CN111197094B

CN111197094B - 用于副溶血弧菌基因分型的组合物、试剂盒和方法

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Publication number: CN111197094B
Application number: CN201811364544.0A
Authority: CN
Inventors: 扈庆华; 李民旭; 姜伊祥; 石晓路; 江敏; 李迎慧; 林一曼; 邱亚群
Original assignee: SHENZHEN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: SHENZHEN CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN111197094A

Abstract

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及用于副溶血弧菌基因分型的组合物、试剂盒和方法。本发明的组合物包括基于13种O抗原基因的12组杂交探针，每组杂交探针均包括上游杂交探针和下游杂交探针；12组上游杂交探针的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示，12组下游杂交探针的序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24所示；其中，所述上游杂交探针1～12或下游杂交探针1～12具有熔点标签序列。在对副溶血弧菌进行基因分型时，采用本发明上述组合物作为杂交探针，能够一次性测定副溶血弧菌的13种O抗原基因型，特异性高，且简化基因分型过程。

Description

用于副溶血弧菌基因分型的组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及用于副溶血弧菌基因分型的组合物、试剂盒和方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio Paraheamolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，主要存在于近海的海水、海底的沉淀物、鱼虾类和贝壳及盐渍加工的海产品中。副溶血弧菌是我国沿海地区中引起海岛食物中毒的最常见病原菌，主要引起食物中毒和急性腹泻，还可引起伤口感染。

传统的，检测副溶血弧菌的方法有溶血性实验，采用人或兔的新鲜红血球制备高盐平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，反之，则为“神奈川现象”阴性。该法为一种菌种分类学方法，基于菌种的生理特性对菌种进行种类鉴别，仅能鉴别该菌是否为副溶血弧菌。然而，现存的副溶血弧菌包括多种基因型，准确鉴别出待测样品中存在的副溶血弧菌的个体基因型，具有极为重要的临床意义。

溶血性实验，是一种当前较为常用的用于鉴别副溶血弧菌具体个体基因型的方法。副溶血弧菌有三种抗原，即O抗原(菌体抗原)，K抗原(荚膜抗原)及H抗原(鞭毛抗原)，其中血清学分类上有意义的主要是前两个，O抗原有13种血清群，K抗原有65种血清型。进行副溶血弧菌的血清学鉴定时，采用O抗原分群，将18～24h的培养物，用3％食盐水制成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集实验，同时用无菌生理盐水作对照，如O凝集反应呈阳性时，可用不经过加热的菌悬液进行K抗血清玻片凝集反应分型鉴定。然而，该法的检测分型过程耗时繁琐，易受主观因素干扰，容易出现假阳性或假阴性结果，无法满足当前的临床应用需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种用于基因分型的组合物，旨在提供一种杂交探针组合物，以一次性识别获取待测样品中所存在的副溶血弧菌O抗原基因片段，实现对副溶血弧菌的快速基因分型。

本发明的另一目的在于提供一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的试剂盒，旨在提供一种包含上述组合物的试剂盒，实现对副溶血弧菌的快速基因分型，简化操作过程。

本发明的又一目的在于提供一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的方法，旨在利用上述组合物作为杂交探针，以一次性识别获取待测样品中所存在的副溶血弧菌O抗原基因片段，实现对副溶血弧菌的快速基因分型。

为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种用于副溶血弧菌基因分型的组合物，包括基于13种O抗原基因的12组杂交探针，每组杂交探针均包括上游杂交探针和下游杂交探针，且12组杂交探针的序列如下所示：

针对O1抗原基因的上游杂交探针1：SEQ ID NO.1，以及下游杂交探针1：SEQ IDNO.13；

针对O2抗原基因的上游杂交探针2：SEQ ID NO.2，以及下游杂交探针2：SEQ IDNO.14；

针对O3和O13抗原基因的上游杂交探针3：SEQ ID NO.3，以及下游杂交探针3：SEQID NO.15；

针对O4抗原基因的上游杂交探针4：SEQ ID NO.4，以及下游杂交探针4：SEQ IDNO.16；

针对O5抗原基因的上游杂交探针5：SEQ ID NO.5，以及下游杂交探针5：SEQ IDNO.17；

针对O6抗原基因的上游杂交探针6：SEQ ID NO.6，以及下游杂交探针6：SEQ IDNO.18；

针对O7抗原基因的上游杂交探针7：SEQ ID NO.7，以及下游杂交探针7：SEQ IDNO.19；

针对O8抗原基因的上游杂交探针8：SEQ ID NO.8，以及下游杂交探针8：SEQ IDNO.20；

针对O9抗原基因的上游杂交探针9：SEQ ID NO.9，以及下游杂交探针9：SEQ IDNO.21；

针对O10抗原基因的上游杂交探针10：SEQ ID NO.10，以及下游杂交探针10：SEQID NO.22；

针对O11抗原基因的上游杂交探针11：SEQ ID NO.11，以及下游杂交探针11：SEQID NO.23；

针对O12抗原基因的上游杂交探针12：SEQ ID NO.12，以及下游杂交探针12：SEQID NO.24；

其中，所述上游杂交探针1～12或下游杂交探针1～12具有熔点标签序列。

本发明的另一方面，提供了一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的试剂盒，包括：上述组合物。

本发明的又一方面，提供了一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的方法，包括以下步骤：

提供副溶血弧菌DNA提取物和上述试剂盒，将所述副溶血弧菌DNA提取物与所述组合物混合，然后在所述杂交连接反应体系中进行杂交连接反应，获得杂交连接产物；

将所述杂交连接产物进行不对称扩增，获得扩增产物；

对所述扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度值，并根据所述熔解温度值确认所述副溶血弧菌的O抗原基因类型。

本发明基于副溶血弧菌O1至O13抗原基因的保守片段，对O1至O13各抗原基因分别设计了一组能与之特异性配对结合的上下游杂交探针序列，其中，由于O3和O13的抗原所有决定簇基因完全相同，识别O3和O13抗原基因的上下游杂交探针相同。当进行副溶血弧菌的基因分型时，以多重连接探针扩增技术的原理为基础，采用本发明设计的上述组合物作为杂交探针，能够一次性测定副溶血弧菌的13种O抗原基因型，简化基因分型过程，有效缩短了副溶血弧菌的检测周期，提高了副溶血弧菌的检测效率。

基于上述组合物，本发明还提供了一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的试剂盒和试剂盒，本发明提供的试剂盒，包括上述组合物。本发明的检测方法通过杂交连接反应，一次性获取副溶血弧菌DNA提取物中存在的O抗原基因片段，并通过不对称扩增，获得主要为与杂交探针互补配对的单链扩增产物，扩增产物中的熔点标签在不对称扩增过程中与荧光探针配对结合形成双链结合体，特异于不同O抗原基因型的单链基因片段上形成的双链结合体的温度稳定性不同，因而根据获得的熔解温度值可确认所述副溶血弧菌的O抗原基因类型。相较于现有技术，本发明检测方法能够实现一次性鉴别所有O抗原基因型的副溶血弧菌，特异性高，检测结果准确；且有效缩短了副溶血弧菌的检测周期，提高了副溶血弧菌的检测效率。

附图说明

图1为实施例1中采用ROX荧光通道进行熔解曲线分析的检测结果；其中，横坐标为温度(T)，纵坐标为荧光信号值(-dF/dT)；

图2为实施例1中采用FAM荧光通道进行熔解曲线分析的检测结果；横坐标为温度(T)，纵坐标为荧光信号值(-dF/dT)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供一种用于副溶血弧菌基因分型的组合物，包括基于13种O抗原基因的12组杂交探针，每组杂交探针均包括上游杂交探针和下游杂交探针，且12组杂交探针的序列如下所示：

副溶血弧菌有13种O抗原，为了实现对副溶血弧菌的13种O抗原进行基因分型，本发明实施例基于副溶血弧菌O1至O13抗原基因的保守片段，设计了12组上下游杂交探针序列，其中，由于O3和O13的抗原所有决定簇基因完全相同，识别O3和O13抗原基因的上下游杂交探针相同。

