CN111304164A - 一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞外泌体的制备方法技术领域，且公开了一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，该脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，制备的外泌体采用常规方法，对外泌体进行流式细胞仪分析，数据用Flow Software7.6.1软件分析，结果表明，外泌体中CD29，CD44，CD90及CD105均为阳性表达，阳性率分别为97.7%，89.3%，97.1%及84.6%，CD34及CD45为阴性表达，阴性率分别为97.7%和92.7%，提高了后期的使用，解决了美容制剂其修复受损和抗衰老的效果不理想，以及普遍存在稳定性不佳，生产成本偏高的问题，从而达到提高其修复受损和抗衰老的效果，提高稳定性和降低生产成本的目的。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞外泌体的制备方法技术领域，具体为一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞是重要的种子细胞之一，具有自我更新和多向分化潜能，其遗传信息稳定，可通过较简单的方法大量提取。与其他间充质干细胞的来源相比，脂肪组织是来源更丰富、可消耗且容易获得的组织，因此，脂肪间充质干细胞逐渐成为干细胞研究的新宠，对脂肪间充质干细胞的研究也越来越多。但是，由于脂肪间充质干细胞储存条件较苛刻，运输不便，临床应用较困难。
外泌体是一种经细胞内体途径生成并释放到细胞外的囊性小泡，由磷脂双层膜包被，其内包裹脂质、蛋白质、核酸等多种生物活性物质，电镜下观察呈杯状，是参与细胞间物质转运与信息传递的重要角色。新近研究表明，外泌体在细胞间信号通讯中发挥要作用，具有免疫调节、促进血管再生、以及介导细胞增殖、分化、迁移、凋亡等功能，维持机体的正常生理状态与参与疾病进程。其中间充质干细胞来源外泌体具有来源细胞特性，能促进受损区域细胞自我修复与组织再生，恢复组织内稳态，加速创面修复等功能。
人脂肪间充质干细胞分泌的外泌体，其结构稳定，不易分解，为脂肪间充质干细胞在临床应用提供了新的可能性。
而传统的外泌体制备技术，包括超离、超滤、磁珠免疫、PEG沉淀法等，其制备的外泌体中CD29，CD44，CD90及CD105均为阳性表达，阳性率分别低于80%，CD34及CD45为阴性表达，阴性率分别低于90%,影响了后期的使用，而且现有许多美容制剂其修复受损和抗衰老的效果不理想。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，解决了现有设备制备的外泌体中CD29，CD44，CD90及CD105均为阳性表达，阳性率分别低于70.1，CD34及CD45为阴性表达，阴性率分别低于90%，而且美容制剂其修复受损和抗衰老的效果不理想，以及普遍存在稳定性不佳，生产成本偏高等情况的问题。
（二）技术方案
本发明提供如下技术方案：一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，所述制备方法至少包括如下步骤：
（1）对人脂肪间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加诱导剂；
（2）对培养后的干细胞进行预处理；
（3）在预处理后的培养基上清液中提取所述的人脂肪间充质干细胞源外泌体；
（4）外泌体制剂的制备。
优选的，所述外泌体为间充质干细胞分化而来。
优选的，所述间充质干细胞源为人脂肪间充质干细胞。
优选的，还包括一种人脂肪间充质干细胞的培养方法：
（1）取吸脂术后脂肪30mL，用含青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗3遍，去除筋膜及红细胞后，加入30ml的0.075%Ⅰ型胶原酶[7-11]，在37℃、150r/min的条件下，消化,40-45min；
（2）加入等体积含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化，15 000 r/min离心10min，去除上层油脂及中层清液，用5mL红细胞裂解液重悬，室温静置5 min，1000r/min离心5 min；
（3）去除上清液，用含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬， 70 μm细胞筛网过滤后，移入培养皿行原代培养，每隔三天换液，细胞浓度融合生长至70%-80%时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代培养；
（4）取3-6代细胞，细胞融合生长至70-80%时，换无血清培养基培养24-48h，收集细胞上清液，收集的细胞上清液保存于-80℃冰箱。
优选的，还包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的提取方法：
（1）在4℃、无菌条件下，将收集的上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片；10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡；再用0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体；
