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CN111315414A - 产生载药聚合物支架和蛋白-聚合物-药物缀合物的方法 - Google Patents

产生载药聚合物支架和蛋白-聚合物-药物缀合物的方法 Download PDF

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CN111315414A CN201880054514.1A CN201880054514A CN111315414A CN 111315414 A CN111315414 A CN 111315414A CN 201880054514 A CN201880054514 A CN 201880054514A CN 111315414 A CN111315414 A CN 111315414A
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V.R.古里加拉
S.R.博卢
J.勒布朗
T.B.罗文格
D.麦吉利库迪
尹茂
A.V.于尔科维茨基
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Original Assignee
Mersana Therapeutics Inc
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Abstract

本公开提供了合成聚合物支架、例如用于与基于蛋白的识别分子(PBRM)缀合以形成PBRM‑聚合物‑药物缀合物的那些聚合物支架及其PBRM‑聚合物‑药物缀合物的方法。根据本公开的方法允许大规模制备具有高纯度的聚合物支架。在一些实施方案中，根据本公开的方法还允许以比先前使用的制备支架及其缀合物的方法更好的产率制备支架及其缀合物。还公开了纯化聚合物支架的方法。

Description

产生载药聚合物支架和蛋白-聚合物-药物缀合物的方法
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年6月22日提交的美国临时申请号62/523,378，2017年8月14日提交的美国临时申请号62/545,296，和2018年1月29日提交的美国临时申请号62/623,275的优先权和利益。这些申请的内容通过引用整体并入本文。
背景
传统上，药物主要由口服(作为固体剂型和液体)分配的或作为可注射剂分配的小分子组成。在过去的三十年间，制剂(即，控制药物递送的途径和/或速率且允许治疗剂递送至需要其的位置的组合物)已经变得日益普遍和复杂。虽然如此，有关新疗法以及其施用机制的发展的许多问题和挑战仍有待解决。例如，由于许多药物在其到达体内合意的靶点之前通常会遭到部分降解，或者在不同于该靶点的组织中累积，或者二者皆有，因此它们呈现出有限的或另外降低的效力和治疗效果。
因此，药物递送系统领域的一个目标在于通过可利用生理学或化学机制、或二者稳定药物并控制治疗剂的体内转移的系统将药物完整地递送至身体的特定靶区。
抗体-药物缀合物已经被开发作为靶点特异性治疗剂。对抗各种癌细胞表面抗原的抗体已经与不同的细胞毒性剂缀合，所述细胞毒性剂抑制各种基本的细胞靶点例如微管(美坦生类化合物、奥瑞斯他汀(auristatin)、紫杉烷：美国专利号5,208,020；5,416,064；6,333,410；6,441,163；6,340,701；6,372,738；6,436,931；6,596,757和7,276,497)；DNA(卡奇霉素、阿霉素、CC-1065类似物；美国专利号5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,534,660；6,756,397和6,630,579)。在癌症治疗的临床上，正对抗体与这些细胞毒性药物中的一些的缀合物进行积极的研究(Ricart,A.D.和Tolcher,A.W.,2007,Nature ClinicalPractice,4,245-255；Krop等人,2010,J.Clin.Oncol.,28,2698-2704)。然而，现有的抗体-药物缀合物已经呈现出一些限制。主要的限制在于其不能将足够浓度的药物递送至靶点位置，这是由于有限数目的被靶向的抗原和癌症药物如甲氨蝶呤、柔红霉素、美坦生类化合物、紫杉烷和长春新碱的相对温和的细胞毒性。实现显著的细胞毒性的一个方法是将大量的药物分子直接或间接连接至抗体。然而，此类经高度修饰的抗体经常显示出与靶抗原的减弱的结合和从血流快速体内清除。鉴于前述内容，需要开发改进的抗体-药物缀合物及其制备方法。
概述
本公开至少部分基于发现制备载药聚合物支架的改进方法。
本公开涉及制备和/或纯化聚合物支架的方法，所述聚合物支架可用于与基于蛋白的识别分子(PBRM)缀合。本公开还涉及制备和/或纯化包含聚合物支架和PBRM的此类缀合物的方法。此外，本公开涉及基本上高纯度的蛋白-聚合物-药物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)，并且其可以通过避免繁琐的步骤以减少的时间和成本来制备。
一方面，本公开涉及一种制备式(A)的聚合物支架或其盐的方法：
Figure GDA0002428537640000021
该方法包括一个或多个选自以下的步骤：
(1)使
Figure GDA0002428537640000031
(“化合物A”)与
Figure GDA0002428537640000032
(“化合物B”)在形成第一反应混合物的条件下反应；和
(2)将
Figure GDA0002428537640000033
(“化合物C”)或其盐添加至第一反应混合物中以形成第二反应混合物，该第二反应混合物包含式(A)的支架或其盐；
其中：
化合物B或式(A)的支架包含分子量为约5kDa至约10kDa的聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基-缩甲醛)(PHF)；
m为约20至约75的整数，
n为约7至约40的整数，并且m与n之间的比例为约2∶1至约3∶1，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3是约1至约5的整数，并且
m，m1，m2和m3的总和为约40至约75。
在一些实施方案中，PHF的分子量为约6kDa至约8kDa。
在一些实施方案中，PHF的分子量为约6kDa至约7kDa。
在一些实施方案中，化合物B的分子量为约6kDa至约13kDa，并且n为m和n之和的约26-34％。在一些实施方案中，化合物B的分子量为约7kDa至约12kDa，并且n为m和n之和的约28-32％。在一些实施方案中，化合物B的分子量为约10kDa至约12kDa。
在一些实施方案中，该方法进一步包括分离式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，式(A)的支架或其盐通过反相HPLC分离分离。在一些实施方案中，用包含乙酸钠缓冲剂和乙腈的流动相进行反相HPLC分离。在一些实施方案中，在反相HPLC分离之前，对第二反应混合物进行一次或多次过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合。在一些实施方案中，在反相HPLC分离之前，将第二反应混合物进行一种或多种非吸附色谱分离。在一些实施方案中，在反相HPLC分离之后，对第二反应混合物进行一次或多次过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合。在一些实施方案中，在进行反相HPLC分离之后，将第二反应混合物进行一种或多种非吸附色谱分离。
在一些实施方案中，式(A)的支架的分子量为约4kDa至约18kDa，约5kDa至约17kDa，约6kDa至约16kDa或约7kDa至约14.5kDa。
在一些实施方案中，式(A)的支架的分子量为约7kDa至约14.5kDa。
在一些实施方案中，m2为m，m1，m2和m3总和的约5％至约13％，约6％至约12％，约7％至约11％，或约7.5％至约10.5％。
在一些实施方案中，m2是m，m1，m2和m3总和的约8％至约10％。
在一些实施方案中，m3为m，m1，m2和m3总和的约2％至约4％。
在一些实施方案中，在将化合物C或其盐添加到第一反应混合物中之前，消耗了至少80％的化合物A。
在一些实施方案中，在添加化合物C或其盐之前不分离第一反应混合物。
在一些实施方案中，化合物A和化合物B的反应在第一温度下在羧酸的活化剂和偶联剂的存在下进行。
在一些实施方案中，第一反应混合物与化合物C或其盐的反应在第二温度下在羧酸的活化剂和偶联剂的存在下进行。
在一些实施方案中，活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。在一些实施方案中，偶联剂是乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)。在一些实施方案中，第一温度在约0℃和约15℃之间。在一些实施方案中，第二温度在约5℃和约15℃之间。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使化合物A的被保护形式脱保护来提供化合物A。在一些实施方案中，化合物A的被保护形式是
Figure GDA0002428537640000051
(“化合物AA”)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯在约0℃至约25℃之间的温度下，与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯反应提供化合物AA。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使PHF与3-异氰酰丙酸甲酯反应以形成化合物B的甲酯并将该甲酯转化为化合物B来提供化合物B。
在一些实施方案中，PHF的分子量为约5kDa至约10kDa。在一些实施方案中，PHF的分子量为约6kDa至约8kDa。
在一些实施方案中，PHF的分子量为约6kDa至约7kDa。
在一些实施方案中，该方法进一步包括纯化化合物B，使得如此纯化的化合物B的分子量为约6kDa至约13kDa，并且n为m和n之和的约26-34％。在一些实施方案中，如此纯化的化合物B的分子量为约7kDa至约12kDa，并且n为m和n之和的约29-33％。在一些实施方案中，如此纯化的化合物B具有约10kDa至约12kDa的分子量。
在一些实施方案中，化合物B通过弱阴离子交换色谱分离纯化。在一些实施方案中，用包含磷酸钠缓冲剂的流动相进行弱阴离子交换柱分离。在一些实施方案中，在弱阴离子交换色谱分离之前，用一次或多次过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合来纯化化合物B。在一些实施方案中，在弱阴离子交换色谱分离之前，用一种或多种非吸附色谱分离纯化化合物B。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过脱保护化合物C的被保护形式提供化合物C或其盐。在一些实施方案中，化合物C的被保护形式为
Figure GDA0002428537640000061
(“化合物CC”)。在一些实施方案中，化合物C的盐是三氟乙酸盐。
在一些实施方案中，非吸附色谱分离中的至少一种是用包含交联葡聚糖的柱进行的。在一些实施方案中，非吸附色谱分离中的至少一种是用Sephadex柱进行的。在一些实施方案中，非吸附色谱分离中的至少一种是用Sephadex G-25柱进行的。
在一些实施方案中，切向流过滤中的至少一次是用分子量截留在约650Da和1000Da之间的膜进行的。在一些实施方案中，膜的分子量截留为约650Da。在一些实施方案中，过滤中的至少一次是用分子量截留在约50kDa和100kDa之间的膜进行的，以获得包含式(A)的支架或其盐的渗透物。
在一些实施方案中，纳滤中的至少一次是用分子量截留在1000Da和4000Da之间的膜进行的。在一些实施方案中，膜的分子量截留为约3500Da。
在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少75％，80％，85％，90％，约95％，约98％或约99％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少75％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少80％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少85％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少90％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少95％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少98％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少99％的纯度。
在一些实施方案中，式(A)的支架或其盐是大规模产生的。在一些实施方案中，单批产生至少100g的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少200g，500g，1kg，1.5kg，2kg或2.5kg的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少200g的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少500g的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少1kg的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少1.5kg的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少2kg的式(A)的支架或其盐。在一些实施方案中，单批产生至少2.5kg的式(A)的支架或其盐。
在另一方面，本公开涉及一种制备PBRM-聚合物-药物缀合物的方法，该方法包括：
(1)提供式(A)的聚合物支架或其盐和还原的PBRM；
(2)将还原的PBRM添加到式(A)的聚合物支架或其盐以形成包含式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物的第三反应混合物：
Figure GDA0002428537640000081
其中：
Xa和Xb之一是H，另一个是水溶性马来酰亚胺基封闭部分，或Xa和Xb与它们所连接的碳原子一起形成碳-碳双键；
PHF的分子量为约5kDa至约10kDa；
m是20到75的整数，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3a是0至约4的整数，
m3b是1至约5的整数，
m，m1，m2，m3a和m3b的总和为约40至约75，并且
m5是2至约4的整数。
在一些实施方案中，式(A)的聚合物支架或其盐是通过进行本公开的方法制备的。
在一些实施方案中，通过使PBRM与还原剂反应来制备还原的PBRM。在一些实施方案中，PBRM以约1∶2至约1∶4的摩尔比和任选地以约1∶2.4，约1∶2.5，约1∶3.0，或约1∶3.5的摩尔比与还原剂反应。
在一些实施方案中，PBRM的一个或多个二硫键被还原剂还原为一个或多个巯基。
在一些实施方案中，还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其盐。在一些实施方案中，还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐。
在一些实施方案中，使式(A)的聚合物支架或其盐与还原的PBRM以约0.5∶1至约1.2∶1的重量比反应。在一些实施方案中，使式(A)的聚合物支架或其盐与还原的PBRM以约0.7∶1至约0.95∶1的重量比反应。
在一些实施方案中，通过加入马来酰亚胺基封闭化合物来终止式(A)的聚合物支架或其盐与还原的PBRM的反应。在一些实施方案中，马来酰亚胺基封闭化合物选自半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸，半胱氨酸甲酯，N-甲基半胱氨酸，2-巯基乙醇，3-巯基丙酸，2-巯基乙酸，巯基甲醇，苄基硫醇及其盐。在一些实施方案中，该马来酰亚胺基封闭化合物是半胱氨酸。
在一些实施方案中，该方法进一步包括从第三反应混合物中分离式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物用色谱分离分离。在一些实施方案中，式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物用离子交换色谱分离分离。
在一些实施方案中，通过强阳离子交换(SCX)色谱分离分离式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，用包含乙酸钠，氯化钠或其组合的流动相进行强阳离子交换色谱分离。在一些实施方案中，流动相的pH值为约5至约7。在一些实施方案中，流动相的pH值为约5.5至约6.5。在一些实施方案中，流动相的pH值为约5.8至约5.9。
在一些实施方案中，如通过分析型HPLC WCX色谱所确定的，强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除了具有高AF HPA与PBRM比的一种或多种酸性级分。在一些实施方案中，如通过分析型HPLC WCX色谱所确定的，强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除了具有低AF HPA与PBRM比的一种或多种碱性级分。在一些实施方案中，强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除一种或多种聚集的物类。在一些实施方案中，强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除未反应的PBRM物类。
在一些实施方案中，在强阳离子交换色谱分离期间，收集通过分析型HPLC WCX色谱确定的酸性(例如，早期洗脱)和碱性(例如，晚期洗脱)级分之间洗脱的一种或多种主要级分，其具有期望的AF HPA与PBRM比，从而提供由此纯化的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物以约20∶1至约6∶1的比例包含奥瑞斯他汀F羟丙基酰胺(AF HPA)和PBRM。在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例为约20∶1，约19∶1，约18∶1，约17∶1，约16∶1，约15∶1，约14∶1，约13∶1，约12∶1，约11∶1，约10∶1，约9∶1，约8∶1，约7∶1或约6∶1。在一些实施方案中，AF HPA与PBRM之间的比例为约10∶1至约15∶1。在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例为约10∶1至约12∶1。在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例为约12∶1至约15∶1。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物以约6∶1至约2∶1的比例包含AF HPA和PHF。在一些实施方案中，AF HPA与PHF之间的比例为约6∶1，约5∶1，约4∶1，约3∶1或约2∶1。在一些实施方案中，AF HPA和PHF之间的比例为约4∶1。
在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物以约6∶1至约2∶1的比例包含PHF和PBRM。在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例为约6∶1，约5∶1，约4∶1，约3∶1或约2∶1。在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例为约4∶1。在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例为约3∶1。
在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约98％或约99％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约80％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约85％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约90％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约95％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约98％的纯度。在一些实施方案中，由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约99％的纯度。
在一些实施方案中，大规模产生式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少200g，500g，1kg，1.5kg，2kg或2.5kg的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少200g的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少500g的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少1kg的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少1.5kg的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少2kg的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，单批产生至少2.5kg的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
在另一方面，本公开涉及通过本公开的方法制备的式(A)的聚合物支架或其盐。
在另一方面，本公开涉及通过本公开的方法制备的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
在另一方面，本公开涉及制备包含PBRM-聚合物-药物缀合物的药物组合物的方法，该方法包括：
(1)提供式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物；和
(2)向式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物中添加一种或多种药学上可接受的赋形剂以形成药物组合物。
在一些实施方案中，式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物通过执行本公开的方法制备。
在另一方面，本公开涉及药物组合物，其包含本公开方法制备的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常理解的相同的含义。在说明书中，除非上下文清楚地另外指出，单数形式也包括复数。尽管类似于或等同于本文描述的那些的方法和材料可以用于实践或测试本发明，下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用并入。本文提及的参考文献并非承认是要求保护的本发明的现有技术。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是例示性的，并且不意欲为限制性的。
本文所述方法的优点之一是无需繁琐的纯化步骤即可改善载药聚合物支架及其缀合物的产率和纯度。例如，来自化合物A和B的反应产物不需要在加入化合物C或其盐之前进行后处理。另一个优点是产生载药聚合物支架的方法易于放大以产生至少100g的单批产品。另一个优点是，通过本文所述方法制备的蛋白-聚合物-药物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)或载药聚合物支架基本上不含内毒素，并且基本上同质。根据以下详细描述和权利要求，本文描述的方法、支架和缀合物的其他特征和优点将显而易见。
详细说明
本公开提供了用于制备载药聚合物支架及其PBRM缀合物的新颖的合成方法。
本公开还提供了通过本文所述的合成方法产生的载药聚合物支架及其缀合物。
本公开还提供了制备和/或纯化聚合物支架的方法，所述聚合物支架可用于与基于蛋白的识别分子(PBRM)缀合。
本公开还提供了制备和/或纯化包含聚合物支架和PBRM的此类缀合物的方法。
此外，本公开还提供了基本上高纯度的蛋白-聚合物-药物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)，并且其可以通过避免繁琐的步骤以减少的时间和成本来制备。
定义/术语
本文还更详细地描述了本公开的某些化合物和特定官能团的定义。出于本公开的目的，化学元素根据元素周期表(CAS版本，Handbook of Chemistry and Physics,第75版，封里)鉴定，并且特定的官能团通常如本文所述来定义。此外，有机化学的通用原理以及特定的官能部分和反应性描述于“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,UniversityScience Books,Sausalito:1999中，其全部内容通过引用并入本文。另外，本领域普通技术人员将理解如本文所述的合成方法利用各种保护基。
在下面的描述和权利要求书中，冠词“一”，“一个”和“所述”的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“包含”，“具有”，“具有化学式”中的“具有”，“包括”和“含有”应被解释为开放术语(即，意思是“包括但不限于”)，除非另有说明。例如，某一式的聚合物支架包括式中所示的所有单体单元，并且还可以包括式中未示出的其他单体单元。此外，每当在实施方案中使用“包括”或另一个开放式术语时，应理解，可以使用中间术语“基本上由...组成”或封闭式术语“由...组成”，更狭窄地要求保护相同的实施方案。
术语“约”、“大约”或“近似”，当与数值连用时，表示包括值的集合或范围。例如，“约X”包括为X±20％、±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％或±0.1％的值的范围，其中X为数值。在一个实施方案中，术语“约”是指比特定值多或少5％的值的范围。在另一实施方案中，术语“约”是指比特定值多或少2％的值的范围。在另一实施方案中，术语“约”是指比特定值多或少1％的值的范围。
除非本文另有说明，否则数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。除非另有说明，否则本文所使用的范围包括该范围的两个限值。例如，表达“x是1和6之间的整数”和“x是1到6的整数”都表示“x是1、2、3、4、5或6”，即术语“X和Y之间”和“X到Y的范围”包括X和Y及其之间的整数。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何实例和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，不应解释为对权利要求范围的限制，除非另有明确说明。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何非要求保护的要素对于要求保护的方案必不可少。
“抗体”是指包含免疫球蛋白的全长抗体或抗体的功能片段。“功能片段”是指提供足够的免疫球蛋白或抗体部分，以使该部分与其目标细胞群体的细胞表面分子(例如人癌胚抗原)有效结合或复合。
如本文所用，人癌胚抗原包括例如肿瘤相关蛋白，例如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原和癌胚抗原蛋白(也称为未成熟层粘连蛋白受体蛋白，并且已经与例如肠和肾癌相关)。
免疫球蛋白可以使用本领域技术人员已知的技术进行纯化，重组产生，合成产生或其组合。虽然IgG抗体内的免疫球蛋白或从IgG抗体衍生的免疫球蛋白特别完全适合用于本公开，但可选择来自任何种类或亚类的免疫球蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。合适地，免疫球蛋白是IgG类，包括但不限于IgG亚类(IgG1、2、3和4)或IgM类，其能够特异性结合至抗原上的特异性表位。抗体可以是从天然来源或从重组来源衍生的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以以各种形式存在，包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、骆驼化单域抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、重组抗体、抗个体遗传型抗体、域抗体、线性抗体、多重特异性抗体、抗体片段，例如Fv、Fab、F(ab)2、F(ab)3、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、单链可变片段抗体(scFv)、串联/双-scFv、Fc、pFc’、scFvFc(或scFv-Fc)、二硫化Fv(dsfv)、双特异性抗体(bc-scFv)例如BiTE抗体；骆驼抗体、表面重塑抗体、人源化抗体、完全人类抗体、单域抗体(sdAb，也称为
