CN111329033B - 一种多菌种复合发酵制备海鲜酱油的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多菌种复合发酵制备海鲜酱油的方法，属于发酵技术领域。本发明通过多菌种复合发酵法制备海鲜酱油，利用不同菌种对不同原料分解和产生风味物质的不同，尤其在海带干原料处理过程中加入适量褐藻胶裂解酶、对蚬子干原料处理过程中加入酿酒酵母CGMCC No.13030，以及在复合发酵过程中加入瑞氏乳杆菌CGMCC No.12933，综合制备得到一种味道鲜美，海鲜风味浓郁，酱油总风味更加丰满的海鲜酱油。本发明的成品酱油颜色红褐色，色泽红亮鲜艳，酱香浓郁，滋味鲜美、醇厚，有海鲜的特殊鲜味，咸甜适口，澄清无杂质。

Description

一种多菌种复合发酵制备海鲜酱油的方法

技术领域

本发明涉及一种多菌种复合发酵制备海鲜酱油的方法，属于发酵技术领域。

背景技术

酱油是以大豆、面粉或小麦为主要原料，利用天然存在的米曲霉制曲，以及天然的乳酸菌及酵母菌进行发酵制备的；酱油最主要的酿造菌种是米曲霉，酿造酱油所具有的色香味特征是经过米曲霉分泌的酶对豆粕、麸皮等原料进行分解完成的，在发酵过程中参与酱醪反应的细菌如乳酸菌、酵母菌等，乳酸菌有利于发酵过程产生乳酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸等有机酸，酵母菌对酱油后期产生醇香味起着关键作用。

近年来，以低值而高蛋白海产品作为原料酿造酱油，可以提升原材料的附加值，产品风味独特。常见的海鲜酱油有鱼酱油、贝类酱油和鱿鱼酱油等。鱼酱油的原料一般是经济价值低的小型鱼类，如大眼鲱鱼、沙丁鱼以及各种混在一起的小杂鱼。原料各种成分含量的高低对鱼酱油成品的质量、产量、营养价值和风味有不同程度的影响。以低值鱼、豆粕、小麦、麸皮为原料，采用单菌种制曲，低盐固态发酵，可以制备口感鲜美、海鲜风味浓郁的海鲜酱油；尤其含硫氨基酸含量高的原料鱼容易形成鱼酱油的特征气味，而脂肪含量过高的原料鱼则不适合进行鱼酱油生产；以扇贝裙边为原料，利用多菌种混合制曲、高盐稀态发酵方法可以开发扇贝裙边海鲜酱油，或以牡蛎为原料，低盐固态发酵酿造牡蛎酱油，产品都具有特别的海鲜风味，也可以利用贻贝蒸煮液、米曲霉、高渗酵母、啤酒酵母和乳酸菌发酵制备得到滋味醇厚、海鲜味突出、咸味适中的海鲜酱油，在整体滋味和气味上较温和，感官评价优于市售部分鱼露和大豆酱油产品。

现有采用复合菌种发酵制备海鲜酱油的工艺存在以下问题：①未有针对具体的海鲜品种进行菌种筛选，选择适合具体海鲜品种发酵的微生物；如海带中富含褐藻胶、岩藻糖胶、褐藻淀粉等多糖，和酸性聚糖类物质、大叶藻素、半乳糖醛酸、昆布氨酸、牛磺酸等活性成分，这些成分不仅可以提高成品酱油的营养，而且可以提供生成特殊的风味；蚬子、蛤蜊、文蛤等贝壳类海鲜处理往往只考察了分解后的氨基酸组成，这类海鲜腥味大，添加在酱油里能闻到不愉悦的腥味；②工业化生产中，多采用往发酵生产的酱油原油中添加海鲜调味汁进行复配的方法，未见直接在种曲中添加海鲜一同发酵生产海鲜酱油，原因是在酱油窖池中存在的多种复杂微生物(以曲霉为主)作用下，海鲜容易分解产生苦味，对成品的风味造成影响。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种通过多菌种复合发酵法制备海鲜酱油，利用不同菌种对不同原料分解和产生风味物质的不同，制备一种味道鲜美，海鲜风味浓郁，酱油总风味更加丰满的海鲜酱油。

本发明的第一个目的是提供一种多菌种复合发酵制备海鲜酱油的方法，包括如下步骤：

(1)原料预处理：将海带干浸泡后打浆，按海带干质量的0.5％～1％加入褐藻胶裂解酶酶解，灭酶后过滤取上清液浓缩得到海带浓缩液；将蚬子干浸泡后打浆，按照蚬子干质量的1％～5％加入酿酒酵母SL-1干粉培养20～40min，再按照蚬子干质量的0.3％～0.5％加入风味蛋白酶酶解，灭酶后过滤取上清液浓缩得到蚬子浓缩液；

(2)种曲培养：在麸皮、面粉与水混合得到的种曲原料中接入米曲霉，培养至曲料均匀分布黄绿色孢子，得到种曲；

(3)制曲：按照大豆：海带浓缩液：蚬子浓缩液质量比为5:1～3:1～3，将大豆与海带浓缩液和蚬子浓缩液混合进行浸豆，充分浸泡后进行灭菌蒸煮；分别按照大豆与海带浓缩液和蚬子浓缩液总质量的2％～4％接入步骤(2)的种曲和瑞士乳杆菌LHE02培养制曲，至曲料表面均匀附着黄绿色孢子，得到成曲；

(4)发酵：采用高盐稀态发酵法对步骤(3)的成曲进行发酵；

(5)成品：发酵后的酱醅经过淋油、调配、沉淀得到成品酱油。

进一步地，所述的酿酒酵母SL-1，于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13030，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

进一步地，所述的瑞士乳杆菌LHE02，于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12933，分类命名为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。

进一步地，在步骤(1)中，海带干采用0.3％～0.5％的醋酸溶液浸泡5～10min，洗净后按质量体积比1:10～1:15加水打浆。

进一步地，在步骤(1)中，褐藻胶裂解酶酶解的条件为35～45℃，酶解1～1.5h。

进一步地，所述的海带浓缩液的密度为1.05～1.15g/mL。

进一步地，在步骤(1)中，蚬子干采用质量体积比1:5～1:8的水进行浸泡后打浆。

进一步地，在步骤(1)中，风味蛋白酶酶解的条件为45～55℃酶解1～2h。

进一步地，所述的蚬子浓缩液的密度为1.05～1.15g/mL。

进一步地，在步骤(2)中，种曲制备的具体步骤为：将麸皮:面粉:水按质量比为5:1～2:3～5混合，混合后灭菌，然后摇松，冷却至25～35℃；接入米曲霉在28～32℃培养16～20h，震摇至混匀后继续培养6～10h，再次震摇至混匀后培养65～80h，得到所述的种曲。

进一步地，在步骤(4)中，所述的高盐稀态发酵法具体包括如下步骤：配制波美度18～20的盐水，按照成曲和盐水的质量体积比为1:2～3的比例加入盐水进行发酵；发酵前两个月每隔2天搅拌酱醅一次，第三个月起每隔5天搅拌一次，发酵110～130天。

进一步地，在步骤(5)中，所述的淋油包括如下步骤：抽出头道油，头道滤渣用波美度18的食盐水浸泡；10天后抽二道油，二道滤渣用加盐后的四道油和波美度18的食盐水浸泡；10天后抽三道油，三道滤渣用80℃的热水浸泡；12h后抽出四道油，四道油加盐至波美度达到18，供下批发酵的二道滤渣使用。

进一步地，在步骤(5)中，所述的调配是将头道油、二道油和三道油混合后进行调配。

本发明的第二个目的是提供所述的方法制备得到的海鲜酱油。

本发明的有益效果：

本发明通过多菌种复合发酵法制备海鲜酱油，利用不同菌种对不同原料分解和产生风味物质的不同，尤其在海带干原料处理过程中加入适量褐藻胶裂解酶、对蚬子干原料处理过程中加入酿酒酵母CGMCC No.13030，以及在复合发酵过程中加入瑞氏乳杆菌CGMCCNo.12933，综合制备得到一种味道鲜美，海鲜风味浓郁，酱油总风味更加丰满的海鲜酱油。本发明的成品酱油颜色红褐色，色泽红亮鲜艳，酱香浓郁，滋味鲜美、醇厚，有海鲜的特殊鲜味，咸甜适口，澄清无杂质。

