Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN111239386A - 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用 - Google Patents

一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111239386A
CN111239386A CN202010067614.7A CN202010067614A CN111239386A CN 111239386 A CN111239386 A CN 111239386A CN 202010067614 A CN202010067614 A CN 202010067614A CN 111239386 A CN111239386 A CN 111239386A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitamin
small molecule
targeted
activity
inhibition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010067614.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111239386B (zh
Inventor
沈国民
刘红丽
刘浩
沈滟
曹青
高蒙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Science and Technology
Original Assignee
Henan University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Science and Technology filed Critical Henan University of Science and Technology
Priority to CN202010067614.7A priority Critical patent/CN111239386B/zh
Publication of CN111239386A publication Critical patent/CN111239386A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111239386B publication Critical patent/CN111239386B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/58—1,2-Diazines; Hydrogenated 1,2-diazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/502—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. cinnoline, phthalazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种靶向抑制维生素K依赖性γ‑谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学技术领域。本发明通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系，可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；进一步通过检测小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用，并用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，可以得到靶向抑制维生素K依赖性γ‑谷氨酰羧化酶(VKGC)的小分子化合物。采用该方法，本发明首次筛选到一个特异性抑制维生素K依赖性γ‑谷氨酰羧化酶的小分子化合物，该小分子可用于研究VKGC蛋白的生化特性，具有开发为灭鼠药和抗凝药物的潜在应用价值。

Description

一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合 物的筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用，属于分子细胞生物学和生物化学技术领域。
背景技术
维生素K在血液正常凝固中发挥重要作用，主要用于防止新生婴儿出血疾病、预防内出血以及维生素K拮抗剂的解毒剂。维生素K通过调节一些凝血因子(如凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ)的翻译后修饰参与凝血(如图1所示)。维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基γ羧基化修饰是其发挥凝血功能的必要条件。维生素K在这一翻译后修饰过程中发挥核心作用，并以三种形式在体内循环，分别是维生素K环氧化物(KO)、维生素K(K)和二氢维生素K(KH2)。
目前已知两个酶在维生素K循环中发挥作用。其中维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)利用KH2为辅因子，对维生素K依赖性凝血因子的Gla结构域的谷氨酸残基进行γ羧基化修饰，同时把KH2转化成KO。为了使VKGC的催化反应可以持续进行，KO必须被还原成KH2，而这一反应主要是由具有KO还原酶活性和K还原酶活性的维生素K环氧化物还原酶(VKOR)催化的。VKOR催化KO到K，以及K到KH2，使维生素K可以循环利用。研究表明，VKOR是临床抗凝血药物华法林(warfarin)的特异性作用靶点，华法林通过抑制VKOR的活性，使KO不能转化为K和KH2，从而阻断了维生素K循环，进而抑制凝血因子Gla结构域的谷氨酸残基的γ羧基化修饰，达到抗凝血的目的。此外，杀鼠药溴敌隆也是特异性靶向VKOR的抑制剂。
维生素K循环的关键酶(VKOR和VKGC)是开发抗凝血药物(或杀鼠药)的重要靶点，然而目前还没有报道特异性靶向VKGC的小分子化合物及其筛选方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法。
同时，本发明还提供一种通过上述方法筛选出的小分子化合物作为制备靶向维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的抑制剂的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，包括以下步骤：
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；
所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；
3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物
用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物。
本发明通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系(即双报告基因细胞体系)，可以快速对药物小分子库进行高通量筛选，得到靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；进一步通过检测筛选出的小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用，可以筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；最后用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，可以得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)的小分子化合物。采用该方法，本发明首次筛选到一个特异性抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物，该小分子可用于研究VKGC蛋白的生化特性，具有开发为灭鼠药和抗凝药物的潜在应用价值，是开发灭鼠药和抗凝药物的先导化合物。
步骤1)中，所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex(invitrogen)。
步骤1)中，所述FIX-Gla-PC融合基因(人源F9和PROC基因的重组基因)编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤1)中，所述报告基因为荧光素酶报告基因，如甲虫(萤火虫)荧光素酶报告基因。甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步优选的，步骤1)中，所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因(甲虫荧光素酶报告基因)的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液的培养基为含双抗的完全培养基，双抗分别为青霉素和链霉素。含双抗的完全培养基的组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone)。
步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1～20μmol/L；更优选为5μmol/L。
步骤2)中，VKOR蛋白活性测定可采用传统的微粒体法(参见文献：Fasco,M.J.,Principe,L.M.,Walsh,W.a&Friedman,P.a.Warfarin inhibition of vitamin K 2,3-epoxide reductase in rat liver microsomes.Biochemistry.22,5655–60(1983)；Rost,S.,Fregin,A.,Ivaskevicius,V.,Conzelmann,E.&Hortnagel,K.Mutations in VKORC1cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type2.Nature.427,537–541(2004).)。优选的，采用以下方法：
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；和/或者，
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性。
上述方法的检测原理是利用产物KH2在250nm的激发光下可以产生荧光的特性，通过检测产物KH2的生成量来反映VKOR蛋白的活性，该方法可以用终点法测定荧光强度反映VKOR的活性，也可以实时检测荧光强度反映VKOR蛋白的活性。
所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3，配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30-80μmol/L的维生素K环氧化物工作液；
缓冲液1的组成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶剂为水；
缓冲液2的组成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶剂为水；pH值7.0-7.6；
缓冲液3的组成包括：维生素K环氧化物1-50mmol/L，溶剂为异丙醇。