Figure GDA0002428537640000151
)、嵌合抗体、包含至少一个人类恒定区的嵌合抗体、双亲和性抗体例如双亲和性重新靶向蛋白(DARTTM)、二价(或双价)单链可变片段(di-scFvs、bi-scFvs)(包括但不限于微小抗体(minibody)、双抗体(diabody)、三抗体(triabody或tribody)、四抗体(tetrabody)等)，以及多价抗体。“抗体片段”是指结合至其靶点的免疫球蛋白分子的可变区(即抗原结合区)的至少一部分。除非另外指明，如本文所用的术语“抗体”是指全长抗体和抗体片段二者。
“基于蛋白的识别分子”或“PBRM”是指识别和结合至细胞表面标志物或受体，例如跨膜蛋白、表面固定化蛋白或蛋白多糖的分子。PBRM的实例包括但不限于，抗体(例如，曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、依帕珠单抗、维妥珠单抗、拉贝珠单抗、B7-H4、B7-H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c-Met、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD-L1、c-Kit、MUC1和抗-5T4)或肽(LHRH受体靶向肽、EC-1肽)、脂笼蛋白，例如，anticalin、蛋白，例如，干扰素、淋巴因子、生长因子、集落刺激因子等、肽或肽模拟物等。基于蛋白的识别分子除了将修饰的聚合物缀合物靶向至特定细胞、组织或位点之外，还可以具有某些治疗效果，例如对于靶细胞或通路的抗增殖(抑制细胞和/或细胞毒素)活性。基于蛋白的识别分子包含或可以通过基因工程改造而包含至少一个化学反应性基团，例如-COOH、伯胺、仲胺-NHR、-SH，或化学反应性氨基酸部分或侧链，例如酪氨酸、组氨酸、半胱氨酸或赖氨酸。在一个实施方案中，PBRM可以是与给定的靶细胞群体的细胞表面分子(例如细胞表面受体或抗原)特异性地结合或复合的配体(LG)或靶向部分。在配体与其受体特异性结合或复合后，细胞对配体或配体-药物缀合物的吸收是允许的，然后其被内化进入细胞。如本文所用的，“特异性结合或复合”或“靶向”细胞表面分子的配体优选经由分子间力与细胞表面分子缔合。例如，配体可优选以少于约50nM、少于约5nM，或少于500pM的Kd与细胞表面分子缔合。测量配体与细胞表面分子的结合亲和力的技术是众所周知的；例如，一种合适的技术被称为表面细胞质基因共振(SPR)。在一个实施方案中，配体用于靶向，且当与它递送的药物分离时没有可检测的治疗效果。在另一实施方案中，配体起着作为靶向部分和作为治疗剂或免疫调节剂二者的功能(例如，增强活性药物或前药的活性)。
如本文所用的“生物相容的”旨在描述当与体液或活细胞或组织接触时施加最小的破坏效应或宿主反应效应的化合物。因此，如本文所用的生物相容的基团是指脂族、环烷基、杂脂族、杂环烷基、芳基或杂芳基部分，其落在以上和本文所定义的术语生物相容的定义之内。如本文所用的术语“生物相容性”也被认为表示呈现出与识别蛋白(例如，天然存在的抗体、细胞蛋白、细胞和生物系统的其它组分)之间最少的相互作用的化合物，除非此类相互作用是特别合意的。因此，特别旨在引起上述最少的相互作用的物质和官能团(例如，药物和前药)被认为是生物相容的。优选地(除了旨在为细胞毒性的化合物，例如抗肿瘤剂以外)，若有下列情形，则化合物是“生物相容的”：将该化合物以与预期的全身性体内浓度类似的浓度体外添加至正常的细胞时，在等同于该化合物的体内半衰期(例如，50％的体内给予的化合物被消除/清除所需的时间周期)的时间内导致小于或等于1％的细胞死亡，以及所述化合物的体内给予诱发最少的和医学上可接受的炎症、异物反应、免疫毒性、化学毒性和/或其它此类不良反应。在上述句子中，术语“正常细胞”是指不意欲被受试化合物破坏或者另外显著影响的细胞。
“可生物降解的”：如本文所用，“可生物降解的”聚合物是对体内生物处理敏感的聚合物。如本文所用，“可生物降解的”化合物或部分是当被细胞吸收时可被溶酶体或其他化学机构或通过水解分解成细胞可重复使用或处置而对细胞没有明显毒性作用的组分。本文所用的术语“可生物裂解的”具有与“可生物降解的”相同的含义。降解片段优选在体内几乎不引起或不引起器官或细胞超负荷或由这种超负荷或其他不利影响引起的病理过程。生物降解过程的例子包括酶促和非酶促水解，氧化和还原。本文所描述的可生物降解的蛋白-聚合物-药物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)或其组分(例如，可生物降解的聚合物载体以及载体与抗体或药物分子之间的连接基)的非酶促水解的合适条件例如包括将可生物降解的缀合物在溶酶体细胞内区室的温度和pH下暴露于水。一些蛋白-聚合物-药物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)或其组分(例如，可生物降解的聚合物载体以及载体与抗体或药物分子之间的连接基)的生物降解也可以在细胞外(例如在动物体的低pH值区域，例如发炎区域，活化的巨噬细胞或释放降解促进因子的其他细胞附近)增强。在某些优选的实施方案中，在pH～7.5下聚合物载体的有效尺寸在1至7天内没有可检测地变化，并且在至少几周内保持在原聚合物尺寸的50％以内。另一方面，在pH～5下，聚合物载体优选在1至5天内可检测地降解，并在两周至几个月的时间范围内完全转化为低分子量片段。这种测试中的聚合物完整性可以例如通过尺寸排阻HPLC来测量。尽管在某些情况下更快的降解可能是优选的，但是通常可能更希望聚合物在细胞中降解的速率不超过细胞对聚合物片段的代谢或排泄速率。在优选的实施方案中，聚合物和聚合物生物降解副产物是生物相容的。
“生物利用度”：术语“生物利用度”是指给予受试者的给定量的药物或化合物的全身性利用度(即，血液/血浆水平)。生物利用度是绝对术语，其表示药物或化合物由所给予的剂型到达一般循环的时间(速率)和总量(程度)二者的量度。
“亲水的”：术语“亲水的”，当涉及到例如在聚合物单体单元上或在马来酰亚胺基封闭部分上的取代基以使其具有亲水性或水溶性时，基本上无异于该术语在本领域中的通常含义，并且表示含有可电离的、极性的或可极化的原子或者另外可以被水分子溶剂化的化学部分。因此，如本文所用的亲水基团是指落入如上所定义的术语“亲水的”的定义之内的脂族、环烷基、杂脂族、杂环烷基、芳基或杂芳基部分。适合的具体的亲水有机部分的实例包括(但不局限于)包含在约1至12个原子之间范围内的原子的链的脂族或杂脂族基团、羟基、羟烷基、胺、羧基、酰胺、羧酸酯、硫酯、醛、硝酰基、异硝酰基、亚硝基、羟基胺、巯基烷基、杂环、氨基甲酸酯、羧酸及其盐、磺酸及其盐、磺酸酯、磷酸及其盐、磷酸酯、聚二醇醚、聚胺、聚羧酸酯、聚酯和聚硫酯。在某些实施方案中，亲水取代基包含羧基(COOH)、醛基(CHO)、酮基(COC1-4烷基)、羟甲基(CH2OH)或二醇(例如，CHOH-CH2OH或CH-(CH2OH)2)、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等。
术语“亲水的”当涉及本公开的聚合物时总体上无异于本领域中该术语的使用，并且表示包含如上定义的亲水性官能团的聚合物。在优选的实施方案中，亲水性聚合物是水溶性聚合物。聚合物的亲水性可通过测定水合能直接测量，或通过在两个液相之间的研究或通过在具有已知疏水性的固相(例如C4或C18)上的色谱测定。
“聚合物载体”或“聚合物支架”：如本文所用，术语“聚合物载体”或“聚合物支架”是指聚合物或改性聚合物，其适于共价连接或可共价连接至具有指定的连接基的一个或多个药物分子和/或具有指定的连接基的一个或多个PBRM。在一些实施方案中，聚合物或改性聚合物共价连接至一个或多个药物分子和/或一个或多个PBRM。
“生理条件”：如本文所用的短语“生理条件”涉及在活组织的细胞外流体中可能遇到的化学(例如，pH、离子强度)和生物化学(例如，酶浓度)条件的范围。对于大多数正常组织而言，生理学pH范围从约7.0至7.4。循环血浆和正常的间质液代表正常生理学条件的典型实例。
“多糖”、“碳水化合物”或“寡糖”：术语“多糖”、“碳水化合物”或“寡糖”是本领域已知的，并且通常是指具有化学式(CH2O)n(其中通常n>2)的物质，及其衍生物。碳水化合物是多羟基醛或多羟基酮，或者通过简单的化学转化(例如水解、氧化或还原)变为此类物质。典型地，碳水化合物以环状缩醛或缩酮的形式存在(例如，葡萄糖或果糖)。这些环状单元(单糖)可以互相连接以形成具有少数单糖单元的分子(寡糖)或具有数个单糖单元的分子(多糖)。通常，带有明确定义的数目、种类和定位的单糖单元的碳水化合物被称为寡糖，而由具有可变数目和/或定位的单糖单元的分子的混合物组成的碳水化合物被称为多糖。术语“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”在本文中可互换使用。多糖可以包括天然的糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖和木糖)和/或天然存在的糖的衍生物(例如，2′-氟代核糖、2′-脱氧核糖和己糖)。
“药物”：如本文所用的，术语“药物”是指为生物学活性的并在给予有需要的受试者后提供所需生理学作用的化合物(例如，活性药物成分)。
“前药”：如本文所用的术语“前药”是指活性药物的前体，即可转化为活性药物的化合物。典型地，此类前药经受体内处理，这使药物转化为生理学活性形式。在一些情况下，前药本身可具有所需生理学作用。所需生理学作用可以是例如治疗性的、细胞毒性的、免疫调节的等。
“细胞毒性的”：如本文所用的术语“细胞毒性的”表示对细胞或选择的细胞群体(例如，癌细胞)为毒性的。毒性作用可导致细胞死亡和/或溶胞作用。在某些情况下，毒性作用可以是对细胞的亚致死破坏作用，例如减慢或阻止细胞生长。为了获得细胞毒性作用，药物或前药可选自DNA损伤剂、微管破坏剂，或细胞毒性蛋白或多肽等。
“抑制细胞的”：如本文所用的术语“抑制细胞的”是指抑制或阻止细胞生长和/或增殖的药物或其它化合物。
“小分子”：如本文所用的，术语“小分子”是指或者天然存在或者人工产生(例如经由化学合成)的具有相对较低的分子量的分子。优选的小分子是生物学活性的，其在动物，优选哺乳动物，更优选人类体内产生局部性或全身性作用。在某些优选的实施方案中，该小分子是药物并且该小分子被称为“药物分子”或“药物”或“治疗剂”。在某些实施方案中，药物分子具有小于或等于约5kDa的MW。在其它实施方案中，药物分子具有小于或等于约1.5kDa的MW。在实施方案中，药物分子选自长春花生物碱、奥瑞斯他汀、倍癌霉素、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂、PI3激酶抑制剂、卡奇霉素、SN38、喜树碱、拓扑异构酶抑制剂、非天然喜树碱、蛋白合成抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000201
美坦生类化合物、DNA-结合药物、DNA嵌入药物及其类似物。优选地，虽然非必要，该药物是已经被适当的政府机关或团体(例如FDA)认定为安全且有效使用的那种。例如，根据FDA的21 C.F.R.§§330.5,331至361，和440至460列举的供人类使用的药物；根据FDA的21 C.F.R.§§500至589列举的供兽医使用的药物(通过引用并入本文)都被视为适用于本发明的亲水性聚合物。可用于实施本发明的药物分子的类别包括，但不限于，抗癌物质、放射性核素、维生素、抗AIDS物质、抗生素、免疫抑制剂、抗病毒物质、酶抑制剂、神经毒素、阿片类、安眠药、抗组胺剂、润滑剂、镇静剂、抗惊厥药、肌肉松弛剂和抗帕金森症物质、解痉药和肌肉收缩剂(包括通道阻断剂)、缩瞳药和抗胆碱能药、抗青光眼化合物、抗寄生虫和/或抗原虫化合物、细胞-细胞外基质相互作用调节剂(包括细胞生长抑制剂和抗粘合分子)、血管舒张剂、DNA，RNA或蛋白合成的抑制剂、抗高血压剂、镇痛剂、解热剂、甾体和非甾体抗炎剂、抗血管生成因子、抗分泌因子、抗凝血剂和/或抗血栓形成剂、局部麻醉剂、眼药、前列腺素、抗抑郁剂、抗精神病物质、镇吐剂、显像剂。许多大分子也是药物，并且此类大分子可用于本文描述的缀合物和其它构建体。合适的大分子的实例包括，例如，基于氨基酸的分子。基于氨基酸的分子可包含，例如，肽、多肽、酶、抗体、免疫球蛋白或其功能片段等。
虽非穷举，适合于在本公开中使用的类别和特定药物的更加完整的清单可见于Axel Kleemann和Jurgen Engel的“Pharmaceutical Substances:Syntheses,Patents,Applications”,Thieme Medical Publishing,1999和由Susan Budavari等人编辑的“Merck Index:An Encyclopedia of Chemicals,Drugs,and Biologicals”,CRC Press,1996，这二者通过引用并入本文。在优选的实施方案中，在本公开中使用的药物是对靶细胞或通路具有抗增殖(抑制细胞和/或细胞毒性)活性的治疗剂。该药物可以具有化学反应性基团，例如-COOH、伯胺、仲胺-NHR、-OH、-SH、-C(O)H、-C(O)R、-C(O)NHR2b、C(S)OH、-S(O)2OR2b、-P(O)2OR2b、-CN、-NC或-ONO，其中R为脂族、杂脂族、碳环或杂环烷基部分并且R2b为氢、脂族、杂脂族、碳环或杂环部分。
如本文所用，“药物衍生物”或“修饰的药物”等是指包含意图通过本公开的缀合物递送的药物分子和能够将药物分子连接至聚合物载体的官能团的化合物。
如本文所用的“活性形式”是指在体内或体外呈现出预期的药物功效的化合物形式。特别地，当旨在通过本公开的缀合物递送的药物分子从该缀合物中释放时，该活性形式可以是药物本身或其衍生物，其呈现出预期的治疗性质。药物从该缀合物中的释放可以通过将该药物连接至聚合物载体的连接基的可生物降解的键的裂解而实现。因此，活性药物衍生物可包含该连接基的一部分。
“诊断标签”：如本文所用的，术语诊断标签是指可以使用本领域中已知的分析法在体内或体外检测的物质组合物的原子、原子团、部分或官能团、纳米晶体或其它的离散要素。当与本公开的缀合物结合时，此类诊断标签容许在体内监测该缀合物。可选地或额外地，包括诊断标签的构建体和组合物可以用于监测生物学功能或结构。诊断标签的实例包括，但不限于，可以用于医学诊断过程的标签，例如用于γ闪烁照相术和正电子发射断层显像术(PET)的放射性同位素(放射性核素)；用于核磁共振成像(MRI)的造影剂(例如顺磁原子和超顺磁纳米晶体)；用于计算机断层显像术和其它基于X-射线的成像方法的造影剂；用于基于超声波的诊断方法(超声波扫描术)的试剂；用于中子活化法的试剂(例如，硼、钆)；用于各种光学过程的荧光团；以及通常可以发射、反射、吸收、散射或以其他方式影响电磁场或波(例如，γ-射线、X-射线、无线电波、微波、光)、粒子(例如α粒子、电子、正电子、中子、质子)或其它形式的辐射(例如超声波)的部分。
“缀合物”：本文所用的术语“缀合物”是指共价连接至或被共价连接至具有指定连接基的一个或多个药物分子和/或具有指定连接基的一个或多个PBRM的聚合物或改性聚合物。
以下是在本申请中使用的更通用的术语：
“动物”：如本文所用的，术语动物是指在任何发展阶段的人类以及非人动物，包括，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、蠕虫类和单细胞类。细胞培养物和活组织样品被认为是复数动物。优选地，非人动物为哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)。动物可以是转基因动物。术语“受试者”涵盖动物。
“有效量”：通常，当提及活性剂或药物递送装置时，术语“有效量”是指引起所需的生物学应答所必需的量。本领域技术人员将理解的是，药剂或装置的有效量可以随着此类因素而改变：如所需的生物学终点、待递送的药剂、包封基质的组成、靶组织等。例如，含有待递送以免疫个体的抗原的微粒的有效量是导致足以防止具有被给予抗原的生物体感染的免疫应答的量。
“PHF”是指聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基-缩甲醛)。
如本文所用，术语“聚合物单元”，“单体单元”，“单体”，“单体单元”，“单元”均是指聚合物中的可重复结构单元。
如本文所用，聚合物或聚合物载体/支架或聚合物缀合物的“分子量”或“MW”是指重均分子量，除非另有说明。
“非吸附色谱”是指使用非吸附树脂的色谱，包括但不限于Sephadex G-25，G-50，G-100，Sephacryl树脂(例如S-200和S-300)，Superdex树脂(例如Superdex 75和Superdex200)，生物凝胶树脂(例如P-6，P-10，P-30，P-60和P-100)以及本领域技术人员已知的其他树脂。
本公开意欲包括本化合物中存在的原子的所有同位素。同位素包括具有相同的原子序数但不同的质量数的那些原子。通过一般实例，但不限制的方式，氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括C-13和C-14。
本公开意欲包括化合物的所有异构体，其是指并包括光学异构体和互变异构体，其中光学异构体包括对映异构体和非对映异构体、手性异构体和非手性异构体，并且光学异构体包括分离的光学异构体以及光学异构体的混合物，包括外消旋和非外消旋混合物；其中异构体可以是分离的形式或与一种或更多种其它异构体的混合物。
聚合物载体
在某些示例性实施方案中，本公开的缀合物可用于生物医学应用中，例如药物递送和组织工程，并且载体是生物相容的和可生物降解的。在某些实施方案中，载体是可溶性聚合物，纳米颗粒，凝胶，脂质体，胶束，缝合线，植入物等。在某些实施方案中，术语“可溶性聚合物”包括可生物降解的生物相容性聚合物，例如聚醚多元醇(polyal)(例如，亲水性聚缩醛或聚缩酮)。在某些其他实施方案中，载体是完全合成的，半合成的或天然存在的聚合物。在某些其他实施方案中，载体是亲水的。
在某些示例性实施方案中，本公开中使用的载体是可生物降解的生物相容性聚醚多元醇，其在位于主链内的每个单体单元中包含至少一个可水解键。这确保了降解过程(通过单体单元的水解/裂解)将导致聚合物缀合物断裂成单体组分(即降解)，并赋予本公开的聚合物缀合物其可生物降解的性质。可生物降解的生物相容性聚合物缀合物的性质(例如，溶解性、生物粘附性和亲水性)可通过随后另外的亲水或疏水基团的取代来改变。适用于实施本发明的可生物降解的生物相容性聚合物的实例尤其可见于美国专利号5,811,510；5,863,990；5,958,398；7,838,619和7,790,150；上面列出的每个专利文件均通过引用整体并入本文。在以上引用的文件中可以找到关于这种聚合物的重要性，制备和应用的指导。在某些实施方案中，预期本发明将特别可用于与以上引用的专利文件以及美国专利号5,582,172和6,822,086组合，上面列出的每个专利文件均通过引用整体并入本文。
本公开的缀合物是亲水的、可水解的，并且包含药物分子(例如，长春花生物碱或衍生物，拓扑异构酶抑制剂，例如SN38，喜树碱，拓扑替康，依沙替康，非天然喜树碱化合物或衍生物；奥瑞斯他汀，多拉司他汀，nemorubicine及其衍生物，PNU-159682，蒽环类抗生素，倍癌霉素，激酶抑制剂(例如PI3激酶抑制剂或MEK抑制剂)，KSP抑制剂，卡奇霉素，吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000241
美坦生类化合物、依利萘法德，DNA结合药物，DNA嵌入药物和其立体异构体，等排体，类似物和衍生物)和抗体(例如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、依帕珠单抗、维妥珠单抗、拉贝珠单抗、B7-H4、B7-H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c-Met、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD-L1、NaPi2b、c-Kit、MUC1和抗-5T4)或肽(LHRH受体靶向肽，EC-1肽)，其通过包含一个或多个可生物降解键的连接键共价连接到聚合物载体。因此，在某些示例性实施方案中，适合于实施本发明的载体是在位于主链内的每个单体单元中具有至少一个缩醛/缩酮氧原子的聚醚多元醇。如上所述，这确保了降解过程(通过聚合物缩醛/缩酮基的水解/裂解)将导致聚醚多元醇缀合物断裂为低分子量组分(即，降解)。在某些实施方案中，用于制备本公开的聚合物缀合物的可生物降解的生物相容性聚合物载体是天然存在的多糖，糖多糖和聚糖苷，聚缩醛，聚酰胺，聚醚和聚酯来源的合成聚合物以及它们的氧化，官能化，修饰，交联和缀合的产物。
在某些其他实施方案中，载体是选自碳水化合物，糖多糖，糖脂，糖缀合物，聚缩醛类，聚缩酮类及其衍生物的亲水性可生物降解聚合物。
在某些示例性实施方案中，载体是天然存在的线性和/或分支的可生物降解的生物相容性均多糖，选自纤维素，直链淀粉，葡聚糖，左聚糖，岩藻依聚糖，角叉菜聚糖，菊粉，果胶，支链淀粉，糖原和lixenan。
在某些其他示例性实施方案中，载体是天然存在的线性和分支的可生物降解的生物相容性杂多糖，其选自琼脂糖，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，硫酸角蛋白，藻酸和肝素。
在其他示例性实施方案中，聚合物载体包含聚缩醛/聚缩酮和选自聚丙烯酸酯，聚乙烯聚合物，聚酯，聚原酸酯，聚酰胺，多肽及其衍生物的亲水性聚合物的共聚物。
在又一个实施方案中，聚合物载体是葡聚糖，其是由从各种天然产物例如小麦，大米，玉米和木薯中获得的淀粉的水解产生的。取决于淀粉起始材料的结构，各葡聚糖包含α-1,4键和α-1,6键的独特分布。由于α-1,6键的生物降解率通常小于α-1,4键的生物降解率，因此优选α-1,4键的百分比小于10％，更优选小于5％。在一个实施方案中，葡聚糖的分子量为约2kDa至约40kDa，更优选为约2kDa至约20kDa，或为约3kDa至约15kDa，或为约5kDa至约10kDa或约6.6kDa。
在某些实施方案中，载体包含多糖，在与药物分子或PBRM缀合之前，通过1,2-，1,4-，1,6-和2,6-吡喃糖苷以及1,2-，1,5-，1,6-呋喃糖苷的环连位二醇的选择性氧化，或通过含侧链6-羟基和5,6-二醇的多糖的氧化，活化所述多糖。
在其他实施方案中，聚合物载体包含可生物降解的生物相容性聚缩醛，其中至少一部分聚缩醛重复结构单元具有以下化学结构：
Figure GDA0002428537640000251
其中，对于每次出现的n括号内的结构，R1和R2中的一个为氢，另一个为生物相容性基团，并包括与C1共价连接的碳原子；Rx是与C2共价连接的碳原子；n”为整数；每次出现的R3、R4，R5和R6均是生物相容性基团，并且独立地为氢或有机部分；并且对于每次出现的括号内的结构n，R1，R2，R3，R4，R5和R6中的至少一个包含适合于偶联的官能团。在某些实施方案中，该官能团是羟基部分。
在一个实施方案中，聚合物载体包含活化的亲水性可生物降解的生物相容性聚合物，其包含0.1％至100％的聚缩醛部分，其主链由以下化学结构表示：
(-CH2-CHR7-O-CHR8-O-)o，
其中：
R7和R8独立为氢，羟基，羟烷基(例如-CH2OH,–CH(OH)-CH2OH)，-CHO，-CH(OH)-CHO或羰基；且
o是20到2000的整数。
在其他实施方案中，聚合物载体包含可生物降解的生物相容性聚缩酮，其中至少一部分聚缩酮可重复结构单元具有以下化学结构：
Figure GDA0002428537640000261
其中每次出现的R1和R2是生物相容性基团，并且Rx，R3，R4，R5，R6和如本文所定义。
在某些实施方案中，缩酮单元是式(IIa)或(IIb)的单体：
Figure GDA0002428537640000262
可生物降解的，生物相容性的聚缩酮聚合物及其制备方法已描述于美国专利号5,811,510,7,790,150和7,838,619，其全部内容通过引用结合于此。
在一个实施方案中，聚合物载体可以从部分氧化的葡聚糖(□1→6)-D-葡萄糖)得到，然后还原。在该实施方案中，聚合物包含以下结构的未修饰的葡聚糖(A)，部分氧化的葡聚糖缩醛单元(B)和彻底的葡聚糖缩醛单元(C)的随机混合物：
Figure GDA0002428537640000271
在另一个实施方案中，聚合物载体包含未改性的缩醛单元，即聚缩醛链段。在一些实施方案中，聚缩醛可衍生自彻底氧化的葡聚糖，然后还原。这些聚合物已在参考文献中进行了描述，参见例如美国专利号5,811,510，该文件在第2栏第65行至第8栏第55行对聚缩醛的描述以及在第10栏第45行至第11栏第14行对其合成的描述在此通过引用并入。在一个实施方案中，未改性的聚缩醛聚合物是聚(羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)聚合物(PHF)。
除聚(羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)聚合物，聚合物载体的主链还可包含聚(羟甲基亚乙基羟甲基缩甲醛)嵌段和其他缩醛或非缩醛单体或聚合物的共聚物。例如，聚乙二醇聚合物可用作聚合物主链中的隐形剂，因为它们可以减少附加官能团的聚合物侧链之间的相互作用。这样的基团还可用于限制诸如血清因子和改性聚合物之间的相互作用。包含在聚合物主链中的其他隐形剂单体包括，例如，乙烯亚胺，甲基丙烯酸，丙烯酰胺，谷氨酸及其组合。
缩醛或缩酮单元以有效促进生物相容性的量存在于改性聚合物中。未改性的缩醛或缩酮单元可被描述为“隐形剂”，其为改性聚合物提供生物相容性和溶解性。另外，与聚缩醛或聚缩酮聚合物的缀合可以改变与其连接的部分对代谢和降解的敏感性，并影响生物分布，清除和降解。
未改性的缩醛单元是式(III)的单体：
Figure GDA0002428537640000281
未改性的聚缩醛单元的摩尔分数n是基于改性聚合物中的聚合物单元总数可用于促进生物相容性，溶解性和增加半衰期的摩尔分数。摩尔分数n可以是提供生物相容性，溶解性，稳定性或特定的半衰期所需的未改性单体缩醛单元的最小分数，或者可以是更大一些的分数。最理想的细胞毒性程度是基本上没有，即改性聚合物对受试者基本上是惰性的。然而，如本领域普通技术人员所理解的，可以容许一定程度的细胞毒性，这取决于要治疗的疾病或症状的严重程度，治疗的功效，免疫应答的类型和程度以及类似的考虑因素。
在一个实施方案中，改性的聚合物主链包含式(IV)的单元：
Figure GDA0002428537640000282
其中X'表示聚合物主链的羟基的取代基。如式(IV)和本文所述的其他式所示，每个聚缩醛单元具有连接至该单元的甘油部分的单个羟基和连接至该单元的乙醇醛部分的X'基团(或另外的取代基如-LD-D。这仅是为了方便起见，并且应解释为具有式(IV)和本文所述其他式的单元的聚合物可包含以下单元的随机分布：具有连接于该单元的乙醇醛部分的X'基团(或另外的取代基，例如包含马来酰亚胺末端的连接基)的单元，和具有连接于该单元的甘油部分的单个X'基团(或另外的取代基，例如包含马来酰亚胺末端的连接基)的单元，以及具有两个X'基团(或其他取代基，例如包含马来酰亚胺末端的连接基)的单元，其中一个连接至该单元的乙醇醛部分，另一个连接至该单元的甘油部分。
在一个实施方案中，适用于实施本发明的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇的分子量为约0.5至约300kDa。例如，可生物降解的生物相容性聚醚多元醇的分子量为约1至约300kDa(例如约1至约200kDa,约2至约300kDa,约2至约200kDa,约5至约100kDa,约10至约70kDa,约20至约50kDa,约20至约300kDa,约40至约150kDa,约50至约100kDa,约2至约40kDa,约6至约20kDa,或约8至约15kDa)。例如，用于本公开的聚合物支架或缀合物的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇是具有约2至约40kDa(例如约2-20kDa,3-15kDa,5-10kDa,6-8kDa,或约7–8kDa)的分子量的PHF。
在一个实施方案中，在与药物或PBRM缀合之前，对适于实施本发明的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇进行修饰。例如，该聚醚多元醇包含—C(＝O)-X-(CH2)v-C(＝O)—，其中X为CH2，O或NH，v为1到6的整数。下表A提供了适合与药物或PBRM或其衍生物缀合的改性聚醚多元醇的一些实例。
治疗剂
在某些实施方案中，适合于实施本发明的治疗剂为具有优选≤约5kDa，更优选≤约4kDa，更优选≤约3kDa，最优选≤约1.5kDa或≤约1kDa的分子量的小分子。
在某些实施方案中，治疗剂具有约小于1nM的IC50。
在另一实施方案中，治疗剂具有约大于1nM的IC50，例如，治疗剂具有约1至50nM的IC50。