附图说明

图1为种曲培养流程图；

图2为制曲流程图；

图3为酶解对蚬子干酶解液电子鼻响应值的影响；

图4为不同酶酶解对蚬子干酶解液LDA图的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：

本发明的海鲜酱油的主要制备方法如下步骤：

1、海带干原料预处理

将海带干去除泥沙，用0.3％～0.5％的醋酸溶液浸泡5～10min，取出洗净，按质量体积比1:10～1:15加纯净水后打浆；按原料海带干质量的0.5％～1％加入褐藻胶裂解酶，温度控制在35～45℃，酶解1～1.5h，将酶解液煮沸10min灭酶；过滤后将上清液浓缩至密度为1.05～1.15g/mL，浓缩液备用。

2、蚬子干原料预处理

按质量体积比1:5～1:8将蚬子干浸泡于纯净水中，打浆；按原料蚬子干质量的1％～5％加入酿酒酵母SL-1的干粉，摇床培养20～30min，温度37℃，转速50～150rpm；该酿酒酵母SL-1于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13030，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，干粉由活化后的酿酒酵母CGMCCNo.13030经过扩培、菌体分离和冻干获得。然后按原料蚬子干质量的0.3～0.5％加入风味蛋白酶粉末，45～55℃酶解1～2h；将酶解液煮沸10min灭酶，过滤，上清液浓缩至密度为1.05～1.15g/mL，浓缩液备用。

3、种曲培养

种曲培养的工艺路线按图1所示。种曲原料按质量配比为：麸皮:面粉:水为5:1:4，将上述麸皮和面粉用筛子筛去粗粒，然后按质量比和水混合；装入干热灭菌过的三角瓶，使原料厚度为1.5cm左右，蒸汽灭菌，121℃，20min。灭菌后趁热把原料摇松，自然冷却至30℃。在无菌室中接入米曲霉(沪酿3.042或其他市售米曲霉菌株)，摇匀后置于培养箱中30℃培养18h左右，三角瓶中曲料稍稍发白，有结块现象，震摇至混匀，继续培养8h左右，曲料又出现发白和结块，再次震摇至混匀；培养72h左右，至曲料均匀分布黄绿色孢子，即可作为种曲使用。

4、制曲

制曲的工艺路线按图2所示。将大豆清洗，除去浮于水面的杂质，换水2～3次，再用步骤1、2制备好的海带浓缩液、蚬子浓缩液进行浸豆，按大豆和浓缩液质量比混合，黄豆:海带浓缩液:蚬子浓缩液为5:2:2，浸泡至黄豆充分吸水，豆粒膨胀无皱纹，略带弹性，手捏即可皮肉分开，豆粒切开后无干心，然后121℃蒸汽灭菌和煮透20min，自然冷却至30℃。经蒸煮的大豆，颜色为棕褐色，有熟豆香气和海鲜气味，手捏绵软。按大豆和两种海鲜浓缩液总质量的3％接入上一步制备好的种曲和瑞士乳杆菌LHE02，装入盘子，覆盖湿润的纱布，于培养箱中进行成曲培养；每隔10h左右翻曲一次，避免曲料结块并适当通风和补充水分。72h后，曲料表面均匀附着有黄绿色孢子，可以闻到曲料特有的香气，即制曲完成，得到成曲。该瑞士乳杆菌LHE02于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12933，分类命名为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。

5、发酵

采用高盐稀态发酵法，配制波美度18～20的盐水，按照成曲和盐水的质量体积比为1:2～3的比例加入盐水，至发酵罐中于室温阴凉处发酵。发酵前两个月每隔2天搅拌酱醅一次，第三个月起每隔5天搅拌一次，至120天左右，发酵完成。此时豆粒已经完全分解，酱醅颜色为暗褐色。

6、成品

抽出头道油，头道滤渣用波美度18的食盐水浸泡；10天后抽二道油，二道滤渣用加盐后的四道油和波美度18的食盐水浸泡；10天后抽三道油，三道滤渣用80℃的热水浸泡；12h后抽出四道油，四道油加盐至波美度达到18，供下批发酵的二道滤渣使用。将头道油、二道油和三道油混合后进行调配，加热至90℃，沉淀静置7天。已经澄清的上层酱油经过60℃灭菌30min后装瓶。成品酱油颜色红褐色，色泽红亮鲜艳，酱香浓郁，滋味鲜美、醇厚，有海鲜的特殊鲜味，咸甜适口，澄清无杂质。

实施例2：海带干原料处理方式对海带浓缩汁的成分影响和对成品酱油的口感影响

主要检测海带浓缩汁中的以下成分：

1、还原糖：DNS法测定；还原糖含量越高，说明酶解效果越好；

2、总糖：苯酚-浓硫酸法，以葡萄糖作标曲；

3、固形物：折射仪法，参照NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定》；

4、粗蛋白：参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法；

5、总酚：参照GB/T 31740.2-2015《茶多酚》；

6、甘露醇：比色法，高碘酸钠盐酸溶液-鼠李糖-Nash试剂法，以甘露醇标品作标曲；

7、氨基酸：参照GB5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸自动分析仪测定。

分别采用海带干质量0、0.25％、0.5％、0.75％、1％和1.25％的褐藻胶裂解酶和果胶酶，按发明内容中海带干原料预处理的方式：将海带干去除泥沙，用0.3％的醋酸溶液浸泡10min，取出洗净，按质量体积比1:10加纯净水后打浆；加酶，温度45℃，酶解1h，将酶解液煮沸10min灭酶。不同的酶及用量制备的海带干酶解液中还原糖、总糖、固形物、粗蛋白、总酚、甘露醇的含量见下表1，氨基酸的含量见下表2；将制备得到的酶解液浓缩后按照发明内容的完整步骤制备海鲜酱油，对成品酱油的口感影响见下表3。

表1 不同的酶及用量对海带干酶解液的成分影响

表2 不同的酶及用量对海带干酶解液的氨基酸影响

注：①鲜味氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；②甜味氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸；③亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸

表3 不同的酶及用量对成品酱油的口感影响

	成品酱油的感官评价得分及口感描述
		未加酶	60，大豆酱油的酱香味
0.25％褐藻胶裂解酶	69，大豆酱油的酱香味，没有明显的海鲜味
		0.5％褐藻胶裂解酶	78，酱香味，有点味增汤的滋味，更鲜美
0.75％褐藻胶裂解酶	87，酱香味，海鲜味，浓郁，鲜美
		1％褐藻胶裂解酶	92，颜色鲜亮，海鲜味浓郁，鲜美
1.25％褐藻胶裂解酶	75，酱香味，有特殊鲜味，回味微苦
		0.25％果胶酶	67，大豆酱油的酱香味，没有明显的海鲜味
0.5％果胶酶	69，大豆酱油的酱香味，没有明显的海鲜味
		0.75％果胶酶	74，酱香和特殊的香气，鲜美，但海鲜味不明显
1％果胶酶	70，酱香和特殊的香气，鲜美，微苦
		1.25％果胶酶	58，酱香和特殊的香气，微苦，有涩味

由表1可以看出，添加了褐藻胶裂解酶和果胶酶，可以提高海带干的提取率，酶解液中还原糖、总糖、固形物、粗蛋白、总酚、甘露醇的含量都明显提高，但是当加酶量增加到一定程度时，含量增高不再明显，以褐藻胶裂解酶为例，添加量从1％增加到1.25％时，用酶量增加了25％，还原糖含量从13.23mg/g增加到13.73mg/g，只提高了3.78％；在相同用量下褐藻胶裂解酶的酶解优于果胶酶。

由表2可以看出，添加了褐藻胶裂解酶和果胶酶，可以明显增加游离氨基酸的释放；由于氨基酸的呈味特性，有些氨基酸是呈鲜味和甜味的，有些氨基酸是呈苦味或涩味的，因此并不是总的游离氨基酸含量越高越好。当褐藻胶裂解酶的用量超过1％时，苦味氨基酸明显增多；果胶酶酶解液游离氨基酸中，呈苦味的氨基酸含量更高。