所述维生素K工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液4，配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K浓度为30-80μmol/L的维生素K工作液；
缓冲液1、缓冲液2的组成同上；
缓冲液4的组成包括：维生素K1-100mmol/L，溶剂为异丙醇。
所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：分别取VKOR蛋白和缓冲液1，配制得到VKOR蛋白浓度为1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；
缓冲液1的组成同上。
所述缓冲液2的组成还包括碱性pH值调节剂，如NaOH、KOH等，碱性pH值调节剂的用量以调节缓冲液2的pH值至7.0-7.6为准。
所述缓冲液1添加表面活性剂LMNG或GDN的作用是稳定蛋白，VKOR蛋白为跨膜蛋白，只有在合适的表面活性剂中才能正确的折叠，不变性。
进一步优选的，所述缓冲液1的组成为：pH值7.5的Tris-HCl 20mmol/L，NaCl100mmol/L，LMNG 1g/L或GDN 0.5g/L，溶剂为水；
所述缓冲液2的组成为：GSH 0.5mol/L，碱性pH值调节剂适量，溶剂为水；pH值7.5；
所述缓冲液3的组成为：维生素K环氧化物1mmol/L，溶剂为异丙醇；
所述缓冲液4的组成为：维生素K1mmol/L，溶剂为异丙醇。
所述维生素K环氧化物工作液在配制完成后需在室温下平衡1小时以上。
所述VKOR蛋白为人VKOR蛋白，具体为纯化的人VKOR蛋白。纯化的人VKOR蛋白的制备方法为：将编码人VKOR蛋白的基因(Gene ID：79001)克隆到毕赤酵母表达载体pPICZ-B(invitrogen)中，其C末端依次连接PreScission蛋白酶切割位点和GFP-HIS10标签；蛋白表达和纯化按照试剂盒(货号K171001，Thermofisher公司)和文献(Ren F,Logeman BL,ZhangX,Liu Y,Thiele DJ,Yuan P.X-ray structures of the high-affinity coppertransporter Ctr1.Nat Commun.2019,27；10(1):1386.doi:10.1038/s41467-019-09376-7.)中的方法进行。纯化、浓缩后的人VKOR蛋白用缓冲液(组成为：pH值7.0-8.0的Tris-HCl20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶剂为水)收集备用。
进一步优选的，所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：以配制1mL工作液为例，取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液3，混合均匀后室温下平衡1小时以上，得到GSH浓度为80mmol/L、维生素K环氧化物浓度为40μmol/L的维生素K环氧化物工作液。
进一步优选的，所述维生素K工作液的配制方法为：以配制1mL工作液为例，取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液4，混合均匀，得到GSH浓度为80mmol/L、维生素K浓度为40μmol/L的维生素K工作液。
进一步优选的，所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：取(纯化的人)VKOR蛋白，用缓冲液1稀释至人VKOR蛋白浓度为3μmol/L，得到VKOR蛋白工作液。
所述终点法计算荧光值的增加量为：用荧光检测仪每隔一段时间检测一次荧光，检测总时长为1-2小时；VKOR蛋白的活性＝反应1小时的荧光值(FT1)-反应开始时的本底荧光值(FT0)。更优选为：设定激发光的波长为250nm，发射光的波长为430nm；每30秒检测一次荧光，检测总时长为1-2小时。
步骤3)中，所述VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系的构建方法为本领域常规技术(参见文献4)。本发明中使用的VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系由文献4中的作者惠赠。
上述靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法筛选出的小分子化合物及其结构类似物作为制备靶向维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的抑制剂的应用。
所述筛选出的小分子化合物及其结构类似物的结构式如下：
Figure BDA0002376426780000051
(HF13141-H5)、
Figure BDA0002376426780000052
(HF13141-H5的结构类似物HTS03341)。
本发明的有益效果：
本发明通过构建维生素K循环小分子抑制剂筛选体系和靶向VKOR蛋白的小分子抑制剂筛选体系，可以筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；进一步用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，得到一个靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物HF13141-H5。
HF13141-H5是首个鉴定出特异性抑制VKGC活性的小分子化合物。试验表明，HF13141-H5在293TRex-F9-Met细胞中抑制VKGC活性的IC50为98.5±10.33nM；在DKO细胞中抑制VKGC活性的的IC50为136.4±9.56nM。HF13141-H5的结构类似物在293TRex-F9-Met细胞中抑制VKGC活性的IC50为916.9±206.8nM；在DKO细胞中抑制VKGC活性的IC50为1154±301nM。由于抑制维生素K循环的小分子是开发抗凝药和杀鼠药的先导化合物，所以HF13141-H5及其结构类似物具有开发为抗凝药和杀鼠药的潜在应用价值。
附图说明
图1为维生素K循环示意图；
图2为实施例1中14种小分子化合物以KO为底物均一化的荧光值；
图3为实施例1中14种小分子化合物以K为底物均一化的荧光值；
图4为实施例1中7种小分子化合物以KO为底物均一化的荧光值；
图5为实施例1中7种小分子化合物以K为底物均一化的荧光值；
图6为实施例1中7种小分子化合物均一化的报告基因活性；
图7为试验例1中均一化的荧光值；
图8为试验例2中HF13141-H5在293TRex-F9-Met细胞中抑制VKGC活性的IC50；
图9为试验例3中HF13141-H5在DKO细胞中抑制VKGC活性的IC50；
图10为试验例4中HTS03341在293TRex-F9-Met细胞中抑制VKGC活性的IC50；
图11为试验例5中HTS03341在DKO细胞中抑制VKGC活性的IC50。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
试剂、材料和仪器：
GSH：谷胱甘肽；LMNG：Lauryl Maltose Neopentyl Glycol，购自Anatrace公司；GDN：glyco-diosgenin，购自Anatrace公司；DDM：n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside，购自Anatrace公司；CHAPS：3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，3-[(3-Cholamidopropyl)dimethy lammonio]propanesulfonate，3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate，购自Anatrace公司；蛋白表达和纯化按试剂盒，货号K171001，购自Thermofisher公司；黑色96孔荧光测量板，为康宁(Corning)3915全黑荧光检测板；荧光检测仪(molecular device，SpetraMAX M5)。
实施例及试验例中所用纯化的人VKOR蛋白的制备方法为：将编码人VKOR蛋白的基因(Gene ID：79001)克隆到毕赤酵母表达载体pPICZ-B(invitrogen)中，其C末端依次连接PreScission蛋白酶切割位点和GFP-HIS10标签；蛋白表达和纯化按照试剂盒(货号K171001，Thermofisher公司)和文献(Ren F,Logeman BL,Zhang X,Liu Y,Thiele DJ,YuanP.X-ray structures of the high-affinity copper transporter Ctr1.NatCommun.2019,27；10(1):1386.doi:10.1038/s41467-019-09376-7.)中在毕赤酵母表达膜蛋白的方法进行。纯化步骤如下：
1)表达人VKOR蛋白的酵母细胞被碾碎后，溶于裂解液(2％DDM，150mM NaCl，50mMTris-HCl pH 8.0，10μg/mL DNase I，2mM PMSF蛋白酶抑制剂，溶剂为水)中，在4℃下搅拌提取3h(3-4h均可)；混合物在30000g、4℃下离心1h，收集上清；
2)上清液在4℃下用钴柱填料(货号635503，Clontech公司)孵育3h(3-4h均可)，轻轻搅拌；然后收集钴柱填料，用10倍柱填料体积的缓冲液(30mM imidazole，4mM DDM，150mMNaCl，20mM Tris-HCl pH 8.0，溶剂为水)清洗填料；
3)将清洗过的钴柱填料与PreScission蛋白酶在4℃下孵育过夜，去除C端GFP-HIS10标记，收集人VKOR蛋白，用10kD的浓缩管进行浓缩；
4)将浓缩的蛋白过Superdex 200的分子筛，其流动相的缓冲液包含0.1％LMNG，150mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.5，溶剂为水；收集目的蛋白峰，用10kD的浓缩管进行浓缩，至浓度大于30μmol/L，冻存于-80度备用。
实施例1
本实施例中靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，包括以下步骤：
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物，具体操作如下：
a.用同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒(如SEQ ID NO.5所示，交由生物公司合成)转染293TRex细胞系(invitrogen)(参见文献1)，用hygromycin筛选稳定表达FIX-gla-PC和Metridia Luciferase双报告基因的细胞体系，命名为293TRex-F9-Met。
b.将Maybridge Hit Finder小分子化合物库(14400种小分子化合物)中的小分子化合物分别铺在96孔细胞培养板中，每孔加150nL的小分子药物(浓度为10mmol/L)，置于-20℃冰箱备用。
c.在铺好小分子化合物的96孔板中铺293TRex-F9-Met细胞，每孔的细胞量为30000-40000个，体积为150μL；相当于2-2.5×105个/mL浓度的细胞悬液，培养基为含双抗的完全培养基(组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone))，维生素K浓度为5μmol/L。
d.培养24小时后，收集96孔细胞培养板中培养基上清，分别用ELSIA检测报告基因FIX-gla-PC的分泌量(参见文献2)，荧光素酶报告基因实验检测甲虫荧光素酶(MetridiaLuciferase)的活性(参见文献3和4)。
