CN111270005B

CN111270005B - 水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记及其应用

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Publication number: CN111270005B
Application number: CN202010217817.XA
Authority: CN
Inventors: 方军; 于洋; 刘奕媺; 沙汉景
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2024-07-30
Anticipated expiration: 2040-03-25
Also published as: CN111270005A

Abstract

水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记及其应用，涉及一种鉴别水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型的分子标记及其应用。本发明的目的是提供一种水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记及其应用，用以鉴别水稻强抗逆基因型。用于特异性PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物：5’‑CACCCGCACAACCACAAC‑3’，反向引物：5’‑GAGTGTGACAAGGGTGAGGAG‑3’。分子标记在鉴定或筛选水稻强抗逆性优势品种中的应用。本发明发现了水稻耐碱转录因子基因OsIDEF1在调控植物应答碱胁迫过程中具有重要作用，并发现OsIDEF1在自然界中存在不同基因型差异。本发明应用于水稻抗逆育种领域。

Description

水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种鉴别水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型的分子标记及其应用。

背景技术

水稻是世界上食用人口最多、历史最悠久的农作物。全球25亿以上的人口以水稻为主食。中国稻作历史约有七千年，我国不仅是世界栽培稻起源地之一，也是世界上的产稻大国，稻作播种面积仅次于印度，约占世界水稻总面积的1/6，产量居世界第一，约占世界水稻总产量的27.5％。据估计，到2030年需要多生产40％的水稻以满足人们日益增长的粮食需求。

我国大约有1亿hm²盐碱地与滩涂地，面积相当于2017年我国粮食耕地面积的80％。其中东北松嫩平原是世界上苏打盐碱化土壤的最大集中分布区，盐碱地面积高达765万hm²，约占我国盐碱地面积的7.7％。科学合理地开发和利用这些土地资源将为我国粮食安全提供更好地保障，创造巨大的经济效益、社会效益和生态效益。因此，如何提高作物耐碱性是我国乃至全世界农业生产亟待解决的重大问题。如何准确、快速的鉴定具有强抗逆能力的基因型，将有利于抗逆水稻品种的选育，从而提高水稻抗逆育种的技术水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记及其应用，用以鉴别水稻强抗逆基因型。

本发明提供一种水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记，用于特异性PCR扩增该分子标记的引物为：

正向引物：5’-CACCCGCACAACCACAAC-3’

反向引物：5’-GAGTGTGACAAGGGTGAGGAG-3’

本发明还提供水稻OsIDEF1基因在调控水稻抗逆性中的应用。

进一步的，所述抗逆性为抗碱胁迫。

进一步的，所述抗碱胁迫为抗NaHCO₃胁迫。体现为在NaHCO₃胁迫的条件下：转基因植物的萌发率或存活率高于受体植物、转基因植物的根长长于受体植物、转基因植物的叶绿素含量高于受体植物。所述植物为水稻。

本发明还提供上述分子标记在鉴定或筛选水稻强抗逆性优势品种中的应用。

进一步的，所述抗逆性为抗碱胁迫。所述抗碱胁迫为抗NaHCO₃胁迫。

进一步的，所述鉴定或筛选方法为：

一、提取待测水稻的基因组DNA；

二、以步骤一获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为：正向引物5’-CACCCGCACAACCACAAC-3’，反向引物5’-GAGTGTGACAAGGGTGAGGAG-3’；

三、检测PCR扩增产物，如果PCR产物大小为103bp，则待测水稻为长白9号，属于强抗逆性优势品种。

其中步骤二所述PCR扩增反应体系为50μl：

步骤二所述PCR反应程序为：

4℃终止反应。

本发明的有益效果：

本发明发现了水稻耐碱转录因子基因OsIDEF1在调控植物应答碱胁迫过程中具有重要作用，并发现OsIDEF1在自然界中存在不同基因型差异。

本发明提供的分子标记能快速鉴定水稻强抗逆性，筛选出耐碱能力更强的水稻品种长白9号。

本发明通过同源克隆，构建CRISPR/Cas9突变体，在水稻中超量表达不同基因型OsIDEF1基因以及利用同一背景不同基因型OsIDEF1的染色体片段代换系，详细地阐述了耐碱水稻品种长白9号和盐碱敏感品种吉粳88中OsIDEF1基因型差异及耐碱功能差异。本发明的实验证明，OsIDEF1基因具有较强的耐碱能力，将该基因超表达于水稻中可显著增强水稻在萌发期和幼苗期对碱胁迫的耐性，且长白9号基因型OsIDEF1相较于吉粳88型具有较强的耐碱能力。说明该基因型可以为培育耐盐碱转基因植物及筛选耐盐碱水稻品种研究奠定基础。