一些具有大于约1nM的IC50的治疗剂(例如，“不太有效的药物”)不适于使用本领域公认的缀合技术与PBRM缀合。不希望受理论束缚，此类治疗剂的效力对于使用常规技术用于靶向PBRM-药物缀合物而言是不充分的，因为药物的足够拷贝(即，超过8)不能使用本领域公认的技术缀合，而不导致缀合物的减少的药代动力学和生理化学性质。然而这些不太有效的药物的足够高的载荷可以使用本文描述的缀合策略实现，从而导致高载荷的治疗剂，同时维持合意的药代动力学和生理化学性质。因此，本公开还涉及包括PBRM、PHF和至少8个治疗剂部分的PBRM-聚合物-药物缀合物，其中治疗剂具有大于约1nM的IC50。
在某些实施方案中，约0.3至约15％的单体包含治疗剂，更优选约2至约12％，甚至更优选约5至约10％的单体包含治疗剂。
在本公开中使用的小分子治疗剂(例如，能够连接至聚合物载体的抗增殖(细胞毒性和抑制细胞)剂)包括细胞毒性化合物(例如，广谱)、血管生成抑制剂、细胞周期进展抑制剂、PI3K/m-TOR/AKT通路抑制剂、MAPK信号传导通路抑制剂、激酶抑制剂、蛋白伴侣抑制剂、HDAC抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog信号传导通路抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。
广谱细胞毒素包括，但不限于DNA-结合、嵌入或烷基化药物、微管稳定剂和去稳定剂、铂化合物、拓扑异构酶I抑制剂和蛋白合成抑制剂。
示例性DNA-结合、嵌入或烷基化药物包括CC-1065及其类似物、蒽环类抗生素(阿霉素、表柔比星、伊达比星、柔红霉素、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682)、双萘二甲酰亚胺(bisnapththalimide)化合物，例如依利萘法德(LU79553)及其类似物、烷基化剂，例如卡奇霉素、放线菌素、丝裂霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000301
等等。示例性CC-1065类似物包括倍癌霉素SA、倍癌霉素A、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素D、DU-86、KW-2189、阿多来新、比折来新、卡折来新、裂环-阿多来新，和相关的类似物和前药形式，其实例描述于美国专利号5,475,092；5,595,499；5,846,545；6,534,660；6,586,618；6,756,397和7,049,316中。阿霉素及其类似物包括描述于美国专利号6,630,579中的那些。卡奇霉素包括，例如烯二炔类，例如埃斯波霉素，和描述于美国专利号5,714,586和5,739,116中的那些。倍癌霉素包括描述于美国专利号5,070,092；5,101,038；5,187,186；6,548,530；6,660,742；和7,553,816 B2；以及Li等人,Tet Letts.,50:2932–2935(2009)中的那些。
吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000311
(PBD)及其类似物包括描述于Denny,Exp.Opin.Ther.Patents.,10(4):459-474(2000)以及Antonow和Thurston,Chem Rev.,2815-2864(2010)中的那些。
示例性微管稳定剂和去稳定剂包括紫杉烷化合物，例如紫杉醇、多西他赛、替司他赛和卡巴兹它赛(carbazitaxel)；美坦生类化合物、奥瑞斯他汀及其类似物、长春花生物碱衍生物、埃坡霉素和念珠藻环肽。
示例性美坦生类化合物或美坦生类化合物类似物包括美登醇和美登醇类似物，美登素或DM-1和DM-4为描述于美国专利号5,208,020；5,416,064；6,333.410；6,441,163；6,716,821；RE39,151和7,276,497中的那些。在某些实施方案中，细胞毒性剂为美坦生类化合物，另一组抗微管蛋白剂(ImmunoGen,Inc.；还参见Chari等人,1992,Cancer Res.52:127-131)，美坦生类化合物或美坦生类化合物类似物。合适的美坦生类化合物的实例包括美登醇和美登醇类似物。合适的美坦生类化合物公开于美国专利号4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545中。
示例性奥瑞斯他汀包括奥瑞斯他汀E(也称为多拉司他汀-10的衍生物)、奥瑞斯他汀EB(AEB)、奥瑞斯他汀EFP(AEFP)、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)、奥瑞斯他汀F、奥瑞斯他汀F苯二胺(AFP)、奥瑞斯他汀FHPA和多拉司他汀。合适的奥瑞斯他汀还描述于美国公开号2003/0083263、2011/0020343和2011/0070248；PCT申请公开号WO 09/117531、WO 2005/081711、WO 04/010957；WO 02/088172和WO01/24763，以及美国专利号7,498,298；6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,124,431；6,034,065；5,780,588；5,767,237；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444和4,486,414中，其公开内容通过引用以其全部并入本文。
示例性长春花生物碱类包括长春新碱、长春碱、长春地辛和诺维本(长春瑞滨)。可以在本公开中使用的合适的长春花生物碱类还公开于美国公开号2002/0103136和2010/0305149，以及美国专利号7,303,749B1中，其公开内容通过引用以其全部并入本文。
示例性埃坡霉素化合物包括埃坡霉素A、B、C、D、E和F，及其衍生物。合适的埃坡霉素化合物及其衍生物描述于，例如，美国专利号6,956,036；6,989,450；6,121,029；6,117,659；6,096,757；6,043,372；5,969,145和5,886,026；以及WO 97/19086；WO 98/08849；WO98/22461；WO 98/25929；WO 98/38192；WO 99/01124；WO 99/02514；WO 99/03848；WO 99/07692；WO 99/27890和WO 99/28324中；其公开内容通过引用以其全部并入本文。
示例性念珠藻环肽化合物描述于美国专利号6,680,311和6,747,021中。
示例性铂化合物包括顺铂
Figure GDA0002428537640000321
卡铂
Figure GDA0002428537640000322
奥沙利铂
Figure GDA0002428537640000323
异丙铂、奥马铂和四铂。
可以选择另外的其它种类的化合物或具有这些或其它细胞毒性的作用模式的化合物，包括，例如丝裂霉素C、丝裂霉素A、柔红霉素、阿霉素、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、氨基蝶呤、博来霉素、1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-醇、吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000324
(PBD)聚酰胺及其二聚体。其它合适的细胞毒性剂包括，例如，嘌呤霉素、托泊替康、根霉素、棘霉素、风车子抑碱、纺锤菌素、雌莫司汀、念珠藻环肽、西马多丁、淅皮海绵内酯、艾榴素和米托蒽醌。
示例性拓扑异构酶I抑制剂包括喜树碱、喜树碱衍生物、喜树碱类似物和非天然喜树碱，例如，CPT-11(伊立替康)、SN-38、GI-147211C、托泊替康、9-氨基喜树碱、7-羟甲基喜树碱、7-氨甲基喜树碱、10-羟基喜树碱、(20S)-喜树碱、卢比替康、吉马替康、卡瑞尼特辛(karenitecin)、席拉替康(silatecan)、勒托替康、依沙替康、二氟替康、贝洛替康、勒托替康和S39625。可以在本公开中使用的其它喜树碱化合物包括在例如，J.Med.Chem.,29:2358-2363(1986)；J.Med.Chem.,23:554(1980)；J.Med.Chem.,30:1774(1987)中描述的那些。
血管生成抑制剂包括，但不限于MetAP2抑制剂、VEGF抑制剂、PIGF抑制剂、VGFR抑制剂、PDGFR抑制剂、MetAP2抑制剂。示例性VGFR和PDGFR抑制剂包括索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)和伐他拉尼。示例性MetAP2抑制剂包括烟曲霉醇(fumagillol)类似物，表示包括夫马洁林核结构的任何化合物，包括烟曲霉胺(fumagillamine)，其抑制MetAP-2将NH2-末端甲硫氨酸从蛋白中除去的能力，如于Rodeschini等人,J.Org.Chem.,69,357-373,2004和Liu等人,Science 282,1324-1327,1998中所述。“烟曲霉醇类似物”的非限制性实例公开于J.Org.Chem.,69,357,2004；J.Org.Chem.,70,6870,2005；欧洲专利申请0 354 787；J.Med.Chem.,49,5645,2006；Bioorg.Med.Chem.,11,5051,2003；Bioorg.Med.Chem.,14,91,2004；Tet.Lett.40,4797,1999；WO99/61432；美国专利号6,603,812；5,789,405；5,767,293；6,566,541和6,207,704中。
示例性细胞周期进展抑制剂包括CDK抑制剂，例如，BMS-387032和PD0332991；Rho-激酶抑制剂，例如GSK429286；检查点激酶抑制剂，例如，AZD7762；极光激酶抑制剂，例如，AZD1152、MLN8054和MLN8237；PLK抑制剂，例如，BI 2536,BI6727(伏拉塞替(Volasertib))、GSK461364、ON-01910(Estybon)；和KSP抑制剂，例如，SB 743921、SB 715992(伊匹尼塞)、MK-0731、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
示例性PI3K/m-TOR/AKT信号传导通路抑制剂包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、GSK-3抑制剂、ATM抑制剂、DNA-PK抑制剂和PDK-1抑制剂。
示例性PI3激酶抑制剂公开于美国专利号6,608,053中，并包括BEZ235、BGT226、BKM120、CAL101、CAL263、脱甲绿胶酶素、GDC-0941、GSK615、IC87114、LY294002、Palomid529、哌立福辛、PI-103、PF-04691502、PX-866、SAR245408、SAR245409、SF1126、渥曼青霉素、XL147和XL765。
示例性AKT抑制剂包括，但不限于AT7867。
示例性MAPK信号传导通路抑制剂包括MEK、Ras、JNK、B-Raf和p38 MAPK抑制剂。
示例性MEK抑制剂公开于美国专利号7,517,994中，并包括GDC-0973、GSK1120212、MSC1936369B、AS703026、RO5126766和RO4987655、PD0325901、AZD6244、AZD8330以及GDC-0973。
示例性B-raf抑制剂包括CDC-0879、PLX-4032和SB590885。
示例性B p38 MAPK抑制剂包括BIRB 796、LY2228820和SB 202190。
受体酪氨酸激酶(RTK)是细胞表面受体，其经常与信号传导通路有关，所述信号传导通路刺激癌细胞的不受控制的增殖和新血管生成。已经鉴定出许多RTK，其过度表达或具有突变而导致受体的组成性活化，包括但不限于VEGFR、EGFR、FGFR、PDGFR、EphR和RET受体家族受体。示例性的特异性RTK靶包括ErbB2、FLT-3、c-Kit和c-Met。
示例性ErbB2受体(EGFR家族)的抑制剂包括，但不限于AEE788(NVP-AEE788)、BIBW2992(阿法替尼)、拉帕替尼、厄洛替尼(得舒缓(Tarceva))和吉非替尼(易瑞沙(Iressa))。
示例性的靶向多于一个信号传导通路的RTK抑制剂(多靶标激酶抑制剂)包括AP24534(泊那替尼)，其靶向FGFR、FLT-3、VEGFR-PDGFR和Bcr-Abl受体；ABT-869(里尼凡尼(Linifanib))，其靶向FLT-3和VEGFR-PDGFR受体；AZD2171，其靶向VEGFR-PDGFR、Flt-1和VEGF受体；CHR-258(多韦替尼)，其靶向VEGFR-PDGFR、FGFR、Flt-3和c-Kit受体；舒尼替尼(Sutent)，其靶向VEGFR、PDGFR、KIT、FLT-3和CSF-IR；索拉非尼(Nexavar)和伐他拉尼，其靶向VEGFR、PDGFR以及在Raf/Mek/Erk通路中的细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶。
示例性蛋白伴侣抑制剂包括HSP90抑制剂。示例性HSP90抑制剂包括17AAG衍生物、BIIB021、BIIB028、SNX-5422、NVP-AUY-922和KW-2478。
示例性HDAC抑制剂包括贝林司他(Belinostat)(PXD101)、CUDC-101、佐西司他(Droxinostat)、ITF2357(奇维司他(Givinostat)、加维司他(Gavinostat))、JNJ-26481585、LAQ824(NVP-LAQ824、达西司他(Dacinostat))、LBH-589(帕比司他)、MC1568、MGCD0103(莫西司他(Mocetinostat))、MS-275(恩替司他(Entinostat))、PCI-24781、Pyroxamide(NSC 696085)、SB939、曲古抑菌素A和伏立诺他(SAHA)。
示例性PARP抑制剂包括依尼帕尼(iniparib)(BSI 201)、奥拉帕尼(olaparib)(AZD-2281),ABT-888(凡立帕尼(Veliparib))、AG014699、CEP 9722、MK 4827、KU-0059436(AZD2281)、LT-673、3-氨基苯甲酰胺、A-966492和AZD2461。
示例性Wnt/Hedgehog信号传导通路抑制剂包括维莫德吉(vismodegib)(RG3616/GDC-0449)、环巴胺(11-去氧芥芬胺)(Hedgehog通路抑制剂)和XAV-939(Wnt通路抑制剂)。
示例性RNA聚合酶抑制剂包括鹅膏蕈毒素。示例性鹅膏毒素包括α-鹅膏毒环肽、β-鹅膏毒环肽、γ-鹅膏毒环肽、ε-鹅膏毒环肽、鹅膏无毒环肽、鹅膏毒肽羧酸(amanullicacid)、鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、鹅膏素和鹅膏无毒环肽原(proamanullin)。
示例性的蛋白合成抑制剂包括单端孢霉烯化合物。
在一个实施方案中，本公开的所述药物是拓扑异构酶抑制剂(例如，非天然喜树碱化合物)、长春花生物碱、激酶抑制剂(例如，PI3激酶抑制剂(GDC-0941和PI-103))、MEK抑制剂、KSP抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、蛋白合成抑制剂、PARP抑制剂、多西他赛、紫杉醇、阿霉素、倍癌霉素、奥瑞斯他汀、多拉司他汀、卡奇霉素、托泊替康、SN38、喜树碱、依沙替康、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、CC1065、依利萘法德、单端孢霉烯、吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000361
美坦生类化合物、DNA-结合药物或铂化合物，及其类似物。在特定的实施方案中，所述药物为SN-38的衍生物、喜树碱、托泊替康、依沙替康、卡奇霉素、依沙替康、奈莫柔比星、PNU-159682、蒽环类抗生素、美坦生类化合物、紫杉烷、单端孢霉烯、CC1065、依利萘法德、长春地辛、长春碱、PI-103、AZD8330、多拉司他汀、奥瑞斯他汀E、奥瑞斯他汀F、倍癌霉素化合物、伊匹尼塞、吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000362
ARRY-520及其立体异构体、电子等排体和类似物。
在另一实施方案中，本公开中使用的药物是两种或更多种药物的组合，例如，PI3激酶抑制剂和MEK抑制剂；广谱细胞毒性化合物和铂化合物；PARP抑制剂和铂化合物；广谱细胞毒性化合物和PARP抑制剂的组合。
在又一实施方案中，本公开中使用的药物是奥瑞斯他汀F-羟丙基酰胺-L-丙氨酸。
在一个实施方案中，长春花生物碱是式(V)的化合物：
Figure GDA0002428537640000371
其中：
R14是氢、-C(O)-C1-3烷基或-C(O)-氯取代的C1-3烷基；
R15是氢、-CH3或–CHO；
当独立考虑R17和R18时，R18是氢，且R16或R17的任一个是乙基，而另一个是羟基；
当R17和R18与它们连接的碳在一起以形成环氧乙烷环时，R16是乙基；
R19是氢、OH、氨基、烷基氨基或-[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NH2、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、–COOH或–COO-C1-6烷基；
X2为天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的杂环部分；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；和
f是1至12的整数。
长春花生物碱的其它实例描述于US8524214B2和US 2002/0103136中。
在一个实施方案中，式(V)的长春花生物碱是式(VI)的化合物：
Figure GDA0002428537640000381
其中：
R40是氢、-OH、-NH2或下列结构中的任何种：
Figure GDA0002428537640000382
Figure GDA0002428537640000391
其中：
a是1至6的整数；
g是2至6的整数；且
c是0至3的整数。
在一个实施方案中，在式(VI)中，R40是
Figure GDA0002428537640000401
Figure GDA0002428537640000402
在另一实施方案中，R40是
Figure GDA0002428537640000403
在另一实施方案中，式(VI)的化合物是式(VIa)、(VIb)、(VIc)或(VId)的化合物：
Figure GDA0002428537640000404
Figure GDA0002428537640000411
在另一实施方案中，拓扑异构酶抑制剂为式(VII)的喜树碱化合物：
Figure GDA0002428537640000421
其中：
R24是-H、-Cl、-F、-OH或烷基；或R24和R25可在一起以形成任选取代的5-或6-元环；
R25是-H、-F、-OH、-CH3、-CH＝N-O-叔丁基、-CH2CH2Si(CH3)3、-Si((CH3)2)-叔丁基、-O-C(O)-R29；
R29是–NH2、-R28-C1-6烷基-R22、5至12元杂环烷基、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22或-R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R26是–H、-CH2-N(CH3)2、NH2或NO2；
R27是-H、乙基、N-甲基哌啶、环烷基、-CH2OH、-CH2CH2NHCH(CH3)2或-N-4-甲基环己胺；
R79是–H或–C(O)-R28-[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NH2、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
每个R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
或者R26和R27当与它们连接的两个碳原子以及连接该两个碳原子的第三个碳原子在一起时，形成任选取代的6元环；
R28为不存在、-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；
f是1至12的整数；
u是0或1的整数；
w是0或1的整数；且
前提是式(VII)的化合物必须含有R29和R79中的至少一个。
在一个实施方案中，式(VII)的喜树碱化合物是式(VIII)、(VIIIa)或(VIIIb)，或式(XXV)或(XXVa)的化合物：
Figure GDA0002428537640000431
Figure GDA0002428537640000441
其中：R30是-NH2、-R28-[C(R20R21)]a-R22、-R28-C1-6烷基-R22、5至12元杂环烷基、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22或-R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；
R28为不存在、-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NH2、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2为天然或非天然氨基酸的侧链；
R77为氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；且
f是1至12的整数。
在一些实施方案中，R30是下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000451
其中：
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；且
g是2至6的整数。
在一个实施方案中，在式(VII)中，R30是：
Figure GDA0002428537640000452
在另一实施方案中，式(VII)的化合物是式(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)或(VIIf)的化合物：
Figure GDA0002428537640000461
Figure GDA0002428537640000471
在另一实施方案中，PI3激酶抑制剂为式(IX)的化合物：
Figure GDA0002428537640000481
其中
R47为氨基、-R9-[C(R20R21)]a-R10、-R9-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R10、5至12元杂环烷基或-R9-C6-10芳基；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R10是–OH、-NHR83、-N-(R83)R11、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)、–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77或–R82-C(O)-[C(R20R21)]a-R82-R83；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2为天然或非天然氨基酸的侧链；
R77为氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R9为不存在、N-(R83)或氧；
R83是氢或CH3；
R11是：
Figure GDA0002428537640000482
各R12独立地为氢、氯、-CH3或–OCH3；
R13是氢或–C(O)-(CH2)d-(O-CH2-CH2)f-NH2；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
X4是赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或甘氨酸的侧链；
X5是苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或色氨酸的侧链；
X6和X7各自独立地为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸或脯氨酸的侧链；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；
f是1至12的整数；且
各u独立地为0或1的整数；
或R11是–Yu-Wq-R88，
其中：
Y是下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000491
在其每一个中，Y的末端NR83基团邻近于R88；
R83是氢或CH3；
各W是氨基酸单元；
各R12’独立地为卤素、-C1-8烷基、-O-C1-8烷基、硝基或氰基；
R88是氢或-C(O)-(CH2)ff–(NH-C(O))aa-Ej-(CH2)bb-R85；
R85是NH2或OH；
E是-CH2-或-CH2CH2O-；
u是0或1的整数；
q是0至12的整数；
aa是0或1的整数；
bb是0或2的整数；
ff是0至10的整数；
h是0至4的整数；
j是0至12的整数；且
当E是-CH2-时，bb是0且j是0至10的整数；且当E是-CH2CH2-O-时，bb是2且j是1至12的整数；
或R11是：
Figure GDA0002428537640000501
其中：
R83是氢或CH3；
R84是C1-6烷基或C6-10芳基；
各R12’独立地为卤素、-C1-8烷基、-O-C1-8烷基、硝基或氰基；
h是0至4的整数；且
u是0或1的整数。
在一些实施方案中，R11是：
Figure GDA0002428537640000502
其中：
各R12’独立地为氯、-CH3或–OCH3；
R88是氢或–C(O)-(CH2)ff-(CH2-CH2O)j-CH2-CH2-NH2；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
X4是赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、丙氨酸或甘氨酸的侧链；
X5是苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或色氨酸的侧链；
X6和X7各自独立地是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸或脯氨酸的侧链；
ff是1至3的整数；
j是1至12的整数；
h是0至4的整数；且
各u独立地为0或1的整数。
在一些实施方案中，
Figure GDA0002428537640000511
是瓜氨酸-缬氨酸；赖氨酸-苯丙氨酸；瓜氨酸-苯丙氨酸；瓜氨酸-亮氨酸；瓜氨酸-缬氨酸-甘氨酸-甘氨酸；甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸；缬氨酸；脯氨酸；亮氨酸或异亮氨酸。
在另一实施方案中，R11是下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000512
Figure GDA0002428537640000521
Figure GDA0002428537640000531
在一些实施方案中，R47是下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000532
Figure GDA0002428537640000541
Figure GDA0002428537640000551
其中：
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；且
g是2至6的整数。
在另一实施方案中，奥瑞斯他汀为式(X)的化合物：
Figure GDA0002428537640000552
其中：
R31和R32各自独立地为氢或C1-8烷基且R31和R32中最多一个是氢；
R33是氢、C1-8烷基、C3-8碳环、C6-10芳基、C1-8烷基-C6-10芳基、X1-(C3-8碳环)、C3-8杂环或X1-(C3-8杂环)；
R34是氢、C1-8烷基、C3-8碳环、C6-10芳基、X1-C6-10芳基、X1-(C3-8碳环)、C3-8杂环或X1-(C3-8杂环)；
R35是氢或甲基；
或R34和R35与它们连接的碳原子一起形成具有式-(CR55R41)b-的碳环，其中R55和R41各自独立地为氢或C1-8烷基且b是3至7的整数；
R36是氢或C1-8烷基；
R37是氢、C1-8烷基、C3-8碳环、C6-10芳基、-X1-C6-10芳基、-X1-(C3-8碳环),C3-8杂环或-X1-(C3-8杂环)；
各R38独立地为氢、OH、C1-8烷基、C3-8碳环或O-(C1-8烷基)；