e.计算每孔FIX-gla-PC的分泌量与甲虫荧光素酶的荧光值的比值(FIX-gla-PC的分泌量/甲虫荧光素酶的荧光值，命名为R)，用加药组的比值(R drug，缩写为Rd)除以不加药组的比值(R no treatment，缩写为Rn)，得到比值(Rd/Rn)；将比值Rd/Rn≤0.3的小分子化合物判定为阳性结果，共筛选到21种靶向抑制维生素K循环的小分子化合物，如下表1所示，其中华法林为阳性对照。
表1Maybridge Hit Finder小分子化合物库的筛选结果
编号 药物小分子 Rd/Rn 编号 药物小分子 Rd/Rn
1 HF13020-E7 0.16 13 HF13110-F4 0.07
2 HF13021-B2 0.09 14 HF13132-G10 0.16
3 HF13027-G5 0.23 15 HF13136-E7 0.09
4 HF13028-F7 0.19 16 HF13138-A2 0.04
5 HF13037-D8 0.12 17 HF13141-H5 0.13
6 HF13050-F5 0.13 18 HF13144-B11 0.06
7 HF13052-C5 0.08 19 HF13148-C7 0.04
8 HF13073-G2 0.18 20 HF13169-G5 0.13
9 HF13075-C9 0.15 21 HF13178-A2 0.15
10 HF13089-C5 0.22 阳性对照 华法林 0.08
11 HF13091-E6 0.27 未处理组 DMSO 1
12 HF13106-C10 0.14 / / /
21种小分子化合物的结构式如下：
Figure BDA0002376426780000081
Figure BDA0002376426780000091
2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物，具体操作如下：
a.材料的准备：
分别配制缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4和待选小分子化合物溶液；
所述缓冲液1的组成为：pH值7.5的Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 100mmol/L，LMNG1g/L，溶剂为水；
所述缓冲液2的组成为：GSH 0.5mol/L，NaOH适量，溶剂为水；pH值7.5；
所述缓冲液3的组成为：维生素K环氧化物1mmol/L，溶剂为异丙醇；
所述缓冲液4的组成为：维生素K1mmol/L，溶剂为异丙醇；
所述待选小分子化合物溶液的组成为：待选小分子化合物浓度为1mmol/L，溶剂为DMSO。
b.工作液的配制：
分别配制维生素K环氧化物工作液、维生素K工作液和VKOR蛋白工作液，备用；
所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：以配制1mL工作液为例，取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液3，混合均匀后室温下平衡1小时以上，得到GSH浓度为80mmol/L、维生素K环氧化物浓度为40μmol/L的维生素K环氧化物工作液；
所述维生素K工作液的配制方法为：以配制1mL工作液为例，取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液4，混合均匀，得到GSH浓度为80mmol/L、维生素K浓度为40μmol/L的维生素K工作液；
所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：取纯化的人VKOR蛋白(浓度大于30μmol/L)，用缓冲液1稀释至人VKOR蛋白浓度为3μmol/L，得到VKOR蛋白工作液。
c.待选小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制作用测定：
待选小分子化合物对VKOR蛋白催化KO活性的抑制作用的测定：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL待选小分子化合物溶液，之后分别取维生素K环氧化物工作液和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，在96孔荧光检测仪(molecular device，SpetraMAX M5)中检测荧光，设定激发光的波长为250nm，发射光的波长为430nm；每30秒检测一次荧光，检测总时长为1-2小时，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；
待选小分子化合物对VKOR蛋白催化K活性的抑制作用的测定：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL待选小分子化合物溶液，之后分别取维生素K工作液和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，在96孔荧光检测仪(moleculardevice，SpetraMAX M5)中检测荧光，设定激发光的波长为250nm，发射光的波长为430nm；每30秒检测一次荧光，检测总时长为1-2小时，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；
VKOR蛋白的活性＝反应1小时的荧光值(FT1)-反应开始时的本底荧光值(FT0)。
对照组：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL DMSO，之后分别取维生素K环氧化物工作液(或维生素K工作液)和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，其他同上。
Warfarin对照组：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL华法林溶液(华法林0.4mmol/L，溶剂为DMSO)，之后分别取维生素K环氧化物工作液(或维生素K工作液)和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，其他同上。
d.抑制效果的判定
对照组的活性记为CFA，Warfarin对照组活性记为WFA，小分子化合物处理组活性记为DFA。之后对荧光值用对照组的CFA做均一化处理，其中对照组为1，代表VKOR蛋白活性的不抑制的状态；华法林处理组为WFA/CFA(均一化的荧光值)，表示华法林对VKOR蛋白活性的抑制效果；小分子化合物处理组活性除以对照组的活性，即DFA/CFA(均一化的荧光值)，表示小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制效果。如果DFA/CFA数值≤1/2，表示小分子化合物对VKOR蛋白活性有较好的抑制效果；如果DFA/CFA≤WFA/CFA，表示小分子化合物抑制效果相当于或好于华法林；如果1/2DFA/CFA＞WFA/CFA，表示小分子化合物的抑制效果不如华法林；如果1＞DFA/CFA数值＞1/2，表示小分子化合物的抑制效果不好；如果DFA/CFA数值≥1，表示无抑制效果。
筛选结果如下表2所示，从表2可以看出，共筛选出14种抑制VKOR活性效果好的小分子，7种抑制效果差或不抑制VKOR的小分子。
表2 21种小分子化合物的VKOR蛋白活性抑制结果
Figure BDA0002376426780000111
Figure BDA0002376426780000121
14种小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制效果分析(如图2-3所示)：14种小分子化合物分别为：HF13020-E7，HF13021-B2，HF13028-F7，HF13052-C5，HF13073-G2，HF13089-C5，HF13091-E6，HF13106-C10，HF13110-F4，HF13136-E7，HF13138-A2，HF13169-G5，HF13144-B11，HF13148-C7。以维生素K环氧化物(KO)为底物，检测到14种小分子化合物均能较好的抑制VKOR蛋白活性。其中7种小分子化合物在体外活性测定中抑制效果优于华法林，分别为HF13073-G2，HF13106-C10，HF13110-F4，HF13136-E7，HF13138-A2，HF13144-B11，HF13148-C7。在这14种小分子化合物中，以维生素K(K)为底物，检测它们对VKOR蛋白催化K活性的抑制效果，发现5种小分子化合物的抑制效果不好，分别是HF13052-C5，HF13073-G2，HF13089-C5，HF13091-E6和HF13169-G5；3种小分子化合物的抑制效果不如华法林，分别为HF13028-F7，HF13106-C10，HF13144-B11；6种小分子化合物的抑制效果等同于或优于华法林，分别为HF13020-E7，HF13021-B2，HF13110-F4，HF13136-E7，HF13138-A2和HF13148-C7。
7种小分子化合物对VKOR蛋白活性的抑制效果分析(如图4-5所示)：7种小分子化合物分别为：HF13027-G5，HF13037-D8，HF13050-F5，HF13075-C9，HF13132-G10，HF13141-H5，HF13178-A2。分别以维生素K环氧化物(KO)为底物或维生素K为底物，检测它们对VKOR蛋白催化活性的抑制效果，发现它们对VKOR蛋白抑制效果不好或无抑制效果。
3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物
用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定(参见文献4)，得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物，具体操作如下：
a.VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系(DKO细胞系)的获得
DKO细胞系由文献4中的作者惠赠。
b.在24孔细胞培养板中，每孔加0.8μL的小分子药物(浓度为10mmol/L)，每个小分子铺3个孔，其中DMSO和华法林组为对照组。
c.在铺好小分子化合物的24孔板中，铺DKO细胞系细胞，每孔的细胞量为160000-200000个，体积为800μL；相当于2-2.5×105个/mL浓度的细胞悬液，培养基为含双抗的完全培养基(组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone))，维生素K浓度为10μmol/L。
d.培养48小时后，收集24孔板中的培养基上清，分别用ELSIA检测报告基因FIX-gla-PC的分泌量。
e.计算小分子化合物在DKO细胞中对报告基因活性的影响：用加药组的报告基因活性除以不加药组(DMSO处理组)，得到的比值为均一化的报告基因活性。DMSO处理组均一化的报告基因活性为1，加药处理组均一化的报告基因活性≤0.3的小分子化合物判定为阳性结果。鉴定结果如图6所示，共筛选到1种小分子化合物HF13141-H5，为抑制VKGC活性的小分子。
结果分析：通过DKO细胞报告基因活性测定结果可以看出，小分子化合物HF13141-H5特异性抑制VKGC酶活性，而其他小分子不抑制VKGC酶活性。
实施例2
本实施例中由实施例1筛选出的小分子化合物HF13141-H5及其结构类似物HTS03341作为制备靶向维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的抑制剂的应用，小分子化合物HF13141-H5及其结构类似物HTS03341的结构式如下：
Figure BDA0002376426780000131
(HF13141-H5)、
Figure BDA0002376426780000132