（2）用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体；
（3）106×g离心70min，去除清液，用100μLPBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
优选的，包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的冻干粉美容制剂制备方法：
（1）取外泌体，加入10%的甘露醇，混匀后用0.22 μm针头滤器过滤，分装后放入-80 ℃冰箱10小时。然后再真空下进行冻干（-50℃，24h），得到人间充质干细胞外泌体冻干粉；
（2）称取外泌体冻干粉10mg，葡糖胺基葡聚糖15mg，透明质酸15mg，海藻糖10mg，溶解于100ml甘油中，混合搅拌至透明状，用0.22μm针头滤器过滤，即得到所述美容制剂。
（三）有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，具备以下有益效果：
（1）该脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，制备的外泌体采用常规方法，对外泌体进行流式细胞仪分析，数据用Flow Software7.6.1软件分析，结果表明，外泌体中CD29， CD44，CD90及CD105均为阳性表达，阳性率分别为 97.7%，89.3%，97.1%及84.6%，CD34及CD45为阴性表达，阴性率分别为97.7%和92.7%，提高了后期的使用。
（2）该脂肪来源干细胞外泌体的应用，解决了美容制剂其修复受损和抗衰老的效果不理想，以及普遍存在稳定性不佳，生产成本偏高的问题，从而达到提高其修复受损和抗衰老的效果，提高稳定性和降低生产成本的目的。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，所述制备方法至少包括如下步骤：
（1）对人脂肪间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加诱导剂；
（2）对培养后的干细胞进行预处理；
（3）在预处理后的培养基上清液中提取所述的人脂肪间充质干细胞源外泌体；
（4）外泌体制剂的制备。
进一步的，外泌体为间充质干细胞分化而来。
进一步的，所述间充质干细胞源为人脂肪间充质干细胞。
进一步的，还包括一种人脂肪间充质干细胞的培养方法：
（1）取吸脂术后脂肪30mL，用含青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗3遍，去除筋膜及红细胞后，加入30ml的0.075%Ⅰ型胶原酶[7-11]，在37℃、150r/min的条件下，消化,40-45min；
（2）加入等体积含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化，15 000 r/min离心10min，去除上层油脂及中层清液，用5mL红细胞裂解液重悬，室温静置5 min，1000r/min离心5 min；
（3）去除上清液，用含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬， 70 μm细胞筛网过滤后，移入培养皿行原代培养，每隔三天换液，细胞浓度融合生长至70%-80%时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代培养；
（4）取3-6代细胞，细胞融合生长至70-80%时，换无血清培养基培养24-48h，收集细胞上清液，收集的细胞上清液保存于-80℃冰箱。
进一步的，还包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的提取方法：
（1）在4℃、无菌条件下，将收集的上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片；10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡；再用0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体；
（2）用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体；
（3）106×g离心70min，去除清液，用100μLPBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
一种人脂肪间充质干细胞外泌体的冻干粉美容制剂制备方法：
（1）取外泌体，加入10%的甘露醇，混匀后用0.22 μm针头滤器过滤，分装后放入-80℃冰箱10小时。然后再真空下进行冻干（-50℃，24h），得到人间充质干细胞外泌体冻干粉；
（2）称取外泌体冻干粉10mg，葡糖胺基葡聚糖15mg，透明质酸15mg，海藻糖10mg，溶解于100ml甘油中，混合搅拌至透明状，用0.22μm针头滤器过滤，即得到所述美容制剂。