R53是：
Figure GDA0002428537640000561
或R54；
R39是H、C1-8烷基、C6-10芳基、-X1-C6-10芳基、C3-8碳环、C3-8杂环、-X1-C3-8杂环、-C1-8亚烷基-NH2或(CH2)2SCH3；
各X1独立地为C1-10亚烷基或C3-10亚环烷基；
R44是氢或C1-8烷基；
R45是X3-R42或NH-R19；
X3是O或S；
R19是氢、OH、氨基、烷基氨基或-[C(R20R21)]a-R22；
R42是氨基、C1-6烷基氨基或-[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R54是-C(R56)2–C(R56)2-C6-10芳基、-C(R56)2–C(R56)2-C3-8杂环或-C(R56)2–C(R56)2-C3-8碳环；
R56独立地选自H、OH,C1-8烷基、C3-8碳环、-O-C1-8烷基、-O-C(O)-R29和-O-R23-O-C1-6烷基-NH2；
R29是氨基、5至12元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22、-[C(R20R21)]a-R22或-R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R28为不存在、-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；且
f是1至12的整数。
在一些实施方案中，在式(X)的奥瑞斯他汀化合物中：
R39是苄基或
Figure GDA0002428537640000571
且
R44是氢。
在另一实施方案中，奥瑞斯他汀为式(Xa)的化合物：
Figure GDA0002428537640000572
(Xa)
其中：
R33至R38，以及R44如本文所定义，
R31和R32之一是氢或C1-8烷基，而另一个是：
Figure GDA0002428537640000581
其中：
R83是氢或CH3；
R84是C1-6烷基或C6-10芳基；
各R12’独立地为卤素、-C1-8烷基、-O-C1-8烷基、硝基或氰基；
h是0至4的整数；且
u是0或1的整数；
R53是：
Figure GDA0002428537640000582
或R54
R39是H、C1-8烷基、C6-10芳基、-X1-C6-10芳基、C3-8碳环、C3-8杂环、-X1-C3-8杂环、-C1-8亚烷基-NH2或(CH2)2SCH3，
各X1独立地为C1-10亚烷基或C3-10亚环烷基；
R45是X3-R42或NH-R19；
X3是O或S；
R19是氢、OH、氨基、烷基氨基或-[C(R20R21)]a-R22；
R42是H、氨基、C1-6烷基氨基或-[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R54是-C(R56)2–C(R56)2-C6-10芳基、-C(R56)2–C(R56)2-C3-8杂环或-C(R56)2–C(R56)2-C3-8碳环；
R56独立地选自H、OH、C1-8烷基、C3-8碳环、-O-C1-8烷基、-O-C(O)-R29和-O-R23-O-C1-6烷基-NH2；
R29是氨基、5至12元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22、-[C(R20R21)]a-R22或-R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R28为不存在、-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；和
f是1至12的整数。
在一个实施方案中，式(Xa)的奥瑞斯他汀化合物为式(XIa)或式(XIb)的化合物：
Figure GDA0002428537640000591
Figure GDA0002428537640000601
其中：
R92是：
Figure GDA0002428537640000602
且
R83是氢或CH3。
在一个实施方案中，式(X)的奥瑞斯他汀为式(XI)、式(XII)或式(XIII)的化合物：
其中式(XI)的化合物是：
Figure GDA0002428537640000603
其中R42是–CH3或下列结构的任何一个：
Figure GDA0002428537640000604
Figure GDA0002428537640000611
其中：
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；且
g是2至6的整数；
其中式(XII)的化合物是：
Figure GDA0002428537640000612
其中R40是氢、-OH、-NH2或下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000613
Figure GDA0002428537640000621
其中：
a是1至6的整数；
g是2至6的整数；且
c是0至3的整数；
其中式(XIII)的化合物是：
Figure GDA0002428537640000631
其中R29是氨基、5至12元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22、-R28-[C(R20R21)]a-R22或-R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R28为不存在、-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；且
f是1至12的整数。
在一个实施方案中，在式(XII)中，R40是
Figure GDA0002428537640000641
Figure GDA0002428537640000642
在另一实施方案中，式(XII)的化合物为式(XIIb)或(XIIc)的化合物：
Figure GDA0002428537640000643
在一个实施方案中，在式(XIII)的化合物中，R29是-NH2、5元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22或-R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R28为不存在、-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(O＝CH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；且
f是1至12的整数。
在又一实施方案中，R29是下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000651
Figure GDA0002428537640000661
Figure GDA0002428537640000671
其中：
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；且
g是2至6的整数。
在一个实施方案中，MEK抑制剂为式(XIV)的化合物：
Figure GDA0002428537640000672
其中R43是H或-R46–R47；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NH2、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
R46是–C(O)-、-C(O)–O-、-C(O)–NH-或不存在；
R47如本文所定义；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；且
f是1至12的整数。
MEK抑制剂的其它实例公开于US7,517,994B2中。
在一些实施方案中，R43是–C(O)-(CH2)a-NH2或–C(O)-C(H)(CH3)-(CH2)c-NH2；其中a是1至6的整数；且c是0至3的整数。
在另一实施方案中，倍癌霉素化合物为式(XV)的化合物：
Figure GDA0002428537640000691
其中：
R47如本文所定义；
R48是氢、-COOC1-6烷基、-COOH、-NH2或-CH3；
R49是Cl、Br或-OH；
R50是氢、-OCH3，
Figure GDA0002428537640000692
R51和R52各自独立地为氢或-OCH3；且
环AA是苯环或吡咯环。
倍癌霉素化合物的其它实例公开于US7,553,816中。
在一个实施方案中，式(XV)的倍癌霉素化合物为式(XVI)、(XVII)、(XVIII)或(XIX)的化合物：
Figure GDA0002428537640000693
Figure GDA0002428537640000701
其中：
R49是Cl、Br或-OH；且
R47如本文所定义。
在另一实施方案中，倍癌霉素化合物是式(XX)：US5101038；或(XXI)的倍癌霉素SA化合物：
Figure GDA0002428537640000711
其中：
R42是C1-6烷基氨基或–[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化C6-10芳基、多羟基化C6-10芳基、5至12元杂环、C3-8环烷基、羟基化C3-8环烷基、多羟基化C3-8环烷基或者天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NH2、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
各R23独立地为氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮的环状化合物；
R82是-NH、-N(C1-6烷基)或氧；
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；
d是1至3的整数；且
f是1至12的整数。
在一些实施方案中，R42是下列结构中的任何一个：
Figure GDA0002428537640000721
Figure GDA0002428537640000731
其中：
a是1至6的整数；
g是2至6的整数；且
c是0至3的整数。
在另一实施方案中，KSP抑制剂化合物为式(XXVI)的化合物：
Figure GDA0002428537640000732
其中R30如本文所定义。
在一些实施方案中，R30是：
Figure GDA0002428537640000733
Figure GDA0002428537640000741
其中：
a是1至6的整数；
c是0至3的整数；且
g是2至6的整数。
在另一实施方案中，倍癌霉素化合物是倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、CC-1065、阿多来新、比折来新或卡折来新。
在另一实施方案中，KSP抑制剂化合物为式(XXVII)、(XXVIII)或(XXIX)的化合物：
Figure GDA0002428537640000742
其中：
R11如本文所定义。
治疗剂领域的技术人员将容易理解，本文描述的每一种治疗剂都能够以这样一种方式被修饰，即所得的化合物仍保持原始化合物的特异性和/或活性。技术人员还将理解，这些化合物中的许多种可用于代替本文描述的治疗剂。因此，本公开的治疗剂包括本文描述的化合物的类似物和衍生物。
下表A提供适合于缀合以形成本公开的聚合物-药物支架或聚合物-药物-蛋白缀合物的治疗剂及其衍生物的更多实例。还提供了某些化合物的光谱数据(表中的ND指“未检测”)。当药物在体外或在体内从缀合物中释放出来时，这些实例也可以是该药物的活性形式。
表A
Figure GDA0002428537640000751
Figure GDA0002428537640000752
Figure GDA0002428537640000753
Figure GDA0002428537640000754
Figure GDA0002428537640000761
Figure GDA0002428537640000762
Figure GDA0002428537640000763
Figure GDA0002428537640000764
Figure GDA0002428537640000765
Figure GDA0002428537640000771
Figure GDA0002428537640000781
Figure GDA0002428537640000782
Figure GDA0002428537640000783
Figure GDA0002428537640000784
Figure GDA0002428537640000791
Figure GDA0002428537640000792
Figure GDA0002428537640000801
Figure GDA0002428537640000802
Figure GDA0002428537640000803
Figure GDA0002428537640000811
基于蛋白的识别分子(PBRM)
基于蛋白的识别分子将药物-聚合物载体缀合物导向至特定的组织、细胞或细胞内的位置。基于蛋白的识别分子可以指导培养物中的或完整的有机体中的或二者中的改性聚合物。在每一种情况下，基于蛋白的识别分子具有配体，该配体存在于靶细胞的细胞表面上，并且以有效的特异性、亲和性和亲和力与该配体结合。在一些实施方案中，基于蛋白的识别分子将改性聚合物靶向至除了肝脏以外的组织。在其它实施方案中，基于蛋白的识别分子将改性聚合物靶向至特定的组织例如肝脏、肾脏、肺或胰脏。基于蛋白的识别分子可以将改性聚合物靶向至靶细胞(例如癌细胞)，例如在细胞(例如癌细胞)上表达的受体、基质组织或与癌症有关的蛋白(例如肿瘤抗原)。或者，可以靶向包含肿瘤维管结构的细胞。基于蛋白的识别分子可以将聚合物导向至特定类型的细胞，例如特定靶向至肝脏中的肝细胞而非枯氏细胞。在其它情况下，基于蛋白的识别分子可以将聚合物导向至网状内皮或淋巴系统的细胞，或导向至专业的吞噬细胞，例如巨噬细胞或嗜酸性粒细胞。(在此类情况下，聚合物本身也可以是有效的递送系统，无需特定的靶向)。
在还有其它的实施方案中，基于蛋白的识别分子可以将改性聚合物靶向至细胞内的位置，例如细胞核、细胞质或内体。在特定的实施方案中，基于蛋白的识别分子可以增强与受体的细胞结合，或细胞质至细胞核的运输，以及细胞核进入内体或其它细胞内囊泡或从内体或其它细胞内囊泡中释放。
在特定的实施方案中，基于蛋白的识别分子包括抗体、蛋白和肽或肽模拟物。
在优选的实施方案中，基于蛋白的识别分子包含巯基，且基于蛋白的识别分子通过经由巯基和聚合物的官能团形成共价键而与聚合物-药物缀合物缀合。
对于细胞表面标志物具有特异性的示例性的抗体或衍生自Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段的抗体包括，但不限于，5T4、AOC3、ALK、AXL、C242、CA-125、CCL11、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD5、CD15、CA15-3、CD18、CD19、CA19-9、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD30、CD31、CD33、CD37、CD38、CD40、CD41、CD44、CD44v6、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD74、CD79-B、CD80、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、聚集因子、CTLA-4、CXCR2、EGFR(HER1)、ErbB2、ErbB3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、EPHB4、FGFR(即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)、FLT3、叶酸受体、FAP、GD2、GD3、GPNMB、HGF、HER2、HER3、HMI.24、ICAM、ICOS-L、IGF-1受体、VEGFR1、EphA2、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、c-KIT、c-MET、ACE、APP、肾上腺素能受体-β2、Claudine3、间皮素、MUC1、NaPi2b、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、RON、ROR1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-B4、IL-2受体、IL-4受体、IL-13受体、整联蛋白(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整联蛋白)、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE、IGF-1受体、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-22、IL-4、IL-5、IL-6、干扰素受体、ITGB2(CD18)、LFA-1(CD11a)、L-选择蛋白(CD62L)、粘蛋白、MUC1、肌肉生长抑制素、NCA-90、NGF、PDGFRα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病毒、RANKL、呼吸道合孢病毒、恒河猴因子、SLAMF7、鞘氨醇-1-磷酸、TAG-72、T-细胞受体、腱生蛋白C、TGF-1、TGF-□2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR2、波形蛋白等等。
在一个实施方案中，对于细胞表面标志物具有特异性的抗体或衍生自Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段的抗体包括CA-125、C242、CD3、CD19、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD138、CD141、CD326、CEA、CTLA-4、EGFR(HER1)、ErbB2、ErbB3、FAP、叶酸受体、IGF-1受体、GD3、GPNMB、HGF、HER2、VEGF-A、VEGFR2、VEGFR1、EphA2、EpCAM、5T4、TAG-72、腱生蛋白C、TRPV1、CFTR、gpNMB、CA9、Cripto、ACE、APP、PDGFRα、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、肾上腺素能受体-β2、Claudine 3、粘蛋白、MUC1、间皮素、IL-2受体、IL-4受体、IL-13受体和整联蛋白(包括αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α5β1、α6β4整联蛋白)、腱生蛋白C、TRAIL-R2和波形蛋白。
示例性抗体包括3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(REOPRO)、阿达木单抗(HUMIRA)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、阿拉昔单抗(alacizumab)、ALD518、阿仑单抗(CAMPATH)、阿妥莫单抗、阿马昔单抗、麻安莫单抗、安芦珠单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗、阿西莫单抗(CEA-SCAN)、阿塞珠单抗、阿立珠单抗(atlizumab)(托西珠单抗(tocilizumab)、安挺乐(Actemra)、RoActemra)、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗(Simulect)、巴土昔单抗、贝妥莫单抗(LYMPHOSCAN)、贝利木单抗(BENLYSTA)、班拉珠单抗(benralizumab)、柏替莫单抗、贝索单抗(SCINITIMUN)、贝伐单抗(AVASTIN)、比西单抗(FIBRISCINT)、比伐单抗、柏纳妥莫单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、布里金单抗(briakinumab)、坎金单抗(canakinumab)(ILARIS)、坎妥珠单体(cantuzumab)、卡罗单抗、卡妥索单抗(REMOVAB)、CC49、西利珠单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗(ERBITUX)、西他土珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克立昔单抗、克利凡珠单抗(clivatuzumab)、可纳木单抗(conatumumab)、CR6261、达西珠单抗(dacetuzumab)、达克珠单抗(ZENAPAX)、达雷木单抗(daratumumab)、地舒单抗(PROLIA)、地莫单抗、朵利莫单抗(dorlimomab)、朵利珠单抗、依美昔单抗、依库珠单抗(SOLIRIS)、埃巴单抗、依决洛单抗(PANOREX)、依法珠单抗(RAPTIVA)、依夫单抗(MYCOGRAB)、依洛珠单抗(elotuzumab)、艾西莫单抗、恩莫单抗、依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、厄妥韦单抗(ertumaxomab)(REXOMUN)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)(ABEGRIN)、艾韦单抗、法索单抗(NEUTROSPEC)、法拉莫单抗、法乐特珠单抗(farletuzumab)、非韦珠单抗、非扎奴单抗(fezakinumab)、斐济木单抗(figitumumab)、芳妥珠单抗(HuZAF)、夫瑞韦如单抗(foravirumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗(galiximab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、吉妥珠单抗、吉伦昔单抗(girentuximab)、格雷木单抗(glembatumumab)、戈利木单抗(SIMPONI)、戈利昔单抗、艾巴珠单抗(ibalizumab)、替伊莫单抗、伊戈伏单抗(INDIMACIS-125)、英西单抗(MYOSCINT)、英夫利昔单抗(REMICADE)、英妥木单抗(intetumumab)、伊诺莫单抗、伊珠单抗、伊匹木单抗、伊妥木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗(CEA-CIDE)、拉贝布瑞奇珠单抗(lebrikizumab)、来马索单抗(lemalesomab)、乐地单抗、来沙木单抗、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗、马帕木单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗(BOSATRIA)、美替木单抗、米拉土珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、莫他珠单抗(NUMAX)、莫罗单抗-CD3(ORTHOCLONEOKT3)、那可单抗(nacolomab)、那莫单抗(naptumomab)、那他珠单抗(TYSABRI)、奈巴库单抗、奈西木单抗(necitumumab)、奈瑞莫单抗、尼妥珠单抗(THERACIM)、诺莫单抗、奥瑞珠单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗(ARZERRA)、奥拉木单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(XOLAIR)、翁特珠单抗(ontecizumab)、奥普珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(OVAREX)、奥特希珠单抗(otelixizumab)、帕昔单抗、帕利珠单抗(SYNAGIS)、帕尼单抗(VECTIBIX)、帕诺库单抗(panobacumab)、帕考珠单抗、沛土莫单抗(pemtumomab)(THERAGYN)、培妥珠单抗(OMNITARG)、培克珠单抗、平妥单抗(pintumomab)、普立昔单抗、普立木单抗、PRO140、雷韦单抗(rafivirumab)、雷莫芦单抗、雷珠单抗(LUCENTIS)、雷昔库单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(RITUXAN)、若巴木单抗(robatumumab)、罗利珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(LEUKARREST)、鲁利单抗(ANTOVA)、沙妥莫单抗喷地肽、司韦单抗、西罗珠单抗、西法木单抗(sifalimumab)、丝妥昔单抗(siltuximab)、西利珠单抗、索岚珠单抗(solanezumab)、索西珠单抗(sonepcizumab)、松妥珠单抗、司他莫单抗、硫索单抗(LEUKOSCAN)、替拉珠单抗(AFP-CIDE)、替塞坦、他度珠单抗、他利珠单抗、他尼珠单抗(tanezumab)、帕他普莫单抗(taplitumomabpaptox)、替非珠单抗(AUREXIS)、替莫单抗、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗、替利珠单抗(teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(tremelimumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、TNX-650、托西珠单抗(阿立珠单抗、安挺乐(ACTEMRA))、托利珠单抗、托西莫单抗(BEXXAR)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、翠每莫单抗(tremelimumab)、土可珠单抗(tucotuzumab)、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗(ustekinumab)(STELERA)、伐利昔单抗、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西珠单抗(visilizumab)(NUVION)、伏洛昔单抗(HUMASPECT)、伏妥莫单抗、扎芦木单抗(HuMEX-EGFr)、扎木单抗(HuMAX-CD4)、齐拉木单抗(ziralimumab)和佐莫单抗。
在一些实施方案中，将抗体导向至以下细胞表面标志物：5T4、CA-125、CEA、CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD51、CTLA-4、EpCAM、HER2、EGFR(HER1)、FAP、叶酸受体、HGF、整联蛋白αvβ3、整联蛋白α5β1、IGF-1受体、GD3、GPNMB、粘蛋白、MUC1、磷脂酰丝氨酸、前列腺癌细胞、PDGFRα、TAG-72、腱生蛋白C、TRAIL-R2、VEGF-A和VEGFR2。在该实施方案中，抗体是阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿拉昔单抗、阿妥莫单抗、麻安莫单抗、阿西莫单抗、巴土昔单抗、贝伐单抗(AVASTIN)、比伐单抗、柏纳妥莫单抗、本妥昔单抗、坎妥珠单体、卡妥索单抗、卡罗单抗、西妥昔单抗、西他土珠单抗、克利凡珠单抗、可纳木单抗、达西珠单抗、依决洛单抗、依帕珠单抗、厄妥韦单抗、伊瑞西珠单抗、法乐特珠单抗、斐济木单抗、吉妥珠单抗、格雷木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英妥木单抗、伊珠单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、马妥珠单抗、米妥莫单抗、伊那莫单抗(naptumomab estafenatox)、奈西木单抗、奥普珠单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、沛土莫单抗、培妥珠单抗、普立木单抗、利妥昔单抗(RITUXAN)、利妥木单抗、若巴木单抗、沙妥莫单抗、西罗珠单抗、他普莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗、替妥莫单抗、替西木单抗(翠每莫单抗)、替加珠单抗、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、托西莫单抗、翠每莫单抗、土可珠单抗西莫白介素(tucotuzumabcelmoleukin)、伏洛昔单抗和扎芦木单抗。
在特定的实施方案中，就HER2而言，导向至细胞表面标志物的抗体是培妥珠单抗或曲妥珠单抗，而就EGFR(HER1)而言，抗体是西妥昔单抗或帕尼单抗；并且就CD20而言，抗体是利妥昔单抗，并且就VEGF-A而言是贝伐单抗，并且就CD-22而言，抗体是依帕珠单抗或维妥珠单抗，并且就CEA而言，抗体是拉贝珠单抗。