(HTS03341)。
试验例1
VKOR体外活性试验：测定小分子化合物HF13141-H5对VKOR活性的抑制作用，方法如下：
a.材料的准备：
分别配制缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4、华法林溶液和HF13141-H5溶液；
所述缓冲液1的组成为：pH值7.5的Tris-HCl 20mmol/L，NaCl 100mmol/L，LMNG1g/L，溶剂为水；
所述缓冲液2的组成为：GSH 0.5mol/L，NaOH适量，溶剂为水；pH值7.5；
所述缓冲液3的组成为：维生素K环氧化物1mmol/L，溶剂为异丙醇；
所述缓冲液4的组成为：维生素K1mmol/L，溶剂为异丙醇；
所述华法林溶液的组成为：华法林0.4mmol/L，溶剂为DMSO；
所述HF13141-H5溶液的组成为：HF13141-H5 0.4mmol/L，溶剂为DMSO。
b.工作液的配制：
分别配制维生素K环氧化物工作液、维生素K工作液和VKOR蛋白工作液；
所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：以配制1mL工作液为例，取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液3，混合均匀后室温下平衡1小时以上，得到GSH浓度为80mmol/L、维生素K环氧化物浓度为40μmol/L的维生素K环氧化物工作液；
所述维生素K工作液的配制方法为：以配制1mL工作液为例，取800μL缓冲液1、160μL缓冲液2和40μL缓冲液4，混合均匀，得到GSH浓度为80mmol/L、维生素K浓度为40μmol/L的维生素K工作液；
所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：取纯化的人VKOR蛋白(浓度大于30μmol/L)，用缓冲液1稀释至人VKOR蛋白浓度为3μmol/L，得到VKOR蛋白工作液。
c.小分子化合物HF13141-H5对VKOR蛋白活性的抑制作用测定：
小分子化合物HF13141-H5对VKOR蛋白催化KO活性的抑制作用的测定：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL HF13141-H5溶液，之后分别取维生素K环氧化物工作液和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，在96孔荧光检测仪(molecular device，SpetraMAX M5)中检测荧光，设定激发光的波长为250nm，发射光的波长为430nm；每30秒检测一次荧光，检测总时长为1-2小时，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；
小分子化合物HF13141-H5对VKOR蛋白催化K活性的抑制作用的测定：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL HF13141-H5溶液，之后分别取维生素K工作液和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，在96孔荧光检测仪(moleculardevice，SpetraMAX M5)中检测荧光，设定激发光的波长为250nm，发射光的波长为430nm；每30秒检测一次荧光，检测总时长为1-2小时，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；
VKOR蛋白的活性＝反应1小时的荧光值(FT1)-反应开始时的本底荧光值(FT0)。
对照组：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL DMSO，之后分别取维生素K环氧化物工作液(或维生素K工作液)和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，其他同上。
Warfarin对照组：在黑色的96孔荧光测量板中加入0.8μL华法林溶液，之后分别取维生素K环氧化物工作液(或维生素K工作液)和VKOR蛋白工作液各40μL，先后加入黑色的96孔荧光测量板中混合均匀，其他同上。
对照组的活性记为CFA，Warfarin对照组活性记为WFA，小分子化合物处理组活性记为DFA。之后对荧光值用对照组的CFA做均一化处理，其中对照组为1，代表VKOR蛋白活性的不抑制的状态；华法林处理组为WFA/CFA(均一化的荧光值)，表示华法林对VKOR蛋白活性的抑制效果；HF13141-H5处理组活性除以对照组的活性，即DFA/CFA(均一化的荧光值)，表示HF13141-H5对VKOR蛋白活性的抑制效果；试验结果如图7所示。
从图7可以看出，小分子化合物HF13141-H5不抑制VKOR活性。
试验例2
在293TRex-F9-Met细胞中，测定小分子HF13141-H5抑制VKGC活性的IC50，方法如下：
1)准备小分子化合物HF13141-H5的12个浓度梯度的培养基，其中维生素K的浓度为5μmol/L，培养基为DMEM完全培养基；HF13141-H5的浓度分别为4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.25μM，0.125μM，0.0625μM，0.03125μM，0.0156μM，0.0078μM，0.0039μM，0μM；之后加入24孔细胞培养板中，每孔加入400μL。
2)准备93TRex-F9-Met细胞的细胞悬液，用含有双抗的完全DMEM培养基(组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone))制备细胞悬液，细胞浓度为2-2.5×105细胞/mL，取400μL细胞悬液加入上述含有HF13141-H5的24孔细胞培养板中。
3)培养24小时后，收集培养基上清，分别用ELSIA检测报告基因FIX-gla-PC的分泌量(参见文献2)，荧光素酶报告基因实验检测甲虫荧光素酶(Metridia Luciferase)的活性(参见文献3和4)。
4)计算小分子化合物的IC50：首先计算不同浓度下FIX-gla-PC的分泌量与甲虫荧光素酶的荧光值的比值(FIX-gla-PC的分泌量/甲虫荧光素酶的荧光值，命名为R)，用不加药组的R值对不同浓度药物处理组的R值做均一化处理，然后用graphpad prism 5计算小分子化合物HF13141-H5抑制VKGC活性的IC50，结果如图8所示。
以华法林处理为对照组，华法林的浓度分别为1μM，0.5μM，0.25μM，0.125μM，0.0625μM，0.03125μM，0.0156μM，0.0078μM，0.0039μM，0.00196μM，0.00098μM，0μM；测定方法同上。
试验结果表明，HF13141-H5在293TRex-F9-Met细胞中抑制VKGC活性的IC50为98.5±10.33nM，而对照组warfarin(华法林)抑制维生素K循环的IC50为86.1±7.28nM。
试验例3
在DKO细胞中，测定小分子HF13141-H5抑制VKGC活性的IC50，方法如下：
1)准备小分子化合物HF13141-H5的12个浓度梯度的培养基，其中维生素K的浓度为10μmol/L，培养基为DMEM完全培养基；HF13141-H5的浓度分别为4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.25μM，0.125μM，0.0625μM，0.03125μM，0.0156μM，0.0078μM，0.0039μM，0μM；之后加入24孔细胞培养板中，每孔加入400μL。
2)准备DKO细胞的细胞悬液，用含有双抗的完全DMEM培养基(组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone))制备细胞悬液，细胞浓度为2-2.5×105细胞/mL，取400μL细胞悬液加入上述含有HF13141-H5的24孔细胞培养板中。
3)培养48小时后，收集24孔板中的培养基上清，分别用ELSIA检测报告基因FIX-gla-PC的分泌量。
4)计算小分子化合物HF13141-H5的IC50：用不加药组的报告基因活性对不同浓度药物处理组的报告基因活性做均一化处理，然后用Graphpad prism 5计算小分子化合物HF13141-H5抑制VKGC活性的IC50，结果如图9所示。
以华法林和DMSO处理为对照组，华法林的浓度分别为4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.25μM，0.125μM，0.0625μM，0.03125μM，0.0156μM，0.0078μM，0.0039μM，0μM；测定方法同上。
试验结果表明，HF13141-H5在DKO细胞中抑制VKGC活性的IC50为136.4±9.56nM；华法林和DMSO处理为对照组，它们对VKGC酶活性无抑制作用。
试验例4
HF13141-H5的结构类似物HTS03341购自molport公司，Compound number(化合物号为)：MolPort-001-807-211，公司网址为https://www.molport.com/shop/find-chemicals。
在293TRex-F9-Met细胞中，测定小分子HTS03341抑制VKGC活性的IC50，方法如下：
1)准备小分子化合物HTS03341的12个浓度梯度的培养基，其中维生素K的浓度为5μmol/L，培养基为DMEM完全培养基；HTS03341的浓度分别为10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.156μM，0.078μM，0.039μM，0.0195μM，0.0098μM，0μM；之后加入24孔细胞培养板中，每孔加入400μL。
2)准备93TRex-F9-Met细胞的细胞悬液，用含有双抗的完全DMEM培养基(组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone))制备细胞悬液，细胞浓度为2-2.5×105细胞/mL，取400μL细胞悬液加入上述含有HTS03341的24孔细胞培养板中。
3)培养24小时后，收集培养基上清，分别用ELSIA检测报告基因FIX-gla-PC的分泌量(参见文献2)，荧光素酶报告基因实验检测甲虫荧光素酶(Metridia Luciferase)的活性(参见文献3和4)。
4)计算小分子化合物的IC50：首先计算不同浓度下FIX-gla-PC的分泌量与甲虫荧光素酶的荧光值的比值(FIX-gla-PC的分泌量/甲虫荧光素酶的荧光值，命名为R)，用不加药组的R值对不同浓度药物处理组的R值做均一化处理，然后用graphpad prism 5计算小分子化合物HTS03341抑制VKGC活性的IC50，结果如图10所示。
试验结果表明，HTS03341在293TRex-F9-Met细胞中抑制VKGC活性的IC50为916.9±206.8nM。
试验例5
在DKO细胞中，测定小分子HTS03341抑制VKGC活性的IC50，方法如下：
1)准备小分子化合物HTS03341的12个浓度梯度的培养基，其中维生素K的浓度为10μmol/L，培养基为DMEM完全培养基；HTS03341的浓度分别为10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.3125μM，0.156μM，0.078μM，0.039μM，0.0195μM，0.0098μM，0μM；之后加入24孔细胞培养板中，每孔加入400μL。
2)准备DKO细胞的细胞悬液，用含有双抗的完全DMEM培养基(组成为：10％FBS(胎牛血清，v/v)，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，DMEM(货号SH30243.01，Hyclone))制备细胞悬液，细胞浓度为2-2.5×105细胞/mL，取400μL细胞悬液加入上述含有HTS03341的24孔细胞培养板中。
