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CN111378026A - 一种制备结合位点可控的peg化生物分子的方法 - Google Patents

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CN111378026A CN201911367538.5A CN201911367538A CN111378026A CN 111378026 A CN111378026 A CN 111378026A CN 201911367538 A CN201911367538 A CN 201911367538A CN 111378026 A CN111378026 A CN 111378026A
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王庆彬
齐杰
李玉
赵宣
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Tianjin Jenkem Technology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：(1)阻隔物与生物分子结合；(2)PEG化生物分子；(3)将阻隔物与生物分子分离。另一方面，本发明公开了一种制备结合位点可控的PEG化IL‑2的方法，包括如下步骤：(1)将IL‑2与IL‑2α受体结合，封闭IL‑2的α结合位点；(2)PEG化，PEG与IL‑2偶联；(3)将IL‑2与IL‑2α受体分离。通过对IL‑2的结合位点进行调控，PEG化过程中只添加1或2个PEG，使IL‑2选择性的结合IL‑2Rβγ类受体。

Description

一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体的涉及一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方 法。
背景技术
白细胞介素-2(IL-2)是由植物血凝素(PHA)等分裂原刺激淋巴细胞增殖时产生的。 近来对该因子及其受体的研究日益深入，发现它在细胞免疫、体液免疫及免疫调节中起重 要作用。特别是在肿瘤免疫治疗中的作用及临床意义受到许多作者的重视。
IL-2大多数由CD4+的T辅助细胞(Th)产生的，少数由CD8+及其它免疫细胞产生。这些细胞在IL-1作用下能分泌IL-2。淋巴细胞产生的IL-2作用于表面带IL-2受体的细胞，使细胞增殖而发挥其生物学功能，可作用于正常T、B淋巴细胞、NK细胞的前体细胞、细 胞毒T细胞(CTL)以及淋巴因子活化的杀伤细胞的前体细胞等。IL-2的生物学功能包括： 1，维持活化后T细胞体外长期生存，并保持其生物学功能活性，一些受肿瘤抗原激活的T 细胞在IL-2作用下，可增强其杀伤肿瘤细胞的功能，加强抗肿瘤作用；2，促进B细胞增 殖，分化并产生抗体；3，刺激粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及γ-干扰素等的分泌，促进 淋巴细胞表达这些受体；维特亚剂量促分裂原存在时胸腺的增殖；促进IL-2受体表达，参 与机体免疫调节系统，维持免疫平衡和稳定。
IL-2是最早的免疫治疗药物。早在1992和1998年，美国FDA就批准了IL-2药物阿地白介素(Aldesleukin)用于晚期肾癌和恶性黑色素瘤，有效率在15％-20％，能使近10％-15％的患者存活期超过5年。不过，由于临床使用的剂量很高，IL-2的副作用很大， 比如严重的低血压和血管渗漏综合征。在当时，使用IL-2治疗的患者必须住院，24小时 密切观察，稍有不慎就有生命危险。所以，巨大的副作用限制了IL-2的使用，多数临床医 生并不敢轻易碰它。
IL-2的作用机理如下：IL-2主要由经抗原刺激后的CD4+T细胞产生，CD8+T细胞，NK细胞和DC细胞也可以分泌。高剂量的IL-2可以促进CD4+T细胞的分化，CD8+T 细胞和NK细胞的增殖，增加他们的杀伤力从而调动机体的免疫反应。反过来，低剂量的 IL-2会促进调节性T细胞的增殖，对免疫系统起到抑制的作用，因此低剂量的IL-2也 常常用来治疗自身免疫性疾病。
之所以有此不同主要是因为免疫细胞表面IL-2受体分布不同，IL-2受体共有三个亚 基构成α，β，γ亚基。CD8阳性T细胞和NK细胞等起杀伤性细胞表面受体主要是β和 γ亚基构成(IL-2Rβγ)，该受体对IL-2亲和力较低，需要大剂量IL-2才能激活。而调节 性T细胞表面多为α，β，γ三个亚基组成的高亲和抗体(IL-2Rαβγ)，低剂量的IL-2更 容易激活他们从而起到免疫抑制作用。
IL-2早在20多年前就被批准治疗肾细胞瘤和转移性黑色素瘤，却一直身处免疫治疗 的冷宫，鲜有使用。究其原因主要是以下几点：1，有效率低，单用IL-2的有效率只能达到15-20％左右；2，IL-2功能双面性，低剂量IL-2促进调节性T细胞的增殖引起免疫 抑制，如何调和这两个功能尚待解决；3，半衰期短，只有几分钟，想要持续起效必须要 大剂量给药；4，不良反应严重，过度激活的免疫系统有可能会攻击自身脏器造成器官衰 竭，剂量窗口比较窄。为了提高IL-2的疗效，降低不良反应，科学家们还尝试了各种联 用方案，比如IL-2+干扰素，IL-2+淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞疗法，IL-2+化疗等， 效果均不理想。
最近几年，科学家们发现：在正常的IL-2分子上面添加化学修饰，可以维持IL-2的效果，同时降低使用浓度，也降低副作用。于是，NKTR-214就诞生了。NKTR-214并不 神秘，本质上是一个20多年前就上市的老药IL-2的升级版，副作用更低，特异性更好(更 容易激活CD8而不是Treg细胞)，可以更高效的激活免疫系统。具体的是在IL-2分子上 添加6个聚乙二醇(PEG)修饰，形成了无活性的药物；神奇的是，给肿瘤患者注射之后， 这6个PEG修饰会逐渐脱落，形成了有活性的2-PEG和1-PEG的形式。
NKTR-214是PEG化的IL-2，原药的活性很低。六个PEG链被巧妙的连接在IL-2 中可以结合IL-2Rαβγ高亲和抗体α亚基的部位，使得PEG化后的IL-2更倾向于结合 在杀伤性免疫细胞中的IL-2Rβγ类受体。随着PEG逐个被降解掉，药物的活性得到缓慢 的释放。NKTR-214解决了IL-2在肿瘤治疗中的两大痛点：一是通过PEG降级达到了 药物缓释的效果，从而大大提高了耐受性；二是提高了对杀伤性免疫细胞的选择性，增加 了微环境中免疫细胞PD-1的表达量。