示例性肽或肽模拟物包括整联蛋白靶向肽(RGD肽)、LHRH受体靶向肽、ErbB2(HER2)受体靶向肽、前列腺特异性膜结合抗原(PSMA)靶向肽、脂蛋白受体LRP1靶向肽、ApoE蛋白衍生的肽、ApoA蛋白肽、生长激素抑制素受体靶向肽、蝎氯毒素衍生的肽以及蛙皮素。
在特定的实施方案中，肽或肽模拟物是LHRH受体靶向肽和ErbB2(HER2)受体靶向肽。
示例性蛋白包括胰岛素、转铁蛋白、纤维蛋白原-γ片段、血小板反应蛋白、紧密连接蛋白、载脂蛋白E、Affibody分子，例如ABY-025、锚蛋白重复蛋白、锚蛋白样重复蛋白和合成肽。
在一些实施方案中，蛋白-聚合物-药物缀合物(例如PBRM-聚合物-药物缀合物)包含广谱细胞毒素与细胞表面标志物的组合，就HER2而言，例如培妥珠单抗或曲妥珠单抗；对于EGFR而言，为例如西妥昔单抗和帕尼单抗；就CEA而言，为例如拉贝珠单抗；就CD20而言，为例如利妥昔单抗；就VEGF-A而言，为例如贝伐单抗；或就CD-22而言，为例如依帕珠单抗或维妥珠单抗。
在其它实施方案中，在本公开中使用的蛋白-药物-聚合物缀合物或蛋白-聚合物缀合物(例如PBRM-聚合物-药物缀合物)包括两种或更多种基于蛋白的识别分子的组合，例如，导向至肿瘤细胞上的EGF受体(EGFR)和T细胞上的CD3和CD28的双特异性抗体的组合；抗体或衍生自Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段的抗体与肽或肽模拟物的组合；抗体或衍生自Fab、Fab2、scFv或骆驼抗体重链片段的抗体与蛋白的组合；两种双特异性抗体例如CD3x CD19加CD28 x CD22双特异性抗体的组合。
在其它实施方案中，在本公开中使用的蛋白-药物-聚合物缀合物或蛋白-聚合物缀合物(例如PBRM-聚合物-药物缀合物)包含基于蛋白的识别分子，其为对抗抗原的抗体，例如，曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、贝伐单抗、依帕珠单抗、维妥珠单抗、拉贝珠单抗、B7-H4、B7-H3、CA125、CD33、CXCR2、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、HER2、NaPi2b、c-Met、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PD-L1、c-Kit、MUC1和5T4。
可以例如根据所公开的技术和方法，将本文所述的这些靶向配体、连接基和药物或前药片段组装成本公开的治疗药物和靶向缀合物。以下通过非限制性实例描述了本公开的治疗和靶向缀合物，以及产生它们的方法。
缀合物或聚合物支架
本公开的缀合物包括一次或多次出现的D，其中D是治疗剂，例如药物，其中一次或多次出现的D可以相同或不同。
在某些其他实施方案中，一次或多次出现的PBRM连接至聚合物载体，其中一次或多次出现的PBRM可以相同或不同。在某些其他实施方案中，包含一次或多次出现的D的一种或多种聚合物载体连接到PBRM(例如，抗体)。
如上更一般的讨论，在某些实施方案中，每种聚合物载体独立地具有约0.1％至约25％的包含D的单体，更优选地约0.5％至约20％，更优选地约1％至约15％，甚至更优选约2％至约10％。在一些实施方案中，聚合物载体是PHF，其分子量为约2kDa至约40kDa，并且具有约0.3％至约15％的包含奥瑞斯他汀F的单体，更优选约2％至12％，更优选约5％至10％。
在某些实施方案中，当D是在广泛的细胞系中抗增殖活性的IC50＜10pM的药物时，聚合物载体是PHF，其分子量为约2kDa至约40kDa，并具有约0.1％至约25％的包含D的单体，更优选约2％至10％，更优选约2％至5％。
在某些实施方案中，可以使用本公开的方法合成的支架具有式(Id)：
Figure GDA0002428537640000891
其中：
每次出现的D独立地是分子量≤5kDa的治疗剂，且D和羰基之间的
Figure GDA0002428537640000892
表示D直接或间接与羰基相连，
m1是1至约140的整数，并且
m7是1至约40的整数，其中m1和m7之和是m6(即2至约180)。
在一个实施方案中，D是a)奥瑞斯他汀化合物；(b)卡奇霉素化合物；(c)倍癌霉素化合物；(d)拓扑异构酶抑制剂，(e)吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000901
化合物；(f)长春花化合物；(g)蛋白合成抑制剂；(h)RNA聚合酶抑制剂；(i)微管蛋白结合化合物；或其类似物。
在某些实施方案中，D是(a)奥瑞斯他汀化合物；(b)卡奇霉素化合物；(c)倍癌霉素化合物；(d)喜树碱化合物；(e)吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000902
化合物；(f)长春花化合物；或其类似物。
在一些实施方案中，奥瑞斯他汀化合物是奥瑞斯他汀、多拉司他汀、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)、奥瑞斯他汀F、AF HPA、苯二胺(AFP)。
在一些实施方案中，倍癌霉素或其类似物是倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、CC-1065、阿多来新、比折来新，或卡折来新。
在一些实施方案中，喜树碱化合物是喜树碱、CPT-11(伊立替康)、SN-38或托泊替康。
在一些实施方案中，吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000906
化合物为吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000903
单体、对称的吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000905
二聚体或不对称的吡咯并苯并二氮杂
Figure GDA0002428537640000904
二聚体。
式(Id)的聚合物-药物支架可用于与具有以下分子量的PBRM缀合：约40kDa或更大(例如，60kDa或更大、80kDa或更大、100kDa或更大、120kDa或更大、140kDa或更大、160kDa或更大、180kDa或更大、或200kDa或更大，或约40-200kDa、40-180kDa、40-140kDa、60-200kDa、60-180kDa、60-140kDa、80-200kDa、80-180kDa、80-140kDa、100-200kDa、100-180kDa或100-140kDa)。
在一些实施方案中，为了缀合具有40kDa或更大(例如60kDa或更大，80kDa或更大，100kDa或更大，120kDa或更大，140kDa或更大，160kDa或更大或180kDa或更大)的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。
在一些实施方案中，为了缀合具有40kDa至200kDa的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。
在一些实施方案中，为了缀合具有40kDa至80kDa的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。例如，PHF具有约5kDa，10kDa或15kDa的分子量。
在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，例如Fab。
在一些实施方案中，为了缀合具有60kDa至120kDa的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。例如，PHF具有约5kDa，10kDa或15kDa的分子量。
在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如骆驼抗体，Fab2，scFvFc等。
在一些实施方案中，为了缀合具有140kDa至180kDa的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。例如，PHF具有约5kDa，10kDa或15kDa的分子量。
在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如全长抗体，例如IgG，IgM。
在一些实施方案中，当PHF的分子量为2kDa至40kDa时(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa，约7-8kDa)，每个PHF的药物数量(例如m2)是1至约40的整数(例如，约1:20或约2-15或约3:10)。该支架可以例如用于缀合分子量为140kDa至180kDa的PBRM。在该实施方案中，PBRM/PHF的比例为约1:1至约1:10,约1:1至约1:9,约1:1至约1:8,约1:1至约1:7,约1:1至约1:6,约1:1至约1:5,约1:1至约1:4,约1:1至约1:3,约1:1至约1:2,约1:2至约1:6,约1:2至约1:5,约1:2至约1:4或约1:2至约1:3。在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如全长抗体，例如IgG，IgM。
在一些实施方案中，当PHF的分子量为2kDa至40kDa时(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa，或约7-8kDa)，每个PHF的药物数量(例如m2)是1至约40的整数(例如，约1:20或约2:15或约3:10)。该支架可以例如用于缀合分子量为60kDa至120kDa的PBRM。在该实施方案中，PBRM/PHF的比例为约1:1至约1:10,约1:1至约1:9,约1:1至约1:8,约1:1至约1:7,约1:1至约1:6,约1:1至约1:5,约1:1至约1:4,约1:1至约1:3,约1:1至约1:2,约1:2至约1:6,约1:2至约1:5,约1:2至约1:4或约1:2至约1:3。在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，例如Fab2，scFcFv和骆驼抗体。
在一些实施方案中，当PHF的分子量为2kDa至40kDa时(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa，或约7-8kDa)，每个PHF的药物数量(例如m2)是1至约40的整数(例如，约1:20或约2-15或约3:10)。该支架可以例如用于缀合分子量为40kDa至80kDa的PBRM。在该实施方案中，PBRM/PHF的比例为约1:1至约1:10,约1:1至约1:9,约1:1至约1:8,约1:1至约1:7,约1:1至约1:6,约1:1至约1:5,约1:1至约1:4,约1:1至约1:3,约1:1至约1:2,约1:2至约1:6,约1:2至约1:5,约1:2至约1:4或约1:2至约1:3。在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，例如Fab。
在一些实施方案中，可以使用本公开的方法合成的支架是具有式(A)的支架：
Figure GDA0002428537640000931
或其盐，
其中：
式(A)的支架包含分子量为约5kDa至约10kDa的聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基-缩甲醛)(PHF)；
m是约20至约75的整数，m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3是约1至约5的整数，并且
m、m1、m2和m3的总和为约40至约75。
在某些实施方案中，可以使用本公开的方法合成的PBRM-聚合物-药物缀合物具有式(Ie)：
Figure GDA0002428537640000941
其中：
每次出现的D独立地是分子量≤5kDa的治疗剂，且D和羰基之间的
Figure GDA0002428537640000942
表示D直接或间接与羰基相连，
Xa和Xb之一是H，另一个是马来酰亚胺基封闭部分，或Xa和Xb与它们所连接的碳原子一起形成碳-碳双键；
m3a是0至约17的整数，
m3b是1至约8的整数，其中m3a和m3b之和是m3，
m、m1、m7、m3a和m3b的总和为约15至约300，并且
m5是1至约10的整数。
在一些实施方案中，PBRM具有约40kDa或更大(例如60kDa或更大；80kDa或更大；100kDa或更大；120kDa或更大；140kDa或更大；160kDa或更大；180kDa或更大；或200kDa或更大，或约40-200kDa，40-180kDa，40-140kDa，60-200kDa，60-180kDa，60-140kDa，80-200kDa，80-180kDa，80-140kDa，100-200kDa，100-180kDa或100-140kDa)的分子量。
在一些实施方案中，PBRM具有约40kDa或更大(例如60kDa或更大；80kDa或更大；100kDa或更大；120kDa或更大；140kDa或更大；160kDa或更大；180kDa或更大；或200kDa或更大，或约40-200kDa，40-180kDa，40-140kDa，60-200kDa，60-180kDa，60-140kDa，80-200kDa，80-180kDa，80-140kDa，100-200kDa，100-180kDa或100-140kDa)的分子量，并具有巯基(即-SH或硫醇基)。
在一些实施方案中，在PHF和PBRM之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)为约10或更少。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例大于约1∶1且小于或等于约10∶1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约9:1,8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约2:1至约5:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约2:1至约4:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约4:1或3:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约4:1。
在一些实施方案中，m7与m3b之间的比例为约3:1。
在一些实施方案中，D与PBRM之间的比例可以为约2:1至约40:1，约4:1至约30:1，约6:1至约20:1，约8:1至约18:1，或10:1至约15:1。
在一些实施方案中，当式(Ie)中的PHF具有约2kDa至约20kDa的分子量时，m、m1、m7、m3a和m3b的总和为约15至约150，m1是1至约70的整数，m7是1至约20的整数，m3a是0至约9的整数，m3b是1至约8的整数，且m5是2至约8的整数。
在一些实施方案中，当式(Ie)中的PHF具有约3kDa至约15kDa的分子量时，m、m1、m7、m3a和m3b的总和为约20至约110，m1是2至约50的整数，m7是2至约15的整数，m3a是0至约7的整数，m3b是1至约8的整数，且m5是2至约4的整数。
在一些实施方案中，当式(Ie)中的PHF具有约5kDa至约10kDa的分子量时，m、m1、m7、m3a和m3b的总和为约40至约75，m1是约5至约35的整数，m7是约3至约10的整数，m3a是0至约4的整数，m3b是1至约5的整数，且m5是2至约4的整数。
在一些实施方案中，可以使用本公开的方法合成的PBRM-聚合物-药物缀合物具有式(B)：
Figure GDA0002428537640000961
其中：
Xa和Xb之一是H，另一个是水溶性马来酰亚胺基封闭部分，或Xa和Xb与它们所连接的碳原子一起形成碳-碳双键；
PHF的分子量为约5kDa至约10kDa；
m是20至75的整数，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3a是约0至约4的整数，
m3b是约1至约5的整数，
m、m1、m2、m3a和m3b的总和为约40至约75，并且
m5是2至约5的整数。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约30:1,29:1,28:1,27:1,26:1,25:1,24:1,23:1,22:1,21:1,20:1,19:1,18:1,17:1,16:1,15:1,14:1,13:1,12:1,11:1,10:1,9:1,8:1,7:1或6:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约20:1,19:1,18:1,17:1,16:1,15:1,14:1,13:1,12:1,11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约18:1,17:1,16:1,15:1,14:1,13:1或12:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约15:1,14:1,13:1,12:1,11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约15:1,14:1,13:1,12:1,11:1或10:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约15:1,14:1,13:1或12:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约14:1,13:1,12:1,11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约13:1,12:1,11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约12:1,11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以是约11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以是约10:1,9:1,8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以是约10:1至约1:1,约7:1至约2:1,或约5:1至约3:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以是约6:1,5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以是约5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以是约5:1,4:1或3:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以是约4:1或3:1。
在一些实施方案中，PBRM具有约40kDa或更大(例如60kDa或更大；80kDa或更大；100kDa或更大；120kDa或更大；140kDa或更大；160kDa或更大；180kDa或更大；或200kDa或更大，或约40-200kDa，40-180kDa，40-140kDa，60-200kDa，60-180kDa，60-140kDa，80-200kDa，80-180kDa，80-140kDa，100-200kDa，100-180kDa或100-140kDa)的分子量。
在一些实施方案中，在PHF和PBRM之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)为10或更小。
在一些实施方案中，在PHF和PBRM之间形成的硫键的总数为约3至约10。
在一些实施方案中，在PHF和PBRM之间形成的硫键的总数为约3,4,5,6,7,8,9,或10。
在一些实施方案中，在PHF和PBRM之间形成的硫键的总数为约3,4,5,6,7或8。
在一些实施方案中，在PHF和PBRM之间形成的硫键的总数为约3,4或5。
在一些实施方案中，m是约20至约60,约25至约45,约30至约40,或约33至约37的整数。在一些实施方案中，m为约33,34,35,36,或37。
在一些实施方案中，m1是约5至约20,约6至约15,约7至约10,或约8至约10的整数。
在一些实施方案中，m2是约3至约8,约3至约6,或约3或约5的整数。在一些实施方案中，m2为约3,4,或5。
在一些实施方案中，m3a是约0至约3,约0至约2,或约0至约1的整数。
在一些实施方案中，m3b是约1至约4,约1至约3,或约1至约2的整数。
在一些实施方案中，m5是约2至约8,约2至约6,或约3至约5的整数。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约1:1至约10:1。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约9:1,8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约2:1至约4:1。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约4:1,3:1,或2:1。
在一些实施方案中，m2和m3b之间的比例为约4:1或3:1。
在一些实施方案中，当式(B)中的PHF的分子量为约5kDa至约10kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和为约40至约75，m1是约5至约35的整数，m2是约3至约10的整数，m3a是0至约4的整数，m3b是1至约5的整数，且m5是2至约4的整数。
当式B中的PHF的分子量为约5kDa至约10kDa时，m、m1、m2、m3a和m3b的总和为约40至约75，m1是约2至约35的整数，m2是约2至约10的整数，m3a是0至约4的整数，m3b是1至约5的整数，m3a和m3b的总和是1至约5；且PHF与抗体之间的比例为2至约8的整数(例如约2至约6或约2至约4)。
在一些实施方案中，奥瑞斯他汀F羟丙基酰胺(“AF HPA”)和PBRM之间的比例可以为约30:1,29:1,28:1,27:1,26:1,25:1,24:1,23:1,22:1,21:1,20:1,19:1,18:1,17:1,16:1,15:1,14:1,13:1,12:1,11:1,10:1,9:1,8:1,7:1或6:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以为约25:1,24:1,23:1,22:1,21:1,20:1,19:1,18:1,17:1,16:1,15:1,14:1,13:1,12:1,11:1,10:1,9:1,8:1,7:1或6:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以为约20:1,19:1,18:1,17:1,16:1,15:1,14:1,13:1,12:1,11:1,10:1,9:1,8:1,7:1或6:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以为约16:1,15:1,14:1,13:1,12:1,11:1或10:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以为约15:1,14:1,13:1,12:1,11:1或10:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以为约15:1,14:1,13:1或12:1。
在一些实施方案中，AF HPA和PBRM之间的比例可以为约12:1,11:1,10:1或9:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约10:1,9:1,8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1,2:1或1:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约8:1,7:1,6:1,5:1,4:1,3:1或2:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约6:1,5:1,4:1,3:1,2:1或1:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约6:1,5:1,4:1,3:1或2:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约6:1,5:1,4:1或3:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约5:1,4:1或3:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约4:1,3:1或2:1。
在一些实施方案中，PHF和PBRM之间的比例可以为约4:1或3:1。
在一些实施方案中，所述马来酰亚胺基封闭部分是在马来酰亚胺基与式(II)的含巯基的化合物反应后可以共价连接至两个烯烃碳原子之一的部分：
R90-(CH2)d-SH
(II)
其中：
R90是NHR91、OH、COOR93、CH(NHR91)COOR93或取代的苯基；
R93是氢或C1-4烷基；
R91是氢、CH3或CH3CO，且
d是1至3的整数。
在一些实施方案中，式(II)的马来酰亚胺基封闭化合物可以是半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸甲基酯、N-甲基半胱氨酸、2-巯基乙醇、3-巯基丙酸、2-巯基乙酸、巯基甲醇(即，HOCH2SH)、苄基硫醇(其中苯基被一个或更多个亲水取代基取代)或3-氨基丙烷-1-硫醇。苯基上的一个或更多个亲水取代基包含OH、SH、甲氧基、乙氧基、COOH、CHO、COC1-4烷基、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等等。
在一些实施方案中，马来酰亚胺基封闭基团是-S-(CH2)d-R90，其中，
R90是OH、COOH或CH(NHR91)COOR93；
R93是氢或CH3；
R91是氢或CH3CO；且
d是1或2。
在一些实施方案中，马来酰亚胺基封闭基团是-S-CH2-CH(NH2)COOH。
在某些实施方案中，缀合物或支架在几个步骤中形成。这些步骤包括：(1)修饰聚合物，使其包含可以与药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)使改性聚合物与药物或其衍生物反应，以使药物与聚合物连接；(3)修饰聚合物-药物缀合物，使得聚合物包含可以与PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团，和(4)使修饰的聚合物-药物缀合物与PBRM或其衍生物反应以形成本公开的缀合物。如果通过步骤(1)产生的改性聚合物包含可以与PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团，则可以省略步骤(3)。步骤(3)和步骤(1)至(2)的顺序可以颠倒，即步骤(3)也可以在步骤(1)和(2)之前进行。
在另一个实施方案中，缀合物或支架在几个步骤中形成：(1)修饰聚合物，使其包含可与第一药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)使改性聚合物与第一药物或其衍生物反应，以使第一药物与聚合物连接；(3)修饰聚合物-药物缀合物，使其包含可与第二药物或其衍生物的官能团反应的不同官能团；(4)使修饰的聚合物-药物缀合物与第二药物或其衍生物反应，使得第二药物与聚合物-药物缀合物相连；(5)修饰包含两种不同药物的聚合物-药物缀合物，以使聚合物包含可与PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团；和(6)使步骤(5)的修饰的聚合物-药物缀合物与PBRM或其衍生物反应以形成本公开的缀合物。如果将两种不同的PBRM或其衍生物缀合以形成包含两种不同药物和两种不同PBRM的聚合物-药物缀合物，则可以重复步骤(5)和(6)。步骤(5)和步骤(1)至(4)的顺序可以颠倒，即步骤(5)也可以在步骤(1)至(4)之前进行。
在另一个实施方案中，缀合物或支架在几个步骤中形成。这些步骤包括(1)改性聚合物，使其包含可以与药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)进一步改性聚合物，使其还包含可与PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团；(3)使改性聚合物与药物或其衍生物反应，从而使药物与聚合物连接；(4)使改性的聚合物-药物缀合物与PBRM或其衍生物反应以形成本公开的缀合物。步骤(1)和(2)的顺序或步骤(3)和(4)的顺序可以颠倒。另外，如果改性聚合物包含可以与药物或其衍生物的官能团和PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团，则可以省略步骤(1)或(2)。步骤(2)和步骤(1)的顺序可以颠倒，即步骤(2)也可以在步骤(1)之前进行。