由感官评价员对成品酱油的分析(表3)可以看出，适合的酶及添加量，可以增加酱油的海鲜风味，提高色泽的饱满度，使总体得分更高。

实施例3：蚬子干原料处理方式对蚬子浓缩汁的成分影响和对成品酱油的口感影响

按质量体积比1:5将蚬子干浸泡于纯净水中，打浆；分别按原料蚬子干质量的3％加入酿酒酵母CGMCC No.13030、市售安琪面包酵母、商品化的啤酒酵母的干粉，摇床培养30min，温度37℃，转速100rpm；然后按原料蚬子干质量的0.1％、0.3、0.5％、0.7％、0.9％加入风味蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶，50℃酶解2h；将酶解液煮沸10min灭酶，过滤，取上清液，检测其中的游离氨基酸含量(参照GB5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸自动分析仪测定，结果见表4)、挥发性成分含量(分别采用PEN3型电子鼻传感器分析和SPME-GC-MS分析，结果见图3、图4)，将制备得到的酶解液浓缩后按照发明内容的完整步骤制备海鲜酱油，对成品酱油的口感影响见表5。

表4 不同的酶及用量对蚬子干酶解液的氨基酸影响

注：①鲜味氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；②甜味氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸；③亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸

由表4可以看出，酶解后的蚬子提取物，较未加酶的(相当于蒸煮汁)的游离氨基酸含量明显增高，但是增高的幅度与所加酶的种类及用量相关，游离氨基酸含量的提高与酶用量的增加并不呈线性相关；并且根据氨基酸的呈味特性，不同酶及其用量对所水解出的氨基酸种类和含量相差甚大，因此要筛选出合适的酶及用量并非是本领域技术人员显而易见的，并不具备规律性可循。

表5 不同酿酒酵母处理对成品酱油的口感影响

	成品酱油的感官评价得分及口感描述
		未加酿酒酵母	有海鲜味，但是蛤类的腥味明显
酿酒酵母CGMCC No.13030	海鲜味浓郁，和酱香味协调统一，无腥味
		市售安琪面包酵母	有海鲜味和少许腥味，带有酵母特有的酸味
商品化的啤酒酵母	有海鲜味和腥味，回味略苦

由表5可知，发明人使用酿酒酵母CGMCC No.13030处理了蚬子干后，意外的发现制备的海鲜酱油味道鲜美，具有浓郁的海鲜风味，并且去除了蛤类类似鱼虾的腥味；这种功效是同属于酿酒酵母的面包酵母和啤酒酵母不具备的。

实施例4：复合发酵法对海鲜酱油的成分和口感影响

分别采用单独米曲霉发酵制备海鲜酱油，和发明内容的方法添加瑞氏乳杆菌CGMCC No.12933复合发酵制备海鲜酱油，将两者进行比较(结果见表6)。

分别采用发明内容的方法添加瑞氏乳杆菌CGMCC No.12933、鲁氏酵母、球拟酵母、醋酸杆菌、发酵乳杆菌复合发酵制备海鲜酱油，将成品进行比较(结果见表7)。

分别采用在制曲步骤海鲜浓缩汁浸泡大豆(即发明内容的方法)和在成品酱油调配阶段加入海鲜浓缩汁这两种方法制备海鲜酱油，将两者进行比较(结果见表8)。主要检测以下成分及评价口感：