3)培养48小时后，收集24孔板中的培养基上清，分别用ELSIA检测报告基因FIX-gla-PC的分泌量。
4)计算小分子化合物HTS03341的IC50：用不加药组的报告基因活性对不同浓度药物处理组的报告基因活性做均一化处理，然后用Graphpad prism 5计算小分子化合物HTS03341抑制VKGC活性的IC50，结果如图11所示。
试验结果表明，HTS03341在DKO细胞中抑制VKGC活性的IC50为1154±301nM。
参考文献：
文献1：Wanrooij S,Goffart S,
Figure BDA0002376426780000181
JLO,Yasukawa T,SpelbrinkJN.Expression of catalytic mutants of the mtDNAhelicase Twinkle andpolymerase POLG causes distinct replication stalling phenotypes.Nucleic AcidsRes 2007；35:3238-51.；
文献2：Tie J-K,Jin D-Y,Straight DL,Stafford DW.Functional study of thevitamin K cycle in mammalian cells.Blood 2011；117:2967-74.；
文献3：Shen G,Cui W,Zhang H,Zhou F,Huang W,Liu Q,Yang Y,Li S,BowmanGR,Sadler JE,Gross ML,Li W,Guomin S,Weidong C,Hao Z,Fengbo Z,Wei H,Qian L,Yihu Y,Bowman GR,et al.Warfarin prevents blood coagulation by trapping humanvitamin K epoxide reductase in an intermediate state during electrontransfer.Nat Struct Mol Biol 2016；24:69-76.；
文献4：Tie JK,Jin DY,Tie K,Stafford DW.Evaluation of warfarinresistance using transcription activator-like effector nucleases-mediatedvitamin K epoxide reductase knockout HEK293 cells.J Thromb Haemost 2013；11:1556-64.。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<160> 5
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人源F9和PROC基因重组
<221> FIX-Gla-PC融合基因
<400> 1
atggcatggc agctcacaag cctcctcctg ttcgtggcca cctggggaat ttccggcaca 60
ccagctcctc ttgactcagt gttctccagc agcgagcgtg cccaccaggt gctgcggatt 120
cgaaaacgtt ataattcagg taaattggaa gagtttgttc aagggaacct tgagagagaa 180
tgtatggaag aaaagtgtag ttttgaagaa gcacgagaag tttttgaaaa cacggaaaga 240
acaactgaat tttggaagca gtatgttgac ggtgaccagt gcttggtctt gcccttggag 300
cacccgtgcg ccagcctgtg ctgcgggcac ggcacgtgca tcgacggcat cggcagcttc 360
agctgcgact gccgcagcgg ctgggagggc cgcttctgcc agcgcgaggt gagcttcctc 420
aattgctctc tggacaacgg cggctgcacg cattactgcc tagaggaggt gggctggcgg 480
cgctgtagct gtgcgcctgg ctacaagctg ggggacgacc tcctgcagtg tcaccccgca 540
gtgaagttcc cttgtgggag gccctggaag cggatggaga agaagcgcag tcacctgaaa 600
cgagacacag aagaccaaga agaccaagta gatccgcggc tcattgatgg gaagatgacc 660
aggcggggag acagcccctg gcaggtggtc ctgctggact caaagaagaa gctggcctgc 720
ggggcagtgc tcatccaccc ctcctgggtg ctgacagcgg cccactgcat ggatgagtcc 780
aagaagctcc ttgtcaggct tggagagtat gacctgcggc gctgggagaa gtgggagctg 840
gacctggaca tcaaggaggt cttcgtccac cccaactaca gcaagagcac caccgacaat 900
gacatcgcac tgctgcacct ggcccagccc gccaccctct cgcagaccat agtgcccatc 960
tgcctcccgg acagcggcct tgcagagcgc gagctcaatc aggccggcca ggagaccctc 1020
gtgacgggct ggggctacca cagcagccga gagaaggagg ccaagagaaa ccgcaccttc 1080
gtcctcaact tcatcaagat tcccgtggtc ccgcacaatg agtgcagcga ggtcatgagc 1140
aacatggtgt ctgagaacat gctgtgtgcg ggcatcctcg gggaccggca ggatgcctgc 1200
gagggcgaca gtggggggcc catggtcgcc tccttccacg gcacctggtt cctggtgggc 1260
ctggtgagct ggggtgaggg ctgtgggctc cttcacaact acggcgttta caccaaagtc 1320
agccgctacc tcgactggat ccatgggcac atcagagaca aggaagcccc ccagaagagc 1380
tgggcacctt aa 1392
<211> 463
<212> PRT
<213> 人源F9和PROC基因重组
<221> FIX-Gla-PC融合基因编码的蛋白质
<400> 2
MAWQLTSLLL FVATWGISGT PAPLDSVFSS SERAHQVLRI RKRYNSGKLE EFVQGNLERE 60
CMEEKCSFEE AREVFENTER TTEFWKQYVD GDQCLVLPLE HPCASLCCGH GTCIDGIGSF 120
SCDCRSGWEG RFCQREVSFL NCSLDNGGCT HYCLEEVGWR RCSCAPGYKL GDDLLQCHPA 180
VKFPCGRPWK RMEKKRSHLK RDTEDQEDQV DPRLIDGKMT RRGDSPWQVV LLDSKKKLAC 240
GAVLIHPSWV LTAAHCMDES KKLLVRLGEY DLRRWEKWEL DLDIKEVFVH PNYSKSTTDN 300
DIALLHLAQP ATLSQTIVPI CLPDSGLAER ELNQAGQETL VTGWGYHSSR EKEAKRNRTF 360
VLNFIKIPVV PHNECSEVMS NMVSENMLCA GILGDRQDAC EGDSGGPMVA SFHGTWFLVG 420
LVSWGEGCGL LHNYGVYTKV SRYLDWIHGH IRDKEAPQKS WAP 463
<211> 660
<212> DNA
<213> 甲虫
<221> 甲虫荧光素酶报告基因
<400> 3
atggacatca aggtggtgtt caccctggtg ttcagcgccc tggtgcaggc caagagcacc 60
gagttcgacc ccaacatcga catcgtgggc ctggaaggca agttcggcat caccaacctg 120
gaaaccgacc tgttcaccat ctgggagacc atggaagtga tgatcaaggc cgacatcgcc 180
gacaccgacc gggccagcaa cttcgtggcc accgagaccg acgccaaccg gggcaagatg 240
cccggcaaga agctgcccct ggccgtcatc atggaaatgg aagccaacgc cttcaaggcc 300
ggctgcaccc ggggctgcct gatctgcctg agcaagatca agtgcaccgc caagatgaag 360
gtgtacatcc ccggcaggtg ccacgactac ggcggcgaca agaaaaccgg ccaggccggc 420
atcgtgggcg ccatcgtgga catccccgag atcagcggct tcaaagaaat ggcccccatg 480
gaacagttca tcgcccaggt ggacagatgc gccagctgca ccaccggctg cctgaagggc 540
ctggccaacg tgaagtgcag cgagctgctg aagaagtggc tgcccgaccg ctgcgccagc 600
ttcgccgaca agatccagaa agaggtgcac aacatcaagg gcatggccgg cgacaggtga 660
<211> 219
<212> PRT
<213> 甲虫
<221> 甲虫荧光素酶报告基因编码的蛋白质
<400> 4
MDIKVVFTLV FSALVQAKST EFDPNIDIVG LEGKFGITNL ETDLFTIWET MEVMIKADIA 60
DTDRASNFVA TETDANRGKM PGKKLPLAVI MEMEANAFKA GCTRGCLICL SKIKCTAKMK 120
VYIPGRCHDY GGDKKTGQAG IVGAIVDIPE ISGFKEMAPM EQFIAQVDRC ASCTTGCLKG 180
LANVKCSELL KKWLPDRCAS FADKIQKEVH NIKGMAGDR 219
<211> 9452
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒
<400> 5
ctccctgctt gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca 60
aggcaaggct tgaccgacaa ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg 120
cttcgcgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 180
taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 240
acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 300
acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 360
ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 420
attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 480
gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 540
ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 600
caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 660
tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 720
tatataagca gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt 780
aatacgactc actataggga gacccaagct tgcattcctg caggtcgacg ccgccaccat 840
ggacatcaag gtggtgttca ccctggtgtt cagcgccctg gtgcaggcca agagcaccga 900
gttcgacccc aacatcgaca tcgtgggcct ggaaggcaag ttcggcatca ccaacctgga 960
aaccgacctg ttcaccatct gggagaccat ggaagtgatg atcaaggccg acatcgccga 1020
caccgaccgg gccagcaact tcgtggccac cgagaccgac gccaaccggg gcaagatgcc 1080
cggcaagaag ctgcccctgg ccgtcatcat ggaaatggaa gccaacgcct tcaaggccgg 1140
ctgcacccgg ggctgcctga tctgcctgag caagatcaag tgcaccgcca agatgaaggt 1200
gtacatcccc ggcaggtgcc acgactacgg cggcgacaag aaaaccggcc aggccggcat 1260
cgtgggcgcc atcgtggaca tccccgagat cagcggcttc aaagaaatgg cccccatgga 1320
acagttcatc gcccaggtgg acagatgcgc cagctgcacc accggctgcc tgaagggcct 1380
ggccaacgtg aagtgcagcg agctgctgaa gaagtggctg cccgaccgct gcgccagctt 1440
cgccgacaag atccagaaag aggtgcacaa catcaagggc atggccggcg acaggtgata 1500
atctagagga tccgaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgaatatgc ataccggtca 1560
tcatcaccat caccattgag tttgatcccc gggaattcag acatgataag atacattgat 1620
gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt 1680
gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttgg ggtgggcgaa 1740
gaactccagc atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat 1800
tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgta gcacgtgtca 1860
gtcctgctcc tcggccacga agtgcacgca gttgccggcc gggtcgcgca gggcgaactc 1920
ccgcccccac ggctgctcgc cgatctcggt catggccggc ccggaggcgt cccggaagtt 1980
cgtggacacg acctccgacc actcggcgta cagctcgtcc aggccgcgca cccacaccca 2040
ggccagggtg ttgtccggca ccacctggtc ctggaccgcg ctgatgaaca gggtcacgtc 2100
gtcccggacc acaccggcga agtcgtcctc cacgaagtcc cgggagaacc cgagccggtc 2160
ggtccagaac tcgaccgctc cggcgacgtc gcgcgcggtg agcaccggaa cggcactggt 2220
caacttggcc atggtttagt tcctcacctt gtcgtattat actatgccga tatactatgc 2280
cgatgattaa ttgtcaacac gtgctgatca gatccgaaaa tggatataca agctcccggg 2340
agctttttgc aaaagcctag gcctccaaaa aagcctcctc actacttctg gaatagctca 2400
gaggcagagg cggcctcggc ctctgcataa ataaaaaaaa ttagtcagcc atggggcgga 2460
gaatgggcgg aactgggcgg agttaggggc gggatgggcg gagttagggg cgggactatg 2520
gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac 2580
tttccacacc tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg 2640
gagcctgggg actttccaca ccctcgtcga gctagcttcg tgaggctccg gtgcccgtca 2700
gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg 2760
aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct 2820
ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt 2880
tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg 2940
gcctggcctc tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca cctggctcca 3000
gtacgtgatt cttgatcccg agctggagcc aggggcgggc cttgcgcttt aggagcccct 3060
tcgcctcgtg cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg 3120
tggcaccttc gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga 3180
tgacctgctg cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaggatctg 3240
cacactggta tttcggtttt tgggcccgcg gccggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc 3300
acatgttcgg cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct 3360
caagctggcc ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg 3420
gcggcaaggc tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc 3480
cctgctccag ggggctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca 3540
cccacacaaa ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag 3600
taccgggcgc cgtccaggca cctcgattag ttctggagct tttggagtac gtcgtcttta 3660
ggttgggggg aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa 3720
gttaggccag cttggcactt gatgtaattc tcgttggaat ttgccctttt tgagtttgga 3780
tcttggttca ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg 3840
tcgtgaacac gtggtcgcgg ccgcttcgaa ggtaccgagc tcggatccgc cgccaccatg 3900
gcatggcagc tcacaagcct cctcctgttc gtggccacct ggggaatttc cggcacacca 3960
gctcctcttg actcagtgtt ctccagcagc gagcgtgccc accaggtgct gcggattcga 4020
aaacgttata attcaggtaa attggaagag tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt 4080
atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca cgagaagttt ttgaaaacac ggaaagaaca 4140
actgaatttt ggaagcagta tgttgacggt gaccagtgct tggtcttgcc cttggagcac 4200
ccgtgcgcca gcctgtgctg cgggcacggc acgtgcatcg acggcatcgg cagcttcagc 4260
tgcgactgcc gcagcggctg ggagggccgc ttctgccagc gcgaggtgag cttcctcaat 4320
tgctctctgg acaacggcgg ctgcacgcat tactgcctag aggaggtggg ctggcggcgc 4380
tgtagctgtg cgcctggcta caagctgggg gacgacctcc tgcagtgtca ccccgcagtg 4440
aagttccctt gtgggaggcc ctggaagcgg atggagaaga agcgcagtca cctgaaacga 4500
gacacagaag accaagaaga ccaagtagat ccgcggctca ttgatgggaa gatgaccagg 4560
cggggagaca gcccctggca ggtggtcctg ctggactcaa agaagaagct ggcctgcggg 4620
gcagtgctca tccacccctc ctgggtgctg acagcggccc actgcatgga tgagtccaag 4680
aagctccttg tcaggcttgg agagtatgac ctgcggcgct gggagaagtg ggagctggac 4740
ctggacatca aggaggtctt cgtccacccc aactacagca agagcaccac cgacaatgac 4800