附图说明

图1.水稻OsIDEF1基因的克隆

图2.长白9号品种与吉粳88品种中OsIDEF1的序列差异模式图

图3.长白9号品种与吉粳88品种中OsIDEF1蛋白序列比对

图4.不同基因型OsIDEF1的PCR鉴定

图5.不同品种中OsIDEF1基因在水稻地上和地下部分的表达量分析

图6.水稻根中OsIDEF1在碱胁迫下的表达模式分析

图7.水稻叶中OsIDEF1在碱胁迫的表达模式分析

图8.OsIDEF1基因的昼夜节律周期表达模式分析

图9.不同基因型OsIDEF1的亚细胞定位分析

图10.idef1突变体的靶点设计

图11.idef1突变体水稻植株的鉴定

图12.idef1突变体碱胁迫下表型分析

图13.idef1突变体碱胁迫下株高的测定

图14.idef1突变体碱胁迫下根长的测定

图15.不同背景染色体片段代换系OsIDEF1基因型的鉴定

图16.越光背景及其代换系在碱胁迫下的表型分析

图17.SaSanishiki背景及其代换系在碱胁迫下的表型分析

图18.OsIDEF1转基因植株的抗性基因PCR检测

图19.J88背景转基因植株中OsIDEF1表达量检测

图20.C9背景转基因植株中OsIDEF1表达量检测

图21.J88背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株萌发期碱胁迫下表型

图22.J88背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株萌发期碱胁迫下根长统计

图23.J88背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株幼苗期碱胁迫下表型

图24.J88背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株的叶绿素含量检测

图25.C9背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株萌发期碱胁迫下表型

图26.C9背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株萌发期碱胁迫下根长统计

图27.C9背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株幼苗期碱胁迫下表型

图28.C9背景及不同基因型OsIDEF1超量表达植株的叶绿素含量检测

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：水稻不同基因型OsIDEF1基因的克隆

1、植物材料的处理

挑选饱满的水稻盐碱敏感型品种吉粳88和耐盐碱型品种长白9号的种子，首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。7天后，待其长成幼苗，取其根部组织迅速冷冻于液氮中，然后置于-80℃保存备用。

2、RNA提取

采用Trizol法(Takara)提取上述水稻根的总RNA。

3、cDNA的获得

以上述总RNA为模板，采用反转录试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)反转录得到cDNA。

4、PCR扩增

以上述不同水稻品种的cDNA为模板，采用Phanta高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增引物序列如下：

OsIDEF1-KS：5’-GCGTGAAGAGAAATTAAGTGAGGG-3’(序列表中SEQ ID NO：5)；

OsIDEF1-KAS：5’-CAACTAACACTGTTGCAATTAACCC-3’(序列表中SEQ ID NO：6)。

高保真酶Phanta扩增反应体系(50μl)：

反应程序：

4℃终止反应。

将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，得到分子量略大于1Kb的条带，将含有目的条带的胶块切下，送交测序公司进行序列测定。

5、测序结果分析

测序结果表明：PCR扩增长白9号和吉粳88中OsIDEF1基因分别得到大小为1174bp和1162bp的扩增产物，分别包含完整的长1089bp和1077bp的ORF，说明OsIDEF1基因在吉粳88和长白9中存在基因型差异。如图2所示，吉粳88品种中OsIDEF1基因与长白9品种中OsIDEF1基因相比缺少12个碱基，导致其缺少4个保守的氨基酸(图3)。因此，长白9号和吉粳88中分别存在两种不同基因型的OsIDEF1基因。其中水稻长白9号基因型OsIDEF1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。吉粳88基因型OsIDEF1的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。水稻长白9号基因型OsIDEF1的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。水稻吉粳88基因型OsIDEF1的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

根据其差异位点附近核酸序列，设计鉴定引物如下：

IDEF1-Iden-S:5’-CACCCGCACAACCACAAC-3’(序列表中SEQ ID NO：7)；

IDEF1-Iden-AS:5’-GAGTGTGACAAGGGTGAGGAG-3’(序列表中SEQ ID NO：8)。

如图4所示，利用该鉴定引物以不同品种DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物大小分别为103bp和91bp，通过4％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，能够明显区分不同基因型的OsIDEF1基因。

实施例2：水稻不同基因型OsIDEF1的表达特性分析

一、水稻不同品种中OsIDEF1基因的相对表达量

1、植物材料的处理

挑选饱满的水稻品种吉粳88和长白9的种子，首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到盛有木村营养液的育苗钵中，将其放置于人工气候室中培养。待幼苗长至2周龄时，分别取水稻地上部分和地下部分，迅速放入液氮中冷冻，置于-80℃保存待用。

2、总RNA的提取和cDNA的获得

采用Trizol试剂(Takara)分别提取上述步骤1获得的不同组织样品的总RNA；以获得总RNA为模板，通过反转录试剂盒TransScript(TRANSGEN BIOTECH)反转录获得cDNA。

3、Real-time PCR

以上述cDNA为模板，采用OsIDEF1基因特性性引物IDEF1-qS和IDEF1-qAS，通过Real-time PCR对不同品种中OsIDEF1基因进行表达量检测。引物序列如下所示：

IDEF1-qS：5’-GAGGCTAGTCTTCCACCTTTG-3’(序列表中SEQ ID NO：9)；；

IDEF1-qAS：5’-TGGCCAGTACCTGTACTTAAAC-3’(序列表中SEQ ID NO：10)。

反应体系和反应条件如下：

反应程序：

Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以水稻Ubi5基因为内参基因。目标基因表达差异通过长白9号的样本相对于吉粳88的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。内参基因引物序列如下所示：

Ubi5-S：5'-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3'(序列表中SEQ ID NO：11)；

Ubi5-AS：5'-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3'(序列表中SEQ ID NO：12)。

结果如图5所示：OsIDEF1基因在水稻植株的地上和地下部分均有所表达，并且在地上部分的表达量略高于地下部分，但是在长白9和吉粳88不同品种中的表达量差异不显著。表明OsIDEF1基因序列差异并没有影响其在不同品种中的表达水平。

二、OsIDEF1基因在碱胁迫处理下的表达模式分析

1、植物材料的处理

由于OsIDEF1在长白9号和吉粳88品种中表达量没有显著差异，因此，本实验只选用长白9号品种进行碱胁迫下的表达模式分析。挑选饱满的水稻品种长白9号的种子，首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。待水稻幼苗长至2周龄，分别转移至正常木村营养液和含有50mM NaHCO₃(pH 8.3+0.2)木村营养液中对水稻幼苗进行碱胁迫处理，分别在处理0h、3h、6h、9h、12h、24h各个时间点选取3株长势相同的水稻幼苗，分别剪取其根部和叶片组织作为待测组织样品，迅速放于液氮中冷冻，然后置于-80℃保存备用。

2、总RNA的提取和cDNA的获得

3、Real-time PCR

以上述cDNA为模板，采用IDEF1-qS和IDEF1-qAS引物，通过Real-time PCR对不同品种在正常条件或碱胁迫条件下的根和叶中的OsIDEF1基因进行表达量检测。反应体系和反应条件如上所述。

结果如图6和7所示(图中虚线表示正常处理条件，实线表示50mM NaHCO₃处理)：在正常处理条件下，根部及叶片组织中OsIDEF1表达量变化趋势基本一致，仅在12小时后出现些微上调并于24小时恢复至起始表达水平。在50mM NaHCO₃处理下，根和叶中OsIDEF1表达均呈现先下调后上调再下降趋于平稳的趋势，且在根中胁迫处理6h时达到最高值，约为处理前的4倍；而在叶中碱胁迫处理12小时后达到最高，约为处理前的4.5倍，说明OsIDEF1基因的表达受碱胁迫的诱导，是水稻中碱胁迫应答基因。

三、水稻OsIDEF1基因的昼夜节律表达变化分析

1、植物材料的处理

挑选饱满的水稻品种长白9号的种子，首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到盛有湿润土壤的育苗桶中，将其放置于人工气候室中培养。待幼苗长至2周龄时，从一个光照周期开始每隔4小时取一次材至24小时，之后隔12小时(第36小时)再取材一次，迅速放入液氮中冷冻，置于-80℃保存待用。

2、总RNA的提取和cDNA的获得

3、Real-time PCR

以上述cDNA为模板，采用IDEF1-qS和IDEF1-qAS引物，通过Real-time PCR对不同品种中OsIDEF1基因进行表达量检测。结果如图8所示(图中实线表示幼苗，虚线表示根)：OsIDEF1基因具有昼夜节律性变化，在夜晚无光照时表达量较白天有光照时表达量显著升高。

实施例3：不同基因型OsIDEF1的亚细胞定位分析

一、亚细胞定位载体的构建

1.入门载体的构建

分别以水稻吉粳88和长白9号品种总cDNA为模板，采用IDEF1-pQBV3-S和IDEF1-pQBV3-AS引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物即OsIDEF1编码基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列，其左侧为保护碱基)：

IDEF1-pQBV3-S：

5'-AAAGCAGGCTCAGGGGATATCATGGGGCAAATGGACGGC-3'(序列表中SEQ ID NO：13)；

IDEF1-pQBV3-AS：

5'-AGCTGGGTGCAGGGCGATATCCTAGGGATTTGTTGTCTGCTGATG-3'(序列表中SEQ IDNO：14)。

用EcoRV限制性内切酶对入门载体pQBV3进行酶切使其线性化，然后使用一步克隆法将目的片段与线性载体进行重组连接，得到含不同基因型OsIDEF1基因的重组载体pQBV3-IDEF1_(C9)和pQBV3-IDEF1_(J88)。

2、Gateway系统表达载体构建

根据Invitrogen公司的LR Clonase^TM ⅡEnzyme Mix说明书，将使用一步克隆法构建的入门载体通过LR反应构建到Gateway系统与GFP融合表达载体pH7WGF2.0上。其中载体pH7WGF2.0由其他实验室馈赠，已公开发表文章“Karimi,M.,De Meyer,B.andHilson,P.Modular cloning in plant cells.Trends Plant Sci.2005,10(3):103-105”。

LR反应体系：

二、农杆菌介导法侵染烟草及亚细胞定位观察

得到目的质粒后转化农杆菌菌株GV3101，将目的质粒的农杆菌重悬液与含p19的农杆菌重悬液两者等比例混合。选取生长4～5周，长势良好，叶色深绿，叶片肥厚的烟草叶片进行农杆菌注射。首先用1mL注射器针头在烟草叶片上扎一个小孔，然后去掉针头，将菌液从烟草叶片背部注射到烟草叶片内。每个组合至少注射3片以上烟草叶片。注射后48h，通过激光共聚焦显微镜进行GFP荧光的观察。观察前2h在注射部位涂抹100ng/mL的DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)溶液。

结果图9所示：GFP阳性对照在细胞内的整个区域都有表达，整个细胞均能够检测到绿色荧光信号，而不同基因型OsIDEF1蛋白均主要定位在细胞核中。

实施例4：idef1突变体的获得及其在碱胁迫下的表型分析

1.CRISPR/Cas9编辑载体构建

根据OsIDEF1基因的cDNA序列，使用CRISPR Primer Designer软件设计一段OsIDEF1的打靶sgRNAs，连入CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中，连接U3启动子的打靶引物IDEF1-LP和IDEF1-RP的核苷酸序列如下：