Nektar公司于2015年10月7日在纳斯达克宣布，已向美国食品药品监督管理局(FDA) 提交NKTR-214的新药申请。该公司已完成NKTR-214的临床前研究，并计划在2015年底启动该药物的一期和二期临床研究。
在临床前研究中，NKTR-214与现有的IL-2治疗药物阿地白介素相比，单剂量给药后， NKTR-214肿瘤内的AUC值是阿地白介素的近400倍。此外，Nektar公司提供的数据表明，NKTR-214在多个临床前动物模型中均表现出长效的抗肿瘤免疫治疗效果；在肿瘤浸润型淋巴细胞模型中，经NKTR-214处理后，CD8阳性T细胞与CD4阳性T细胞的比值约为 450:1，表现出了强效的肿瘤杀伤作用。因此，NKTR-214是免疫刺激因子类抗癌药物，有 着与抗体相近的治疗效应，可刺激T细胞的生长，从而实现对肿瘤的杀伤作用。临床前实 验结果表明该药物具有长效抗肿瘤的治疗效果，是一种极具期待性的抗癌药物。
但是在实际生产过程中，正常的IL-2分子上面通过化学修饰添加6个PEG形成NKTR-214，从而实现IL-2选择性的结合IL-2Rβγ类受体。在本发明中，申请人提供一种 制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，在体外对生物分子的结合位点进行人为干 预，保持结合位点暴露且不被PEG化的状态下，使生物分子进入体内靶向性更强，发挥治 疗效果更迅速。具体的在对IL-2进行修饰时，通过对IL-2的结合位点进行调控，PEG化 只添加1或2个PEG，使IL-2选择性的结合IL-2Rβγ类受体。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，具体的，本发 明提供一种制备结合位点可控的PEG化IL-2的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：
(1)阻隔物与生物分子中至少一个结合位点结合；
(2)PEG化生物分子；
(3)将阻隔物与生物分子分离。
所述步骤(1)中生物分子选自与阻隔物具有特异性结合作用的生物大分子或小分子， 所述生物分子上具有至少一个阻隔物的结合位点。阻隔物与生物分子选自如下组合：配体 与受体、DNA与其互补的DNA或RNA、酶与其底物、酶与其竞争性抑制剂、酶与其辅酶 因子、维生素与其特异性结合蛋白、糖蛋白与其相应的凝集素等。优选的，所述配体与受 体选自：激素与受体、药物与受体等。
所述DNA与其互补的DNA或RNA选自：基因探针与碱基互补的基因序列。
所述酶与其底物选自：蛋白酶与蛋白质、淀粉酶与淀粉、核酸酶与核酸、乳酸脱氢酶 与乳酸、草酰乙酸脱羧酶与草酰乙酸。
所述酶与其竞争性抑制剂选自：琥珀酸脱氢酶与丙二酸、二氢叶酸合成酶与磺胺类药 物、胆碱酯酶与有机磷农药、巯基酶与路易士气。
所述酶与其辅酶因子选自：丙酮酸脱氢酶与Mn2+、过氧化氢酶和氧化还原酶与Fe2+/Fe3+。
所述激素与受体选自：雌激素与雌激素受体、雄激素与雄激素受体、盐皮质激素与盐 皮质激素受体、甲状腺激素与甲状腺激素受体、孕激素与孕激素受体。
所述药物与受体选自：胰岛素、胰岛素样生长因子、上皮生长因子、血小板生长因子 及淋巴因子与具有酪氨酸激酶活性的受体、肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、M-乙酰胆碱、阿片类、嘌呤类、前列腺素及多肽激素类药物与G-蛋白偶联受体。
优选的，所述药物与受体选自：叶酸与叶酸受体、白介素与白介素受体。
更优选的，所述药物与受体选自：白介素-2与白介素-2受体，具体的白介素-2受体有 白介素α、β、γ受体。
所述维生素与其特异性结合蛋白选自：维生素A与视黄醇结合蛋白、维生素D与维生 素D结合蛋白、α-生育酚与α-生育酚转运蛋白、维生素K与脂蛋白。
所述糖蛋白与其相应的凝集素选自：辣根过氧化物酶与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和 豌豆凝集素、木菠萝素与半乳糖、苋科凝集素与N-乙酰半乳糖胺、二聚体几丁质结合凝集 素与N-乙酰氨基葡萄糖寡聚糖、双花扁豆素与血型A物质、荆豆凝集素与血型O物质2-L-岩藻糖。
所述步骤(2)中PEG化的生物分子具有如下结构：
Figure RE-GDA0002488989350000051
X为PEG与生物分子之间的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CR1R2)a-、-(CH2)aNH-、 -NHCO(CH2)a-、-(CH2)aCONH-、-(CH2)aCO-、-CO(CH2)a-、-(CH2)aCONH(CH2)a-、 -(CH2)a-S-S-(CH2)a-、-(CH2)aCOO(CH2)a-、-(CH2)a-S-(CH2)a-中的一种或多种的组合。
a为0-10的整数。优选的，所述a为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。更优选 为0-3的整数。
m为1-12的整数，具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
R1和R2独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR'、-NHR'、-N(R')2、-CN、-F、-Cl、-Br、 -I、-COR'、-COOR'、-OCOR'、-CONHR'或-CON(R')2中的一种或多种的组合。优选的， R1和R2独立地选自：H、C1-3的烷基，具体可为甲基、乙基、正丙基或异丙基、-OH、 C1-3的烷氧基、-NH2、-F、-Cl、-Br和-I中的一种或多种的组合。更优选自：H、-CH3、 -OH、-OCH3和-OCH2CH3。在本发明的一个实施例中，R1为-H，R2选自：-CH3、-OH、 -OCH3和-OCH2CH3。
R'选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br或-I。优选的，R'选自：-H和C1-3的烷基， 具体可为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