atcgcactgc tgcacctggc ccagcccgcc accctctcgc agaccatagt gcccatctgc 4860
ctcccggaca gcggccttgc agagcgcgag ctcaatcagg ccggccagga gaccctcgtg 4920
acgggctggg gctaccacag cagccgagag aaggaggcca agagaaaccg caccttcgtc 4980
ctcaacttca tcaagattcc cgtggtcccg cacaatgagt gcagcgaggt catgagcaac 5040
atggtgtctg agaacatgct gtgtgcgggc atcctcgggg accggcagga tgcctgcgag 5100
ggcgacagtg gggggcccat ggtcgcctcc ttccacggca cctggttcct ggtgggcctg 5160
gtgagctggg gtgagggctg tgggctcctt cacaactacg gcgtttacac caaagtcagc 5220
cgctacctcg actggatcca tgggcacatc agagacaagg aagcccccca gaagagctgg 5280
gcaccttaat ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt 5340
tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 5400
cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 5460
tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 5520
aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc 5580
tctagggggt atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 5640
acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc 5700
ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 5760
ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat 5820
ggttcacgta cctagaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact 5880
tccttggcca aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag 5940
ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc 6000
ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac 6060
aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt 6120
gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc 6180
acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt cgcggaggcc 6240
atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg 6300
caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat 6360
gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc 6420
gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat 6480
ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc 6540
gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg 6600
ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga 6660
tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg 6720
gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga 6780
tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc 6840
gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg 6900
gcaaaggaat agcacgtact acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg 6960
ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg 7020
ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 7080
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 7140
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg 7200
gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 7260
aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 7320
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 7380
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 7440
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 7500
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 7560
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 7620
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 7680
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 7740
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 7800
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 7860
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 7920
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 7980
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 8040
ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 8100
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 8160
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 8220
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 8280
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 8340
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 8400
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 8460
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 8520
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 8580
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 8640
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 8700
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 8760
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 8820
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 8880
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 8940
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 9000
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 9060
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 9120
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 9180
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 9240
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 9300
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 9360
cctgacgtcg acggatcggg agatctcccg atcccctatg gtgcactctc agtacaatct 9420
gctctgatgc cgcatagtta agccagtatc tg 9452

Claims (10)

1.一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)筛选靶向抑制维生素K循环的小分子化合物
将待选小分子化合物加入到含有维生素K的双报告基因细胞体系培养液中进行培养，筛选出靶向抑制维生素K循环的小分子化合物；
所述双报告基因细胞体系中含有同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒，所述FIX-Gla-PC融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
2)筛选对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物
对筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物进行VKOR蛋白活性抑制测定，筛选出对VKOR蛋白活性无抑制作用的小分子化合物；
3)筛选靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物
用VKORC1和VKORC1L1基因双敲除的、同时表达FIX-Gla-PC融合基因的细胞系对筛选出的小分子化合物进行鉴定，得到靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系的宿主细胞为人胚肾细胞293Trex。
3.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述报告基因为甲虫荧光素酶报告基因，甲虫荧光素酶报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述同时表达FIX-Gla-PC融合基因和报告基因的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述双报告基因细胞体系培养液中维生素K的浓度为1～20μmol/L。
6.根据权利要求1所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：步骤2)中，VKOR蛋白活性抑制测定的方法如下：
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K环氧化物工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性；和/或者，
将筛选出的靶向抑制维生素K循环的小分子化合物与维生素K工作液、VKOR蛋白工作液混合加入荧光测量板中，用荧光检测仪检测荧光，设定激发光的波长为245-255nm、发射光的波长为420-440nm，用终点法计算荧光值的增加量代表VKOR蛋白的活性。
7.根据权利要求6所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：所述维生素K环氧化物工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3，配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K环氧化物浓度为30-80μmol/L的维生素K环氧化物工作液；
所述维生素K工作液的配制方法为：分别取缓冲液1、缓冲液2和缓冲液4，配制得到GSH浓度为60-160mmol/L、维生素K浓度为30-80μmol/L的维生素K工作液；
所述VKOR蛋白工作液的配制方法为：分别取VKOR蛋白和缓冲液1，配制得到VKOR蛋白浓度为1-5μmol/L的VKOR蛋白工作液；
缓冲液1的组成包括：pH值7.0-8.0的Tris-HCl 20-50mmol/L，NaCl 100-150mmol/L，LMNG或GDN 0.5-5g/L，溶剂为水；
缓冲液2的组成包括：GSH 0.4-1mol/L，溶剂为水；pH值7.0-7.6；
缓冲液3的组成包括：维生素K环氧化物1-50mmol/L，溶剂为异丙醇；
缓冲液4的组成包括：维生素K1-100mmol/L，溶剂为异丙醇。
8.根据权利要求6或7所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法，其特征在于：所述终点法计算荧光值的增加量为：用荧光检测仪每隔一段时间检测一次荧光，检测总时长为1-2小时；VKOR蛋白的活性＝反应1小时的荧光值FT1-反应开始时的本底荧光值FT0。
9.如权利要求1-8中任一项所述的靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法筛选出的小分子化合物及其结构类似物作为制备靶向维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的抑制剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述筛选出的小分子化合物及其结构类似物的结构式如下：
Figure FDA0002376426770000031
CN202010067614.7A 2020-01-20 2020-01-20 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用 Active CN111239386B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010067614.7A CN111239386B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010067614.7A CN111239386B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111239386A true CN111239386A (zh) 2020-06-05
CN111239386B CN111239386B (zh) 2023-03-14

Family

ID=70879810

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010067614.7A Active CN111239386B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111239386B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111825620A (zh) * 2020-07-17 2020-10-27 河南科技大学 一种氨基甲酸酯类衍生物及其制备方法与应用
CN114948955A (zh) * 2022-06-06 2022-08-30 中国科学技术大学 靶向环鸟苷酸-腺苷酸合成酶的小分子共价抑制剂及其用途
CN115093338A (zh) * 2021-09-24 2022-09-23 洛阳职业技术学院 一种靶向抑制维生素k循环的小分子化合物的合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101198696A (zh) * 2005-04-13 2008-06-11 阿斯利康(瑞典)有限公司 包含产生需要γ-羧化的蛋白质用的载体的宿主细胞
US20130337504A1 (en) * 2010-12-21 2013-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and Compositions for Producing Active Vitamin K-Dependent Proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101198696A (zh) * 2005-04-13 2008-06-11 阿斯利康(瑞典)有限公司 包含产生需要γ-羧化的蛋白质用的载体的宿主细胞
US20130337504A1 (en) * 2010-12-21 2013-12-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and Compositions for Producing Active Vitamin K-Dependent Proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尚琨等: "ELISA高通量筛选PIM靶向抑制剂的研究", 《中国癌症杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111825620A (zh) * 2020-07-17 2020-10-27 河南科技大学 一种氨基甲酸酯类衍生物及其制备方法与应用
CN111825620B (zh) * 2020-07-17 2022-02-15 河南科技大学 一种氨基甲酸酯类衍生物及其制备方法与应用
CN115093338A (zh) * 2021-09-24 2022-09-23 洛阳职业技术学院 一种靶向抑制维生素k循环的小分子化合物的合成方法
CN114948955A (zh) * 2022-06-06 2022-08-30 中国科学技术大学 靶向环鸟苷酸-腺苷酸合成酶的小分子共价抑制剂及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN111239386B (zh) 2023-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111239386B (zh) 一种靶向抑制维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶的小分子化合物的筛选方法及应用
CN107604004A (zh) 用于痘苗病毒天坛株tk基因的示踪打靶质粒及其制备方法
CN112225822B (zh) 高扩增、存续能力和杀瘤作用的CAR-iNKT及应用
CN109609636A (zh) 一种肺腺癌差异性表达circRNA的检测试剂盒及其应用
CN113862235B (zh) 一种嵌合酶及其在体外一步反应合成Cap0 mRNA的用途和方法
CN102002509B (zh) 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用
CN110944656B (zh) 编码人类fkrp蛋白的新型多核苷酸
WO1992017581A1 (en) Mammalian expression vector
CN111239385B (zh) 一种靶向抑制维生素k环氧化物还原酶的小分子化合物的筛选方法及应用
KR20200086902A (ko) 신경세포 분화 추적용 벡터 및 이를 이용한 신경세포로의 분화 추적 방법
CN101463362B (zh) 融合表达绿色荧光蛋白的表达载体及其构建方法与应用
KR101123641B1 (ko) 검출 물질에 특이적으로 반응할 수 있는 분자 인지 물질이 진열된 박테리오파아지의 제조 방법 및 상기 제조 방법으로제조된 박테리오파아지를 미량 검출물을 검출하는데 활용하는 방법 및 상기 박테리오파아지를 이용한 질량 분석장치
CN113046369B (zh) 一种新型冠状病毒的mRNA疫苗
KR20210074869A (ko) 다이드제인을 포함하는 신경세포의 수초화를 촉진하기 위한 조성물 및 그의 용도
US20030186266A1 (en) Highly sensitive nucleic acid hybridization method and gene analysis method by using the same
CN110878301B (zh) 一种特异靶向小鼠G6pc基因的sgRNA导向序列及其应用
CN110115770B (zh) 一种防治丙型病毒性肝炎的新靶点及其CRISPR-Cas9靶向系统与应用
CN111560392B (zh) miRNA表达载体及其应用
CN100429309C (zh) 一种100bp梯度核糖核酸分子量标志物及其制备
CN114457113B (zh) 一种抑制单倍体胚胎干细胞二倍化的方法
CN106519005B (zh) 磷酸化nfat3突变体及其应用
KR20120043657A (ko) 인간 혈액응고 7인자의 대량 생산 방법
CN111154725A (zh) 一种用于筛选维生素k循环小分子抑制剂的双报告基因细胞体系、制备方法及其应用
CN116400081A (zh) 检测用复合物及其制备方法和应用
CN111206024B (zh) 一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant