有预选形状因数或本文披露的形状因数的多个活性细胞(例如，RPE细胞)。
101.如实施例100所述的多个活性细胞(例如，RPE细胞)，其中该形状因数包括工程化活性细胞(例如，RPE细胞)的群集。
102.如实施例101所述的多个活性细胞(例如，RPE细胞)，其中该群集包含至少约100、200、300、400或500个活性细胞(例如，RPE细胞)。
103.一种包括多个腔室的基板，其中该多个腔室中的每个腔室均含有活性细胞(例如，RPE细胞)或工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)。
104.如实施例103所述的基板，其中该多个腔室中的每个腔室均包含多个活性细胞(例如，RPE细胞)或工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)，例如具有本文所述的形状因数(例如群集)的多个工程化RPE细胞。
105.一种微载体(例如，珠粒或基质)，其上设置有本文所述的工程化活性细胞(例如RPE细胞，例如工程化RPE细胞)或活性细胞(例如RPE细胞，例如工程化RPE细胞)群集。
106.如实施例105所述的微载体，其中该微载体包含聚苯乙烯珠粒。
107.一种工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的制剂，其中该制剂包含至少约10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000或75,000个工程化活性细胞(例如，本文所述的工程化RPE细胞)。
108.一种药物组合物，其包含多个如实施例1至70中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞。
实例
为了使本文所述的本披露可以得到更完全的理解，列出了以下实例。提供本申请中描述的实例以说明本文提供的活性细胞(例如，RPE细胞)、可植入元件以及组合物和方法，并且不得以任何方式解释为限制其范围。
实例1：培养活性细胞
可以根据本领域已知的任何方法，诸如根据以下方案培养ARPE-19细胞。吸取75cm2培养瓶中的ARPE-19(来自ATCC)细胞以去除培养基，然后用0.05％(w/v)胰蛋白酶/0.53mM EDTA溶液(“胰蛋白酶EDTA”)短暂漂洗细胞层以去除所有含胰蛋白酶抑制剂的血清痕迹。将2-3mL胰蛋白酶/EDTA溶液添加到烧瓶中，并且在倒置显微镜下观察细胞，直到细胞层分散，通常在5-15分钟之间发生。为避免结块，应小心处理细胞，不建议在分散期间敲击或振荡烧瓶。如果细胞未分离，则将烧瓶置于37℃下以促进分散。一旦细胞分散，就添加6-8mL完全生长培养基，并通过轻轻移液吸取细胞。将细胞悬浮液转移至离心管中，并以大约125x g离心5-10以去除胰蛋白酶EDTA。弃去上清液，并将细胞重悬在新鲜的生长培养基中。将适当的细胞悬浮液等分试样添加到新的培养皿中，在37℃下孵育这些细胞。培养基每周更换2-3次。
实例2A：活性细胞群集的制备
使用AggreWellTM球状体板(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))和本文概述的方案制备活性细胞(例如RPE细胞)的球状体群集。第1天，将漂洗溶液(4mL)添加到每张板中，并将这些板在大型离心机中以3,000RPM离心5分钟。用移液管去除漂洗溶液，并添加4mL完全生长培养基。将RPE细胞以所需的细胞密度接种到板中，并立即移液以防止聚集，通常的经验法则是，每孔390万个细胞会产生150μm直径的群集，并且用于包封在水凝胶胶囊中的理想平均群集直径为约100至150μm。将板以800RPM离心3分钟，并将板放入培养箱中过夜。第2天，将板从孵育中移除。使用大口径移液管尖端，将细胞轻轻移液以移出球状体群集。将群集通过40μm或80μm细胞过滤器过滤，以去除额外的分离的单细胞，然后在离心机中离心2x 1分钟。使用大口径移液管尖端轻轻地将群集重悬，并轻轻搅拌以使它们分布在整个介质或另一种材料(例如藻酸盐)中。
替代性地，可以使用以下方案制备ARPE-19球状体群集。第1天，在无菌组织培养罩中从包装中取出AggreWellTM板。向每个孔中添加2mL的AggrewellTM漂洗溶液。将板以2,000g的速度离心5分钟以去除气泡。从孔中去除AggreWellTM漂洗溶液，并用2mL完全生长培养基漂洗每个孔。在每个孔的3.9mL完全生长培养基中添加200万个ARPE-19细胞。将板以100g离心3分钟。将细胞在
Figure BDA0002428472100001021
下孵育48小时。第3天，使用上述相同的方案去除球状体群集。
实例2B：在微载体上制备活性细胞
可以根据以下方案将单个的ARPE-19细胞接种到可商购的微载体(例如，
Figure BDA0002428472100001022
微载体、
Figure BDA0002428472100001023
微载体、康宁增强型附着微载体)上。
将所需数量的ARPE-19细胞(例如，2000万个细胞)和培养基添加到锥形管中的微载体(任选地，经胶原蛋白包被)中，以达到所需的总体积(例如，10mL)。通过在锥形管中将所需量的无菌微载体与0.1mg/mL的大鼠尾部胶原蛋白I组合在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在室温下以200rpm振荡该管至少2小时，使微载体任选地经胶原蛋白包被。用PBS洗涤胶原蛋白包被的微载体三次，然后用培养基洗涤两次，每次洗涤后使微载体沉降约5分钟，然后去除上清液。
轻轻振荡含细胞和微载体的锥形管直至均匀，然后将其放入固定培养箱37℃中约25分钟，并将这些振荡和孵育步骤重复一次。将来自锥形管的细胞和微载体添加到含所需量(例如70mL)的预热至37℃的培养基的旋转烧瓶中，并且再添加培养基以使烧瓶中的体积达到所需的最终体积(例如90mL)。然后将细胞和微载体于37℃下边搅拌边孵育约4天。将所需体积的微载体/培养基组合物转移至微量离心管中，并将这些微载体在无Ca的Krebs缓冲液中洗涤一次，然后悬浮于所需藻酸盐包封溶液中。
实例3：用于制备经化学改性的可植入元件的示例性化合物的合成
通用方案
以下程序描述了制备用于制备经化学改性的可植入元件的示例性化合物的方法。本文提供的化合物可以使用对本领域技术人员公知的下述具体合成方案的修改由容易获得的原材料制备。应当认识到的是，在给出典型的或优选的工艺条件(即，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)之处，除非另做说明，也可以使用其他工艺条件。最适宜的反应条件可以随着使用的特定反应物或溶剂而变化，但是此类条件可以由本领域的技术人员通过常规优化程序进行决定。
另外，正如本领域的技术人员将清楚的，常规保护基团对于防止某些官能团免于经受不良反应是必需的。适于特定官能团的保护基团以及适于保护以及去保护的条件的选择是本领域公知的。例如，许多保护基团，以及它们的引入和去除，在Greene等人,Protecting Groups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团],第二版,纽约威利出版社(Wiley,New York),1991，以及其中引用的参考文献中进行了描述。
Huisgen环加成反应得到1,4-取代的三唑
使用铜催化的Huisgen[3+2]环加成制备基于三唑的化合物及其组合物、装置和材料。范围和典型方案已成为许多评论的主题(例如，Meldal,M.和Tornoe,C.W.Chem.Rev.[化学评论](2008)108:2952-3015；Hein,J.E.和Fokin,V.V.Chem.Soc.Rev.[化学学会评论](2010)39(4):1302-1315；两者均通过援引并入本文)。
Figure BDA0002428472100001031
在以上所示的实例中，叠氮化物是含有连接元素A的片段中的反应性部分，而炔烃是侧基Z的反应性组分。如下所示，这些官能性手柄可以进行交换，以生成结构相关的三唑产物。这些替代品的制备是类似的，不需要特别考虑。
Figure BDA0002428472100001041
以碘化物开始的典型Huisgen环加成方法概述如下。在一些情况下，为了安全起见，碘化物在反应过程中转化为叠氮化物。
Figure BDA0002428472100001042
将叠氮化钠(1.1当量)、抗坏血酸钠，(0.1当量)反式-N,N’-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.25当量)、碘化铜(I)在甲醇(1.0M，限量试剂)中的溶液用鼓泡氮气进行脱气，并用乙炔(1当量)和芳基碘(1.2当量)处理。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后温热至55℃保持16小时。然后将反应物冷却至室温，通过漏斗过滤，并且用甲醇洗涤滤饼。将合并的滤液浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化(120g二氧化硅，在二氯甲烷中的梯度为0至40％(3％氢氧化铵水溶液，22％甲醇，余量为二氯甲烷)，以得到所希望的目标材料。
以叠氮化物开始的典型Huisgen环加成程序概述如下。
Figure BDA0002428472100001043
将三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(0.2当量)、三乙胺(0.5当量)、碘化铜(I)(0.06当量)在甲醇(0.4M，限量试剂)中的溶液用乙炔(1.0当量)处理并冷却至0℃。使反应物经30分钟温热至室温，然后加热至55℃，保持16小时。使反应物冷却至室温，浓缩，并用HPLC(C18柱，在二氯甲烷中的梯度为0至100％(3％氢氧化铵水溶液，22％甲醇，余量为二氯甲烷)纯化，得到所需的目标材料。
Huisgen环加成反应得到1,5-取代的三唑
还使用钌催化剂进行Huisgen[3+2]环加成反应，优先获得1,5-二取代的产物(例如，如Zhang等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2005,127,15998-15999；Boren等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2008,130,8923-8930所述，其中每一个通过援引以其全文并入本文)。
Figure BDA0002428472100001051
如前所述，叠氮化物和炔烃基团可以交换形成如下所示的类似的三唑。
Figure BDA0002428472100001052
典型程序描述如下：将炔烃(1当量)和叠氮化物(1当量)在二噁烷(0.8M)中的溶液滴加到五甲基环戊二烯基双(三苯基膦)氯化钌(II)(0.02当量)在二噁烷(0.16M)中的溶液中。将小瓶用氮气净化，密封并将混合物加热至60℃，保持12小时。浓缩所得混合物并通过硅胶快速色谱纯化，得到所需化合物。
(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(3)的实验程序
Figure BDA0002428472100001053
用氮气净化(4-碘苯基)甲胺(1，843mg，3.62mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(74μL，0.47mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(72mg，0.36mmol，0.1当量)、碘化铜(69mg，0.36mmol，0.1当量)、叠氮化钠(470mg，7.24mmol，2.0当量)和1-甲基-4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪(2，0.5g，3.62mmol，1.0当量)在甲醇(9mL)和水(1mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，减压浓缩，并且用二氯甲烷萃取褐色浆液。将硅藻土添加到合并的二氯甲烷相中，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(80g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至7.5％，得到(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(3，0.45g，43％)。LCMS m/z：针对C15H22N6计算的[M+H]+是287.2；实测值是287.1。
N-(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(4)的实验程序
Figure BDA0002428472100001061
用冰浴将(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(3，1.2g，4.19mmol，1.0当量)和三乙胺(0.70mL，5.03mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液冷却至0℃，并添加甲基丙烯酰氯(0.43mL，4.40mmol，1.05当量在5mL的CH2Cl2中)。将反应物搅拌一天，同时用冰浴冷却。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至7.5％。减压去除溶剂，并且将所得固体用乙醚研磨，过滤并用乙醚洗涤多次，得到呈白色固体的N-(4-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(4，0.41g，28％收率)。LCMS m/z：针对C19H26N6O计算的[M+H]+是355.2；实测值是355.2。
(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(6)的实验程序
Figure BDA0002428472100001062
用氮气净化(4-碘苯基)甲胺(1，2.95g，12.64mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(259μL，1.64mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(250mg，1.26mmol，0.1当量)、碘化铜(241mg，1.26mmol，0.1当量)、叠氮化钠(1.64g，25.29mmol，2.0当量)和4-甲基-4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪(5，2.0g，12.64mmol，1.0当量)在甲醇(40mL)和水(1mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并减压浓缩。将残余物溶于二氯甲烷中，过滤，并用硅藻土(10g)进行浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至6.25％，得到(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(6，1.37g，35％)。LCMS m/z：针对C15H22N4O3计算的[M+H]+是307.2；实测值是307.0。
N-(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(7)的实验程序
Figure BDA0002428472100001071
用冰浴将4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(6，1.69g，5.52mmol，1.0当量)和三乙胺(0.92mL，6.62mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.57mL，5.79mmol，1.05当量)。将反应物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶(80g)色谱法纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至1.25％，得到呈白色固体的N-(4-(4-((2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(7，1.76g，85％收率)。LCMS m/z：针对C19H26N4O4计算的[M+H]+是375.2；实测值是375.0。
3-(丙-2-炔-1-基氧基)氧杂环丁烷(9)的实验程序
Figure BDA0002428472100001072
用冰浴冷却氢化钠(27.0g，675mmol，60％纯度)在THF(200mL)中的悬浮液。以逐滴方式添加氧杂环丁烷-3-醇(8，25g，337mmol)并在0℃下搅拌30分钟。然后以逐滴方式添加3-溴丙-1-炔(9，41.2mL，371mmol，80％纯度)。将混合物搅拌过夜，同时使其温热至室温。将混合物经硅藻土过滤，用THF洗涤，并在减压下用硅藻土浓缩。将粗产物经硅胶(220g)纯化，并且用己烷/EtOAc洗脱。流动相中EtOAc的浓度从0增加至25％，得到黄色油状物(9，18.25g，48％)。
3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(11)的实验程序
Figure BDA0002428472100001081
将3-(丙-2-炔-1-基氧基)氧杂环丁烷(9，7.96g，71mmol，1.0当量)、3-叠氮基丙-1-胺(10，7.82g，78mmol，1.1当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(8.29g，15.6mmol，0.22当量)、碘化铜(1.35g，7.1mmol，0.1当量)和三乙胺(2.47mL，17.8mmol，0.25当量)将在甲醇(80mL)中的混合物加热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(20g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至15％，得到呈黄色油状物的3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(11，11.85g，79％)。LCMS m/z：针对C9H16N4O2计算的[M+H]+是213.1；实测值是213.0。
N-(3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(12)的实验程序
Figure BDA0002428472100001082
用冰浴将3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(11，3.94g，18.56mmol，1.0当量)和三乙胺(3.1mL，22.28mmol，1.2当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.99mL，20.42mmol，1.1当量)。将反应物搅拌过夜，同时使其温热至室温。添加20克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱法(220g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加至5％，得到呈固体的N-(3-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(12，3.22g，62％收率)。LCMS m/z：针对C13H20N4O3计算的[M+H]+是281.2；实测值是281.0。
N-(4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(14)的实验程序
Figure BDA0002428472100001091
向(4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(13，从无锡获得，1.2g，5.70mmol，1.0当量)和三乙胺(15mL，107.55mmol，18.9当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液中以逐滴方式缓慢地添加甲基丙烯酰氯(893mg，8.54mmol，1.5当量)。搅拌反应物过夜。添加20克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至1.25％，得到N-(4-(1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(14，1.38g，40％收率)。
(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(15)的实验程序
Figure BDA0002428472100001092
用氮气净化(4-碘苯基)甲胺盐酸盐(5.0g，18.55mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.59mL3.71mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(368mg，1.86mmol，0.1当量)、碘化铜(530mg，2.78mmol，0.15当量)、叠氮化钠(2.41g，37.1mmol，2.0当量)、Et3N(3.11mL，22.26mmol，1.2当量)和2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(2.6g，18.55mmol，1.0当量)在甲醇(50mL)和水(12mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并通过413滤纸过滤。添加硅藻土，减压去除溶剂，并使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至6.25％，得到呈白色固体的(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(15，3.54g，66％)。LCMS m/z：针对C15H20N4O2计算的[M+H]+是289.2；实测值是289.2。
N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(16)的实验程序
Figure BDA0002428472100001101
用冰浴将(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(15，3.46g，12.00mmol，1.0当量)和三乙胺(2.01mL，14.40mmol，1.2当量)在CH2Cl2(40mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.23mL，12.60mmol，1.05当量，稀释于5mL的CH2Cl2中)。移去冷却浴，并将反应物搅拌4小时。添加20克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至3.75％，得到呈白色固体的N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(16，2.74g，64％收率)。LCMS m/z：针对C19H24N4O3计算的[M+H]+是357.2；实测值是357.3。
N-(4-(4-(羟甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(17)的实验程序
Figure BDA0002428472100001102
将N-(4-(4-(羟甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(16，1.2g，3.37mmol，1.0当量)的溶液溶于甲醇(6mL)和HCl(1N，水溶液，9mL)中，保持在室温下过夜。添加硅藻土并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶色谱法(24g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至12.5％，得到呈白色固体的N-(4-(4-(羟甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(17，0.85g，92％收率)。LCMS m/z：针对C14H16N4O2计算的[M+H]+是273.1；实测值是273.1。
(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(19)的实验程序
Figure BDA0002428472100001111
将(4-(羟甲基)苄基)氨基甲酸苄酯(2.71g，10mmol，1当量)、3,4-二氢-2H-吡喃(1.81mL，20mmol，2当量)、对甲苯磺酸一水合物(285mg，1.5mmol，0.15当量)的二氯甲烷(100mL)溶液在室温下搅拌过夜。添加硅藻土并减压去除溶剂。使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，经硅胶(24g)纯化粗产物，得到呈无色油状物的(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)-氨基甲酸苄酯(19，2.4g，68％)。LCMS m/z：针对C21H25NO4计算的[M+Na]+是378.17，实测值是378.17。
(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-苯基)甲胺(20)的实验程序
Figure BDA0002428472100001112
将(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)氨基甲酸酯(19，1.5g，4.2mmol，1当量)、钯碳(160mg，10重量％)的EtOH溶液短暂抽真空，然后通过气球添加氢气，并且将混合物在室温下搅拌1小时。添加硅藻土并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(12g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到呈无色油状物的(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苯基)甲胺(20，890mg，95％)。LCMS m/z：针对C13H19NO2计算的[M+H]+是222.15，实测值是222.14。
N-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)-甲基丙烯酰胺(21)的实验程序
Figure BDA0002428472100001121
将(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苯基)甲胺(20，0.5g，2.26mmol，1.0当量)和三乙胺(0.47mL，3.39mmol，1.5当量)在CH2Cl2(10mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.33mL，3.39mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下过夜搅拌。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，通过硅胶色谱法(12g)纯化残余物，得到呈无色固体的N-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)苄基)甲基丙烯酰胺(21，0.47g，72％收率)。LCMS m/z：针对C17H23NO3计算的[M+Na]+是312.16；实测值是312.17。
(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(22)的实验程序
Figure BDA0002428472100001122
用氮气净化(4-碘苯基)甲胺(5.0g，21.45mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.44mL 2.79mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(425mg，2.15mmol，0.1当量)、碘化铜(409mg，2.15mmol，0.1当量)、叠氮化钠(2.79g，42.91mmol，2.0当量)和2-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(3.36mL，21.45mmol，1.0当量)在甲醇(20mL)和水(5mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并通过413滤纸过滤。添加硅藻土(10g)，减压去除溶剂，并使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(220g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至5％，得到呈固体的(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(22，3.15g，49％)。LCMS m/z：针对C16H22N4O2计算的[M+H]+是303.18；实测值是303.18。
N-(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(23)的实验程序
Figure BDA0002428472100001131
用冰浴将(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(22，3.10g，10.25mmol，1.0当量)和三乙胺(1.71mL，12.30mmol，1.2当量)在CH2Cl2(55mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.05mL，12.30mmol，1.2当量，稀释于5mL的CH2Cl2中)。移去冷却浴，并将反应物搅拌4小时。添加8克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至2.5％，得到呈白色固体的N-(4-(4-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(23，2.06g，54％收率)。LCMS m/z：针对C20H26N4O3计算的[M+H]+是371.2078；实测值是371.2085。
(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)甲胺(24)的实验程序
Figure BDA0002428472100001132
用氮气净化(4-乙炔基苯基)甲胺(2.36g，18.00mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.56mL，3.60mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(357mg，1.80mmol，0.1当量)、碘化铜(514mg，2.70mmol，0.15当量)和2-(2-叠氮基乙氧基)四氢-2H-吡喃(3.08，18.00mmol，1.0当量)在甲醇(24mL)和水(6mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并用硅藻土过滤，并用MeOH(3x 50mL)冲洗。减压去除溶剂并将残余物重新溶于二氯甲烷中，添加硅藻土(20g)并且减压去除溶剂，并使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到呈淡黄色油状物的(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)甲胺(24，3.51g，64％)。LCMS m/z：针对C16H22N4O2计算的[M+H]+是303.1816；实测值是303.1814。
N-(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苄基)甲基丙烯酰胺(25)的实验程序
Figure BDA0002428472100001141
将(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苯基)甲胺(24，1.5g，4.96mmol，1.0当量)和三乙胺(1.04mL，7.44mmol，1.5当量)在CH2Cl2(30mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.72mL，7.44mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，通过硅胶色谱法(40g)纯化残余物，得到呈无色固体的N-(4-(1-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)苄基)甲基丙烯酰胺(25，0.9g，49％收率)。LCMS m/z：针对C20H26N4O3计算的[M+Na]+是371.2078；实测值是371.2076。
1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙-1-胺(26)的实验程序
Figure BDA0002428472100001151
用氮气净化1-(4-碘苯基)乙-1-胺盐酸盐(1.0g，4.05mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.08mL 0.53mmol，0.13当量)、抗坏血酸钠(80mg，0.40mmol，0.1当量)、碘化铜(77mg，0.40mmol，0.1当量)、叠氮化钠(526g，8.09mmol，2.0当量)和2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(0.57g，4.05mmol，1.0当量)在甲醇(9mL)和水(1mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温并减压去除溶剂。将残余物重新溶解在二氯甲烷中，并且经硅藻土塞过滤。将硅藻土添加到滤液中并且减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至5％，得到呈淡黄色固体的1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙-1-胺(26，0.62g，51％)。LCMS m/z：针对C16H22N4O2计算的[M+H]+是303.2；实测值是303.2。
N-(1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙基)甲基丙烯酰胺(27)的实验程序
Figure BDA0002428472100001152
用冰浴将1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙-1-胺(26，0.52g，1.7mmol，1.0当量)和三乙胺(0.29mL，2.1mmol，1.2当量)在CH2Cl2(11mL)中的溶液冷却至0℃，并以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.18mL，1.8mmol，1.05当量，稀释于11mL的CH2Cl2中)。移去冷却浴，并将反应物搅拌4小时。添加五(5)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至2.5％，得到呈白色固体的N-(1-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)乙基)甲基丙烯酰胺(27，0.49g，76％收率)。LCMS m/z：针对C20H26N4O3计算的[M+H]+是371.2078；实测值是371.2087。
(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(28)的实验程序
Figure BDA0002428472100001161
用氮气净化(4-碘-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(3.0g，9.97mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.31mL 1.99mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(197mg，1.00mmol，0.1当量)、碘化铜(285mg，1.49mmol，0.15当量)、叠氮化钠(1.30g，19.93mmol，2.0当量)、Et3N(1.67mL，11.96mmol，1.2当量)和2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(1.40g，9.97mmol，1.0当量)在甲醇(24mL)和水(6mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并通过硅藻土塞过滤，并用甲醇(3x 50mL)冲洗。将硅藻土添加到滤液中并且减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到呈绿色油状物的(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(28，2.53g，71％)。LCMS m/z：针对C16H19N4O2F3计算的[M+H]+是357.2；实测值是357.1。
N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2(三氟甲基)苄基)甲基丙烯酰胺(29)的实验程序
Figure BDA0002428472100001171
将(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(三氟甲基)苯基)甲胺(28，1.0g，2.81mmol，1.0当量)和三乙胺(0.59mL，4.21mmol，1.5当量)在CH2Cl2(25mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.41mL，4.21mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，通过硅胶色谱法(40g)纯化残余物，得到呈无色固体的N-(4-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2(三氟甲基)苄基)甲基丙烯酰胺(29，0.65g，55％收率)。LCMS m/z：针对C20H23N4O3F3计算的[M+H]+是425.2；实测值是425.1。
3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(30)的实验程序
Figure BDA0002428472100001172
用氮气净化3-叠氮基丙-1-胺盐酸盐(1.5g，14.98mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(1.99g，3.75mmol，0.25当量)、碘化铜(0.29g，1.50mmol，0.1当量)和三乙胺(0.52mL，3.75mmol，0.25当量)在甲醇(50mL)和水(6mL)中的混合物5分钟并冷却至0℃。添加2-(丙-2-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃(2.10g，14.98mmol，1.0当量)，并将反应混合物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，经硅藻土塞过滤，并用甲醇(3x 50mL)冲洗。将硅藻土(20g)添加到滤液中并且减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至20％，得到3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(30，2.36g，66％)。LCMS m/z：针对C11H20N4O2计算的[M+H]+是241.2；实测值是241.2。
N-(3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(31)的实验程序
Figure BDA0002428472100001181
将3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙-1-胺(30，1.0g，4.16mmol，1.0当量)和三乙胺(0.58mL，4.16mmol，1.0当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.40mL，4.16mmol，1.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至20％，得到呈无色油状物的N-(3-(4-(((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙基)甲基丙烯酰胺(31，0.96g，75％收率)。LCMS m/z：针对C15H24N4O3计算的[M+H]+是309.2；实测值是309.4。
(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(32)的实验程序
Figure BDA0002428472100001182
用氮气净化(4-碘苯基)甲胺盐酸盐(2.64g，9.80mmol，1.0当量)、(1S,2S)-N1,N2-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.31mL 1.96mmol，0.2当量)、抗坏血酸钠(198mg，0.98mmol，0.1当量)、碘化铜(279mg，1.47mmol，0.15当量)、叠氮化钠(1.27g，19.59mmol，2.0当量)、Et3N(1.64mL，11.75mmol，1.2当量)和3-(丙-2-炔-1-基氧基)氧杂环丁烷(9，1.10g，9.80mmol，1.0当量)在甲醇(24mL)和水(6mL)中的混合物5分钟，并加热至55℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并通过硅藻土塞过滤，并用甲醇(3x 50mL)冲洗。将硅藻土添加到滤液中并且减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到呈油状物的(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(32，1.43g，56％)。LCMS m/z：针对C13H16N4O2计算的[M+H]+是261.1346；实测值是261.1342。
N-(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(33)的实验程序
Figure BDA0002428472100001191
将(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(32，0.58g，2.23mmol，1.0当量)和三乙胺(0.47mL，3.34mmol，1.5当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.32mL，3.34mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用己烷/EtOAc作为洗脱剂，从100％己烷开始并将EtOAc的浓度逐渐增加至100％，通过硅胶色谱法(24g)纯化残余物，得到呈无色固体的N-(4-(4-((氧杂环丁烷-3-基氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苄基)甲基丙烯酰胺(33，0.48g，66％收率)。LCMS m/z：针对C17H20N4O3计算的[M+H]+是329.1608；实测值是329.1611。1-(2-甲基丙烯酸酰胺乙基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯(35)的实验程序
Figure BDA0002428472100001192
将1-(2-氨基乙基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯(34，2.0g，10.91mmol，1.0当量)和三乙胺(3.80mL，27.29mmol，2.5当量)在CH2Cl2(20mL)中的溶液短暂抽真空并用氮气吹扫。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(1.60mL，16.37mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。添加十五(15)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到呈无色固体的1-(2-甲基丙烯酸酰胺乙基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯(35，1.28g，47％收率)。LCMS m/z：针对C12H17N3O3计算的[M+H]+是252.1；实测值是252.1。N-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉)苄基)甲基丙烯酰胺(37)的实验程序
Figure BDA0002428472100001201
向4-(4-(氨基甲基)苯基)硫代吗啉、1,1-二氧化物盐酸盐(36，1.15g，4.15mmol，1.0当量)和三乙胺(1.39mL，9.97mmol，2.4当量)在CH2Cl2(80mL)中的溶液，以滴加方式添加甲基丙烯酰氯溶液(0.43mL，4.36mmol，1.05当量，在CH2Cl2中，5mL)。将反应混合物在室温下搅拌22小时。添加八(8)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(80g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至3.75％，得到呈固体的N-(4-(1,1-二氧化硫代吗啉)苄基)甲基丙烯酰胺(37，0.32g，25％收率)。
N-甲基-N-(2-(甲基磺酰基)乙基)丙-2-炔-1-胺(38)的实验程序
Figure BDA0002428472100001202
向1-甲基磺酰基乙烯(4.99g，47.03mmol，4.13mL)和Amberlyst-15((30％w/w))的混合物中，以逐滴方式添加N-甲基丙-2-炔-1-胺(2.6g，37.62mmol)。将混合物在室温下搅拌12小时。过滤去除催化剂，并且减压浓缩滤液，得到：呈油状物的N-甲基-N-(2-(甲基磺酰基)乙基)丙-2-炔-1-胺(38，6.43g，98％)。LCMS m/z：针对C7H13NSO2计算的[M+H]+是176.11；实测值是176.1。
N-((1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺(40)的实验程序
Figure BDA0002428472100001211
将N-甲基-N-(2-(甲基磺酰基)乙基)丙-2-炔-1-胺(38，5.02g，28.64mmol，1.25当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(3.04g，5.73mmol，0.25当量)、碘化铜(436mg，2.29mmol，0.1当量)和三乙胺(0.8mL，5.7mmol，0.25当量)在甲醇(50mL)和水(6mL)中的混合物抽真空并用氮气吹扫(3次)并用冰浴冷却。以逐滴方式添加2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(39，5.02g，22.91mmol，1.0当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(20g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至25％，得到呈油状物的N-((1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺(40，4.98g，55％)。LCMS m/z：针对C15H31N5O5S计算的[M+H]+是394.2；实测值是394.2。
N-(2-(2-(2-(2-(4-((甲基(2-(甲基磺酰基)乙基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(41)的实验程序
Figure BDA0002428472100001212
向N-((1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-N-甲基-2-(甲基磺酰基)乙-1-胺(40，1.0g，2.54mmol，1.0当量)和三乙胺(0.43mL，3.05mmol，1.2当量)在CH2Cl2(15mL)中的溶液，以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯溶液(0.30mL，3.05mmol，1.5当量)。将反应混合物在室温下搅拌5小时。添加硅藻土并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(40g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至12.5％，得到呈油状物的N-(2-(2-(2-(2-(4-((甲基(2-(甲基磺酰基)乙基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(41，0.86g，73％收率)。LCMS m/z：针对C19H35N5O6S计算的[M+H]+是462.2；实测值是462.2。
7-(丙-2-炔-1-基)-2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(42)的实验程序
Figure BDA0002428472100001221
将3-溴-1-炔(4.4mL，39.32mmol，1.0当量)添加到2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(8.54g，39.32mmol，1.0当量)、碳酸钾(17.9g，129.7mmol，3.3当量)在甲醇(200mL)中的混合物中并在室温下搅拌过夜。过滤混合物，添加硅藻土，并且减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱法(220g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加至5％，得到呈油状物的7-(丙-2-炔-1-基)-2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(42，4.44g，68％)。
2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(43)的实验程序
Figure BDA0002428472100001222
用冰浴冷却7-(丙-2-炔-1-基)-2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬烷(42，2.5g，15.13mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(1.77g，3.33mmol，0.22当量)、碘化铜(288mg，1.51mmol，0.1当量)和三乙胺(0.53mL，3.8mmol，0.25当量)在甲醇(50mL)中的混合物。以逐滴方式添加2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(39，3.86g，17.70mmol，1.17当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(10g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至10％，得到呈油状物的2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(43，4.76g，82％收率)。LCMS m/z：针对C18H33N5O4计算的[M+H]+是384.3；实测值是384.2。
N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(44)的实验程序
Figure BDA0002428472100001231
在氮气气氛下用冰浴冷却2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(43，2.65g，6.91mmol，1.0当量)和三乙胺(1.16mL，8.29mmol，1.2当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.74mL，7.6mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱法(120g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加到10％，得到呈无色油状物的N-(2-(2-(2-(2-(4-((2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(44，1.50g，48％收率)。LCMS m/z：针对C22H37N5O5计算的[M+H]+是452.29；实测值是452.25。
4-((1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(45)的实验程序
Figure BDA0002428472100001232
用冰浴冷却4-(丙-2-炔-1-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(1.14g，6.58mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(768mg，1.45mmol，0.22当量)、碘化铜(125mg，0.66mmol，0.1当量)和三乙胺(0.23mL，1.65mmol，0.25当量)在甲醇(20mL)中的混合物。以逐滴方式添加2-(2-叠氮基乙氧基)乙-1-胺(1.00g，7.70mmol，1.17当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(10g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(40g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至9.5％，得到呈白色固体的4-((1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(45，1.86g，93％)。LCMS m/z：针对C11H21N5O4S计算的[M+H]+是304.1438；实测值是304.1445。
N-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(46)的实验程序
Figure BDA0002428472100001241
在氮气气氛下用冰浴冷却4-((1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(45，1.32g，4.35mmol，1.0当量)和三乙胺(0.73mL，5.22mmol，1.2当量)在CH2Cl2(100mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.47mL，4.8mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，通过硅胶色谱法(120g)纯化残余物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至1.25％，得到呈无色油状物的N-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙基)-甲基丙烯酰胺(46，0.90g，56％收率)。LCMS m/z：针对C15H25N5O4S计算的[M+H]+是372.17；实测值是372.15。
4-((1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(47)的实验程序
Figure BDA0002428472100001242
用冰浴冷却4-(丙-2-炔-1-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(4.6g，26.55mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(3.1g，5.84mmol，0.22当量)、碘化铜(506mg，2.66mmol，0.1当量)和三乙胺(0.93mL，6.64mmol，0.25当量)在甲醇(80mL)中的混合物。以逐滴方式添加2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(5.00g，28.68mmol，1.08当量)，移去冷却浴，并且将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加至10％，得到呈淡黄色油状物的4-((1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(47，5.26g，57％)。LCMS m/z：针对C13H25N5O4S计算的[M+H]+是348.1700；实测值是348.1700。