优选的，所述X选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CONHCH2-、 -CH2CONHCH2CH2-、-CH2CONHCH2CH2NH-、-CH2CH2CONHCH2-、-CH2CO-、-CH2 CH2CO-、-CH2CH2CONHCH2CH2-、-CH2NH-、-CH2CONH-、-COCH2-、-COCH2CH2-、 -COCH2CH2CH2-、-CH2-S-S-CH2-、-CH2COOCH2-、-CH2-S-CH2-中的一种或多种的组合。
更优选的，所述X选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CONHCH2-、-CH2CH2CO-、-CH2COOCH2-。
所述PEG为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG 等。
优选地，所述的PEG的分子量可为1-100KDa，例如1-10KDa(具体可为1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10KDa)、10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、 40、45或50KDa)或50-100KDa(具体可为50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95或100KDa)等；进一步优选为10-50KDa。
在本发明的具体实施方式中，所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅱ或Ⅲ所示的结构：
Figure BDA0002338825840000061
Figure BDA0002338825840000062
其中，p和q独立的选自1-2280的整数，优选为220-1140的整数，
Y为封端基，选自：H、C1-6烷基，具体可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等、C3-6环烷基，具体可为环丙基、环丁基、环戊基、 环己基等、C6-10芳基，具体可为苯基、萘基等、-L-T，
L为氧(O)和端基T之间的连接基团，选自：-(CH2)b-、-(CR3R4)b-、-(CH2)bNH-、 -NHCO(CH2)b-、-(CH2)bCONH-和-CO(CH2)b-中的一种或多种的组合，b为0-10的整数。
R3和R4独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR″、-NHR″、-N(R″)2、-CN、-F、-Cl、-Br、 -I、-COR'、-COOR″、-OCOR″、-CONHR″和-CON(R″)2中的一种或多种的组合。
R″选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br和-I。
优选的，L选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CONH-、-NH-、-CO-、-CONHCH2-、-CH2NH-、-CH2CONH-和-COCH2-中的一种或多种的组合。
T为端基，选自：H、C1-6烷基、C3-6环烷基、C6-10芳基、单糖，具体可为葡萄糖、果 糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖等、低聚糖，具体可为二糖(蔗糖、乳糖等)、三糖(龙胆 三糖、棉子糖等)残基。
优选的，T选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000071
Figure BDA0002338825840000072
优选的，所述Y选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000073
在本发明的一个优选实施例中，所述Y为甲基。
在本发明的另一个优选实施例中，所述Y为
Figure BDA0002338825840000074
Figure BDA0002338825840000075
在本发明的具体实施方式中，所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅳ或Ⅴ所 示的结构：
Figure BDA0002338825840000081
Figure BDA0002338825840000082
其中，i和h独立的选自1-1140的整数，优选为110-570的整数。
Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁 基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000083
更优选自：甲基、
Figure BDA0002338825840000084
在本发明的具体实施方式中，所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅵ所示的结构：
Figure BDA0002338825840000085
其中，k是1-760的整数，优选为70-380的整数。
j是3-8的整数。
Q是多分支聚乙二醇的核心分子，Q选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄 糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基，优选的，Q选自：季戊四醇、 二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
优选地，所述多分支聚乙二醇残基，其具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000091
其中，Q、k与j具有与上述通式Ⅵ相同的定义，Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定 义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000092
Figure BDA0002338825840000093
更优选自：甲基、
Figure BDA0002338825840000094
在本发明一个优选实施例中，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000095
其中，w是1-570的整数，优选为55-285的整数；
t为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，优选为1-6的整 数；
其中，Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、 环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000101
更优选自：甲 基、
Figure BDA0002338825840000102
在本发明另一个优选实施例中，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000103
其中，s是1-280的整数，优选为28-140的整数。
y为1-10的整数，具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选为1-5的整 数，更优选为1-3的整数。
Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000104
更优选自：甲基、
Figure BDA0002338825840000111
所述步骤(3)中将阻隔物与生物分子分离的方法包括：离心分离、沉淀分离、过滤分离、泡沫分离、萃取分离、膜分离、层析分离、电泳分离、梯度洗脱中的一种或两种以 上的组合。
一种如上述方法制备的结合位点可控的PEG化生物分子。
一种如上述方法制备的结合位点可控的PEG化生物分子与药学上可接受的载体制备 的药物组合物。
一种如上述方法制备的结合位点可控的PEG化生物分子与药学上可接受的载体制备 的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述生物分子为IL-2，所述阻隔物为IL-2α受体(IL-2Rα)。
具体的，本发明提供一种制备结合位点可控的PEG化IL-2的方法，包括如下步骤：
(1)将IL-2与IL-2α受体结合；
(2)PEG化，PEG与IL-2偶联；
(3)将IL-2与IL-2α受体分离。
优选的，本发明提供一种制备结合位点可控的PEG化IL-2的方法，包括如下步骤：
(1)制备IL-2α受体亲和柱；
(2)IL-2在亲和柱上与IL-2α受体结合；
(3)PEG化，PEG与IL-2偶联；
(4)通过梯度洗脱将IL-2与IL-2α受体分离。
一种如上述方法制备的结合位点可控的PEG化IL-2具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000121
n为1或2；优选的，n为1。
X和PEG与前述定义相同。X为PEG与IL-2之间的连接基团，选自：-(CH2)a-、 -(CR1R2)a-、-(CH2)aNH-、-NHCO(CH2)a-、-(CH2)aCONH-、-(CH2)aCO-、-CO(CH2)a-、 -(CH2)aCONH(CH2)a-、-(CH2)a-S-S-(CH2)a-、-(CH2)aCOO(CH2)a-、-(CH2)a-S-(CH2)a-中的 一种或多种的组合。
a为0-10的整数。优选的，所述a为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。更优选 为0-3的整数。
R1和R2独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR'、-NHR'、-N(R')2、-CN、-F、-Cl、-Br、 -I、-COR'、-COOR'、-OCOR'、-CONHR'或-CON(R')2中的一种或多种的组合。优选的， R1和R2独立地选自：H、C1-3的烷基，具体可为甲基、乙基、正丙基或异丙基、-OH、 C1-3的烷氧基、-NH2、-F、-Cl、-Br和-I中的一种或多种的组合。更优选自：H、-CH3、 -OH、-OCH3和-OCH2CH3。在本发明的一个实施例中，R1为-H，R2选自：-CH3、-OH、 -OCH3和-OCH2CH3。
R'选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br或-I。优选的，R'选自：-H和C1-3的烷基， 具体可为甲基、乙基、正丙基或异丙基。
优选的，所述X选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CONHCH2-、 -CH2CONHCH2CH2-、-CH2CONHCH2CH2NH-、-CH2CH2CONHCH2-、-CH2CO-、-CH2 CH2CO-、-CH2CH2CONHCH2CH2-、-CH2NH-、-CH2CONH-、-COCH2-、-COCH2CH2-、 -COCH2CH2CH2-、-CH2-S-S-CH2-、-CH2COOCH2-、-CH2-S-CH2-中的一种或多种的组合。
更优选的，所述X选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CONHCH2-、-CH2CH2CO-、 -CH2COOCH2-。
所述PEG为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG 等。
优选地，所述的PEG的分子量可为1-100KDa，例如1-10KDa(具体可为1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10KDa)、10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、 40、45或50KDa)或50-100KDa(具体可为50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95或100KDa)等；进一步优选为10-50KDa。
在本发明的具体实施方式中，所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅱ或Ⅲ所示的结构：
Figure BDA0002338825840000131
Figure BDA0002338825840000132
其中，p和q独立的选自1-2280的整数，优选为220-1140的整数，
Y为封端基，选自：H、C1-6烷基，具体可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等、C3-6环烷基，具体可为环丙基、环丁基、环戊基、 环己基等、C6-10芳基，具体可为苯基、萘基等、-L-T，
L为氧(O)和端基T之间的连接基团，选自：-(CH2)b-、-(CR3R4)b-、-(CH2)bNH-、 -NHCO(CH2)b-、-(CH2)bCONH-和-CO(CH2)b-中的一种或多种的组合，b为0-10的整数。
R3和R4独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR″、-NHR″、-N(R″)2、-CN、-F、-Cl、-Br、 -I、-COR'、-COOR″、-OCOR″、-CONHR″和-CON(R″)2中的一种或多种的组合。
R″选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br和-I。
优选的，L选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CONH-、-NH-、-CO-、-CONHCH2-、 -CH2NH-、-CH2CONH-和-COCH2-中的一种或多种的组合。
T为端基，选自：H、C1-6烷基、C3-6环烷基、C6-10芳基、单糖，具体可为葡萄糖、果 糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖等、低聚糖，具体可为二糖(蔗糖、乳糖等)、三糖(龙胆 三糖、棉子糖等)残基。
优选的，T选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000141
Figure BDA0002338825840000142
优选的，所述Y选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000143
在本发明的一个优选实施例中，所述Y为甲基。
在本发明的另一个优选实施例中，所述Y为
Figure BDA0002338825840000144
Figure BDA0002338825840000145
在本发明的具体实施方式中，所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅳ或Ⅴ所 示的结构：
Figure BDA0002338825840000146
Figure BDA0002338825840000151
其中，i和h独立的选自1-1140的整数，优选为110-570的整数。
Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁 基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000152
更优选自：甲基、
Figure BDA0002338825840000153
在本发明的具体实施方式中，所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅵ所示的结构：
Figure BDA0002338825840000154
其中，k是1-760的整数，优选为70-380的整数。
j是3-8的整数。
Q是多分支聚乙二醇的核心分子，Q选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄 糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基，优选的，Q选自：季戊四醇、 二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
优选地，所述多分支聚乙二醇残基，其具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000161
其中，Q、k与j具有与上述通式Ⅵ相同的定义，Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定 义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000162
Figure BDA0002338825840000163
更优选自：甲基、
Figure BDA0002338825840000164
在本发明一个优选实施例中，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000165
其中，w是1-570的整数，优选为55-285的整数，
t为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，优选为1-6的整 数，
其中，Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、 环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000166
更优选自：甲 基、
Figure BDA0002338825840000171
在本发明另一个优选实施例中，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure BDA0002338825840000172
其中，s是1-280的整数，优选为28-140的整数。
y为1-10的整数，具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选为1-5的整 数，更优选为1-3的整数。
Y具有与上述通式Ⅱ中相同的定义，优选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure BDA0002338825840000173
更优选自：甲基、
Figure BDA0002338825840000174
一种如上述方法制备的结合位点可控的PEG化IL-2与药学上可接受的载体制备的药 物组合物。
一种如上述方法制备的结合位点可控的PEG化IL-2与药学上可接受的载体制备的药 物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
优选的，所述的疾病为肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。