IDEF1-LP：5'-GCCGTGGGAGTGGGAGTGTGACA-3'(序列表中SEQ ID NO：15)

IDEF1-RP：5'-AAACTGTCACACTCCCACTCCCAC-3'(序列表中SEQ ID NO：16)

目的载体转化农杆菌EHA105，农杆菌介导法转入黑龙江主栽水稻品种松粳2中。OsIDEF1突变体打靶位点示意图如图10所示。

2.idef1突变体植株的分子鉴定

提取转基因植物DNA，在打靶sgRNAs两端设计引物，通过PCR扩展包含打靶区域的片段，测序分析打靶效果。打靶效果检测引物IDEF1-dabaS和IDEF1-dabaR序列如下:

IDEF1-dabaS：5'-AGACCGTCCCCTTTCCCAAT-3'(序列表中SEQ ID NO：17)

IDEF1-dabaR：5'-ATCTGTAGCTCTGAACAACGCAAC-3'(序列表中SEQ ID NO：18)

idef1突变体打靶效果检测结果如图11所示，得到两个突变体株系。idef1-1突变体为单碱基缺失，导致OsIDEF1蛋白编码移位，提前终止；另一种idef1-2为三碱基突变，导致缺失一个氨基酸。考虑到一个氨基酸的缺失可能对蛋白功能影响不大，选择单碱基缺失类型的idef1突变体用于下一步研究。

5.idef1突变体植株在碱胁迫下的表型分析

挑选饱满的松粳2号及idef1突变体的种子，首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。正常培养7天后开始进行碱胁迫处理，将其转移至含有50mM NaHCO₃(pH 8.3±0.2)的木村营养液中继续培养，每天观察其表型变化，当处理7天时野生型及突变体表型差异明显，此时拍照并测量其株高及根长差异。

结果如图12所示：相较于野生型，idef1突变体对碱胁迫更为敏感，出现明显的黄化、萎蔫并且生长缓慢。同时株高和根长测量结果也表明idef1突变体的生长受到显著的抑制(图13和14)。

实施例5：不同背景OsIDEF1基因染色体片段代换系的耐碱功能分析

一、不同背景OsIDEF1基因型的鉴定

1、植物材料的处理

挑选饱满的水稻品种越光及越光背景NonaBokra的代换系SH160和SH163，Sasanishiki背景及Sasanishiki背景的越光代换系SH155共四类种子，首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入营养液中，将其放置于人工气候箱中培养。7天后，待其长成幼苗，取其幼嫩新叶组织迅速冷冻于液氮中，然后置于-80℃保存备用。本实施例所用的水稻品种代换系均购买自日本水稻基因组资源中心(Rice Genome Resource Center，RGRC)。

某个品种的代换系就是指这个品种的一部分染色体被另一个品种替换了，比如越光背景NonaBokra的代换系就是指越光水稻中一部分染色体被NonaBokra品种的染色体替换了，导致这一部分的染色体的基因来源于NonaBokra，而不是本来的越光的。SH160和SH163是代换系的编号，这两个代换系恰好是IDEF1基因所在的染色体区段由越光的变成了NonaBokra的，而除了这一段染色体变化，其他染色体仍然是越光本身的，所以可以来研究IDEF1的变化带来的改变。

2、不同基因型OsIDEF1的分子鉴定

用上述取材组织提取植株总DNA，利用基因型鉴定引物，以该DNA为模板，同时以吉粳88和长白9号品种作为对照，通过PCR扩增差异片段，利用4％凝胶电泳跑胶区分片段是否存在差异。

结果如图15所示：越光品种中OsIDEF1基因型与长白9号品种基因型一致，而NonaBokra和Sasanishiki品种中OsIDEF1基因型与吉粳88中OsIDEF1基因型一致，因此可以利用越光及越光背景NonaBokra的代换系SH160和SH163，Sasanishiki背景及Sasanishiki背景的越光代换系SH155来验证这两种基因型OsIDEF1是否对水稻耐碱功能产生影响。

二、越光背景染色体片段代换系的耐碱功能分析

挑选饱满的越光及越光背景而OsIDEF1所在染色体片段被NonaBokra品种染色体片段替换的代换系的种子。首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。正常培养2周后开始进行碱胁迫处理，将其转移至含有50mM NaHCO₃(pH 8.3±0.2)的木村营养液中继续培养，每天观察其表型变化。

结果如图16所示：随着碱胁迫处理时间的增长，越光及其代换系均表现出受损表型，包括叶片发黄，萎蔫，生长迟缓等，然后代换系表现出更为敏感的表型，受损更为严重，即使后期恢复正常木村营养液处理其表型也没有恢复。说明含有NonaBokra中的OsIDEF1片段也就是吉粳88型OsIDEF1基因的植株对碱胁迫耐受能力较弱。

三、Sasanishiki背景染色体片段代换系的耐碱功能分析

挑选饱满的Sasanishiki及Sasanishiki背景而OsIDEF1所在染色体片段被越光品种染色体片段替换的代换系的种子。首先浸种，将种子浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。正常培养2周后开始进行碱胁迫处理，将其转移至含有50mM NaHCO₃(pH 8.3±0.2)的木村营养液中继续培养，每天观察其表型变化。