综上所述，该脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，制备的外泌体采用常规方法，对外泌体进行流式细胞仪分析，数据用Flow Software7.6.1软件分析，结果表明，外泌体中CD29， CD44，CD90及CD105均为阳性表达，阳性率分别为97.7%，89.3%，97.1%及84.6%，CD34及CD45为阴性表达，阴性率分别为97.7%和92.7%。
该脂肪来源干细胞外泌体的应用，解决了美容制剂其修复受损和抗衰老的效果不理想，以及普遍存在稳定性不佳，生产成本偏高的问题，从而达到提高其修复受损和抗衰老的效果，提高稳定性和降低生产成本的目的。
实验例1：通过实施例、超离、超滤、磁珠免疫和PEG沉淀法制备外泌体体，每种方法
制备各两份，每份均为10g。
| 阳性/% | CD29 | CD44 | CD90 | CD105 |
| 超离 | 85 | 80 | 84 | 76 |
| 超滤 | 80 | 73 | 81 | 76 |
| 磁珠免疫 | 84 | 75 | 83 | 72 |
| PEG沉淀法 | 79 | 77 | 76 | 78 |
| 实施例 | 97.7 | 89.3 | 97.1 | 84.6 |
| 阴性/% | CD34 | CD45 |
| 超离 | 85 | 87 |
| 超滤 | 90 | 83 |
| 磁珠免疫 | 94 | 79 |
| PEG沉淀法 | 89 | 80 |
| 实施例 | 97.7 | 92.7 |
判断方法：制备的外泌体采用常规方法，对外泌体进行流式细胞仪分析，数据用FlowSoftware7.6.1软件分析。
结构表明：制备的外泌体采用常规方法，对外泌体进行流式细胞仪分析，数据用Flow Software7.6.1软件分析，结果表明，外泌体中CD29， CD44，CD90及CD105均为阳性表达，阳性率分别为 97.7%，89.3%，97.1%及84.6%，CD34及CD45为阴性表达，阴性率分别为97.7%和92.7%，提高了后期的使用。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法至少包括如下步骤：
（1）对人脂肪间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加诱导剂；
（2）对培养后的干细胞进行预处理；
（3）在预处理后的培养基上清液中提取所述的人脂肪间充质干细胞源外泌体；
（4）外泌体制剂的制备。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体为间充质干细胞分化而来。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞源为人脂肪间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法和应用，其特征在于，还包括一种人脂肪间充质干细胞的培养方法：
（1）取吸脂术后脂肪30mL，用含青霉素-链霉素双抗的PBS冲洗3遍，去除筋膜及红细胞后，加入30ml的0.075%Ⅰ型胶原酶[7-11]，在37℃、150r/min的条件下，消化,40-45min；
（2）加入等体积含体积分数10%胎牛血清的 DMEM/F12培养基终止消化，15 000 r/min离心10min，去除上层油脂及中层清液，用5mL红细胞裂解液重悬，室温静置5 min，1000r/min离心5 min；
（3）去除上清液，用含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，70μm细胞筛网过滤后，移入培养皿行原代培养，每隔三天换液，细胞浓度融合生长至70%-80%时，用体积分数0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2传代培养；
（4）取3-6代细胞，细胞融合生长至70-80%时，换无血清培养基培养24-48h，收集细胞上清液，收集的细胞上清液保存于-80℃冰箱。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，还包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的提取方法：
（1）在4℃、无菌条件下，将收集的上清液，300×g离心10min，去除死细胞和大的细胞碎片，2000×g离心10min，去除死细胞和细胞碎片；10000×g/min离心30min去除细胞碎片较大的囊泡；再用0.22μm针头滤器过滤，去除微泡及可能存在的凋亡小体；
（2）用20mL空针将上清液转移至超速离心管中，106×g离心70min，去除上清液，收集沉淀，得到粗提取的外泌体；
（3）106×g离心70min，去除清液，用100μLPBS溶解沉淀，得到较纯的外泌体。
6.根据权利要求1所述的一种脂肪来源干细胞外泌体的应用，其特征在于，包括一种人脂肪间充质干细胞外泌体的冻干粉美容制剂制备方法：
（1）取外泌体，加入10%的甘露醇，混匀后用0.22 μm针头滤器过滤，分装后放入-80℃冰箱10小时。
7.然后再真空下进行冻干（-50℃，24h），得到人间充质干细胞外泌体冻干粉；
（2）称取外泌体冻干粉10mg，葡糖胺基葡聚糖15mg，透明质酸15mg，海藻糖10mg，溶解于100ml甘油中，混合搅拌至透明状，用0.22μm针头滤器过滤，即得到所述美容制剂。
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