在另一个实施方案中，缀合物或支架在几个步骤中形成：(1)修饰聚合物，使其包含可与第一药物或其衍生物的官能团反应的官能团；(2)进一步改性聚合物，使其包含可与PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团；(3)使改性聚合物与第一药物或其衍生物反应，以使第一药物与聚合物连接；(4)修饰聚合物-药物缀合物，使其包含可以与第二药物或其衍生物的官能团反应的不同官能团；(5)使修饰的聚合物-药物缀合物与第二药物或其衍生物反应，使得第二药物与聚合物-药物缀合物连接；(6)使包含两种不同药物的改性聚合物-药物缀合物反应，以使聚合物与PBRM或其衍生物形成本公开的缀合物。如果将两种不同的PBRM或其衍生物缀合以形成包含两种不同药物和两种不同PBRM的聚合物-药物缀合物，则可以重复步骤(6)。可以在步骤(1)之后进行步骤(4)，以使改性聚合物包含可以与两种不同药物或其衍生物反应的两种不同的官能团。在该实施方案中，可以进一步改性包含两种可以与两种不同的药物或其衍生物反应的不同官能团的改性聚合物，以使其包含可以与PBRM或其衍生物的官能团反应的官能团；再使改性聚合物与两种不同药物反应(步骤(3)和步骤(5)或PBRM(步骤(6)。步骤(2)和步骤(1)的顺序可以颠倒，即步骤(2)也可以在步骤(1)之前进行。
可以制备本公开的可生物降解的生物相容性缀合物或支架以满足生物降解性和亲水性的所需要求。例如，在生理条件下，可以达到生物降解性和稳定性之间的平衡。例如，已知分子量超过某个阈值(通常大于40-100kDa，取决于分子的物理形状)的分子不会像小分子那样通过肾脏排泄，并且可以仅通过细胞吸收和细胞内区室(尤其是溶酶体)中的降解从身体清除。该观察结果例证了功能稳定但可生物降解的材料如何可以通过调节它们在一般生理条件(pH＝7.5±0.5)和溶酶体pH(pH接近5)下的稳定性来设计。例如，已知缩醛和缩酮基团的水解被酸催化，因此，聚醚多元醇在酸性溶酶体环境中通常比在例如血浆中更不稳定。可以设计试验，以比较在例如pH＝5和pH＝7.5在37℃下在水性介质中的聚合物降解曲线，从而确定正常生理环境中和细胞吸收后“消化”的溶酶体区室中聚合物稳定性的预期平衡。这种试验中的聚合物完整性可以例如通过尺寸排阻HPLC来测量。本领域技术人员可以选择其他合适的方法来研究本公开的降解的缀合物的各种片段。
在许多情况下，优选的是，在pH＝7.5时，聚合物的有效尺寸在1至7天内不会发生可检测的变化，并且至少在几周内保持在原始值的50％以内。另一方面，在pH＝5时，聚合物优选应在1至5天内可检测地降解，并在两周至几个月的时间范围内完全转化为低分子量片段。尽管在某些情况下更快的降解可能是优选的，但是通常可能更希望聚合物在细胞中降解的速率不超过细胞对聚合物片段的代谢或排泄速率。因此，在某些实施方案中，预期本公开的缀合物是可生物降解的，特别是在被细胞吸收后是可生物降解的，并且相对于生物系统是相对“惰性的”。载体降解的产物优选是不带电荷的，并且不会显著改变环境的pH。提出了醇基团的丰度可能会提供细胞受体，特别是吞噬细胞的细胞受体低的聚合物识别率。本公开的聚合物主链通常包含很少的(如果有的话)抗原决定簇(例如对于某些多糖和多肽特征性的)且通常不包含能够在体内参与“钥锁”型相互作用的刚性结构，除非需要后者。因此，预计本公开的可溶性、交联的和固体的缀合物具有低毒性和生物粘附性，这使其适合于几种生物医学应用。
在某些实施方案中，可生物降解的生物相容性缀合物或支架可以形成线性或分支结构。在一些实施方案中，本公开的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇缀合物或支架可以是手性的(光学活性的)。任选地，本公开的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇缀合物或支架可以是大规模的。
在某些实施方案中，本公开的缀合物或支架是水溶性的。在某些实施方案中，本发明的缀合物或支架是水不溶性的。在某些实施方案中，缀合物或支架为固体形式。在某些实施方案中，本公开的缀合物或支架是胶体。在某些实施方案中，本公开的缀合物或支架为颗粒形式。在某些实施方案中，本公开的缀合物或支架为凝胶形式。
本公开的特征还在于可用于与PBRM缀合以形成本文所述的聚合物-药物-PBRM缀合物的聚合物支架，以及合成支架的方法。支架包含式(Ia)的聚合物载体，其可用于与PBRM(例如分子量为约40kDa或更大的PBRM)缀合：
Figure GDA0002428537640001051
支架包含分子量为约2kDa至约40kDa的聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基-缩甲醛)(PHF)；
X是CH2、O或NH；
m是1至约300的整数，
m1是1至约140的整数，
m2是1至约40的整数，
m3是1至约18的整数，并且
m、m1、m2和m3的总和为约15至约300。
在一些实施方案中，在式(Ia)的“m3”单元中每次出现的马来酰亚胺基部分仍要与PBRM的官能团形成共价键。
在一些实施方案中，为了缀合具有40kDa或更大(例如60kDa或更大，80kDa或更大，100kDa或更大，120kDa或更大，140kDa或更大，160kDa或更大，或180kDa或更大，或约40-200kDa，40-180kDa，40-140kDa，60-200kDa，60-180kDa，60-140kDa，80-200kDa，80-180kDa，80-140kDa，100-200kDa，100-180kDa或100-140kDa)的分子量的PBRM，本公开支架的聚合物载体是聚缩醛，例如分子量(即未修饰PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)的PHF。
在一些实施方案中，为了缀合具有40kDa至200kDa的分子量的PBRM，本公开支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即未修饰PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。
在一些实施方案中，为了缀合具有40kDa至80kDa的分子量的PBRM，本公开支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即未修饰PHF的MW)(即未修饰PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。例如PHF的分子量为约5kDa，6kDa，7kDa，8kDa，10kDa，13KDa或15kDa。
在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如抗体片段，例如Fab。
在一些实施方案中，为了缀合具有60kDa至120kDa的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约5kDa至约40kDa(例如，约5-30kDa，约5-20kDa，约5-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。例如，PHF具有约10kDa，20kDa，30kDa或40kDa的分子量。
在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如骆驼抗体，Fab2，scFcFv等。
在一些实施方案中，为了缀合具有140kDa至180kDa的分子量的PBRM，本公开的支架的聚合物载体是聚缩醛，例如PHF，所述PHF的分子量(即，未修饰的PHF的MW)为约2kDa至约40kDa(例如，约2-20kDa，约3-15kDa，约5-10kDa，约6-8kDa或约7-8kDa)。例如，PHF具有约5kDa，8kDa，10kDa，13kDa或15kDa的分子量。
在该分子量范围内的PBRM包括但不限于例如全长抗体，例如IgG，IgM。
在一些实施方案中，当式(Ia)中的PHF具有约2kDa至约40kDa的分子量(即，m、m1、m2和m3之和为约1至约300)时，m2为1至约40的整数，m3为1至约18的整数，和/或m1为1至约140的整数(例如，m1为约1-90)。
在一些实施方案中，当式(Ia)中的PHF具有约2kDa至约20kDa的分子量(即，m、m1、m2和m3之和为约1至约150)时，m2为1至约20的整数，m3为1至约10的整数，和/或m1为1至约70的整数(例如，m1为约4-45)。
在一些实施方案中，当式(Ia)中的PHF具有约3kDa至约15kDa的分子量(即，m、m1、m2和m3之和为约1至约110)时，m2为2至约15的整数，m3为1至约8的整数，和/或m1为2至约50的整数(例如，m1为约4-30)。
在一些实施方案中，当式(Ia)中的PHF具有约5kDa至约10kDa的分子量(即，m、m1、m2和m3之和为约1至约75)时，m2为3至约10的整数，m3为1至约5的整数，和/或m1为5至约35的整数(例如，m1为约10-25)。
在一些实施方案中，一种或多种载药聚合物载体连接至一种PBRM。在一些实施方案中，支架(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)包含分子量为约40kDa或更大的PBRM和连接至PBRM的一种或多种载药聚合物载体。
在一些实施方案中，支架还包含经由马来酰亚胺基连接至聚合物载体的PBRM。
在一些实施方案中，合成式(Ia)的支架的方法包括使
Figure GDA0002428537640001081
(“化合物A”)与
Figure GDA0002428537640001082
(“化合物B1”)反应形成第一混合物；和
(2)添加
Figure GDA0002428537640001083
(“化合物C”)或其盐与第一混合物反应以产生式(Ia)的支架或其盐；其中n为m1、m2和m3的总和。在一些实施方案中，n是约7至约40的整数。在一些实施方案中，m与n之间的比例为约2∶1至约3∶1。
在一些实施方案中，X是NH。
在一些实施方案中，式(Ia)的支架是式(A)的支架：
Figure GDA0002428537640001084
(A)或其盐，其中
m是20至约75的整数，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3是1至约5的整数，并且
m、m1、m2和m3的总和为40至约75。
在一些实施方案中，来自化合物A和B1反应的第一混合物包括分子量为约2kDa至约40kDa的式(Ic)的聚合物支架；
Figure GDA0002428537640001091
其中：
X是CH2、O或NH；
m是1至约300的整数，
m6是2至约180的整数，
m3是1至约18的整数，并且
m、m6和m3的总和为约15至约300。
在一些实施方案中，式(Ic)的“m3”单元中每次出现的马来酰亚胺基部分仍要与PBRM的官能团形成共价键。
在一些实施方案中，当式(Ic)中的PHF具有约2kDa至约20kDa的分子量(即，m、m6和m3之和为约15至约150)时，m3为1至约9的整数，和/或m6为2至约90的整数(例如，m6为约6-60)。
在一些实施方案中，当式(Ic)中的PHF具有约3kDa至约15kDa的分子量(即，m、m6和m3之和为约20至约110)时，m3为1至约8的整数，和/或m6为4至约65的整数(例如，m6为约6-45)。
在一些实施方案中，当式(Ic)中的PHF具有约5kDa至约10kDa的分子量时，m、m6和m3之和为约40至约75，m6为约8至约45的整数，且m3为1至约5的整数。
在一些实施方案中，通过使用基于半胱氨酸的生物缀合策略，将聚合物支架(例如，聚缩醛聚合物，例如PHF)与PBRM缀合。参见例如WO2010100430和US7,595,292，其内容通过引用整体结合于此。在一个实施方案中，聚合物支架(例如，聚缩醛聚合物，例如PHF)通过在抗体铰链区中的半胱氨酸与PBRM(例如抗体)缀合。不希望受到理论的束缚，通过形成链间桥结构来稳定所得的缀合物。
因此，本公开还涉及包含至少两个与聚合物支架连接的部分的聚合物支架(例如，聚醚多元醇聚合物)，其中每个部分能够与PBRM中氨基酸(例如，半胱氨酸)的巯基缀合以形成蛋白-聚合物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)。在一个实施方案中，连接至聚合物支架的至少两个部分是马来酰亚胺基团。
合成方法
根据本公开，可以使用任何可用的技术来制备缀合物，聚合物支架，或包括它们的组合物，以及可用于制备它们的中间体和组分(例如载体和改性剂)。在一些实施方案中，可以使用半合成和完全合成的方法。
载体
制备适于与改性剂缀合的聚合物载体(例如，生物相容性、可生物降解的聚合物载体)的方法是本领域已知的。例如，合成指南可以见于美国专利号5,811,510；5,863,990；5,958,398；7,838,619；7,790,150；8,685,383；和8,815,226，其各自的内容通过引用整体并入本文。熟练的从业者将知道如何使这些方法适应于制造用于实施本发明的聚合物载体。
在一个实施方案中，用于形成本公开的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇缀合物的方法包括借以将合适的多糖与有效量的二醇-特异性氧化剂结合以形成醛中间体的过程。然后可以将本身为聚醚多元醇的醛中间体还原为相应的多元醇，琥珀酸化，并与一种或多种合适的改性剂偶联以形成包含含琥珀酰胺键的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇缀合物。
在另一个优选的实施方案中，可以通过使合适的引发剂与合适的前体化合物反应来制备用于本公开的完全合成的可生物降解的生物相容性聚醚多元醇。
在一些实施方案中，可以通过乙烯基醚与保护的取代的二醇的缩合来制备完全合成的聚醚多元醇。可以使用其他方法，例如开环聚合，其中方法的有效性可以取决于保护基团的取代度和体积。
Figure GDA0002428537640001111
本领域普通技术人员将理解，可以优化溶剂体系，催化剂和其他因素以获得高分子量产物。
在一些实施方案中，载体是PHF。
在实施方案中，聚合物载体是具有小于1.5，例如＜1.2的多分散性指数(PDI)的PHF。
药物及药物衍生物
在某些实施方案中，可以在与聚合物载体缀合之前对药物进行修饰。方案1和2是用于修饰长春花生物碱的说明性方法。方案3显示了修饰非天然喜树碱衍生物的方法。方案4显示了用于修饰奥瑞斯他汀F的方法。在US2010/0305149中描述了更多的修饰方法，其通过引用并入本文。
方案1
Figure GDA0002428537640001121
长春花生物碱的C23酯与肼反应，然后用NaNO2处理，得到活性叠氮基酯。叠氮基酯与氨基化合物如丙醇胺或1-氨基丙烷-2-醇的反应产生具有官能化羟基的长春花生物碱衍生物，其可以用含氨基的化合物，例如丙氨酸或甲基丙氨酸衍生物进一步衍生化，以与聚合物缀合(参见方案1)。
方案2
Figure GDA0002428537640001131
用含被保护的氨基的系链(例如叔丁氧基酯化的氨基酸)处理长春花生物碱的羟基衍生物，然后进行酯的TFA水解，得到长春花生物碱的TFA盐。(方案2)长春花生物碱与官能化聚合物的缀合产生药物-聚合物缀合物，其可以与PBRM或其衍生物进一步缀合从而产生蛋白-聚合物-药物缀合物(例如PBRM-聚合物-药物缀合物)。
方案3
Figure GDA0002428537640001141
非天然喜树碱衍生物(例如SN38)的10-羟基通过使该衍生物与叔丁基二苯基甲硅烷基氯(TBDPSiCl)在三乙胺的存在下反应来进行选择性保护。可以使用在Sapra,P.等,Clin.CancerRes.,14:1888-1896(2008)中描述的方法，使20-羟基与叔丁基羰基-丙氨酸反应形成丙氨酸衍生物。或者，可以使用其他氨基酸，例如甘氨酸。通过用三氟乙酸处理除去Boc保护基，然后用氟化四丁基铵除去TBDPS保护基，暴露伯胺(参见方案3)。可以将所得的氨基衍生的SN38化合物与官能化的聚合物缀合以形成药物-聚合物缀合物。
方案4
Figure GDA0002428537640001151
用含被保护的氨基的系链(例如叔丁氧基酯化的2-羟基丙胺)处理奥瑞斯他汀F，然后将酯水解(例如，TFA水解或HCl水解)，得到奥瑞斯他汀F的2-羟基丙基氨基衍生物(参见方案4)。奥瑞斯他汀F衍生物与官能化的聚合物的缀合产生药物-聚合物缀合物，其可以进一步与PBRM或其衍生物缀合，从而形成蛋白-聚合物-药物缀合物。
缀合物或聚合物支架
以下方案5A和5B显示了制备本公开的聚合物药物支架的替代合成途径。在一个实施方案中，在几个步骤中形成缀合物：(1)将聚合物PHF改性以包含COOH部分(例如–C(O)-X-(CH2)2-COOH)；(2)然后将聚合物进一步改性，使其含有可与PBRM的官能团反应的马来酰亚胺基部分(例如，EG2-MI)；(3)使含有两个不同官能团的改性聚合物与药物或其衍生物(例如，AF-HPA-Ala)的官能团反应，形成聚合物-药物缀合物；(4)将PBRM的二硫键还原；(5)然后将还原的PBRM与聚合物-药物缀合物反应形成蛋白-聚合物-药物缀合物(例如，PBRM-聚合物-药物缀合物)；和(6)其余的马来酰亚胺基部分任选地与马来酰亚胺基封闭化合物(例如半胱氨酸)反应。
在另一个实施方案中，步骤(2)和(3)的顺序可以颠倒，如下面方案5A或5B的右侧路线所示。
方案5A
Figure GDA0002428537640001161
Figure GDA0002428537640001171
方案5B
Figure GDA0002428537640001172
Figure GDA0002428537640001181
在又一个实施方案中，如以下方案6A或6B所示，同时进行以上步骤(2)和(3)。
方案6A
Figure GDA0002428537640001182
Figure GDA0002428537640001191
方案6B
Figure GDA0002428537640001192
Figure GDA0002428537640001201
在一个方面，本公开涉及制备式(A)的聚合物支架或其盐的方法：
Figure GDA0002428537640001202
该方法包括一个或多个选自以下的步骤：
(1)使
Figure GDA0002428537640001203
(“化合物A”)与
Figure GDA0002428537640001204
(“化合物B”)反应形成第一混合物；和
(2)添加
Figure GDA0002428537640001211
(“化合物C”)或其盐与第一混合物反应产生式(A)的支架或其盐；
其中：
化合物B或式(A)的支架包含分子量为约5kDa至约10kDa(例如，约6kDa至约8kDa或约6kDa至约7kDa)的聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基-缩甲醛)(PHF)；
m为20至约75的整数，
n为约7至约40的整数，并且m与n之间的比例为约2∶1至约3∶1，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3是1至约5的整数，并且
m，m1，m2和m3的总和为40至约75。
此外，本公开还涉及纯化聚合物支架的方法，所述聚合物支架例如本文公开的化合物B或式(A)的支架。
本公开还提供了制备缀合物的方法，所述缀合物包括式(A)的聚合物支架和PBRM。该方法包括使式(A)的支架与PBRM或其衍生物反应。
在实施方案中，当适用时，本公开的方法可以具有以下特征中的一个或多个。
在一些实施方案中，用于本公开的方法的化合物B的分子量为约6kDa至约13kDa，例如约7kDa至约12kDa，或约10kDa至约12kDa。在一些实施方案中，在化合物B中，n为m和n之和的约26-34％(例如约29-33％)。
在一些实施方案中，至少70％(例如，至少75％，80％，85％，90％或95％)的化合物A被消耗(例如，通过RP-HPLC监测)，再添加化合物C或其盐与第一混合物反应。
在一些实施方案中，其中在添加化合物C或其盐之前不对第一混合物进行后处理。
在一些实施方案中，化合物A和化合物B之间的反应在第一温度下在羧酸的活化剂和偶联剂的存在下进行。在一些实施方案中，活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。在一些实施方案中，偶联剂是乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)。在一些实施方案中，化合物A和化合物B之间的反应在约4至约6(例如，约4.2-5.4或约4.2-6)的pH下进行。
在一些实施方案中，第一混合物与化合物C或其盐之间的反应在第二温度下在羧酸的活化剂和偶联剂的存在下进行。在一些实施方案中，活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。在一些实施方案中，偶联剂是乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)。在一些实施方案中，第一混合物与化合物C或其盐之间的反应在约4至约6(例如5.0±0.3，约4.2-5.4或约4.2-6)的pH下进行。
在一些实施方案中，第一温度为约0℃至15℃。
在一些实施方案中，第二温度为约5℃至15℃。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过将化合物A的被保护形式例如
Figure GDA0002428537640001221
(“化合物AA”)脱保护提供化合物A。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯在例如约0℃至25℃的温度下反应提供化合物AA。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过使PHF(例如分子量为约5kDa至约10kDa，约6kDa至约8kDa，约6kDa至约7kDa的PHF)与3-异氰酰丙酸甲酯反应形成化合物B的甲酯，并将该甲酯转化为化合物B，提供化合物B。
在一些实施方案中，该方法进一步包括纯化化合物B，使得如此纯化的化合物B具有约6kDa至约13kDa的分子量，并且n为m和n之和的约26-34％。在一些实施方案中，如此纯化的化合物B的分子量为约7kDa至约12kDa，并且n为m和n之和的约28-32％(例如29-34％，或平均约31％)。在一些实施方案中，化合物B的分子量为约10kDa至约12kDa。在一些实施方案中，化合物B的平均分子量为11.3kDa。
在一些实施方案中，化合物B具有小于2.0，小于1.9，小于1.8，小于1.7或小于1.6的多分散性指数(PDI)。在一些实施方案中，化合物B具有小于1.5的多分散性指数(PDI)。
在一些实施方案中，化合物B的纯化包括弱阴离子交换(WAX)色谱纯化。在一些实施方案中，用于弱阴离子交换色谱纯化的流动相包含磷酸钠缓冲剂。在一些实施方案中，纯化进一步包括一次或多次过滤，例如一次或多次凝胶过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合。
在一些实施方案中，化合物B的粗产物首先通过非吸附色谱如凝胶过滤(例如，使用Sephadex G-25柱色谱)纯化去除无机盐，然后进行切向流过滤(TFF)渗滤(例如，使用1kDa MWCO膜)，同时将pH保持在例如约6-8，约6.5-7.5或7.0±0.1。在一些实施方案中，化合物B的粗产物首先通过非吸附色谱如凝胶过滤(例如，使用Sephadex G-25柱色谱)纯化去除无机盐，然后进行纳滤(例如，使用3.5kDa MWCO膜)，同时将pH维持在例如约6-8，约6.5-7.5或7.0±0.1。在一些实施方案中，使用例如20mM磷酸钠pH7.0至20mM磷酸钠和1M NaClpH7.0的梯度通过WAX纯化产物。在一些实施方案中，含有化合物B的选择的级分合并并通过例如TFF渗滤(例如，用1kDa MWCO膜)浓缩，再与化合物A反应，所述化合物B具有m和n之和的约29-34％的n(通过例如SEC分析确定)。
在一些实施方案中，该方法进一步包括通过化合物C的被保护形式例如
Figure GDA0002428537640001241
(“化合物CC”)的脱保护提供化合物C或其盐。
在一些实施方案中，化合物C的盐是三氟乙酸盐。
在一些实施方案中，该方法进一步包括例如通过反相HPLC色谱分离纯化式(A)的支架。在一些实施方案中，乙酸钠缓冲剂和乙腈用作流动相。在一些实施方案中，纯化进一步包括一次或多次过滤，例如一次或多次凝胶过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合。在一些实施方案中，在HPLC纯化之前，将第一混合物与化合物C或其盐之间的反应产物浓缩，同时保持pH5.0±0.3。在一些实施方案中，然后将所得浓缩物进行非吸附色谱，例如凝胶过滤(例如，使用Sephadex G-25色谱)以例如除去盐和未反应的试剂，随后例如进行切向流过滤(TFF)渗滤(例如1kDa MWCO膜)，例如在约5-15℃进行，同时将pH保持在4至5。在一些实施方案中，使用乙酸钠和乙腈作为洗脱剂(具有例如，pH值为约5-6，例如pH值为5.8)，通过制备HPLC(例如丁基HG,
Figure GDA0002428537640001242
10μm,250x50mm,1,000psi柱)进一步纯化产物。在一些实施方案中，合并选择的级分(基于例如1H-NMR和SEC分析)，所述级分包含具有7-13kDa MW的式(A)的聚合物支架，其中m2为m，m1，m2和m3的总和的约6-10％，并浓缩(例如，通过旋转蒸发，然后通过TFF 1kDa MWCO膜)，以除去溶剂，缓冲剂和盐。在一些实施方案中，将所得水溶液进行过滤，例如用TFF装置(具有50或100kDa MWCO膜)进行超滤，并收集渗透物，例如，然后进行0.1微米无菌过滤。在一些实施方案中，式(A)的支架的纯化不包括凝胶过滤和/或旋转蒸发。
在一些实施方案中，通过本公开的方法产生的式(A)的支架的产率为至少60％，65％，67％，70％，75％，80％或至少85％。
在一些实施方案中，纯化后，式(A)的支架的分子量为约4kDa至约18kDa，约5kDa至约17kDa，约6kDa至约16kDa或约7kDa至约14.5kDa(例如，约8kDa至约14.5kDa，或约7kDa至约13kDa)。
在一些实施方案中，纯化后，式(A)的支架的分子量为7kDa至约13kDa。
在一些实施方案中，在式(A)的支架中，m2为m，m1，m2和m3的总和的约5％至约13％，约6％至约12％，约7％至约11％，或约7.5％至约10.5％。
在一些实施方案中，在式(A)的支架中，m2为m，m1，m2和m3的总和的约8％至约10％。
在一些实施方案中，在式(A)的支架中，m3为m，m1，m2和m3的总和的约2％至约4％。
在一些实施方案中，由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少75％，80％，85％，90％或至少95％的纯度。
在一些实施方案中，式(A)的支架或其盐是大规模产生的。在一些实施方案中，单批产生至少100g的式(A)的支架或其盐。
在一些实施方案中，单批产生至少200g，500g，1kg，至少2kg或至少2.5kg的式(A)的支架或其盐。
在一些实施方案中，式(A)的支架具有小于3.0，小于2.8，小于2,6，小于2.4或小于2.2的PDI。在一些实施方案中，式(A)的支架的PDI小于2.0。
在一些实施方案中，对于任何公开的方法，进行至少一种非吸附色谱。
在一些实施方案中，对于任何公开的方法，用Sephadex柱色谱进行至少一种非吸附色谱。
在一些实施方案中，对于任何公开的方法，用分子量截留为约650Da至1000Da的膜进行至少一种切向流过滤。在一些实施方案中，对于任何公开的方法，膜具有约650Da的分子量截留。在一些实施方案中，对于任何公开的方法，用分子量截留为约50kDa至100kDa的膜进行至少一种切向流过滤，以获得包含式(A)的支架或其盐的渗透物。
在一些实施方案中，对于任何公开的方法，用分子量截留为1000Da至4000Da的膜进行至少一种纳滤。
在一些实施方案中，对于任何公开的方法，用分子量截留为约1500kDa至3500kDa的膜进行至少一种切向流过滤，以获得包含式(A)的支架或其盐的渗透物。
在另一方面，本公开涉及式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物的方法：
Figure GDA0002428537640001261
其中：
Xa和Xb之一是H，另一个是水溶性马来酰亚胺基封闭部分，或Xa和Xb与它们所连接的碳原子一起形成碳-碳双键；
PHF的分子量为约5kDa至约10kDa；
m是20至75的整数，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3a是0至约4的整数，
m3b是1至约5的整数，
m、m1、m2、m3a和m3b的总和为约40至约75，并且
m5是2至约4的整数。
该方法包括一个或多个选自以下的步骤：
(1)提供式(A)的聚合物支架或其盐和还原的PBRM；
(2)将还原的PBRM加入到式(A)的聚合物支架或其盐中，以形成包含式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物的第三反应混合物。
在一些实施方案中，式(A)的聚合物支架或其盐是通过进行本公开的方法制备的。
在一些实施方案中，通过使PBRM与还原剂反应来制备还原的PBM，其中PBRM的一个或多个二硫键被还原剂还原成一个或多个巯基。
在一些实施方案中，通过使用还原剂，例如TCEP、DTT或β-巯基乙醇，在与聚合物-药物缀合物缀合之前，实现相关的PBRM中链间二硫基团或未配对的二硫化物的部分选择性还原。该反应通常在约25±2℃下进行约1.5小时。
在一些实施方案中，PBRM二硫基团转化为反应性巯基的程度取决于PBRM的化学计量，还原剂，pH，温度和/或反应持续时间。当PBRM中某些但不是全部的二硫基团被还原时，还原的PBRM是部分还原的PBRM。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约2至约4摩尔当量，形成巯基(SH)。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约2.4摩尔当量，形成巯基。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约2.5摩尔当量，形成巯基。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约2.7摩尔当量，形成巯基。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约3.0摩尔当量，形成巯基。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约3.25摩尔当量，形成巯基。
在一些实施方案中，PBRM上的二硫键被TCEP·HCl部分还原，使用相对于PBRM约3.4摩尔当量，形成巯基。
部分还原的PBRM与式(A)聚合物支架或其盐的缀合在中性或弱碱性条件下(pH5.5-8.5)以0.5至2.0(w/w)的聚合物-药物缀合物与PBRM的浓度比在约25±2℃进行约60分钟至约120分钟。
在一些实施方案中，部分还原的PBRM与式(A)的聚合物支架或其盐的缀合以0.7(w/w),0.8(w/w),0.9(w/w),1.0(w/w),1.2(w/w)或1.5(w/w)的式(A)的聚合物支架或其盐与PBRM的比例进行。
在一些实施方案中，部分还原的PBRM与式(A)的聚合物支架或其盐的缀合以1.0(w/w)的式(A)的聚合物支架或其盐与PBRM的比例进行。在一些实施方案中，部分还原的PBRM与式(A)的聚合物支架或其盐的缀合以0.9(w/w)的式(A)的聚合物支架或其盐与PBRM的比例进行。在一些实施方案中，部分还原的PBRM与式(A)的聚合物支架或其盐的缀合以0.8(w/w)的式(A)的聚合物支架或其盐与PBRM的比例进行。在一些实施方案中，部分还原的PBRM与式(A)的聚合物支架或其盐的缀合以0.75(w/w)的式(A)的聚合物支架或其盐与PBRM的比例进行。在一些实施方案中，部分还原的PBRM与式(A)的聚合物支架或其盐的缀合以0.7(w/w)的式(A)的聚合物支架或其盐与PBRM的比例进行。在PBRM与聚合物-药物缀合物的马来酰亚胺基团缀合之后，通过添加水溶性的马来酰亚胺基封闭化合物例如N-乙酰基半胱氨酸，半胱氨酸甲酯，N-甲基半胱氨酸，2-巯基乙醇，3-巯基丙酸，2-巯基乙酸，巯基甲醇(即HOCH2SH)，苄基硫醇等来终止缀合。
在一些实施方案中，马来酰亚胺基封闭化合物可以是半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、半胱氨酸甲基酯、N-甲基半胱氨酸、2-巯基乙醇、3-巯基丙酸、2-巯基乙酸、巯基甲醇(即，HOCH2SH)、苄基硫醇(其中苯基被一个或更多个亲水取代基取代)或3-氨基丙烷-1-硫醇。苯基上的一个或更多个亲水取代基包含OH、SH、甲氧基、乙氧基、COOH、CHO、COC1-4烷基、NH2、F、氰基、SO3H、PO3H等等。
在一些实施方案中，马来酰亚胺基封闭基团是-S-(CH2)d-R90，其中，
R90为OH，COOH或CH(NHR91)COOR93；
R93为氢或CH3；
R91为氢或CH3CO；和
d为1或2。
在一些实施方案中，马来酰亚胺基封闭基团是-S-CH2-CH(NH2)COOH。
通常通过渗滤来纯化所得的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物，以除去任何未缀合的聚合物-药物缀合物，未缀合的药物和小分子杂质。替代地或另外地，适当的色谱分离程序，例如尺寸排阻色谱，疏水相互作用色谱，离子色谱，例如WCX色谱，SCX色谱，反相色谱，羟基磷灰石色谱，陶瓷羟基磷灰石色谱，亲和色谱或其组合可用于纯化PBRM-聚合物-药物缀合物。
在一些实施方案中，通过色谱分离，例如离子交换色谱分离，从第三反应混合物中分离式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
在一些实施方案中，通过强阳离子交换(SCX)色谱分离分离式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。在一些实施方案中，SCX色谱分离是用包含乙酸钠，氯化钠或其组合的流动相进行的。在一些实施方案中，流动相的pH值为约5至约7，约5.5至约6.5或约5.8至约5.9。
在一些实施方案中，SCX色谱分离从第三反应混合物中去除具有高AF HPA与PBRM比的一种或多种酸性级分(通过分析型HPLC WCX色谱测定)。在一些实施方案中，所述一种或多种酸性级分由于弱的抗原结合而具有受损的活性。在一些实施方案中，SCX色谱分离从第三反应混合物中去除具有低AF HPA与PBRM比的一种或多种碱性级分(通过分析型HPLCWCX色谱测定)。在一些实施方案中，SCX色谱分离从第三反应混合物中去除一种或多种聚集的物类以及任何未反应的PBRM。
在一些实施方案中，其中在强阳离子交换色谱分离过程中收集具有期望的AF HPA与PBRM之比的一个或多个主要级分，从而提供由此纯化的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
通常在pH5.0-6.5的一种或多种缓冲剂和任选地一种或多种稳定剂，一种或多种表面活性剂和/或一种或多种无机盐中配制所得的纯化的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
在一些实施方案中，所述一种或多种稳定剂是海藻糖，山梨糖醇，甘露糖醇，蔗糖，乳糖，葡萄糖，木糖醇，麦芽糖，羟丙基-β-环糊精，乳糖醇，右旋糖，甘油或麦芽糖醇。
在一些实施方案中，稳定剂是海藻糖，山梨糖醇或甘露糖醇。
在一些实施方案中，稳定剂是海藻糖。
在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲剂是柠檬酸钠，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，乳酸盐，柠檬酸，硼酸，硼砂，盐酸，磷酸氢二钠，乙酸，甲酸，甘氨酸，碳酸氢盐，酒石酸，Tris-甘氨酸，Tris-NaCl，Tris-乙二胺四乙酸(“EDTA”)，Tris-硼酸盐-EDTA，Tris-乙酸盐-EDTA(“TAE”)缓冲剂和Tris缓冲盐水，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(“HEPES”)，3-(N-吗啉代)丙磺酸(“MOPS”)，哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(“PIPES”)，2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(“MES”)，组氨酸，磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)，盐水柠檬酸钠(“SSC”)，盐水-tris-EDTA(“STE”)或tris-镁。
例如，缓冲剂是柠檬酸钠。
在一些实施方案中，所述一种或多种表面活性剂是聚山梨酯80，聚山梨酯20，泊洛沙姆407，Solutol HS 15，泊洛沙姆188，月桂基硫酸钠，醚硫酸盐，硫酸化油，西曲溴铵BP，苯扎氯铵，卵磷脂，cetromacrogel 1000BPC或式RCOOX的碱金属皂，其中R为C10-C20烷基。
本公开的缀合物和包含于其中的药物化合物可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法便利地进行制备。具有本文所描述的各化学式的本公开的缀合物或化合物可以根据下列程序，由市售可得的起始原料或使用文献程序可以制备的起始原料来制备。这些程序显示了本公开的代表性缀合物的制备。
一旦被生产出来，通过上述方法设计、选择和/或优化的缀合物就可以使用本领域技术人员已知的各种试验进行表征，以确定该缀合物是否具有生物活性。在一些实施方案中，可以通过常规的试验包括，但不限于如下文所描述的那些试验来表征该缀合物，以确定它们是否具有预期的活性、结合活性和/或结合特异性。
此外，高通量筛选可以用于加速使用此类试验的分析。因此，使用本领域中已知的技术，有可能对本文所描述的缀合物分子的活性进行快速筛选。用于进行高通量筛选的一般方法学描述于，例如Devlin(1998)High Throuthput Screening,Marcel Dekker和美国专利号5,763,263中。高通量试验可以使用一种或多种不同的试验技术，包括但不限于下文描述的那些。
本文所引用的所有出版物和专利文件都通过引用并入本文，就如同将此类出版物或文件中的每一个被明确地且个别地指定为通过引用并入本文一样。出版物和专利文件的引用不意欲承认任何一者作为相关的现有技术，也不构成任何对于其内容或日期的承认。本发明既已通过书面的说明书加以描述，本领域技术人员将会认识到，本发明可以各种实施方案加以实施并且上述说明以及下列实施例是出于例示的目的，而并非对随附的权利要求加以限制。
实施例
以下工作实施例是说明性的，而不是意图为限制性的，并且本领域技术人员将容易理解，可以使用其他试剂或方法。
本文所述的缀合物可通过以上概述的方案和以下实施例中所述的方法制备。除非另有说明，否则在以下某些实施例中使用的术语“含量”是指被预期的部分例如连接基或药物分子取代的聚合物结构单元的摩尔分数或摩尔百分比。因此，除非另有说明，否则在以下实施例中使用的载药聚合物支架中各种聚合物单元的报告百分比为摩尔百分比。
缩写
下列缩写用于后续的反应方案和合成实施例。该列表并不意味着是本申请中所使用的缩写的全部清单，因为有机合成领域的技术人员容易理解的额外的标准缩写也可以用于合成方案和实施例。
Figure GDA0002428537640001321
Figure GDA0002428537640001331
一般信息
本文所述的聚合物-药物缀合物一旦产生，就可以用本领域技术人员已知的多种分析技术来表征。在一些实施方案中，聚合物-药物缀合物可以通过常规分析技术表征，包括但不限于以下描述的那些技术。
在Phenomenex Gemini 5μm
Figure GDA0002428537640001332
250 x 10mm,5微米,半制备柱上进行RP-HPLC分析。
在丁基HG,
Figure GDA0002428537640001333
10μm,250 x 50mm,250 x 75mm,和250 x 150mm(高度×直径)≥1,000psi柱上进行制备型HPLC纯化。
在Tosoh Biosciences TSK凝胶G5000柱(7.8mm x 30cm,10um)或Superose 12柱上进行SEC-HPLC分析。
在带有RI检测器的Sephadex G-25(27cm直径,74cm高度玻璃柱)上进行SEC纯化。
在205nm用UV检测，在CAPTO DEAE(GE Healthcare和/或Bo Ge Long)柱(8/45cm直径,33/35cm高度)上进行WAX。
在Phenomenex Gemini 5μm
Figure GDA0002428537640001334
250 x 10mm,5微米,半制备柱上进行HPLC纯化。
为了确定聚合物缀合物中游离药物的浓度，将酸化的样品用乙腈处理。萃取游离药物并分析乙腈上清液。为了确定缀合的AF-HPA的浓度，将样品进行彻底的碱水解。分析含有释放的AF-HPA和AF的乙腈上清液。
AF和AF-HPA的分析使用C-18柱，乙腈梯度和UV检测通过RP-HPLC进行。峰面积被积分并与AF和AF-HPA标准进行比较。该方法AF-HPA对于AF-HPA的定量范围为0.05％至5％，对于AF的定量范围为高达0.2％，血浆以及肿瘤和组织匀浆分别在0.3至3,000ng/mL和10至20,000ng/mL的浓度范围内呈线性。
通过1H-NMR确定聚合物支架的马来酰亚胺基和水解的马来酰亚胺基含量。
通过鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)凝胶凝块测定或鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)动力学显色测定法来测定内毒素。
聚合物缀合物的分子量(报告为表观重均分子量或峰分子量)通过SEC使用多糖或蛋白分子量标准测定。更具体地，对于聚合物或聚合物-药物缀合物，使用多糖分子量标准，对于蛋白-药物-聚合物缀合物，使用蛋白标准。除非特别指出，否则报道的聚合物载体分子量是PHF的重均分子量。聚合物-药物缀合物的分子量和蛋白-聚合物-药物缀合物为峰值分子量。合成/测量的聚合物缀合物通常具有≤1.5的多分散性。
MALDI-TOF质谱用于确定PBRM-聚合物-药物缀合物的完整分子量。用双官能试剂处理PBRM-聚合物-药物缀合物，以使赖氨酸残基交联，从而在MALDI-TOF质谱分析条件下稳定PBRM-聚合物-药物缀合物。通常，对交联的PBRM-聚合物-药物缀合物的分析显示与连接1至3个聚合物-药物缀合物的完整抗体一致的具有宽质量范围的峰。
PBRM-聚合物-药物缀合物的蛋白含量在280nm处通过分光光度法测定或通过ELISA测定。
通常，PBRM-聚合物-药物缀合物通常包含<5％(w/w,例如<2％w/w)的聚集级分，如通过SEC测定的；<0.5％(w/w,例如<0.1％w/w)的游离(未缀合)药物，如通过RP-HPLC或LC-MS/MS测定的；<1％(w/w)的游离聚合物-药物缀合物，如通过SEC和/或RP-HPLC测定的，和<2％(w/w，例如，<1％w/w)的未缀合的PBRM，如通过HIC-HPLC和/或WCXHPLC测定的。使用文献中描述的方法制备还原的或部分还原的抗体，参见，例如，Francisco等,Blood 102(4):1458-1465(2003)。总药物(缀合和未缀合)浓度通过LC-MS/MS或RP-HPLC测定。
LC-MS或Western印迹用于表征PBRM-聚合物-药物缀合物中半胱氨酸生物缀合位点的特异性和分布。Western印迹结果给出了药物-聚合物缀合物在PBRM的重(H)和轻(L)链上的位置分布。胰蛋白酶消化物的LC-MS显示与PBRM的缀合发生在重链和轻链链间半胱氨酸铰链区。
对于Western印迹分析，首先使用变性凝胶电泳根据大小分离DTT还原的PBRM-聚合物-药物缀合物，然后将分离的PBRM片段转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，称为“印迹”。使用对药物具有特异性的单克隆抗体，人IgG FC(重链)和人IgG Kappa(轻链)在印迹上检测交联。所有三种抗体检测到的大于50kDa的高分子物类的存在表明通过聚合物-药物缀合物的PBRM的重链和轻链的链间交联已发生。
对于PBRM-聚合物-药物缀合物的胰蛋白酶消化物的LC-MS分析，连接至聚合物-药物缀合物的含马来酰亚胺部分的含半胱氨酸的胰蛋白酶肽的特征是该肽的质量加上马来酰亚胺残基的分子量601Da。结果表明，PBRM的铰链区半胱氨酸与聚合物-药物缀合物相连。
icIEF将PBRM-聚合物-药物缀合物蛋白物类根据它们在pH梯度中的电荷差异分开。icIEF将常规等电聚焦的分辨能力与毛细管电泳的自动化和定量结合在一起。使用全柱成像检测系统在聚焦过程中将样品在实时监测下在高压下在毛细管柱中聚焦。分辨的电荷物类显示为电泳峰，该峰使用280nm的UV吸光度检测。pI标记内的所有主要峰均被积分并分为三个物类：酸性、主要和碱性。通过将单个物类的面积与所有三个物类的总面积进行比较，将每种物类的百分比确定为AUC百分比。还报告了每个物类中最大峰的pI值。
使用多信号沉降速度(MSSV)技术确定PBRM与聚合物-药物缀合物的比例。通过同时获取吸光度和折射率来获取PBRM-聚合物-药物缀合物的沉降速度数据，以获得确定PBRM与聚合物-药物缀合物比例的化学计量所必需的数据。
实施例1：PHF-β-丙氨酸(化合物B)的合成：
Figure GDA0002428537640001361
(“化合物B”)
将PHF(7.5kDa,1.12kg,8.35摩尔,1.0eq)在氮气下溶于DMAc(99％,12.7kg,12体积)，然后在60-65℃下搅拌，并通过在真空下DMAc共沸蒸馏除去残留的水。将溶液冷却至～38℃，然后依次添加吡啶(1.3kg,16.43摩尔,1.97eq)，3-异氰酰丙酸甲酯(402.3g,3.12摩尔,0.37eq)和DMAc(107g)。将所得混合物加热至60±5℃，并继续蒸馏。将所得的稠黄色油冷却至约30℃，然后以两等份添加0.5N NaOH(850g NaOH/41.6kg水,21.25摩尔,2.5eq)，将温度调节至约25℃，并将得到的溶液搅拌至少12小时。使用2N HCl将pH调节至pH6.1，然后将溶液冷却至2-8℃，得到粗产物。
粗产物首先通过Sephadex G-25柱色谱纯化，以除去无机盐，然后进行TFF渗滤(1kDa MWCO膜)，同时将pH保持在7.0±0.1。使用20mM磷酸钠(pH7.0)至20mM磷酸钠和1MNaCl(pH7.0)的多步梯度系统，通过WAX纯化产物。包含具有约29-34％的β-丙氨酸载量(如表1所示，通过SEC分析测定)的PHF-β-丙氨酸(化合物B)的适当级分被合并，并通过TFF渗滤(1kDa MWCO膜)进行浓缩和脱盐，得到标题化合物(461g，～39％产率)，平均分子量为11.9kDa，32.7％β-丙氨酸,PDI<1.5。
1H-NMR(400MHz,D2O):δ4.8-5.1(1H,m,O-CH-O,缩醛质子,聚合物),4.2–4.3(4H,m,-O-CH2,聚合物主链和连接基质子),4.0ppm(1H,m,O-CH-CH2,聚合物主链),3.9(2H,m,CH2,聚合物主链),3.8(4H,m,CH2,聚合物主链,-CH2OH)3.7(2H,m,CH2-NH-,β-丙氨酸和连接基质子),2.4(2H,m,CH2-COOH-,β-丙氨酸和连接基质子)。
表1
级分编号 MWt(KDa) β-丙氨酸(％)
1 4.7
3 5.3
5 7.9 20.8
6 9.8 25.4
7 11.6 29.9
8 12.4 31.6
9 12.9 32.5
10 13.4 33.6
11 13.9 33.9
12 14.3 35.5
13 14.6 36.1
14 14.9 36.7
16 15.3
18 16.5
20 17.7
根据上述程序合成了五批化合物B。表2显示了所产生的化合物B的分析特性。
表2
Figure GDA0002428537640001371
实施例1A.PHF-β-丙氨酸(化合物B)的合成：
Figure GDA0002428537640001372
(“化合物B”)
将PHF(5.5kDa,1.003kg,7.48摩尔,1.0eq)在氮气下溶于DMAc(99％,10kg,10体积)，然后在55-60℃下搅拌，并通过在真空下共沸蒸馏DMAc除去残留的水。将溶液冷却至20-30℃，随后依次加入吡啶(1.18kg,14.95摩尔,2.0eq)，3-异氰酰丙酸甲酯(0.175Kg,1.36摩尔,0.182eq)。将所得混合物加热至55-60℃，并在相同温度下搅拌过夜。通过1HNMR监测反应系统的β-氨基酸载量。加入第二部分3-异氰酰丙酸甲酯(0.135Kg,1.05摩尔,0.140eq.)，并将反应搅拌过夜。通过在55-60℃下真空蒸馏将均匀溶液浓缩至稠浆。将所得的稠黄色油冷却至约20-30℃，然后一批加入0.5N NaOH(200g NaOH/10kg水,5摩尔,0.67eq)，将温度调节至约20-30℃，并将所得溶液搅拌至少15小时。用2N HCl将pH调节至pH6.2，然后将溶液冷却至2-8℃，得到粗产物。将所得溶液用0.22um过滤器过滤。
粗产物通过纳滤(3.5kDa MWCO膜)在四个循环中纯化，以使批料脱盐并浓缩。随后，使用20mM磷酸钠(pH7.0)至20mM磷酸钠和1M NaCl(pH7.0)的多步梯度系统，通过WAX纯化产物。包含如表1A所示具有约27-35％BA载量(通过1H-NMR分析测定)和7-14kDa MW(通过SEC检测)的PHF-β-丙氨酸(化合物B)的适当级分被合并，然后再通过纳滤(3.5kDa MWCO膜)浓缩并脱盐。将所得水溶液进行TFF(50kDa MWCO膜，并收集渗透物作为产物)，然后进行0.2微米过滤，得到标题化合物(461g，～39％产率)，平均分子量为11.9kDa，32.7％β-丙氨酸,PDI<1.5。
1H-NMR(400MHz,D2O):δ4.8-5.1(1H,m,O-CH-O,缩醛质子,聚合物),4.2–4.3(4H,m,-O-CH2,聚合物主链和连接基质子),4.0ppm(1H,m,O-CH-CH2,聚合物主链),3.9(2H,m,CH2,聚合物主链),3.8(4H,m,CH2,聚合物主链,-CH2OH)3.7(2H,m,CH2-NH-,β-丙氨酸和连接基质子),2.4(2H,m,CH2-COOH-,β-丙氨酸和连接基质子)。
表1A
Figure GDA0002428537640001381
Figure GDA0002428537640001391
ND＝未确定
根据上述程序合成六批化合物B。表2A显示了所产生的化合物B的分析特性。
表2A
Figure GDA0002428537640001392
实施例2：(16-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,14-二氧代-7,10-二氧杂-3,13-二氮杂十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(化合物AA)的合成
Figure GDA0002428537640001393
(“化合物AA”)
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(“马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯”，656g，1.54摩尔，1.0eq)在无水DCM(6.4kg)中的冷却的溶液中缓慢加入(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(“N-BOC-乙二胺”,272g,1.70摩尔,1.1eq)的无水DCM(13.5kg，2.0w/w)溶液，同时保持温度低于10℃。将反应混合物在环境温度下搅拌直至RP-HPLC分析表明～98％转化为所需产物。将有机相用水，10％NaCl溶液洗涤，并在旋转蒸发仪上于32℃减压浓缩至约6体积。最后，将标题化合物在EtOAc∶庚烷(2∶1)中沉淀，过滤，用庚烷洗涤两次，并在25℃下真空干燥，得到575g(1.22摩尔，产率80％)。ESI-MS:C21H34N4O8(M+1)471.3。
1H-NMR(400MHz,DMSOd6):δ8.0(1H,m),7.8(1H,m,),7.0(2H,s,),6.8(1H,m),3.6(4H,m),3.5(4H,m),3.4(2H,m),3.3(2H,m),3.1(2H,m),3.0(2H,m),2.3(4H,m),1.4(9H,s)。
13C-NMR(400MHz,DMSOd6):δ135,70,69,66,40,39,38,36,34,28。
实施例2：(16-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,14-二氧代-7,10-二氧杂-3,13-二氮杂十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(化合物AA)的合成
Figure GDA0002428537640001401
(“化合物AA”)
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(“马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯”，140g，0.33摩尔，1.0eq)在无水DCM(1.2kg)中的冷却的溶液中缓慢加入(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(“N-BOC-乙二胺”,58g,0.36摩尔,1.1eq)的无水DCM(0.19kg，2.0w/w)溶液，同时保持温度低于10℃。将反应混合物在环境温度下搅拌直至RP-HPLC分析表明～98％转化为所需产物。将有机相用水，10％NaCl溶液洗涤，并在旋转蒸发仪上于32℃减压浓缩至约6体积。最后，将标题化合物在EtOAc∶庚烷(2∶1)中沉淀，过滤，用庚烷洗涤两次，并在25℃下真空干燥，得到113g(0.24摩尔，产率67％)。ESI-MS:C21H34N4O8(M+1)471.3。
1H-NMR(400MHz,DMSOd6):δ8.0(1H,m),7.8(1H,m,),7.0(2H,s,),6.8(1H,m),3.6(4H,m),3.5(4H,m),3.4(2H,m),3.3(2H,m),3.1(2H,m),3.0(2H,m),2.3(4H,m),1.4(9H,s)。
13C-NMR(400MHz,DMSOd6):δ135,70,69,66,40,39,38,36,34,28。
实施例2A：(16-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,14-二氧代-7,10-二氧杂-3,13-二氮杂十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(化合物AA)的合成
Figure GDA0002428537640001411
(“化合物AA”)
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(“马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯”，140g，0.33摩尔，1.0eq)在无水DCM(1.2kg)中的冷却的溶液中缓慢加入(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(“N-BOC-乙二胺”,58g,0.36摩尔,1.1eq)的无水DCM(0.19kg，2.0w/w)溶液，同时保持温度低于10℃。将反应混合物在环境温度下搅拌直至RP-HPLC分析表明～98％转化为所需产物。将有机相用水，10％NaCl溶液洗涤，并在旋转蒸发仪上于32℃减压浓缩至约6体积。最后，将标题化合物在EtOAc∶庚烷(2∶1)中沉淀，过滤，用庚烷洗涤两次，并在25℃下真空干燥，得到113g(0.24摩尔，产率67％)。ESI-MS:C21H34N4O8(M+1)471.3。
1H-NMR(400MHz,DMSOd6):δ8.0(1H,m),7.8(1H,m,),7.0(2H,s,),6.8(1H,m),3.6(4H,m),3.5(4H,m),3.4(2H,m),3.3(2H,m),3.1(2H,m),3.0(2H,m),2.3(4H,m),1.4(9H,s)。
13C-NMR(400MHz,DMSOd6):δ135,70,69,66,40,39,38,36,34,28。
实施例3：奥瑞斯他汀F羟丙基丙氨酸(AF-HPA-ala)(化合物C)的合成
Figure GDA0002428537640001421
(“化合物C”)
在Parr压力反应器中，向CBz保护的AF-HPA-ala(即化合物CC,250g,0.248摩尔,1.0eq)中添加10％钯/碳(50％湿(37.5g，0.15w/w))，2-丙醇(6.6.kg，26w/w)和TFA(28g,0.248摩尔,1.0eq)。然后使反应器经受50PSI氢气，直到等分试样的分析显示98％转化为标题化合物。首先借助于另外的2-丙醇(786g)过滤反应器的内容物以除去废催化剂，然后加入在2-丙醇(193g)中的TFA(42g，0.368摩尔，1.5eq)。将反应混合物在20℃下搅拌1小时，然后添加叔丁基甲基酯(1.87kg)，并且在～20℃下继续搅拌另外两个小时，然后在～10℃下搅拌过夜。通过过滤分离标题化合物，并在真空下干燥，得到250g(80％产率)，ESI-MS:C46H79N7O9(M+1)873.5。
实施例3A：奥瑞斯他汀F羟丙基丙氨酸(AF-HPA-ala)(化合物C)的合成
Figure GDA0002428537640001422
(“化合物C”)
在20L玻璃反应器中，向CBz保护的AF-HPA-ala(即化合物CC,350g,0.347摩尔,1.0eq)中添加2-丙醇(4.2kg，12w/w)和TFA(39g,0.347摩尔,1.0eq)，然后添加10％钯/碳(50％湿(53g，0.15w/w))。然后使反应器在大气压下经受氢气，直到等分试样的分析显示98％转化为标题化合物。首先借助于另外的2-丙醇(5.5kg)过滤反应器中的内容物以除去废催化剂，然后浓缩至～3vol。加入在2-丙醇(274g)中的TFA(60g,0.515摩尔,1.5eq)。将反应混合物在20℃下搅拌1小时，然后加入叔丁基甲基酯(2.6kg)，并在～20℃下继续搅拌另外两个小时，然后在～10℃下搅拌过夜。通过过滤分离标题化合物，并在真空下干燥，得到334g(85％产率)。ESI-MS:C46H79N7O9(M+1)873.5。
实施例4：式A的聚合物支架的合成
Figure GDA0002428537640001431
在氮气下，在<5℃，向DCM(375g)中的实施例2的产物(28.3g,0.06摩尔,0.04eq)中于20分钟内添加TFA(163g,1.43摩尔,0.95eq)，同时保持温度低于5℃。将所得混合物在环境温度搅拌2小时。通过HPLC分析等分试样表明脱保护反应完成。将反应混合物通过旋转蒸发仪在30℃下浓缩，得到所需产物O-[N-(3-马来酰亚胺基丙酰基)氨基乙基]-O’-[3-(N-(2-氨基乙基)氨基)-3-氧代丙基]乙二醇(“化合物A”)，为油。
在～8℃下单独向PHF-β-丙氨酸(6296g水溶液，以干重计含有257g,1.5摩尔,1.0eq,pH 6.5)中添加ACN/水(55g)中的NHS(47g,0.07摩尔,0.046eq)，然后添加上述制备的化合物A/ACN(594g)。将所得混合物的pH值使用0.1N NaHCO3从pH4.2调节至pH5.4，然后分三部分添加在ACN/水(148g)中的EDC.HCl(36g,0.188摩尔,0.125eq)，最终pH 6。加入EDC.HCl完成后，继续搅拌1.5小时。在通过RP-HPLC监测到消耗了～80％的化合物A之后，添加在ACN/水(64g)中的NHS(16g,0.139摩尔,0.092eq)，随后添加在水(1316g)中的实施例3的产物，AF-HPA-ala或化合物C(132g,0.124摩尔,0.083eq)，然后经1.5小时分批添加ACN/水(272g)中的EDC.HCl(71g,0.370摩尔,0.247eq)。将所得混合物在环境温度搅拌过夜。通过RP-HPLC分析等分试样表明剩余＜1％的AF-HPA-ala。加入NaCl(252g)，继续搅拌1小时，然后将混合物浓缩至～2L，同时保持pH5.0±0.3。使全部浓缩液经历Sephadex G-25色谱以除去盐和未反应的试剂，然后在5-15℃下进行TFF渗滤(1kDa MWCO膜)，同时将pH保持在4至5。
渗余物通过制备型HPLC(丁基HG,
Figure GDA0002428537640001442
10μm,250x50mm,1,000psi柱)进一步纯化，使用25mM乙酸钠和乙腈，pH5.8作为洗脱剂。将包含具有6-10％AF-HPA载量和7-13kDaMW的聚合物支架的选择的级分(基于1H-NMR和SEC分析)合并，进行旋转蒸发，然后进行TFF1kDa MWCO膜)浓缩以除去溶剂，缓冲剂和盐。将所得水溶液进行TFF(100kDa MWCO膜，并收集渗透物作为产物)，然后进行0.1微米无菌过滤。获得标题聚合物支架，是无色至浅琥珀色水溶液(233g,～67％产率,11.4kDa,3.8％MI,9.0％AF-HPA)。
根据上述程序合成了七批式(A)的支架。表3显示了所产生的聚合物支架的分析特性。
表3
Figure GDA0002428537640001441
Figure GDA0002428537640001451
实施例4A：式A的聚合物支架的合成
Figure GDA0002428537640001452
在氮气下，在<5℃，向DCM(459g)中的实施例2A的产物(34.0g,0.072摩尔,0.04eq)中于20分钟内添加TFA(195g,1.71摩尔,0.95eq)，同时保持温度低于5℃。将所得混合物在环境温度搅拌2小时。通过HPLC分析等分试样表明脱保护反应完成。将反应混合物通过旋转蒸发仪在30℃下浓缩，得到所需产物O-[N-(3-马来酰亚胺基丙酰基)氨基乙基]-O’-[3-(N-(2-氨基乙基)氨基)-3-氧代丙基]乙二醇(“化合物A”)，为油。
在～8℃下单独向PHF-β-丙氨酸(1.01kg水溶液，以干重计含有310g,1.80摩尔,1.0eq,pH6.5)中添加ACN/水(37g)中的NHS(8.4g,0.072摩尔,0.04eq)，然后添加上述制备的化合物A/ACN(704g)。将所得混合物的pH值使用0.1N NaHCO3从pH4.2调节至pH5.4，然后分三部分添加在ACN/水(162g)中的EDC.HCl(45g,0.235摩尔,0.125eq)，最终pH6。加入EDC.HCl完成后，继续搅拌1.5小时。在通过RP-HPLC监测到消耗了～80％的化合物A之后，添加在ACN/水(82g)中的NHS(20g,0.170摩尔,0.092eq)，随后添加在水(1605g)中的实施例3A的产物，AF-HPA-ala或化合物C(172g,0.197摩尔,0.083eq)，然后经3.5小时分批添加ACN/水(321g)中的EDC.HCl(85g,0.441摩尔,0.247eq)。将所得混合物在环境温度搅拌过夜。通过RP-HPLC分析等分试样表明剩余＜1％的AF-HPA-ala。加入NaCl(126g)，继续搅拌1小时，然后将混合物用～32L水稀释，同时保持pH5.0±0.3。使全部产物溶液在5–15℃经历TFF渗滤(1kDa MWCO膜)，同时将pH保持在4至5。
渗余物通过制备型HPLC(丁基HG,
Figure GDA0002428537640001462
10μm,250x75mm,>1,000psi柱)进一步纯化，使用25mM乙酸钠和乙腈，pH5.8作为洗脱剂。将包含具有6-10％AF-HPA载量和7-13kDaMW的聚合物支架的选择的级分(基于1H-NMR和SEC分析)合并，用总共～200L水稀释，然后进行TFF(1kDa MWCO膜)浓缩以除去溶剂，缓冲剂和盐。将所得水溶液进行TFF(100kDa MWCO膜，并收集渗透物作为产物)，然后进行0.1微米无菌过滤。获得标题聚合物支架，是无色至浅琥珀色水溶液(233g,50％产率,9.5kDa,3.2％MI,8.9％AF-HPA)。
根据上述程序合成了四批式(A)的支架。表3A显示了所产生的聚合物支架的分析特性。
表3A
Figure GDA0002428537640001461
Figure GDA0002428537640001471
实施例5：还原的PBRM的合成
使用0.5M的碳酸氢钠(pH8.5)将在50mM TEAA或50mM乙酸钠，1mM EDTA，pH7.0中的PBRM溶液(5.0mg/mL)的pH调节至pH7.0±0.5。通过在10分钟内向PBRM溶液中缓慢添加2.0-4.0摩尔当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)，部分还原PBRM中的二硫键。TCEP·HCl添加完成后，将所得溶液在25±2℃下搅拌1.5小时。然后使用1.0M乙酸将所得溶液的pH调节至5.5至7.0。
根据上述程序，使用例如2.4、2.5、2.75、3.0、3.25或3.4摩尔当量的TCEP·HCl，合成多批还原的PBRM。观察到相对于在还原中使用的PBRM的TCEP·HCl的摩尔当量与进一步产生的PBRM-聚合物-药物缀合物的DAR之间的线性关系。用于还原抗体所需的TCEP·HCl的摩尔当量取决于以下因素，包括抗体的性质和进一步产生的PBRM-聚合物-药物缀合物的所需DAR。应当理解，本领域技术人员将能够通过常规实验确定所需的TCEP·HCl摩尔当量。
实施例6：式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的合成
式A的聚合物支架和还原的PBRM的缀合
在20分钟的时间内，将实施例5的还原的PBRM添加至在pH7.0的缓冲剂中的式A的聚合物支架的溶液，以形成比例为0.9(w/w)或0.75(w/w)的式A和PBRM的溶液。将所得溶液在25℃下混合约45至60分钟。
或者，将式A的聚合物支架在pH7.0缓冲剂中的溶液加入实施例5的还原的PBRM中以形成式A的溶液，使得PBRM的比例为0.9(w/w)或0.75(w/w)。
使用式A的聚合物支架和PBRM以0.5∶1至1.2∶1的比例进行多批缀合。缀合反应中使用的式A的聚合物支架与抗体之间的比例取决于以下因素，包括抗体的性质以及所产生的PBRM-聚合物-药物缀合物的所需DAR。应当理解，本领域技术人员将能够通过常规实验确定该比例。
猝灭反应
通过加入25摩尔当量的L-半胱氨酸(相对于抗体)猝灭反应，并将所得的PBRM-聚合物-药物缀合物溶液在25℃下混合30分钟。
式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的纯化
纯化所得的含有式B缀合物的混合物，以除去未反应的式A聚合物支架，具有低和高DAR的不期望的式B缀合物，任何聚集物类和未反应的PBRM，从而提供具有所需DAR的纯化的式B缀合物。用1.0M乙酸将含有PBRM-聚合物-药物缀合物的猝灭溶液的pH值调节至5.8，并将所得混合物通过0.2微米过滤器过滤。含有PBRM-聚合物-药物缀合物的粗混合物通过SCX色谱(POROS HS50)使用从50mM乙酸钠(NaOAc；pH5.8)到50mM乙酸钠和1.0M NaCl(pH5.8)的多步梯度纯化，如下表4所示。洗脱曲线通过UV吸光度监测。SCX色谱旨在去除早期洗脱的酸性级分(高分子量和高DAR)和晚期洗脱的碱性级分(通过WCX分析方法测定的低DAR比，<10)以及任何聚集的物类和未反应的PBRM。收集具有所需DAR的含有式B缀合物的主要级分。
表4
Figure GDA0002428537640001481
Figure GDA0002428537640001491
通过分析型HPLC WCX色谱分析柱级分，以将式B的缀合物分类为酸性(早期洗脱)级分，碱性(晚期洗脱)级分或在酸性和碱性级分之间洗脱的主要级分。
表5显示了通过分析型HPLC WCX色谱纯化的三批式B的缀合物的分析特性。
表5
<u>批号</u> <u>酸性级分(％)</u> <u>主要级分(％)</u> <u>碱性级分(％)</u>
1 14.0 71.0 15.0
2 10.0 86.4 3.6
3 13.5 84.4 2.1
式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的缓冲剂交换
将包含具有所需DAR的式B的缀合物的收集的级分合并，然后使用30kDaMWCO膜将所得溶液与25mM柠檬酸钠和75mM氯化钠(pH5.5缓冲剂)的溶液进行缓冲剂交换。交换完成后，将渗余物通过0.2μm过滤器过滤以提供纯化的式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的溶液。
式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的配制
通过添加25mM柠檬酸钠和75mM氯化钠(pH5.5)的溶液，将纯化的式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的溶液稀释至15mg/mL的浓度。然后通过添加25mM柠檬酸钠，75mM氯化钠和150g/L海藻糖(pH5.5)的溶液将所得溶液配制为10mg/mL的浓度。将所得的式B的PBRM-聚合物-药物缀合物的制剂通过0.22微米的过滤器过滤，并储存在≤-60℃。
根据上述程序合成三批式B的PBRM-聚合物-药物缀合物。表6显示了所产生的PBRM-聚合物-药物缀合物的分析特性。
表6
<u>分析特性</u> <u>批号1</u> <u>批号2</u> <u>批号3</u>
AF-HPA:PBRM 12 12 12
AF-HPA:PHF 3.8 3.8 4
PHF:PBRM 3.2 3.2 2.8
主要级分(％)(WCX) 86.4 84.4 90.3
游离AF-HPA(％) 0.01 nd nd
游离PBRM(％) 1.9 1.0 1.1
本发明可以在不偏离其精神或必要特性的情况下，以其它的具体形式体现。因此，就所有方面而言，上述实施方案均被视为示例性的而非限制本文所描述的发明。因而，本发明的范围由随附的权利要求书而非上述说明书来指定，并且落入权利要求书中的等同意义和范围内的所有变化都意欲囊括于其中。

Claims (92)

1.一种制备式(A)的聚合物支架或其盐的方法：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(A),
该方法包括一个或多个选自以下的步骤：
(1)使
Figure 932629DEST_PATH_IMAGE002
(“化合物A”)与
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(“化合物B”)在形成第一反应混合物的条件下反应；和
(2)将
Figure 849769DEST_PATH_IMAGE004
(“化合物C”)或其盐添加至第一反应混合物中以形成第二反应混合物，该第二反应混合物包含式(A)的支架或其盐；
其中：
化合物B或式(A)的支架包含分子量为约5kDa至约10kDa的聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基-缩甲醛)(PHF)；
m为约20至约75的整数，
n为约7至约40的整数，并且m与n之间的比例为约2∶1至约3∶1，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3是约1至约5的整数，并且
m，m1，m2和m3的总和为约40至约75。
2.权利要求1的方法，其中所述PHF的分子量为约6kDa至约8kDa。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中化合物B的分子量为约6kDa至约13kDa，并且n为m和n之和的约26-34％。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中化合物B的分子量为约7kDa至约12kDa，并且n为m和n之和的约28-32％。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中化合物B的分子量为约10kDa至约12kDa。
6.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括分离式(A)的支架或其盐。
7.权利要求6的方法，其中式(A)的支架或其盐通过反相HPLC分离分离。
8.权利要求7的方法，其中反相HPLC分离用包含乙酸钠缓冲剂和乙腈的流动相进行。
9.权利要求7或8的方法，其中在反相HPLC分离之前，对第二反应混合物进行一次或多次过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合。
10.权利要求7或8的方法，其中在反相HPLC分离之后，对第二反应混合物进行一次或多次过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合。
11.权利要求7或8的方法，其中在所述反相HPLC分离之前，对第二反应混合物进行一种或多种非吸附色谱分离。
12.权利要求7或8的方法，其中在所述反相HPLC分离之后，对第二反应混合物进行一种或多种非吸附色谱分离。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中式(A)的支架的分子量为约4kDa至约18kDa，约5kDa至约17kDa，约6kDa至约16kDa，或约7kDa至约14.5kDa。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中m2为m，m1，m2和m3总和的约5％至约13％，约6％至约12％，约7%至约11％，或约7.5％至约10.5％。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中m2是m，m1，m2和m3总和的约8％至约10％。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中m3为m，m1，m2和m3总和的约2％至约4％。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中在将化合物C或其盐添加到第一反应混合物中之前，消耗了至少80％的化合物A。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中在添加化合物C或其盐之前不分离第一反应混合物。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中化合物A和化合物B的反应在第一温度下在羧酸的活化剂和偶联剂的存在下进行。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中第一反应混合物与化合物C或其盐的反应在第二温度下在羧酸的活化剂和偶联剂的存在下进行。
21.权利要求19或20的方法，其中活化剂是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
22.权利要求19至21中任一项的方法，其中偶联剂是乙基(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)。
23.权利要求19至22中任一项的方法，其中第一温度在约0℃和约15℃之间。
24.权利要求19至23中任一项的方法，其中第二温度在约5℃和约15℃之间。
25.前述权利要求中任一项的方法，该方法进一步包括通过使化合物A的被保护形式脱保护来提供化合物A。
26.权利要求25的方法，其中化合物A的被保护形式是
Figure DEST_PATH_IMAGE005
(“化合物AA”)。
27.权利要求26的方法，该方法进一步包括通过使2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯在约0℃至约25℃之间的温度下，与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯反应提供化合物AA。
28.前述权利要求中任一项的方法，该方法进一步包括通过使PHF与3-异氰酰丙酸甲酯反应以形成化合物B的甲酯并将该甲酯转化为化合物B来提供化合物B。
29.权利要求28的方法，其中PHF的分子量为约5kDa至约10kDa。
30.权利要求28或29的方法，其中PHF的分子量为约6kDa至约8kDa。
31.权利要求28至30中任一项的方法，该方法进一步包括纯化化合物B，使得如此纯化的化合物B的分子量为约6kDa至约13kDa，并且n为m和n之和的约26-34％。
32.权利要求31的方法，其中如此纯化的化合物B的分子量为约7kDa至约12kDa，并且n为m和n之和的约28-32％。
33.权利要求31或32的方法，其中如此纯化的化合物B具有约10kDa至约12kDa的分子量。
34.权利要求31至33中任一项的方法，其中化合物B通过弱阴离子交换色谱分离纯化。
35.权利要求34的方法，其中用包含磷酸钠缓冲剂的流动相进行弱阴离子交换柱分离。
36.权利要求31至35中任一项的方法，其中在弱阴离子交换色谱分离之前，用一次或多次过滤，一次或多次切向流过滤，一次或多次渗滤，一次或多次超滤，一次或多次纳滤或其组合来纯化化合物B。
37.权利要求31至35中任一项的方法，其中在弱阴离子交换色谱分离之前，用一种或多种非吸附色谱分离纯化化合物B。
38.前述权利要求中任一项的方法，该方法进一步包括通过脱保护化合物C的被保护形式提供化合物C或其盐。
39.权利要求38的方法，其中化合物C的被保护形式为
Figure 567190DEST_PATH_IMAGE006
(“化合物CC”)。
40.前述权利要求中任一项的方法，其中化合物C的盐是三氟乙酸盐。
41.前述权利要求中任一项的方法，其中非吸附色谱分离中的至少一种是用包含交联葡聚糖的柱进行的。
42.前述权利要求中任一项的方法，其中非吸附色谱分离中的至少一种是用Sephadex柱进行的。
43.前述权利要求中任一项的方法，其中切向流过滤中的至少一次是用分子量截留在约650Da和1000Da之间的膜进行的。
44.权利要求43的方法，其中膜的分子量截留为约650Da。
45.前述权利要求中任一项的方法，其中纳滤中的至少一次是用分子量截留在约1000Da和4000Da之间的膜进行的。
46.权利要求45的方法，其中膜的分子量截留为约3500Da。
47.前述权利要求中任一项的方法，其中过滤中的至少一次是用分子量截留在约50kDa和100kDa之间的膜进行的，以获得包含式(A)的支架或其盐的渗透物。
48.前述权利要求中任一项的方法，其中由此产生的式(A)的支架或其盐具有至少75％，80％，85％，90％，约95％，约98％或约99％的纯度。
49.前述权利要求中任一项的方法，其中式(A)的支架或其盐是大规模产生的。
50.权利要求49的方法，其中单批产生至少100g的式(A)的支架或其盐。
51.权利要求49或50的方法，其中单批产生至少200g，500g，1kg，1.5kg，2kg或2.5kg的式(A)的支架或其盐。
52.一种制备PBRM-聚合物-药物缀合物的方法，该方法包括：
(1)提供式(A)的聚合物支架或其盐和还原的PBRM；
(2)将还原的PBRM添加到式(A)的聚合物支架或其盐以形成包含式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物的第三反应混合物：
Figure 962399DEST_PATH_IMAGE008
其中：
Xa和Xb之一是H，另一个是水溶性马来酰亚胺基封闭部分，或Xa和Xb与它们所连接的碳原子一起形成碳-碳双键；
PHF的分子量为约5kDa至约10kDa；
m是20到75的整数，
m1是约5至约35的整数，
m2是约3至约10的整数，
m3a是0至约4的整数，
m3b是1至约5的整数，
m，m1，m2，m3a和m3b的总和为约40至约75，并且
m5是2至约10的整数。
53.权利要求52的方法，其中式(A)的聚合物支架或其盐是通过进行权利要求1-51任一项的方法制备的。
54.权利要求52或53的方法，其中通过使PBRM与还原剂反应来制备还原的PBRM。
55.权利要求54的方法，其中PBRM以约1∶2至约1∶4的摩尔比和任选地以约1∶2.4，约1∶2.5，约1∶3.0，或约1∶3.5的摩尔比与还原剂反应。
56.权利要求54或55的方法，其中PBRM的一个或多个二硫键被还原剂还原为一个或多个巯基。
57.权利要求54至56中任一项的方法，其中还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其盐。
58.权利要求54至57中任一项的方法，其中还原剂是三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐。
59.权利要求52至58中任一项的方法，其中使式(A)的聚合物支架或其盐与还原的PBRM以约0.5∶1至约1.2∶1的重量比反应。
60.权利要求59的方法，其中使式(A)的聚合物支架或其盐与还原的PBRM以约0.7∶1至约0.95∶1的重量比反应。
61.权利要求52至60中任一项的方法，其中通过加入马来酰亚胺基封闭化合物来终止式(A)的聚合物支架或其盐与还原的PBRM的反应。
62.权利要求61的方法，其中马来酰亚胺基封闭化合物选自半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸，半胱氨酸甲酯，N-甲基半胱氨酸，2-巯基乙醇，3-巯基丙酸，2-巯基乙酸，巯基甲醇，苄基硫醇及其盐。
63.权利要求62的方法，其中马来酰亚胺基封闭化合物是半胱氨酸。
64.权利要求52至63中任一项的方法，该方法进一步包括从第三反应混合物中分离式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
65.权利要求64的方法，其中式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物用色谱分离分离。
66.权利要求64或65的方法，其中式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物用离子交换色谱分离分离。
67.权利要求64至66中任一项的方法，其中通过强阳离子交换(SCX)色谱分离分离式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
68.权利要求67的方法，其中用包含乙酸钠，氯化钠或其组合的流动相进行强阳离子交换色谱分离。
69.权利要求67或68的方法，其中流动相的pH值为约5至约7。
70.权利要求67至69中任一项的方法，其中流动相的pH值为约5.5至约6.5。
71.权利要求67至70中任一项的方法，其中流动相的pH值为约5.8至约5.9。
72.权利要求67至71中任一项的方法，其中如通过分析型HPLC WCX色谱所确定的，强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除了具有高AF HPA与PBRM比的一种或多种酸性级分。
73.权利要求67至72中任一项的方法，其中如通过分析型HPLC WCX色谱所确定的，强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除了具有低AF HPA与PBRM比的一种或多种碱性级分。
74.权利要求67至73中任一项的方法，其中强阳离子交换色谱分离从第三反应混合物中去除一种或多种聚集的物类和任何未反应的PBRM。
75.权利要求67至74中任一项的方法，其中在强阳离子交换色谱分离期间，收集通过分析型HPLC WCX色谱确定的酸性和碱性级分之间洗脱的一种或多种主要级分，其具有期望的AF HPA与PBRM比，从而提供由此纯化的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
76.权利要求52至75中任一项的方法，其中由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物以约20∶1至约6∶1的比例包含奥瑞斯他汀F羟丙基酰胺(AF HPA)和PBRM。
77.权利要求76的方法，其中AF HPA和PBRM之间的比例为约20∶1，约19∶1，约18∶1，约17∶1，约16∶1，约15∶1，约14∶1，约13∶1，约12∶1，约11∶1，约10∶1，约9∶1，约8∶1，约7∶1或约6∶1。
78.权利要求76或77的方法，其中AF HPA与PBRM之间的比例为约10∶1至约15∶1。
79.权利要求52至78中任一项的方法，其中由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物以约6∶1至约2∶1的比例包含AF HPA和PHF。
80.权利要求79的方法，其中AF HPA与PHF之间的比例为约6∶1，约5∶1，约4∶1，约3∶1或约2∶1。
81.权利要求79或80的方法，其中AF HPA和PHF之间的比例为约4∶1或约3∶1。
82.权利要求52至81中任一项的方法，其中由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物以约6∶1至约2∶1的比例包含PHF和PBRM。
83.权利要求82的方法，其中PHF和PBRM之间的比例为约6∶1，约5∶1，约4∶1，约3∶1或约2∶1。
84.权利要求82或83的方法，其中PHF和PBRM之间的比例为约4∶1或约3∶1。
85.权利要求52至84中任一项的方法，其中由此产生的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物具有至少约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约98％或约99％的纯度。
86.权利要求52至85中任一项的方法，其中大规模产生式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
87.权利要求86的方法，其中单批产生至少200g，500g，1kg，1.5kg，2kg或2.5kg的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
88.通过权利要求1-51中任一项的方法制备的式(A)的聚合物支架或其盐。
89.通过权利要求52-87中任一项的方法制备的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
90.一种制备包含PBRM-聚合物-药物缀合物的药物组合物的方法，该方法包括：
(1)提供式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物；和
(2)向式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物中添加一种或多种药学上可接受的赋形剂以形成药物组合物。
91.权利要求90的方法，其中式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物通过执行权利要求52-87中任一项的方法制备。
92.一种药物组合物，其包含通过前述权利要求中任一项的方法制备的式(B)的PBRM-聚合物-药物缀合物。
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