结果如图17所示：随着碱胁迫处理时间的增长，Sasanishiki及其代换系均表现出受损表型，包括叶片发黄，萎蔫，生长迟缓等，然而Sasanishiki表现出更为敏感的表型，受损更为严重，即使后期恢复正常木村营养液处理其表型也没有恢复。相反其越光代换系表现较好，耐碱性较强。说明含有Sasanishiki中的OsIDEF1片段也就是吉粳88型OsIDEF1基因的植株对碱胁迫耐受能力较强，含有越光中的OsIDEF1片段也就是长白9型OsIDEF1基因的植株对碱胁迫耐受能力较强。

实施例6：不同背景转不同基因型OsIDEF1水稻植株的获得

1、不同基因型OsIDEF1基因植物表达载体的构建

根据Invitrogen公司的LR Clonase^TM ⅡEnzyme Mix说明书，使用实施例3中的得到的pQBV3-IDEF-J88,pQBV3-IDEF-C9重组入门载体，根据Invitrogen公司的LR Clonase^TM ⅡEnzyme Mix说明书，将使用一步克隆法构建的入门载体通过LR反应，将不同基因型OsIDEF1基因整合到Gateway系统植物表达载体pGWB18上。

LR反应体系：

2、水稻的遗传转化

采用冻融法，将含有不同基因型OsIDEF1的重组载体pGWB18-IDEF1转化至根癌农杆菌LBA4404中，经PCR鉴定得到阳性转化子(含有序列表中序列1-2所示的OsIDEF1基因的转化子)利用农杆菌介导的遗传转化方法将两种基因型的OsIDEF1分别转化至水稻受体材料吉粳88和长白9中。

3、转基因水稻植株的鉴定

分别将含有不同基因型OsIDEF1的重组载体的农杆菌对水稻进行遗传转化，得到能够在50uM潮霉素(glufosinate-ammonium，Sigma，45520)的培养基上正常生长的抗性植株。提取抗性植株总DNA，通过PCR扩增抗性基因HPT对转基因植株进行鉴定。部分检测结果如图18所示，野生型及阴性对照均无抗性基因HPT条带，而所检测抗性植株均能检测到HPT，说明目的基因成功整合到受体植株的基因组上。

4、不同基因型OsIDEF1过表达水稻植株的分子鉴定

提取T₃代转不同基因型OsIDEF1水稻幼苗的总RNA，反转录得到cDNA；以cDNA为模板，以水稻Ubi5基因为内参，采用实时荧光定量PCR法检测转基因植株中OsIDEF1基因的表达量，分别获得吉粳88和长白9背景的过表达OsIDEF1水稻植株。

结果如图19所示，吉粳88背景下株系ACO07-1，ACO07-2表达量比野生型显著提高，约为野生型中OsIDEF1表达量的4～5倍。如图20所示，长白9背景下株系FAS4和FAS20表达量显著提高，约为野生型中OsIDEF1表达量的5倍左右。表明外源基因OsIDEF1基因不但已顺利整合到水稻的基因组上，而且能够在转基因水稻中正常过量表达。因此选取吉粳88背景下转吉粳88型OsIDEF1株系ACO07-1和长白9型OsIDEF1株系ACO07-2，以及长白9背景下转吉粳88型OsIDEF1株系FAS4和长白9型OsIDEF1株系FAS20用于下一步的表型分析。

实施例7：不同背景超量表达不同基因型OsIDEF1水稻植株在碱胁迫下的表型分析

一、吉粳88背景转不同基因型OsIDEF1植株在碱胁迫下的表型分析

1、转不同基因型OsIDEF1株系在碱处理下的萌发期表型

选取饱满的野生型吉粳88、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系ACO07-1及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系ACO07-2的种子，首先浸种，将种子避光于室温浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后分别放置于正常水浸湿的湿润滤纸上，以及用40mM NaHCO₃浸润的湿润滤纸上进行碱胁迫处理，28℃暗培养2天生根催芽后转移至光照培养箱，每天观察种子萌发状态及根长和芽长，并于表型差异明显时进行拍照并统计根长及芽长。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系90株。

结果如图21所示：在正常条件下，野生型吉粳88、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系ACO07-1及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系ACO07-2的种子萌发状态无显著差异，说明导入的OsIDEF1-C9基因并未对水稻萌发期的生长、发育造成影响；在40mM NaHCO₃胁迫下，野生型吉粳88、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系ACO07-1及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系ACO07-2的种子萌发缓慢，根长芽长发育均受到抑制。然而如图22所示：不同株系之间的萌发率和芽长没有显著差异，根部生长却表现出明显差异，转基因植株根长均显著高于野生型，说明其受碱胁迫抑制程度较弱，耐碱能力较强。同时转C9基因型OsIDEF1植株的根长略高于J88基因型OsIDEF1基因植株。

2、转不同基因型OsIDEF1株系在碱处理下的幼苗期表型

选取饱满的野生型吉粳88、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系ACO07-1及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系ACO07-2的种子，首先浸种，将种子避光于室温浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。正常培养2周后开始进行碱胁迫处理，分别将其转移至含有正常木村营养液和含有50mM NaHCO₃(pH 8.3±0.2)的木村营养液中继续培养，每天观察其表型变化。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系72株。

结果如图23所示：在正常条件下，野生型吉粳88、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系ACO07-1及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系ACO07-2的幼苗生长状态无显著差异，说明导入的OsIDEF1基因并未对水稻幼苗期的生长、发育造成影响；在50mM NaHCO₃胁迫下，野生型吉粳88、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系ACO07-1及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系ACO07-2幼苗均表现出发黄，萎蔫，老叶干枯现象，同时生长发育均受到抑制。然而转基因植株长势优于野生型，失绿萎蔫程度较弱，说明其受碱胁迫抑制程度较弱。同时如图24所示，叶绿素测定表明，碱胁迫处理下，所有植株中叶绿素水平均有所下降，然而转基因植株叶绿素水平均显著高于野生型，表明转基因植株耐碱性较强，且转C9基因型OsIDEF1植株的叶绿素含量略高于J88基因型OsIDEF1基因植株，表明C9基因型OsIDEF1的植株耐碱性更强。

二、长白9背景转不同基因型OsIDEF1植株在碱胁迫下的表型分析

1、转不同基因型OsIDEF1株系在碱处理下的萌发期表型

选取饱满的野生型长白9号、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系FAS4及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系FAS20的种子，首先浸种，将种子避光于室温浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后分别放置于正常水浸湿的湿润滤纸上，以及用40mM NaHCO₃浸润的湿润滤纸上进行碱胁迫处理，28℃暗培养2天生根催芽后转移至光照培养箱，每天观察种子萌发状态及根长和芽长，并于表型差异明显时进行拍照并统计根长及芽长。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系90株。

结果如图25所示：在正常条件下，野生型长白9号、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系FAS4及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系FAS20萌发状态无显著差异，说明导入的OsIDEF1基因并未对水稻萌发期的生长、发育造成影响；在40mM NaHCO₃胁迫下，野生型长白9号、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系FAS4及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系FAS20的种子萌发缓慢，根长芽长发育均受到抑制，然而不同株系之间的萌发率和芽长没有显著差异，根部生长却表现出明显差异，如图26所示，转基因植株根长均显著高于野生型，说明其受碱胁迫抑制程度较弱，耐碱能力较强。同时转C9基因型OsIDEF1植株的根长略高于J88基因型OsIDEF1基因植株。

2、转不同基因型OsIDEF1株系在碱处理下的幼苗期表型

选取饱满的野生长白9号、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系FAS4及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系FAS20的种子，首先浸种，将种子避光于室温浸于水中24小时，然后冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，28℃暗培养2天生根催芽，待根长到约1～2cm时，将其转移到96孔板中，放入盛有木村营养液的容器中，使根浸入培养液中，将其放置于人工气候箱中培养。正常培养2周后开始进行碱胁迫处理，分别将其转移至含有正常木村营养液和含有50mMNaHCO₃(pH 8.3±0.2)的木村营养液中继续培养，每天观察其表型变化。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系72株。

结果如图27所示：在正常条件下，野生型长白9号、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系FAS4及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系FAS20的幼苗生长状态无显著差异，说明导入的OsIDEF1基因并未对水稻幼苗期的生长、发育造成影响；在50mM NaHCO₃胁迫下，野生型长白9号、转OsIDEF1-J88基因型转基因株系FAS4及转OsIDEF1-C9基因型转基因株系FAS20幼苗均表现出发黄，萎蔫，老叶干枯现象，同时生长发育均受到抑制。然而转基因植株长势优于野生型，失绿萎蔫程度较弱，说明其受碱胁迫抑制程度较弱。同时如图28所示，叶绿素测定表明，碱胁迫处理下，所有植株中叶绿素水平均有所下降，然而转基因植株叶绿素水平均显著高于野生型，表明转基因植株耐碱性较强，且转C9基因型OsIDEF1植株的叶绿素含量略高于J88基因型OsIDEF1基因植株，表明C9基因型OsIDEF1的植株耐碱性更强。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记及其应用

<160> 18

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213>水稻（Oryza sativa）

<220>

<223>水稻长白9号品种中OsIDEF1基因序列

<400> 1

atggggcaaa tggacggcgg cgacggcggc ggcggcggcc acccctacca ctaccaggct 60

ctcctggccg ccgtccacca gcagaccgtc ccctttccca atcccttccc cgccccctcc 120

tccggagccg agccccccca cccgcacaac cacaaccaca accacaatca caaccacaat 180

attcacaatt ctcacaatca caaccacaat cacaatgctg ctcctcaccc ttgtcacact 240

cccactccca ctcccactcc cagaggtttc gccgactgga gcgcctccac cagcgccttc 300

acctcccttg ccgcgcactc ttctactgcc cccagcaatg ccgttcacta cagcttctcc 360

ccctgctatg ccttctggac acattacatg ctcaacaaga acgcctaccc cacctccttc 420

cctgcgccac acgacgacca cctgcgcctt gccaacaaca atcatcctag agacgcacca 480

ggtcctgcat ccagctacgg ggtcgagtct tttacttcac cgtccatggc accgaatatt 540

tgcacccaca tgcctcccat agaaggaccc atatctgcca aggaagataa gaaaccagag 600

attttgccta gagtggttaa gagcagtgat gaattggaaa ccagaaacag caatgttgaa 660

tttcactctg agacagttgg tactctccct gagtcgaagc aaggccatga cagtcgtgct 720

actaaactac tcaactcggg agaataccaa gtcattctgc gcaaggagct gacaaagagt 780

gatgttggaa atgttggaag aattgtgcta cccaagaagg atgcagaggc tagtcttcca 840

cctttgttgc aaagggatcc tttgatactg cacatggacg acatggtgct cccagtgaca 900

tggaagttta agtacaggta ctggccaaat aacaaaagca gaatgtacat tctggattct 960

gcaggtgaat ttctgaagac acatggtctt caggctgggg atgtcatcat tatctacaaa 1020

aacttggctc ctggcaaatt tattatccga ggagagaagg ccattcatca gcagacaaca 1080

aatccctag 1089

<210> 2

<211> 1077

<212> DNA

<213>水稻（Oryza sativa）

<220>

<223>水稻吉粳88品种中OsIDEF1基因序列

<400> 2

atggggcaaa tggacggcgg cgacggcggc ggcggcggcc acccctacca ctaccaggct 60

ctcctggccg ccgtccacca gcagaccgtc ccctttccca atcccttccc cgccccctcc 120

tccggagccg agccccccca cccgcacaac cacaaccaca accacaatat tcacaattct 180

cacaatcaca accacaatca caatgctgct cctcaccctt gtcacactcc cactcccact 240

cccactccca gaggtttcgc cgactggagc gcctccacca gcgccttcac ctcccttgcc 300

gcgcactctt ctactgcccc cagcaatgcc gttcactaca gcttctcccc ctgctatgcc 360

ttctggacac attacatgct caacaagaac gcctacccca cctccttccc tgcgccacac 420

gacgaccacc tgcgccttgc caacaacaat catcctagag acgcaccagg tcctgcatcc 480

agctacgggg tcgagtcttt tacttcaccg tccatggcac cgaatatttg cacccacatg 540

cctcccatag aaggacccat atctgccaag gaagataaga aaccagagat tttgcctaga 600

gtggttaaga gcagtgatga attggaaacc agaaacagca atgttgaatt tcactctgag 660

acagttggta ctctccctga gtcgaagcaa ggccatgaca gtcgtgctac taaactactc 720

aactcgggag aataccaagt cattctgcgc aaggagctga caaagagtga tgttggaaat 780

gttggaagaa ttgtgctacc caagaaggat gcagaggcta gtcttccacc tttgttgcaa 840

agggatcctt tgatactgca catggacgac atggtgctcc cagtgacatg gaagtttaag 900

tacaggtact ggccaaataa caaaagcaga atgtacattc tggattctgc aggtgaattt 960

ctgaagacac atggtcttca ggctggggat gtcatcatta tctacaaaaa cttggctcct 1020

ggcaaattta ttatccgagg agagaaggcc attcatcagc agacaacaaa tccctag 1077

<210> 3

<211> 362

<212> PRT

<213>水稻（Oryza sativa）

<220>

<223>水稻长白9号品种中OsIDEF1基因编码蛋白

<400> 3

Met Gly Gln MET Asp Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly His Pro

5 10 15

Tyr His Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Ala Val His Gln Gln Thr Val

20 25 30

Pro Phe Pro Asn Pro Phe Pro Ala Pro Ser Ser Gly Ala Glu Pro

35 40 45

Pro His Pro His Asn His Asn His Asn His Asn His Asn His Asn

50 55 60

Ile His Asn Ser His Asn His Asn His Asn His Asn Ala Ala Pro

65 70 75

His Pro Cys His Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Arg Gly Phe

80 85 90

Ala Asp Trp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Phe Thr Ser Leu Ala Ala

95 100 105

His Ser Ser Thr Ala Pro Ser Asn Ala Val His Tyr Ser Phe Ser

110 115 120

Pro Cys Tyr Ala Phe Trp Thr His Tyr Met Leu Asn Lys Asn Ala

125 130 135

Tyr Pro Thr Ser Phe Pro Ala Pro His Asp Asp His Leu Arg Leu

140 145 150

Ala Asn Asn Asn His Pro Arg Asp Ala Pro Gly Pro Ala Ser Ser

155 160 165

Tyr Gly Val Glu Ser Phe Thr Ser Pro Ser Met Ala Pro Asn Ile

170 175 180

Cys Thr His Met Pro Pro Ile Glu Gly Pro Ile Ser Ala Lys Glu

185 190 195

Asp Lys Lys Pro Glu Ile Leu Pro Arg Val Val Lys Ser Ser Asp

200 205 210

Glu Leu Glu Thr Arg Asn Ser Asn Val Glu Phe His Ser Glu Thr

215 220 225

Val Gly Thr Leu Pro Glu Ser Lys Gln Gly His Asp Ser Arg Ala

230 235 240

Thr Lys Leu Leu Asn Ser Gly Glu Tyr Gln Val Ile Leu Arg Lys

245 250 255

Glu Leu Thr Lys Ser Asp Val Gly Asn Val Gly Arg Ile Val Leu

260 265 270

Pro Lys Lys Asp Ala Glu Ala Ser Leu Pro Pro Leu Leu Gln Arg

275 280 285

Asp Pro Leu Ile Leu His MET Asp Asp Met Val Leu Pro Val Thr

290 295 300

Trp Lys Phe Lys Tyr Arg Tyr Trp Pro Asn Asn Lys Ser Arg Met

305 310 315

Tyr Ile Leu Asp Ser Ala Gly Glu Phe Leu Lys Thr His Gly Leu

320 325 330

Gln Ala Gly Asp Val Ile Ile Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Pro Gly