所述肿瘤疾病为肾细胞癌、黑色素瘤、恶性血管内皮细胞瘤、皮肤T细胞瘤、卵巢癌、 乳腺癌、膀胱癌、肺癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肝癌、毛细胞白血病、髓样母细胞白血病、结肠癌、癌性胸腹腔积液或非霍奇金淋巴瘤。
所述自身免疫疾病为类风湿关节炎、系统性红斑狼疮或干燥综合征。
所述病毒为肝炎病毒、乳头状病毒、单纯孢疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、 人类孢疹病毒4型(EBv)、冠状病毒和流感病毒，更优选为肝炎病毒，如乙型肝炎病毒 (HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
所述细菌性疾病为麻风病或肺结核。
除非另有定义，本发明中所使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技 术人员通常理解的相同的含义，如：
本发明中术语“白细胞介素2”、“白介素2”、“IL-2”具有相同的含义，可互换使用，其 可以是天然的白介素2、重组蛋白(如重组人白介素2)或同样具有天然IL-2功能的突变体(如“重组人白介素-2(IL-2)突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化”， 刘堰，博士学位论文，中所述的“IL-2-C125A/L18M/L19S”)，也包括通过组织培养、蛋白 质合成、细胞培养(天然、重组细胞或突变体)方法得到的产品。天然、重组IL-2或突变 体的提取和分离方法是本领域技术人员所熟知的。
如本文所用，“药学上可接受”一词是指在对人施用后具有生理相容性并且不会引起肠 胃失调、诸如头晕的过敏反应或类似反应。添加剂可为赋形剂、崩解剂、粘结剂、润滑剂、 悬浮剂、稳定剂等等中的任一种。赋形剂的例子包括乳糖、甘露醇、益寿糖、微晶纤维素、 硅化微晶纤维素、粉状纤维素等等。崩解剂的例子包括低取代羟丙基纤维素、交聚维酮、 羧基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、淀粉等等。粘结剂的例子包括羟丙基纤维素、羟 丙甲纤维素、聚维酮、共聚维酮、预胶凝淀粉等等。润滑剂的例子包括硬脂酸、硬脂酸镁、富马酰硬脂酸钠等等；润湿剂的例子包括聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯蓖麻油衍生物等等。悬浮剂的例子包括羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮、共聚 维酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素等等。稳定剂的例子包括柠檬酸、富马酸、琥珀酸等 等。另外，本发明的药物组合物还可包括阻凝剂、增味剂、乳化剂、防腐剂等等中的任一 种。
本发明所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩 解片、口腔片剂等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、 气雾剂、膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)、注射剂(例如，皮下注射、静脉 注射、肌内注射、腹膜内注射)、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、 栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)、小药丸、鼻制剂、肺制剂(吸入剂)、眼睛滴剂等等、口 服或胃肠外制剂(例如，静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠内 等给药形式、给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。优选的，所述的药物组合物为注射 剂。
本发明所述的药学上可接受的辅料优选为药学上可接受的注射剂辅料，例如等渗的无 菌盐溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等，或上述盐的混合物)，或干燥的例如是冷冻干燥的组合物，其适当地通过加入无菌水或生理盐水形成可注射溶质。
本发明所述的PEG化IL-2可简写为PEG-IL-2。
附图说明
图1IL-2在受体亲和柱上PEG化的色谱图。
图2PEG-IL-2的电泳结果，其中1为PEG-IL-2，2为蛋白标准品。
图3PEG-IL-2的凝胶色谱分离图谱。
图4PEG-IL-2的SDS-PAGE结果，其中1为蛋白标准品，2为IL-2，3为峰2，4为 峰1。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在 没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 IL-2α受体亲和柱的制备
S1：称取0.8g CNBr活化的琼脂糖凝胶(sehparose CNBr)加入12ml 1mM HCl，手动缓慢混合均匀，放4℃冰箱反应15min；
S2：配置偶联buffer：0.1M NaHCO3 pH 8.3与0.5M NaCl充分混合，取12ml偶联buffer洗上步溶胀的填料；
S3：取4瓶共4mg IL-2α受体，溶于2ml偶联buffer加入到步骤2溶好的填料中；
S4：室温下缓慢摇转2h；
S5：用5倍柱体积的偶联buffer洗掉多余的受体；
S6：加入0.1M pH 8.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，室温放置2h，倒掉Tris-HCl；
S7：用5倍柱体积的含有0.5M NaCl的0.1M pH 4.0醋酸/醋酸钠缓冲液洗，然后用5倍柱体积的含有0.5M NaCl的0.1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗；
S8：重复步骤6和7，重复3次；
S9：加入0.5ml 0.1M pH 8.0的Tris-HCl；
S10：将sepharose树脂灌装至5ml的空柱子中，4℃冰箱保存。
实施例2 IL-2在受体亲和柱上PEG化
S1：将5ml受体亲和柱安装在蛋白纯化系统(AKTA purifier)上；
S2：配制流动相，A相：5mM PBS，pH7.0；B相：含有0.2M NaCl的0.2M醋酸溶 液；
S3：设置流动相流速为0.45ml/min；
S4：A相平衡至UV曲线平稳；
S5：将IL-2样品经进样环进样，IL-2上的α受体结合位点与IL-2α受体结合；
S6：取适量的分子量为20KDa的甲氧基聚乙二醇-丙酸琥珀酰亚胺酯(M-SPA-20K)溶解在pH 8.0 2.5mM PB中，其终浓度为40mg/ml，抽取2ml M-SPA-20K经进样环进样， 平衡至UV曲线平稳；
S7：重复步骤6，重复3次；
S8：梯度洗脱，色谱图如图1所示，收集洗脱峰，经超滤浓缩后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。
实施例3 PEG-IL-2凝胶过滤色谱分离
凝胶过滤色谱设置如下：流动相：5Mm PBS，流速：0.75ml/min，柱子：superdex 200increase 10/300GL。
分离步骤如下：S1：将色谱系统平衡至UV曲线平稳；S2：样品上样后收集洗脱峰；S3：收集组分超滤浓缩后SDS-PAGE检测，结果如图3和图4所示。
检测结果：经SDS-PAGE确认图4中的峰1为PEG-IL-2，峰2为IL-2。
实施例4受体亲和力测试
分别收集图4中的峰1(PEG-IL-2)和峰2(IL-2)样品，浓缩后用SPR仪器进行亲 和力测试。受体蛋白分别为IL-2α受体，IL-2β受体，测试结果如下：
样品 PEG-IL-2 IL-2
IL-2/IL-2Rα(uM) 0.34 0.023
IL-2/IL-2Rβ(uM) 31.96 2.80
上表结果表明，通过本发明所述的方法制备的PEG-IL-2与IL-2β受体的结合力较强。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管 参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行 等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方 案的范围。

Claims (16)

1.一种制备结合位点可控的PEG化生物分子的方法，包括如下步骤：
(1)阻隔物与生物分子中至少一个结合位点结合；
(2)PEG化生物分子；
(3)将阻隔物与生物分子分离；
其中，所述步骤(1)中生物分子选自与阻隔物具有特异性结合作用的生物大分子或小分子，所述生物分子上具有至少一个阻隔物的结合位点；
阻隔物与生物分子选自如下组合：配体与受体、DNA与其互补的DNA或RNA、酶与其底物、酶与其竞争性抑制剂、酶与其辅酶因子、维生素与其特异性结合蛋白、糖蛋白与其相应的凝集素；优选的，所述配体与受体选自：激素与受体、药物与受体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DNA与其互补的DNA或RNA选自：基因探针与碱基互补的基因序列；
所述酶与其底物选自：蛋白酶与蛋白质、淀粉酶与淀粉、核酸酶与核酸、乳酸脱氢酶与乳酸、草酰乙酸脱羧酶与草酰乙酸；
所述酶与其竞争性抑制剂选自：琥珀酸脱氢酶与丙二酸、二氢叶酸合成酶与磺胺类药物、胆碱酯酶与有机磷农药、巯基酶与路易士气；
所述酶与其辅酶因子选自：丙酮酸脱氢酶与Mn2+、过氧化氢酶和氧化还原酶与Fe2+/Fe3+；
所述激素与受体选自：雌激素与雌激素受体、雄激素与雄激素受体、盐皮质激素与盐皮质激素受体、甲状腺激素与甲状腺激素受体、孕激素与孕激素受体；
所述药物与受体选自：胰岛素、胰岛素样生长因子、上皮生长因子、血小板生长因子及淋巴因子与具有酪氨酸激酶活性的受体、肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、M-乙酰胆碱、阿片类、嘌呤类、前列腺素及多肽激素类药物与G-蛋白偶联受体；优选的，所述药物与受体选自：叶酸与叶酸受体、IL与IL受体；
所述维生素与其特异性结合蛋白选自：维生素A与视黄醇结合蛋白、维生素D与维生素D结合蛋白、α-生育酚与α-生育酚转运蛋白、维生素K与脂蛋白；
所述糖蛋白与其相应的凝集素选自：辣根过氧化物酶与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素、木菠萝素与半乳糖、苋科凝集素与N-乙酰半乳糖胺、二聚体几丁质结合凝集素与N-乙酰氨基葡萄糖寡聚糖、双花扁豆素与血型A物质、荆豆凝集素与血型O物质2-L-岩藻糖。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述药物与受体选自：IL-2与IL-2受体，IL-2受体包括IL-2α受体、IL-2β受体、IL-2γ受体。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中将阻隔物与生物分子分离的方法包括：离心分离、沉淀分离、过滤分离、泡沫分离、萃取分离、膜分离、层析分离、电泳分离、梯度洗脱中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEG化的生物分子具有如下结构：
Figure RE-FDA0002488989340000021
m为1-12的整数，具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；
X为PEG与生物分子之间的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CR1R2)a-、-(CH2)aNH-、-NHCO(CH2)a-、-(CH2)aCONH-、-(CH2)aCO-、-CO(CH2)a-、-(CH2)aCONH(CH2)a-、-(CH2)a-S-S-(CH2)a-、-(CH2)aCOO(CH2)a-、-(CH2)a-S-(CH2)a-中的一种或多种的组合；
a为0-10的整数；
R1和R2独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR'、-NHR'、-N(R')2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-COR'、-COOR'、-OCOR'、-CONHR'或-CON(R')2中的一种或多种的组合；
R'选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br或-I；