N-(2-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)甲基丙烯酰胺(48)的实验程序
Figure BDA0002428472100001251
在氮气气氛下用冰浴冷却4-((1-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(47，1.49g，4.29mmol，1.0当量)和三乙胺(0.72mL，5.15mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.46mL，4.7mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱法(80g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加至5％，得到呈无色油状物的N-(2-(2-(2-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-甲基丙烯酰胺(48，0.67g，38％收率)。LCMS m/z：针对C17H29N5O5S计算的[M+H]+是416.20；实测值是416.20。
4-((1-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(49)的实验程序
Figure BDA0002428472100001261
用冰浴冷却4-(丙-2-炔-1-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(5.0g，28.86mmol，1.0当量)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]-胺(3.37g，6.35mmol，0.22当量)、碘化铜(550mg，2.89mmol，0.1当量)和三乙胺(1.01mL，7.22mmol，0.25当量)在甲醇(90mL)中的混合物。以逐滴方式添加14-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-胺(8.86g，33.77mmol，1.17当量)，移去冷却浴并将混合物搅拌5分钟。将反应物温热至55℃，并在氮气气氛下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，添加硅藻土(15g)，并减压浓缩。使用二氯甲烷/(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)作为流动相，经硅胶(220g)纯化粗产物。(含有12％(v/v)氢氧化铵水溶液的甲醇)的浓度从0％逐渐增加到10％，得到呈油状物的4-((1-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(49，7.56g，60％)。LCMS m/z：针对C17H33N5O6S计算的[M+H]+是436.2224；实测值是436.2228。
N-(14-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十四基)甲基丙烯酰胺(50)的实验程序
Figure BDA0002428472100001262
在氮气气氛下用冰浴冷却4-((1-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)硫代吗啉1,1-二氧化物(49，1.95g，4.79mmol，1.0当量)和三乙胺(0.80mL，5.74mmol，1.2当量)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。以逐滴方式添加甲基丙烯酰氯(0.51mL，5.26mmol，1.1当量)。移去冷却浴，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。添加十(10)克硅藻土，并减压去除溶剂。使用二氯甲烷/甲醇作为流动相，通过硅胶色谱法(80g)纯化残余物。甲醇浓度从0％逐渐增加至5％，得到呈无色油状物的N-(14-(4-((1,1-二氧化硫代吗啉)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十四基)甲基丙烯酰胺(50，0.76g，32％收率)。LCMS m/z：针对C21H37N5O7S计算的[M+H]+是504.25；实测值是504.20。
实例4：用于细胞包封的藻酸盐的化学改性
如以下实例5所述，在包封活性细胞(例如，RPE细胞)之前，可以用式(I)的化合物(或其药学上可接受的盐)对聚合物材料进行化学改性。以上实例3中概述了用于聚合物材料改性的示例性化合物的合成方案。这些化合物或其他化合物可用于化学改性任何聚合物材料。
在形成本文所述的装置(例如，本文所述的水凝胶胶囊)之前，可以使用本领域已知的方法，用式(I)的化合物(或其药学上可接受的盐)对聚合物材料进行化学改性。
例如，在藻酸盐的情况下，将藻酸盐羧酸活化以与一种或多种胺官能化化合物偶联，以获得用去纤维化化合物(例如式(I)的化合物)改性的藻酸盐。将藻酸盐聚合物溶于水中(30mL/g聚合物)，并用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.5当量)和N-甲基吗啉(1当量)处理。向该混合物中添加目标化合物(例如，表2中所示的化合物101)在乙腈(0.3M)中的溶液。
添加的化合物和偶联剂的量取决于与藻酸盐结合的化合物的所需浓度，例如缀合密度。为制备CM-LMW-Alg-101-中聚合物溶液，将溶解的未改性的低分子量藻酸盐(近似分子量<75kDa，G:M比率≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐)及化合物101(5.4mmol/g藻酸盐)进行处理。为制备CM-LMW-Alg-101-高聚合物溶液，将溶解的未改性的低分子量藻酸盐(近似分子量<75kDa，G:M比率≥1.5)用2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(5.1mmol/g藻酸盐)和N-甲基吗啉(10.2mmol/g藻酸盐)及化合物101(5.4mmol/g藻酸盐)进行处理。
将反应物温热至55℃，保持16小时，然后冷却至室温，并通过旋转蒸发温和浓缩，然后将残余物溶于水中。将混合物通过氰基改性的硅胶(Silicycle)床过滤，并将滤饼用水洗涤。然后将所得溶液彻底透析(10,000MWCO膜)并通过冻干浓缩藻酸盐溶液以提供所需的作为固体的化学改性的藻酸盐或使用适于产生粘度为25cP至35cP的化学改性的藻酸盐溶液的任何技术浓缩。
通过对氮的百分比进行燃烧分析来测量化学改性的藻酸盐的缀合密度。通过将化学改性的藻酸盐溶液用水(10,000MWCO膜)透析24小时，将水更换两次，然后冻干至恒重来制备样品。
为了用于产生以下实例中描述的水凝胶胶囊，制备化学改性的藻酸盐聚合物，正如通过对氮的百分比进行燃烧分析所测定的那样,其中化合物101(表1所示)与低分子量藻酸盐(近似分子量<75kDa，G:M比率≥1.5)以中密度(2％至5％N)或高密度(5.1％至8％N)缀合，并且在本文中称为CM-LMW-Alg-101-中和CM-LMW-Alg-101-高。除非另有说明，否则以下实例中制备的胶囊中的化学改性的藻酸盐为CM-LMW-Alg-101-中。
实例5：原位包封的可植入元件的形成
根据本文所述的方案，将活性细胞(例如，RPE细胞)群集包封在藻酸盐中以形成原位包封的可植入元件，该可植入元件被构造为水凝胶胶囊。包封藻酸盐是未改性的高分子量藻酸盐(PRONOVATM SLG100,挪威桑维卡的安诺伦(NovaMatrix,Sandvika,Norway)，目录号4202106，近似分子量为150kDa–250kDa，G:M比率≥1.5)和TMTD改性的藻酸盐即低分子量藻酸盐(PRONOVATM VLVG藻酸盐，
Figure BDA0002428472100001281
目录号4200506，近似分子量<75kDa，G:M比率≥1.5)(用与实例4中所述的相似方法，用来自表1的化合物101进行化学改性)。首先将TMTD-藻酸盐以5％重量体积比溶于0.8％盐水或0.9％盐水中，然后与3％重量体积比的SLG100(也分别溶于0.8％盐水或0.9％盐水中)共混，其体积比为80％的TMTD藻酸盐与20％的SLG100或70％的TMTD藻酸盐与30％的SLG100。
在制造原位包封的可植入元件之前，通过高压灭菌对缓冲液进行灭菌，并且使用无菌工艺通过0.2μm过滤器过滤对藻酸盐溶液进行灭菌。静电液滴发生器的设置如下：将ES系列0-100kV、20瓦高压发电机(Gamma ES系列，Gamma High-Voltage Research[Gamma高压研究]，美国佛罗里达州(FL,USA))连接到钝尖针的顶部和底部(SAI输注科技公司(SAIInfusion Technologies)，美国伊利诺伊州(IL,USA))。将该针附接到5-ml的鲁尔接口注射器(美国新泽西州BD公司(BD,NJ,USA))，将该注射器夹到垂直定向的注射泵(泵11PicoPlus，哈佛仪器公司(Harvard Apparatus)，美国马萨诸塞州(MA,USA))上。注射泵将藻酸盐泵出到装有20mM钡交联溶液(25mM HEPES缓冲液、20mM BaCl2和0.2M甘露醇)的玻璃皿中。在一些实验中，交联溶液还含有0.01％的泊洛沙姆188。PicoPlus注射泵的设置取决于水凝胶胶囊的目标大小，直径为12.06mm，流速为约0.16mL/min至0.2ml/min。用25G钝针、5kV电压和200μl/min的流速产生原位包封的可植入元件(球体大小为0.5-mm)。为了形成1.5-mm的球体(例如，胶囊)，使用18号钝尖针(SAI输注科技公司)，其流速为0.16mL/min或10mL/h，并在5–9kV的范围内调节电压直到每10秒有12滴。
在即将包封之前，将培养的单细胞(基本上如实例1中所述制备的)、活性细胞群集(基本上如实例2A中所述制备的)或微载体上的细胞(基本上如实例2B中所述制备的)以1,400r.p.m.离心1分钟并用无钙Krebs-Henseleit(KH)缓冲液(4.7mM KCl、25mM HEPES、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4×7H2O、135mM NaCl，pH≈7.4，≈290mOsm)洗涤。洗涤后，再次离心细胞，吸出所有上清液。然后以一定范围的单细胞、群集或微载体密度(例如，每ml藻酸盐溶液中单细胞或群集的数量或微载体的体积)将细胞沉淀重悬于其中一种TMTD藻酸盐:SLG100溶液(如上所述)中。使用BaCl2交联溶液将原位包封的可植入元件进行交联，并如上所述控制其大小。交联后，立即用HEPES缓冲液(NaCl 15.428g、KCl 0.70g、MgCl2·6H2O0.488g、50ml HEPES(1M)缓冲溶液(Gibco，美国加利福尼亚州的生命技术公司(LifeTechnologies,California,USA)在2升去离子水中)洗涤原位包封的可植入元件(水凝胶胶囊)四次，并储存在4℃下直至使用。在形成后且在使用前，通过光学显微镜术分析原位包囊的可植入元件，以测定大小并评估胶囊质量。
为了检查胶囊组合物中胶囊的质量，从组合物中取出含至少200个胶囊的等分试样，并将其转移至孔板，并通过光学显微镜术，对总数中的球形胶囊数量计数来检查整个等分试样的质量。
实例6：因子VIII-BDD从原位包封的可植入元件的分泌
使用标准转染技术，用编码人因子VIII-BDD的载体转染ARPE-19细胞。该载体还含有博来霉素(zeocin)抗性基因。转染两天后，将细胞系在补充有博来霉素的完全生长培养基中于37℃下培养为单细胞，然后将培养的细胞作为单细胞包封在如实例5概述的1.5mm藻酸盐可植入元件中。
为了测定可用的因子VIII-BDD的量，在转染后4小时、24小时、48小时和72小时将包封的细胞(Cap)离心，并且收集上清液并通过ELISA(VisuLize FVIII抗原ELISA试剂盒，亲和力生物制剂公司(Affinity Biologicals,Inc.))分析是否存在人因子VIII-BDD。将这些结果与未包封的活性细胞(RPE细胞，培养物)进行比较，并示于图1。
如图2A-2B所示，通过显微镜术进一步检查可植入元件以评估细胞活力。如图所示，包含表达因子VIII-BDD的活性细胞的可植入元件在整个实验持续期间显示出高活力。
实例7：在体内评价包封的可植入元件
根据以下程序在小鼠中评价包含工程化活性细胞(例如，工程化RPE细胞)的包封的可植入元件。
准备：通过使小鼠处于1％-4％异氟烷的连续流与0.5L/min的氧气下麻醉，使小鼠准备进行手术。术前，所有小鼠皮下接受0.05-0.1mg/kg体重剂量的丁丙诺啡作为术前镇痛剂，同时皮下接受0.5ml的0.9％盐水以防止脱水。使用具有#40规格的剪毛刀片(clipperblade)的剃须刀去除毛发以在动物腹部的腹中线上显露约2cm×2cm的区域。用聚维酮擦洗(在可能的情况下，沿切口部位的中心向外离心方向)然后用70％酒精冲洗，进行至少3个循环而将整个剃毛区域进行无菌处理。还应用了含有聚维酮的最终皮肤涂剂。在用70％乙醇消毒工作台顶面后，用无菌一次性纸覆盖手术部位以排除周围毛发接触手术部位。人员使用适当的个人防护装备(PPE)、手术服和外科手套。
手术程序：使用锋利的手术刀片或剪刀通过皮肤和白线将受试者小鼠的腹部切开0.5-0.75cm的正中切口。外科医生试图使切口尽可能小，最大的可能切口尺寸为0.75cm。使用无菌塑料移液管将藻酸盐微胶囊(有或无细胞)转移到腹膜腔中。通过用5-0Ethicon黑丝或PDS可吸收的5.0-6.0单丝可吸收线缝合来闭合腹部肌肉，并使用创缘夹闭合外部皮肤层。在手术后7-10天，确认完全愈合后，去除这些创缘夹。在程序间期从手术器械上去除血液和组织碎片，并且在动物间还使用热珠灭菌器对这些器械进行再灭菌。在手术后，将动物放回热垫上或热灯下的笼中并进行监测，直到它们从麻醉中恢复。
术中护理：使用Deltaphase等温垫将动物保持温暖。在手术期间，用无菌眼用软膏使动物的眼睛含水。注意避免过度润湿手术部位以避免体温过低。连续监测呼吸速率和特征。如果生命体征表明极度疼痛和痛苦，则通过颈脱位法对动物施安乐死。
在所需的术后时间点，通过CO2窒息对动物施安乐死，并通过腹膜灌洗收集藻酸盐胶囊。
在这些实验中使用的示例性小鼠品系包括AKXL37/TyJ；IX因子缺陷型品系B6.129P2-F9tm1Dws/J；Bi,L等人(1995)Nature[自然]10:119-121)中描述的因子VIII缺陷型品系；α-半乳糖苷酶品系B6；Ohshima,T等人(1997)Proc Nat’l Sci USA[美国科学院院报]94:2540-2544)中描述的129-Glatm1Kul/J；以及Lin,H-F等人(2017)Blood[血液]90:3962-3966中描述的因子IX缺陷型品系。
实例8：工程化活性细胞的包封结构的比较
进行比较将单个的工程化活性细胞(例如单个的RPE细胞或单个的RPE细胞衍生物)、工程化活性细胞群集(例如工程化RPE细胞群集或RPE细胞衍生物群集)包封在藻酸盐水凝胶胶囊中和工程化活性细胞与微载体结合(例如，工程化RPE细胞与微载体结合)的研究，以测量治疗剂(例如蛋白质)的产生和细胞活力。测定每个每种结构的最大细胞载量，并且针对每种结构在相等的细胞载量和最大细胞载量下进行结构间的比较。在体外和体内评估细胞载量、活力、形态和蛋白质分泌。对于体内药代动力学分析，根据实例7中概述的方案将胶囊经腹腔植入小鼠体内，并在指定时间点，通过ELISA检测血液中的蛋白质，并且将胶囊移出以测定细胞活力。
当使用工程改造为表达FVIII-BDD蛋白并且如实例5所述包封在1.5mm水凝胶胶囊中的ARPE-19细胞进行上述研究时，无论这些细胞是作为单细胞、细胞群集还是与微载体结合的细胞包封，FVIII-BDD表达水平和细胞活力基本上相同(数据未示出)。
实例9：非工程化活性细胞的包封结构的比较
使用包封呈以下结构之一的ARPE-19野生型细胞(即未工程化)的藻酸盐水凝胶胶囊(1.5mm)，检查细胞结构对细胞包装密度、细胞活力和胶囊质量的影响：单细胞、球状体群集、
Figure BDA0002428472100001321
1微载体(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，C0646)上的细胞，
Figure BDA0002428472100001322
-S微载体上的细胞(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，M9043)。
除了通过将一定体积比的70％TMTD藻酸盐与30％SLG100共混，然后将其中一种ARPE-19结构以不同浓度悬浮在藻酸盐溶液中来制备藻酸盐溶液外，如实例5中所述，由藻酸盐溶液(改性藻酸盐和未改性藻酸盐的混合物)形成水凝胶胶囊。由以下悬浮液制备水凝胶胶囊的组合物：(1)1000、1500、2000、3000、4000或5000万个细胞/ml藻酸盐溶液(M/ml)的单细胞悬浮液；3000、4000、5000、7500万和1亿个细胞/ml藻酸盐溶液(M/ml)的球状体悬浮液；体积比为1:8、1:4、1:2、1:1.5、1:1和1:0.5(粒状微载体的毫升数:藻酸盐溶液的毫升数)的Cytodex微载体悬浮液；体积比为1:14、1:10、1:8、1:6、1:4和1:2的CultiSpher微载体悬浮液(粒状微载体的mL:藻酸盐溶液的mL)。
将每种水凝胶胶囊组合物的等分试样放入孔板中，并将孔板储存在37℃的培养箱中数小时，然后通过以下方式评估包封的细胞的活力：活/死染色(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific)#L3224)，然后使用荧光显微镜术以4x放大倍率观察染色的细胞：活细胞染成绿色，死细胞染成红色。通过检查至少100个胶囊的等分试样并计算等分试样中球形胶囊的百分比来测定胶囊质量。每个胶囊的活细胞数量通过
Figure BDA0002428472100001323
2.0测定法(普洛麦格(Promega)，G9242)测定。这些评估的结果示于图5(单细胞)、图6(球状体)、图7(Cytodex微载体)和图8(Cultispher微载体)。
如图5A所示，以所有单细胞悬浮液浓度形成了含有活细胞的球形胶囊。然而，随着包封的细胞浓度的增加，胶囊制剂的整体质量从10M/ml接近100％的球形胶囊降低到50M/ml不到90％的球形胶囊(图5B)。每个胶囊的活细胞数量随着藻酸盐溶液中细胞载量的增加而增加；然而，这对应于胶囊质量降低(图5C)。
当使用球状体群集的悬浮液制备水凝胶胶囊时，以所有细胞浓度形成了含有活细胞的球形胶囊，如图6A所示。然而，随着包封的细胞浓度的增加，胶囊制剂的整体质量从30M/ml的97％的球形胶囊降低到100M/ml大约93％的球形胶囊(图6B)。每个胶囊的活细胞数量随着藻酸盐溶液中细胞载量的增加而增加；然而，在50M/ml的中等细胞浓度下，观察到最大数量的活细胞，球形胶囊也>98％。胶囊质量与细胞数量不直接相关(图6C)。
如图7A和图8A所示，还由每种测试的微载体浓度形成了含有活细胞的球形胶囊。
然而，如图7B所示，制剂中胶囊的整体质量随着Cytodex微载体浓度的增加而降低，即，该胶囊批次的整体质量从最低浓度的悬浮液(1:8)大约98％的球形胶囊降低到最高浓度的悬浮液(1:0.5)仅70％的球形胶囊(图7B)。虽然每个胶囊的活细胞数量随着藻酸盐悬浮液中微载体浓度的增加而增加，但这对应于胶囊质量降低(图7C)。