1、可溶性糖：DNS法，以葡萄糖作标曲；

2、酒精：重铬酸钾比色法；

3、总酯(以乙酸乙酯计)：NaOH-硫酸滴定法；

4、总酸：NaOH滴定法；

5、有机酸：GC-MS分析；

6、氨态氮：甲醛-NaOH滴定法；

7、可溶性蛋白：福林酚法，以牛血清蛋白作标曲；

8、挥发性成分：SPME-GC-MS分析。

表6 发酵方法对海鲜酱油成分和口感的影响

表7 不同菌种复合发酵对酱油成分和口感的影响

采用瑞氏乳杆菌CGMCC No.12933复合发酵的海鲜酱油中，所含的1-辛烯-3-醇(即蘑菇醇)含量显著高于其他菌种复合发酵的海鲜酱油，赋予了成品更鲜香的风味；正辛醇的含量较高，则增加了柑橘和玫瑰的香气；苯甲醛具有杏仁香、坚果香，在本发明方案制备的酱油中也更高；具有果香和茉莉花香的正辛醛含量较其他菌种复合发酵的海鲜酱油高；此外能够反映出香甜滋味的环辛四烯、苯乙烯、双戊烯、茴香烯、1-十二烯和1-十四烯的含量也更高；代表了坚果香味的吡嗪(尤其是2,6-二甲基吡嗪)、代表了烧烤味的呋喃(尤其是2-正戊基呋喃)的含量也较高。以上这几种有代表性的、能够增加酱油滋味的成分，都是在瑞氏乳杆菌CGMCC No.12933的辅助作用下经过微生物代谢所产生的，而被日本酱油所广泛添加的鲁氏酵母和球拟酵母，并不具备这些作用；醋酸杆菌和发酵乳杆菌对总酸以及醋酸、乳酸的含量有提高，虽然有机酸也是酱油鲜美的主要风味物质之一，但是对其他风味物质无甚帮助，酱油总的风味的丰满性并未有显著提高。

表8 海鲜浓缩汁的加入方法对酱油成分和口感的影响

成品调配的酱油中，所含的异戊醛、戊醛、正己醛、庚醛、庚二烯醛、苯乙醛、壬醛、2-癸烯醛等几种醛类的含量显著高于本发明方案制备的海鲜酱油，这几种醛类含量适当时产生的是青草香、花香和水果香，含量超过一定阈值时，反而会产生酸败味、鱼腥味和脂肪油哈味。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种多菌种复合发酵制备海鲜酱油的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原料预处理：将海带干浸泡后打浆，按海带干质量的0.5%~1%加入褐藻胶裂解酶酶解，灭酶后过滤取上清液浓缩得到海带浓缩液；将蚬子干浸泡后打浆，按照蚬子干质量的1%~5%加入酿酒酵母CGMCC No.13030干粉培养20~40min，再按照蚬子干质量的0.3%~0.5%加入风味蛋白酶酶解，灭酶后过滤取上清液浓缩得到蚬子浓缩液；

（2）种曲培养：在麸皮、面粉与水混合得到的种曲原料中接入米曲霉，培养至曲料均匀分布黄绿色孢子，得到种曲；

（3）制曲：按照大豆：海带浓缩液：蚬子浓缩液质量比为5:1~3:1~3，将大豆与海带浓缩液和蚬子浓缩液混合进行浸豆，充分浸泡后进行灭菌蒸煮；分别按照大豆与海带浓缩液和蚬子浓缩液总质量的2%~4%接入步骤（2）的种曲和瑞士乳杆菌CGMCC No.12933培养制曲，至曲料表面均匀附着黄绿色孢子，得到成曲；

（4）发酵：采用高盐稀态发酵法对步骤（3）的成曲进行发酵；

（5）成品：发酵后的酱醅经过淋油、调配、沉淀得到成品酱油。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酿酒酵母CGMCC No.13030，于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13030，分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的瑞士乳杆菌CGMCC No.12933，于2016年9月5日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12933，分类命名为瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，褐藻胶裂解酶酶解的条件为35~45℃，酶解1~1.5h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的海带浓缩液的密度为1.05~1.15g/mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，风味蛋白酶酶解的条件为45~55℃酶解1~2 h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蚬子浓缩液的密度为1.05~1.15g/mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，种曲培养的具体步骤为：将麸皮:面粉:水按质量比为5:1~2:3~5混合，混合后灭菌，然后摇松，冷却至25~35℃；接入米曲霉在28~32℃培养16~20h，震摇至混匀后继续培养6~10 h，再次震摇至混匀后培养65~80h，得到所述的种曲。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述的高盐稀态发酵法具体包括如下步骤：配制波美度18~20的盐水，按照成曲和盐水的质量体积比为1:2~3的比例加入盐水进行发酵；发酵前两个月每隔2天搅拌酱醅一次，第三个月起每隔5天搅拌一次，发酵110~130天。

10.一种权利要求1~9任一项所述的方法制备得到的海鲜酱油。

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