所述PEG为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG，PEG的分子量为1-100KDa。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述a为0-5的整数；
R1和R2独立地选自：H、C1-3的烷基、-OH、C1-3的烷氧基、-NH2、-F、-Cl、-Br和-I中的一种或多种的组合；
R'选自：-H和C1-3的烷基；
所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅱ或Ⅲ所示的结构：
Figure FDA0002338825830000031
其中p和q独立的选自1-2280的整数；
或所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅳ或Ⅴ所示的结构：
Figure FDA0002338825830000032
其中，i和h独立的选自1-1140的整数；
或所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅵ所示的结构：
Figure FDA0002338825830000033
其中，k是1-760的整数，j是3-8的整数；
Y为封端基，选自：H、C1-6烷基，具体可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等、C3-6环烷基，具体可为环丙基、环丁基、环戊基、环己基等、C6-10芳基，具体可为苯基、萘基等、-L-T；
L为氧(O)和端基T之间的连接基团，选自：-(CH2)b-、-(CR3R4)b-、-(CH2)bNH-、-NHCO(CH2)b-、-(CH2)bCONH-和-CO(CH2)b-中的一种或多种的组合，b为0-10的整数；
R3和R4独立地选自：-H、C1-6的烷基、-OR”、-NHR”、-N(R”)2、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-COR'、-COOR”、-OCOR”、-CONHR”和-CON(R”)2中的一种或多种的组合；
R”选自：-H、C1-6的烷基、-F、-Cl、-Br和-I；
T为端基，选自：H、C1-6烷基、C3-6环烷基、C6-10芳基、单糖，具体可为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、脱氧核糖等、低聚糖，具体可为二糖(蔗糖、乳糖等)、三糖(龙胆三糖、棉子糖等)残基；
Q是多分支聚乙二醇的核心分子，Q选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述T选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure FDA0002338825830000041
L选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CONH-、-NH-、-CO-、-CONHCH2-、-CH2NH-、-CH2CONH-和-COCH2-中的一种或多种的组合；
所述Y选自：甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、
Figure FDA0002338825830000042
Figure FDA0002338825830000043
Q选自：季戊四醇、二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure FDA0002338825830000051
所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure FDA0002338825830000052
其中w是1-570的整数，t为1-10的整数；
或所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
Figure FDA0002338825830000053
其中，s是1-280的整数，y为1-10的整数。
9.根据权利要求6-8任一所述的制备方法，其特征在于，所述a为0-3的整数；R1和R2独立地选自：H、-CH3、-OH、-OCH3和-OCH2CH3。
10.根据权利要求6-9任一所述的制备方法，其特征在于，所述X选自：-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CONHCH2-、-CH2CONHCH2CH2-、-CH2CONHCH2CH2NH-、-CH2CH2CONHCH2-、-CH2CO-、-CH2 CH2CO-、-CH2CH2CONHCH2CH2-、-CH2NH-、-CH2CONH-、-COCH2-、-COCH2CH2-、-COCH2CH2CH2-、-CH2-S-S-CH2-、-CH2COOCH2-、-CH2-S-CH2-中的一种或多种的组合。
11.根据权利要求1-10所述的制备方法，其特征在于，制备一种结合位点可控的PEG化IL-2的方法，包括如下步骤：
(1)将IL-2与IL-2α受体结合；
(2)PEG化，PEG与IL-2偶联；
(3)将IL-2与IL-2α受体分离。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，制备一种结合位点可控的PEG化IL-2的方法，包括如下步骤：
(1)制备IL-2α受体亲和柱；
(2)IL-2在亲和柱上与IL-2α受体结合；
(3)PEG化，PEG与IL-2偶联；
(4)通过梯度洗脱将IL-2与IL-2α受体分离。
13.一种权利要求11或12所述的制备方法制备的结合位点可控的PEG化IL-2，具有如下结构：
Figure FDA0002338825830000061
PEG和X的限定范围如权利要求5-10所述，n为1或2，优选的，n为1。
14.一种权利要求11或12所述的制备方法制备的结合位点可控的PEG化IL-2与药学上可接受的载体制备的药物组合物。
15.一种权利要求11或12所述的制备方法制备的结合位点可控的PEG化IL-2与药学上可接受的载体制备的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肿瘤、自身免疫疾病、病毒性疾病或细菌性疾病。
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