相反，对于由Cultispher微载体悬浮液制成的胶囊制剂，整体胶囊质量随着微载体浓度的增加保持相对恒定，范围为91-97％，细胞浓度没有明显的趋势(图8B)。每个胶囊的活细胞数量随着藻酸盐溶液中微载体载量的增加而增加(图8C)。
实例10.ARPE-19细胞在体外表现出接触抑制。
将ARPE-19细胞以1,000个和40,000个细胞/孔接种到96孔板中。如实例2A和5中所述，制备包封野生型ARPE19群集的水凝胶微胶囊。对于平板接种的细胞而言在接种后的第1天和第7天，将细胞与10μm5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)在新鲜培养基中孵育72小时。包封后第1、7、21和28天，将包封的群集与10μm EdU在新鲜培养基中孵育72小时。每次孵育72小时后，将细胞在4％多聚甲醛中固定。通过用Click-iT EdU试剂盒(赛默飞世尔(ThermoFisher)，C10337)染色，对平板接种的细胞和胶囊样品进行EdU掺入染色，以鉴定在72小时孵育期间复制DNA的细胞，并且用DAPI核酸染剂对所有细胞核进行染色。通过荧光显微镜术观察样品。
稀疏(1,000个细胞/孔)或密集(40,000个细胞/孔)接种的细胞在接种后第1天具有许多EdU阳性细胞；然而，到第7天，与接种40,000个细胞的那些孔相比，在最初接种1,000个细胞的孔中有更多的细胞为EdU阳性，并且存在更多的增殖细胞(数据未示出)。这证明ARPE-19细胞随着体外密度增加而停止增殖(例如，显示接触抑制)。包封后第1天，包封群集中的细胞增殖少于平板接种的细胞；到第7天及以后，未观测到增殖细胞(数据未示出)。因此，包封的ARPE-19细胞群集在体外展示出接触抑制。
实例11.工程化RPE细胞中不同启动子对异源蛋白产生的影响的比较。
产生了PiggyBac转座子表达载体，其包含与因子IX编码序列可操作地连接的几种测试启动子之一。使ARPE-19和HS27细胞系在5％CO2和37℃下生长，用各2.5ug的Piggybac转座子DNA表达构建体+0.5ug的cherry-CAG-HyPBase，使用lipofectamine方法转染。为了产生稳定的细胞库，用嘌呤霉素对ARPE-19细胞进行选择。保持细胞并扩增约3周，在这段时间期间每三天添加一次含有选择剂的新鲜培养基。为了评价所选克隆物的细胞特异性生产力，将500,000个细胞一式两份接种在6孔板中。4小时后，更换培养基并用新鲜培养基代替。24小时后，收集上清液培养基并评价活细胞密度。通过将FIX浓度(使用hFIX ELISA测定的)相对于活细胞的数量作图来测定细胞特异性生产力(pg/细胞/天)。
如图9所示，用不同启动子工程改造的ARP-19细胞产生不同水平的FIX表达。用包含与FIX编码序列可操作地连接的CAG启动子的表达载体转染的细胞比用相同但是具有与FIX编码序列可操作地连接的CMV或Ubc启动子的表达载体转染的细胞表现更好。令人惊讶地，ARPE-19细胞中CAG启动子控制下的FIX表达高于HS27成纤维细胞系。监测具有CAG-FIX构建体的ARPE-19细胞对FIX的长期体外表达(1个月)，在不存在嘌呤霉素的情况下，该细胞系的生产力保持不变(数据未示出)，表明工程化ARPE-19细胞的FIX表达是稳定的。
实例11.用于工程改造RPE细胞的示例性表达载体
可以使用PiggyBac转座子系统将RPE细胞(例如ARPE-19细胞)工程改造为表达外源多肽，这涉及用两种质粒共转染RPE细胞：(1)转座子载体，其含有能够表达目标多肽的转录单位，该转录单位插入被PiggyBac转座酶识别的末端反向重复(ITR)元件之间；以及(2)表达piggyBac转座酶的质粒。PiggyBac系统通过“剪切和粘贴”机制介导基因转移，由此转座酶将转录单位和ITR整合到RPE细胞的TTAA染色体位点中。替代性地，可以通过仅用转座子载体转染RPE细胞，将这些细胞工程改造为从染色体外载体表达目标多肽。
用于工程改造RPE细胞的示例性转座子载体如图10(SEQ ID NO:26)示出，并具有以下载体表中描述的载体元件。在转染RPE细胞之前，通过插入目标编码序列紧接在科扎克序列之后并与pCAG启动子可操作地连接，产生待整合到RPE染色体位点的转录单位。
示例性转座子载体组件
Figure BDA0002428472100001351
Figure BDA0002428472100001361
实例12.密码子优化增强工程化RPE细胞的FVIII表达。
使用可商购的算法生成编码图1(SEQ ID NO:1)所示的重组人FVIII-BDD氨基酸序列的密码子优化(CO)序列。将编码相同FVIII-BDD多肽的野生型(例如，未优化的)序列(SEQID NO:8)用作对照(天然的)。将每个CO和天然序列插入图10的转座子表达载体中，插入位点紧邻科扎克序列的下游。将ARPE-19细胞用PiggyBac转座酶载体和天然转座子载体或CO转座子载体共转染，并通过ELISA评估所得工程化细胞的蛋白质产量((pg/细胞/天)。图11示出了相对于用野生型编码序列工程改造的细胞的FVIII-BDD产量，前3个CO构建体的FVIII-BDD产量的增加倍数。
为了评估使用密码子优化序列对其他FVIII-BDD变体蛋白的影响，对rhFVIII-BDDCO6序列(SEQ ID NO:15)进行修饰(视情况，通过核苷酸取代或添加进行修饰)以生成编码rhScFVIII-BDD 2变体(rhScFVIII-BDD CO,SEQ ID NO:16)或单链反向添加BDD蛋白变体(rhScFVIII-BDD CO反向添加；SEQ ID NO:17)的密码子优化序列。对照编码序列是编码原始FVIII-BDD多肽变体(SEQ ID NO:1)(天然的)、四种不同的单链BDD变体(SEQ ID NO:3-6)和反向添加FVIII变体(SEQ ID NO:7)的野生型(例如，未优化的)编码序列。将每个CO变体和对照编码序列插入图10的转座子表达载体中，插入位点紧邻科扎克序列的下游。将ARPE-19细胞用PiggyBac转座酶载体和转座子载体共转染。通过ELISA评估所得工程化细胞的FVIII蛋白产量(pg/细胞/天)。图12示出了相对于rhFVIII-BDD(SEQ ID NO:1)的产生，单链BDD变体和反向添加FVIII-BDD变体的产量变化。
实例13.密码子优化增强工程化RPE细胞的FIX表达。
使用可商购的算法，生成编码重组人FIX-Padua变体多肽(SEQ ID NO:2)的密码子优化(CO)序列(SEQ ID NO.19-21)。将编码相同FIX-Padua多肽的野生型(例如，未优化的)序列(SEQ ID NO:18)用作对照(天然的)。将每个CO和天然序列插入图10的转座子表达载体中，插入位点紧邻科扎克序列的下游。将ARPE-19细胞用PiggyBac转座酶载体和转座子载体共转染。通过ELISA评估所得工程化细胞的FIX蛋白产量(pg/细胞/天)。图13示出了相对于用野生型(例如，未优化的)编码序列(天然的)工程改造的细胞的产量，用CO序列工程改造的细胞的FIX-Padua产量。
实例14.用多个FIX转录单位转染RPE细胞增加工程化RPE细胞中的FIX表达。
通过用PiggyBac转座酶载体和含有野生型编码序列(天然的)的转座子表达载体(图10)，具有密码子优化序列(SEQ ID NO:19)的转座子表达载体(图10)或除了具有重复的密码子优化的转录单位(即pCAG启动子、科扎克序列、SEQ ID NO:19和rBG pA序列)以外相同的转座子表达载体共转染RPE细胞，将这些细胞工程改造为表达FIX-Padua(SEQ ID NO:2)。通过ELISA评估所得工程化细胞的FIX蛋白产量(pg/细胞/天)，并且结果示于图14。
等同形式和范围
本申请引用了各种发布的专利、出版的专利申请、杂志文章和其他出版物，将其全部通过援引并入本文。如果在任一个并入的参考文献和本说明书之间有冲突，以本说明书为准。另外，在现有技术之内的本披露的任何特定实施例可以从任何一项或多项权利要求中明确排除。因为此类实施例被视为对于本领域的普通技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有被明确陈述。本披露的任何特定实施例可以因为任何原因从任一权利要求中排除，不管是否与存在的现有技术相关。
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的具体实施例的许多等同形式。本文描述的实施例的范围不旨在限于以上说明书、附图或实例，而是如所附权利要求中所陈述的。本领域的普通技术人员将认识到，在不脱离如在以下权利要求中所定义的本披露的精神或范围下，可以对本说明书进行各种改变和修改。
序列表
<110> 西吉隆医疗股份有限公司（SIGILON THERAPEUTICS, INC.）
<120> 包含活性细胞的方法、组合物和可植入元件
<130> S2225-7015WO
<140>
<141>
<150> 62/652,882
<151> 2018-04-04
<150> 62/652,881
<151> 2018-04-04
<150> 62/563,877
<151> 2017-09-27
<160> 36
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(19)
<223> /注=“信号序列”
<400> 1
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(28)
<223> /注=“信号序列”
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
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<222> (1)..(19)
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1115 1120 1125
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1130 1135 1140
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
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Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1160 1165 1170
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1175 1180 1185
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1190 1195 1200
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Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
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Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1460 1465 1470
Tyr
<210> 8
<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 8
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
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gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
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ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
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<210> 9
<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 9
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<210> 10
<211> 4374
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 10
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
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<210> 11
<211> 4362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 11
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
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<210> 12
<211> 4365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 12
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<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 13
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<210> 14
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<220>
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<223> /注=“人工序列的描述：合成的
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<210> 15
<211> 4374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 15
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<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
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ttgcccggcc tcattggatg tcacaggaaa agcgtctatt ggcatgtaat cgggatggga 840
accacacctg aggtccacag catatttctg gaaggccaca catttctggt gagaaatcat 900
cgccaggctt ccctggaaat ttcccccatc accttcttga ccgcccagac actgctcatg 960
gatcttgggc agtttctgct gttttgtcat atttcttctc accaacacga cggaatggag 1020
gcctacgtta aggtcgatag ttgccctgaa gaacctcagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080
gaagccgagg actacgatga cgatttgacc gattccgaaa tggacgtggt gcgctttgat 1140
gatgacaatt ctccatcctt cattcagatt agatccgtcg ccaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcact acattgcagc cgaggaggag gattgggact acgcccccct ggtgctggca 1260
cccgacgacc gaagctacaa atctcagtac ctgaacaatg gtccacaacg gatcggcagg 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcctat acagacgaaa ccttcaaaac cagggaggct 1380
atccagcacg agtctgggat tctgggacca ctcctgtacg gcgaagtggg cgacaccttg 1440
ttaattatct tcaagaacca ggctagtaga ccttataaca tttatcccca cggcattacc 1500
gatgtgcggc ctctctactc taggcggctt ccaaaggggg tgaaacacct gaaggacttt 1560
cccatcctcc ctggcgaaat ctttaagtat aagtggacag tgaccgtgga ggatggacca 1620
accaagagcg accccaggtg cctgacacgc tattattcaa gcttcgtgaa tatggaaagg 1680
gacctcgcat ctggcttgat cggccctctg ctgatatgtt acaaggaaag cgtcgatcag 1740
agaggaaatc agatcatgtc agacaaaagg aatgtgatcc tgttctccgt cttcgatgaa 1800
aacaggagct ggtatctgac agagaacatc cagagattcc tgccaaatcc cgccggcgtc 1860
cagctggagg acccggagtt tcaggcatct aacatcatgc attccattaa tggttacgtg 1920
ttcgactccc tgcagctgag cgtgtgcctc cacgaggtgg cctactggta catcttgagc 1980
atcggcgccc agaccgactt tctgagcgtc tttttctccg ggtatacttt caaacataag 2040
atggtgtacg aagatactct gacgctgttc cctttctctg gggagactgt gtttatgtct 2100
atggagaacc ctggactgtg gattctcgga tgccacaaca gtgactttcg taatagaggg 2160
atgactgcac tgctgaaggt gtccagctgt gataaaaata ctggcgacta ctacgaagat 2220
agctatgagg atatctcagc atacctgctg agcaagaata acgccatcga gccccgaagc 2280
ttctcacaga atgccaccaa cgtgagcaac aacagcaaca ccagcaacga cagcaacgtg 2340
agcccccctg tcctcaaggc ccaccaggcg gagatcacaa ggaccacact ccagtccgac 2400
caggaggaga ttgactacga tgacacgatt tctgtggaga tgaaaaaaga ggactttgac 2460
atctacgatg aggatgaaaa ccagagccct aggtcgttcc agaagaaaac aaggcactac 2520
ttcattgccg ccgtggagag actgtgggac tacggaatga gtagttcccc acacgtgttg 2580
cggaacagag cccagagtgg gtccgtccca cagttcaaga aggttgtttt ccaggagttc 2640
acagatggct ccttcactca gccactgtat cgcggcgagc tgaatgagca cttgggctta 2700
ttgggcccct acattcgcgc agaagtcgaa gataatatta tggtgacctt ccgcaaccag 2760
gccagccggc cttactcatt ctactcctct ctcatctctt atgaggagga tcagcgccag 2820
ggcgccgaac cccggaagaa ctttgtgaag cccaatgaaa ccaaaactta cttttggaag 2880
gtgcagcacc atatggcgcc gacgaaagac gaatttgact gcaaagcctg ggcctacttc 2940
agcgacgtcg acttggagaa ggacgtccac agcggcctga ttggcccttt gttggtctgc 3000
cataccaata cactcaaccc tgcccacggg aggcaggtga ccgtgcagga gtttgccttg 3060
ttcttcacca tcttcgacga aaccaagagc tggtacttca cagagaacat ggagaggaac 3120
tgcagagcac cctgtaacat ccagatggag gaccctactt tcaaggaaaa ttacaggttc 3180
catgccatta atggctacat catggatacc ctccccgggc ttgtgatggc tcaggaccag 3240
cgcatccgct ggtacctgct ctcaatgggc tccaacgaga acattcatag catccacttt 3300
agtggccacg tgtttaccgt gcgcaagaag gaggagtaca agatggcact gtacaacctg 3360
taccctggcg tgtttgagac agtggagatg ctgccatcca aggccggcat ctggcgcgtg 3420
gagtgcctca ttggggagca cctccatgct ggcatgtcta cactgttcct ggtgtacagc 3480
aacaagtgtc agactccact cggaatggcc tccgggcata tccgcgattt tcagatcacg 3540
gcctctggcc agtatggcca atgggctccc aagctggcca ggctgcacta cagtgggagt 3600
atcaacgctt ggagcaccaa ggagcctttc tcctggatca aggtggacct gcttgccccc 3660
atgattattc acggcattaa gacacagggg gccaggcaga aattctcctc cctgtacatc 3720
tcccagttca tcatcatgta cagtctggac ggcaaaaagt ggcagaccta ccgcgggaac 3780
agtaccggga cattgatggt gttcttcggg aacgtggact ctagcggcat taaacacaac 3840
attttcaacc cccccatcat tgctaggtat atcaggctcc atcccaccca ctatagcatc 3900
aggtccactc tgcggatgga gctgatgggc tgcgacctta attcatgcag catgccgctg 3960
ggcatggagt caaaggccat ctccgacgcc caaatcaccg cctccagcta cttcaccaat 4020
atgttcgcca cctggagccc cagcaaggcc cggctgcacc tgcagggccg cagcaacgcc 4080
tggcggcctc aggtgaacaa ccccaaggag tggctgcagg tggacttcca gaaaaccatg 4140
aaggtgactg gggtcaccac ccagggagtc aagagcctgc tgaccagcat gtatgtgaag 4200
gagttcttga tcagctcgtc acaggatggc caccagtgga ctttgttctt tcagaacggt 4260
aaggtgaaag tgttccaggg aaaccaagat tcctttacac cagtggtcaa ctctctggat 4320
cctcccctgc tgacacggta cctgcggatc catccccagt catgggtgca ccagattgct 4380
ctgcgcatgg aggtgcttgg ctgcgaggcc caggacctgt actaa 4425
<210> 18
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 18
atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60
ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120
ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaacctt 180
gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240
actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300
ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360
tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420
tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480
tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540
gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600
tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660
tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720
caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780
tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840
gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900
cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960
ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020
tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080
cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140
acatgtcttc tgtctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200
gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260
gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320
tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380
acttaa 1386
<210> 19
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 19
atgcagcgcg tgaacatgat tatggccgag tctcccggcc tgatcaccat ctgtctgctg 60
ggctatctgc tgagcgccga gtgcaccgtg tttctggatc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacagac ccaagcggta caacagcggc aagctggaag agttcgtgca gggcaacctg 180
gaacgcgagt gcatggaaga gaagtgcagc ttcgaagagg ccagagaggt gttcgagaac 240
accgagagaa ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300
ccttgtctga atggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360
ttcggcttcg agggcaagaa ttgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcaga 420
tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtcg tgtgctcctg cacagagggc 480
tacagactgg ccgagaacca gaagtcttgc gagcccgctg tgccctttcc atgtggcaga 540
gtgtctgtgt cccagaccag caagctgacc agagccgaga cagtgttccc cgacgtggac 600
tacgtgaaca gcaccgaggc cgagacaatc ctggacaaca tcacccagag cacccagtcc 660
ttcaacgact tcaccagagt cgtcggcggc gaggatgcta agcctggaca gtttccttgg 720
caagtggtgc tgaacggcaa ggtggacgct ttttgtggcg gctccatcgt gaacgagaag 780
tggatcgtga ccgccgctca ctgtgtggaa accggcgtga agattacagt ggtggccggc 840
gagcacaaca tcgaggaaac agagcacacc gagcagaaac ggaacgtgat cagaatcatc 900
cctcaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgatatcgc cctgctggaa 960
ctggacgagc ccctggtcct gaactcttac gtgaccccta tctgtatcgc cgacaaagag 1020
tacaccaaca tctttctgaa gttcggcagc ggctacgtgt ccggctgggg aagagttttc 1080
cacaagggca gatcagccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggatagagcc 1140
acatgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gaaggcggca gagattcttg tcaaggcgat tctggcggcc ctcacgtgac agaggttgag 1260
ggcacaagct ttctgaccgg catcatcagc tggggcgaag agtgtgccat gaaggggaag 1320
tacggcatct acaccaaggt gtccagatac gtgaactgga tcaaagaaaa gaccaagctc 1380
acctga 1386
<210> 20
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 20
atgcagcgcg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60
ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaaccgcc ccaagcgcta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180
gagcgcgagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg cccgcgaggt gttcgagaac 240
accgagcgca ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300
ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgc 420
tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480
taccgcctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggccgc 540
gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc cgcgccgaga ctgtgttccc cgacgtggac 600
tacgtgaaca gcaccgaggc cgaaacgatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660
ttcaacgact tcacccgcgt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720
caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780
tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggaa accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840
gagcacaaca tcgaggaaac cgagcacacc gagcagaagc gcaacgtgat ccgcatcatc 900
ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960
ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020
tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg ccgcgtgttc 1080
cacaagggcc gcagcgccct ggtgctgcag tacctgcgcg tgcccctggt ggaccgcgcc 1140
acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gagggcggcc gcgacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260
ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320
tacggcatct acaccaaggt gagccgctac gtgaactgga tcaaggagaa aaccaagctg 1380
acctaa 1386
<210> 21
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 21
atgcagcggg tgaacatgat catggccgag agccccgggc tgatcaccat ctgtctgctg 60
gggtacctgc tgtccgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaatcgcc ccaagagata caattccgga aagctggaag agtttgtgca gggcaacctg 180
gagagagagt gcatggaaga gaagtgctcc ttcgaggagg cccgggaggt gttcgagaat 240
actgaacgga caacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgaccagtg tgagagcaac 300
ccctgtctga acggcgggag ctgcaaggac gacattaatt cctacgaatg ctggtgccca 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggccgc 420
tgcgagcagt tttgcaagaa ctccgccgac aacaaggtgg tgtgttcttg caccgagggc 480
taccgcctgg ccgaaaacca gaagagctgt gagcctgccg tgcccttccc ctgcggccgg 540
gtgtctgtgt cccagacctc caagctgacc agagccgaaa ccgtgtttcc agatgtggac 600
tacgtgaata gcaccgaggc cgagactatc ctcgacaaca tcacccagtc cacccagagc 660
tttaacgact tcacccgcgt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720
caggtggtgc tcaacggaaa ggtggacgcc ttctgcggag gcagcatcgt gaatgaaaag 780
tggatcgtga cagccgccca ctgcgtggaa acaggggtga agatcaccgt ggtggctgga 840
gagcacaaca tcgaggagac agagcacacc gaacagaaga ggaatgtgat caggatcatc 900
ccccaccaca actataatgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960
ctggatgagc ccctggtgct caacagctac gtgaccccca tctgcatcgc tgacaaggag 1020
tacaccaaca tcttcctgaa gttcggctcc ggctacgtgt ctggctgggg ccgcgtgttc 1080
cacaagggaa gaagcgccct cgtgctgcag tacctgcggg tgccactggt ggacagggcc 1140
acctgcctgc tgagcactaa gttcaccatt tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gagggcggca gggactcctg ccagggcgac agcggcggcc cccatgtgac cgaggtggag 1260
ggcacctcct ttctgactgg cattatctcc tggggcgagg agtgcgccat gaaggggaag 1320
tatggcatct acaccaaggt gtcccgctac gtgaactgga ttaaggagaa aaccaagctg 1380
acctga 1386
<210> 22
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 22
ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60
tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120
gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180
gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240
ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300
tgttatagat atc 313
<210> 23
<211> 1733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 23
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420
tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480
cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540
ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600
ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660
cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720
cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc 780
ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg 840
aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt 900
gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc 960
gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg 1020
ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg 1080
tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc 1140
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1200
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1260
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1320
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1380
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1440
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1500
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1560
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1620
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 1680
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttg 1733
<210> 24
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 24
tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca 60
caaataccac tgagatcttt ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct 120
tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa 180
ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa 240
tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg 300
ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca 360
tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc 420
tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg 480
actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga tc 522
<210> 25
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 25
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60
acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120
gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180
tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaa 235
<210> 26
<211> 6164
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 26
ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60
tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120
gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc 180
gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg 240
ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct 300
tgttatagat atcatcaact ttgtatagaa aagttgctcg acattgatta ttgactagtt 360
attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 420
cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 480
caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 540
tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 600
cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 660
ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 720
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 780
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 840
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 900
cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 960
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg cgctgccttc 1020
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<210> 27
<211> 6721
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 27
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<210> 28
<211> 3733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多核苷酸”
<400> 28
ctcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
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aggccagaga ggtgttcgag aacaccgaga gaaccaccga gttctggaag cagtacgtgg 2040
acggcgatca gtgcgagagc aacccttgtc tgaatggcgg cagctgcaag gacgacatca 2100
acagctacga gtgctggtgc cccttcggct tcgagggcaa gaattgcgag ctggacgtga 2160
cctgcaacat caagaacggc agatgcgagc agttctgcaa gaacagcgcc gacaacaagg 2220
tcgtgtgctc ctgcacagag ggctacagac tggccgagaa ccagaagtct tgcgagcccg 2280
ctgtgccctt tccatgtggc agagtgtctg tgtcccagac cagcaagctg accagagccg 2340
agacagtgtt ccccgacgtg gactacgtga acagcaccga ggccgagaca atcctggaca 2400
acatcaccca gagcacccag tccttcaacg acttcaccag agtcgtcggc ggcgaggatg 2460
ctaagcctgg acagtttcct tggcaagtgg tgctgaacgg caaggtggac gctttttgtg 2520
gcggctccat cgtgaacgag aagtggatcg tgaccgccgc tcactgtgtg gaaaccggcg 2580
tgaagattac agtggtggcc ggcgagcaca acatcgagga aacagagcac accgagcaga 2640
aacggaacgt gatcagaatc atccctcacc acaactacaa cgccgccatc aacaagtaca 2700
accacgatat cgccctgctg gaactggacg agcccctggt cctgaactct tacgtgaccc 2760
ctatctgtat cgccgacaaa gagtacacca acatctttct gaagttcggc agcggctacg 2820
tgtccggctg gggaagagtt ttccacaagg gcagatcagc cctggtgctg cagtacctga 2880
gagtgcccct ggtggataga gccacatgcc tgctgagcac caagttcacc atctacaaca 2940
acatgttctg cgccggcttc cacgaaggcg gcagagattc ttgtcaaggc gattctggcg 3000
gccctcacgt gacagaggtt gagggcacaa gctttctgac cggcatcatc agctggggcg 3060
aagagtgtgc catgaagggg aagtacggca tctacaccaa ggtgtccaga tacgtgaact 3120
ggatcaaaga aaagaccaag ctcacctgaa attcgcggcc gctaaaccca gctttcttgt 3180
acaaagtggc aactttatta tacatagttg atcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg 3240
tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg 3300
ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3360
aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3420
atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3480
atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3540
aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 3600
tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 3660
ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 3720
tcttatggag atc 3733
<210> 29
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(20)
<223> /注=“信号序列”
<400> 29
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 30
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(25)
<223> /注=“信号序列”
<400> 30
Met Ile Pro Ala Lys Asp Met Ala Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala
1 5 10 15
Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ser
20 25 30
Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser
35 40 45
Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn
50 55 60
Phe
65
<210> 31
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(25)
<223> /注=“信号序列”
<400> 31
Met Ile Pro Ala Lys Asp Met Ala Lys Val Met Ile Val Met Leu Ala
1 5 10 15
Ile Cys Phe Leu Thr Lys Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ser
20 25 30
Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser
35 40 45
Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn
50 55 60
Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln
65 70 75 80
Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys
85 90 95
Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala
100 105 110
Lys Ser Gln
115
<210> 32
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(22)
<223> /注=“信号序列”
<400> 32
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys
20 25 30
Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr
35 40 45
Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val
50 55 60
Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys
65 70 75 80
Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala
85 90 95
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp
100 105 110
Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr
115 120 125
Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe
130 135 140
Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn
145 150 155 160
Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro
165 170 175
Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu
180 185 190
Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp
195 200 205
Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu
210 215 220
Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser
225 230 235 240
Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly
245 250 255
Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln
260 265 270
Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser
275 280 285
Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr
290 295 300
Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg
305 310 315 320
Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Leu Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser
340 345 350
Ile Gly Asp Cys Ala Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His
355 360 365
Val Cys Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu
370 375 380
Cys Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu
385 390 395 400
Cys Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys
405 410 415
Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
420 425 430
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr
435 440 445
Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg
450 455 460
Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His
465 470 475 480
Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys
485 490 495
Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro
500 505
<210> 33
<211> 1247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(22)
<223> /注=“信号序列”
<400> 33
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro
1235 1240 1245
<210> 34
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注=“人工序列的描述：合成的
多肽”
<400> 34
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 35
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 36
<211> 415
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415

Claims (36)

1.一种工程化活性细胞或包含该工程化活性细胞的可植入元件，其中该工程化活性细胞是工程化视网膜色素上皮(RPE)细胞或衍生自RPE细胞的工程化细胞，并且其中该工程化活性细胞包含编码多肽的外源核酸，其中该外源核酸包含以下核苷酸序列中的一个或多个：
a)基本上由以下序列组成或由以下序列组成的启动子序列：(i)SEQ ID NO:23或(ii)与SEQ ID NO:23具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列；
b)编码因子VIII-BDD(FVIII-BDD)多肽的编码序列，其中该FVIII-BDD多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或在位置787和790中的每一处具有丙氨酸而不是精氨酸的SEQ ID NO:7；
c)编码因子IX(FIX)多肽的编码序列，其中该FIX多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:2；
d)编码白细胞介素-2(IL-2)多肽的编码序列，其中该IL-2多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:29；
e)编码甲状旁腺激素(PTH)多肽的编码序列，其中该PTH多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:30或31；
f)编码血管性血友病因子(vWF)多肽的编码序列，其中该vWF多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:32或33；
g)编码(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的氨基酸序列的保守性取代变体的编码序列；以及
h)编码与(b)、(c)、(d)、(f)或(g)中的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的编码序列。
2.一种工程化活性细胞或包含该工程化活性细胞的可植入元件，其中该工程化活性细胞包含编码多肽的外源核酸，其中该外源核酸包含以下核苷酸序列中的一个或多个：
a)基本上由以下序列组成或由以下序列组成的启动子序列：(i)SEQ ID NO:23或(ii)与SEQ ID NO:23具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列；
b)编码因子VIII-BDD(FVIII-BDD)多肽的编码序列，其中该FVIII-BDD多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或在位置787和790中的每一处具有丙氨酸而不是精氨酸的SEQ ID NO:7；
c)编码因子IX(FIX)多肽的编码序列，其中该FIX多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:2；
d)编码白细胞介素-2(IL-2)多肽的编码序列，其中该IL-2多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:29；
e)编码甲状旁腺激素(PTH)多肽的编码序列，其中该PTH多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:30或31；
f)编码血管性血友病因子(vWF)多肽的编码序列，其中该vWF多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:32或33；
g)编码(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的氨基酸序列的保守性取代变体的编码序列；以及
h)编码与(b)、(c)、(d)、(f)或(g)中的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的编码序列。
3.如权利要求2所述的工程化活性细胞或包含该工程化活性细胞的可植入元件，其中该工程化活性细胞具有以下特征中的一个或多个：
(a)它包含视网膜色素上皮(RPE)细胞或由其衍生的细胞；
(b)它包含已从低分化细胞中获得的细胞；以及
(c)它包含具有以下特性中的一个或多个的细胞：
(i)它表达生物标志物CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的一种或多种；
(ii)它不表达生物标志物CRALBP、RPE-65、RLBP、BEST1或αB-晶体蛋白中的一种或多种；
(iii)它天然存在于视网膜中并在布鲁赫氏膜中的脉络膜血管上方形成单层；以及
(iv)它负责视网膜中的上皮转运、光吸收、分泌和/或免疫调节。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽是FVIII-BDD多肽或FIX多肽。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽是FVIII-BDD多肽，并且该编码序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：
a)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQID NO:27；或者
b)与a)中所列的任何编码序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核苷酸序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽是FVIII-BDD多肽，并且该编码序列基本上由或由SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:27组成。
7.如权利要求1-4中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽是FIX多肽，并且该编码序列包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：
a)SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:28；或者
b)与a)中所列的任何编码序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核苷酸序列。
8.如权利要求1-4或7中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽是FIX多肽，并且该编码序列基本上由或由以下序列组成：SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:28。
9.如权利要求1至8中任一项所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该工程化活性细胞是ARPE-19细胞。
10.如权利要求1至9中任一项所述的可植入元件，其包含多个工程化活性细胞。
11.一种工程化活性细胞，例如RPE细胞，或包含该工程化活性细胞的可植入元件，其中该工程化活性细胞包含外源核酸，该外源核酸包含与多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列，其中该启动子序列基本上由或由SEQ ID NO:23组成，或者与SEQ ID NO:23具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
12.如权利要求11所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6。
13.如权利要求12所述的工程化活性细胞或可植入元件，其中该多肽包含SEQ ID NO:4，并且该编码序列包含SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16具有至少99％序列同一性的序列。
14.如权利要求11所述的工程化活性细胞，其中该多肽包含以下序列、基本上由以下序列组成或由以下序列组成：SEQ ID NO:2。
15.如权利要求14所述的工程化活性细胞，其中该多肽包含SEQ ID NO:2，并且该编码序列包含SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19具有至少99％序列同一性的序列。
16.如权利要求11-15中任一项所述的工程化活性细胞，其中该多肽还包含SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35。
17.如权利要求11-16中任一项所述的工程化活性细胞，其中该外源核酸包含紧邻该编码序列上游的科扎克序列。
18.如权利要求17所述的工程化活性细胞，其中该科扎克序列是SEQ ID NO:26的核苷酸2094-2099。
19.如权利要求11-18中任一项所述的工程化活性细胞，其中该外源核酸包含与该编码序列可操作地连接的聚A信号序列，其中该聚A信号序列基本上由或由SEQ ID NO:26的核苷酸2163-2684组成。
20.如前述权利要求中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞，其中该启动子序列由SEQ ID NO:23组成。
21.如前述权利要求中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞，其中该工程化活性细胞是人RPE细胞。
22.如前述权利要求中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞，其中该外源核酸整合到该工程化活性细胞的染色体中。
23.如权利要求1-3或11中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞，其中该多肽选自由以下项组成的组：抗体(例如，抗神经生长因子抗体)、酶(例如，α-半乳糖苷酶)和凝结因子(例如凝血因子，例如活化凝血因子)。
24.如权利要求1-3或11中任一项所述的可植入元件或工程化活性细胞，其中该多肽是胰岛素多肽(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)。
25.如权利要求1-3或11中任一项所述的可植入元件或工程化细胞，其中该多肽不是胰岛素多肽(例如，胰岛素A链、胰岛素B链或胰岛素原)。
26.如权利要求1-10和20-25中任一项所述的可植入元件，其中该可植入元件包含封闭部件。
27.如权利要求26所述的可植入元件，其中该封闭部件包括(i)柔性聚合物(例如，PLA、PLG、PEG、CMC或多糖，例如藻酸盐)或(ii)非柔性聚合物或金属外壳。
28.如权利要求26或27中任一项所述的可植入元件，其中该封闭部件经过化学改性。
29.如前述权利要求中任一项所述的可植入元件，其中该可植入元件或其封闭部件用式(I)的化合物：
Figure FDA0002428472090000051
或其盐改性，其中：
A是烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、–O–、–C(O)O–、–C(O)–、–OC(O)–、–N(RC)–、–N(RC)C(O)–、–C(O)N(RC)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、-N(RC)C(O)(C1-C6-亚烷基)–、–N(RC)N(RD)–、–NCN–、–C(＝N(RC)(RD))O–、–S–、–S(O)x–、–OS(O)x–、–N(RC)S(O)x–、–S(O)xN(RC)–、–P(RF)y–、–Si(ORA)2–、–Si(RG)(ORA)–、–B(ORA)–或金属，其中每个烷基、烯基、炔基、亚烷基、亚烯基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基连接至附接基团(例如，本文定义的附接基团)，并且任选地被一个或多个R1取代；
L1和L3中的每一个独立地是键、烷基或杂烷基，其中每个烷基和杂烷基任选地被一个或多个R2取代；
L2是键；
M是不存在、烷基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R3取代；
P是不存在、环烷基、杂环基或杂芳基，其中每一个任选地被一个或多个R4取代；
Z是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、–ORA、–C(O)RA、–C(O)ORA、–C(O)N(RC)(RD)、–N(RC)C(O)RA、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R5取代；
每个RA、RB、RC、RD、RE、RF和RG独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、叠氮基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R6取代；
或RC和RD与它们所附接的氮原子合在一起形成任选地被一个或多个R6取代的环(例如5-7元环)；
每个R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、叠氮基、氧代、–ORA1、–C(O)ORA1、–C(O)RB1、–OC(O)RB1、–N(RC1)(RD1)、–N(RC1)C(O)RB1、–C(O)N(RC1)、SRE1、S(O)xRE1、–OS(O)xRE1、–N(RC1)S(O)xRE1、–S(O)xN(RC1)(RD1)、–P(RF1)y、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个RA1、RB1、RC1、RD1、RE1和RF1独立地是氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，其中每个烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基任选地被一个或多个R7取代；
每个R7独立地是烷基、烯基、炔基、杂烷基、卤素、氰基、氧代、羟基、环烷基或杂环基；
x是1或2；以及
y是2、3或4。
30.如权利要求29所述的可植入元件，其中该式(I)的化合物是化合物表1中所示的化合物。
31.如权利要求29-30中任一项所述的可植入元件，其中该化合物选自：
Figure FDA0002428472090000071
和
Figure FDA0002428472090000072
或其盐。
32.如权利要求29-30中任一项所述的可植入元件，其中该化合物选自化合物表1中的化合物110、化合物112、化合物113或化合物114。
33.如权利要求26-32中任一项所述的可植入元件，其中该封闭部件是藻酸盐水凝胶胶囊。
34.如权利要求33所述的可植入元件，其包含至少约10,000、15,000或20,000个工程化ARPE-19细胞。
35.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的多个如前述权利要求中任一项所述的可植入元件。
36.如权利要求1-34中任一项所述的可植入元件或如权利要求35所述的药物组合物，用于通过以下方法治疗人类受试者，该方法包括：向该受试者施用或提供该可植入元件或组合物，从而治疗该受试者或向该受试者提供产品(例如，治疗产品)。
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