335 340 345

Lys Phe Ile Ile Arg Gly Glu Lys Ala Ile His Gln Gln Thr Thr

350 355 360

Asn Pro

362

<210> 4

<211> 358

<212> PRT

<213>水稻（Oryza sativa）

<220>

<223>水稻吉粳88品种中OsIDEF1基因编码蛋白

<400> 4

Met Gly Gln Met Asp Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly His Pro

5 10 15

Tyr His Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Ala Val His Gln Gln Thr Val

20 25 30

Pro Phe Pro Asn Pro Phe Pro Ala Pro Ser Ser Gly Ala Glu Pro

35 40 45

Pro His Pro His Asn His Asn His Asn His Asn Ile His Asn Ser

50 55 60

His Asn His Asn His Asn His Asn Ala Ala Pro His Pro Cys His

65 70 75

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Arg Gly Phe Ala Asp Trp Ser

80 85 90

Ala Ser Thr Ser Ala Phe Thr Ser Leu Ala Ala His Ser Ser Thr

95 100 105

Ala Pro Ser Asn Ala Val His Tyr Ser Phe Ser Pro Cys Tyr Ala

110 115 120

Phe Trp Thr His Tyr MET Leu Asn Lys Asn Ala Tyr Pro Thr Ser

125 130 135

Phe Pro Ala Pro His Asp Asp His Leu Arg Leu Ala Asn Asn Asn

140 145 150

His Pro Arg Asp Ala Pro Gly Pro Ala Ser Ser Tyr Gly Val Glu

155 160 165

Ser Phe Thr Ser Pro Ser MET Ala Pro Asn Ile Cys Thr His MET

170 175 180

Pro Pro Ile Glu Gly Pro Ile Ser Ala Lys Glu Asp Lys Lys Pro

185 190 195

Glu Ile Leu Pro Arg Val Val Lys Ser Ser Asp Glu Leu Glu Thr

200 205 210

Arg Asn Ser Asn Val Glu Phe His Ser Glu Thr Val Gly Thr Leu

215 220 225

Pro Glu Ser Lys Gln Gly His Asp Ser Arg Ala Thr Lys Leu Leu

230 235 240

Asn Ser Gly Glu Tyr Gln Val Ile Leu Arg Lys Glu Leu Thr Lys

245 250 255

Ser Asp Val Gly Asn Val Gly Arg Ile Val Leu Pro Lys Lys Asp

260 265 270

Ala Glu Ala Ser Leu Pro Pro Leu Leu Gln Arg Asp Pro Leu Ile

275 280 285

Leu His MET Asp Asp MET Val Leu Pro Val Thr Trp Lys Phe Lys

290 295 300

Tyr Arg Tyr Trp Pro Asn Asn Lys Ser Arg MET Tyr Ile Leu Asp

305 310 315

Ser Ala Gly Glu Phe Leu Lys Thr His Gly Leu Gln Ala Gly Asp

320 325 330

Val Ile Ile Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Pro Gly Lys Phe Ile Ile

335 340 345

Arg Gly Glu Lys Ala Ile His Gln Gln Thr Thr Asn Pro

350 355 358

<210>5

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物OsIDEF1-KS

<400>5

gcgtgaagagaaattaagtgaggg 24

<210> 6

<211>25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物OsIDEF1-KAS

<400>6

Caactaacactgttgcaattaaccc 25

<210> 7

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-Iden-S

<400>7

cacccgcacaaccacaac 18

<210> 8

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-Iden-AS

<400>8

gagtgtgacaagggtgaggag 21

<210> 9

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-qS

<400>9

gaggctagtcttccacctttg 21

<210> 10

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-qAS

<400>10

tggccagtacctgtacttaaac 22

<210> 11

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Ubi5-S

<400>11

accacttcgaccgccactact 21

<210> 12

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物Ubi5-AS

<400>12

acgcctaagcctgctggtt 19

<210> 13

<211>39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-pQBV3-S

<400>13

aaagcaggctcaggggatatcatggggcaaatggacggc 39

<210> 14

<211>45

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-pQBV3-AS

<400>14

agctgggtgcagggcgatatcctagggatttgttgtctgctgatg 45

<210> 15

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-LP

<400>15

gccgtgggagtgggagtgtgaca 23

<210> 16

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-RP

<400>16

aaactgtcacactcccactcccac 24

<210> 17

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-dabaS

<400>17

agaccgtcccctttcccaat 20

<210> 18

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物IDEF1-dabaR

<400>18

atctgtagctctgaacaacgcaac 24

Claims

1.水稻OsIDEF1基因强抗逆基因型分子标记在鉴定或筛选水稻强抗逆性优势品种中的应用，其特征在于所述抗逆性为抗碱胁迫；水稻长白9号基因型OsIDEF1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，水稻吉粳88基因型OsIDEF1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述分子标记为SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2所示的基因型差异。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述抗碱胁迫为抗NaHCO₃胁迫。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述鉴定或筛选水稻强抗逆性优势品种的方法为：

一、提取待测水稻的基因组DNA；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤二所述PCR扩增反应体系为50μl：

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于步骤二所述PCR反应程序为：

4℃终止反应。