在一实施例中，上游杂交探针1～12具有熔点标签序列。在另一实施例中，下游杂交探针1～12具有熔点标签序列。作为优选的实施方式，本发明实施例设计的12组上、下游杂交探针序列组合物中，自5'-端到3'-端，上游杂交探针1～12均依次包括：上游通用引物结合序列、间隔序列、熔点标签序列和上游杂交序列，下游杂交探针1～12均依次包括：下游杂交序列和下游通用引物结合序列。

其中，上游杂交序列和下游杂交序列为特异性识别模板序列，能够特异性识别副溶血弧菌DNA提取物中的O1至O13抗原基因片段。基于多重连接探针扩增技术原理，当上游杂交序列与下游杂交序列特异性结合同一目标序列，且上游杂交序列的3'-端与下游杂交序列的5'-端相邻时，在连接酶的催化作用下，上游杂交序列的3'-端与下游杂交序列的5'-端通过形成3'-5'磷酸二酯键相互连接。

熔点标签序列，用于与荧光探针杂交，且通过人为设计不同突变程度的熔点标签序列，达到结合探针能力不同的效果，使得其与荧光探针结合形成的双链结合体的温度稳定性不同，体现在熔解温度(Tm)值不同。也就是，荧光探针分别与上游杂交序列1～12上的熔点标签序列结合形成的双链结合体的Tm值互不相同。在本发明实施例中，熔点标签序列的设计主要为：在上游杂交探针设计成功后，增加SNP位点，然后根据实际Tm值筛选相差至少2～3℃的序列作为熔点标签序列。在本发明实施例中，针对各O抗原基因的上游杂交探针上的熔点标签序列如下表1所示：

表1

间隔序列，用于分隔开上游通用引物序列和熔点标签序列。在本实施例中，该间隔序列为CCTA。

具体的，本发明实施例设计的12组上、下游杂交探针组合物的具体信息如下表2所示：

表2

Organism	O-antigen	Gene	Sequence-F	Sequence-R
					Vibrio parahaemolyticus	O1	wvaG	SEQ ID NO.1	SEQ ID NO.13
Vibrio parahaemolyticus	O2	wvaR	SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.14
					Vibrio parahaemolyticus	O3/O13	VP208	SEQ ID NO.3	SEQ ID NO.15
Vibrio parahaemolyticus	O4	orf16	SEQ ID NO.4	SEQ ID NO.16
					Vibrio parahaemolyticus	O5	wvcA	SEQ ID NO.5	SEQ ID NO.17
Vibrio parahaemolyticus	O6	wvcJ	SEQ ID NO.6	SEQ ID NO.18
					Vibrio parahaemolyticus	O7	wvcN	SEQ ID NO.7	SEQ ID NO.19
Vibrio parahaemolyticu	O8	wvdG	SEQ ID NO.8	SEQ ID NO.20
					Vibrio parahaemolyticus	O9	wvaH	SEQ ID NO.9	SEQ ID NO.21
Vibrio parahaemolyticus	O10	wvcP	SEQ ID NO.10	SEQ ID NO.22
					Vibrio parahaemolyticus	O11	wvdB	SEQ ID NO.11	SEQ ID NO.23
Vibrio parahaemolyticus	O12	wvcP	SEQ ID NO.12	SEQ ID NO.24

在本发明实施例设计的12组上、下游杂交探针组合物中，上游杂交探针1与下游杂交探针1能特异性识别副溶血弧菌的O1抗原基因片段，上游杂交探针2与下游杂交探针2能特异性识别副溶血弧菌的O2抗原基因片段，上游杂交探针3与下游杂交探针3能特异性识别副溶血弧菌的O3和O13抗原基因片段，上游杂交探针4与下游杂交探针4能特异性识别副溶血弧菌的O4抗原基因片段，上游杂交探针5与下游杂交探针5能特异性识别副溶血弧菌的O5抗原基因片段，上游杂交探针6与下游杂交探针6能特异性识别副溶血弧菌的O6抗原基因片段，上游杂交探针7与下游杂交探针7能特异性识别副溶血弧菌的O7抗原基因片段，上游杂交探针8与下游杂交探针8能特异性识别副溶血弧菌的O8抗原基因片段，上游杂交探针9与下游杂交探针9能特异性识别副溶血弧菌的O9抗原基因片段，上游杂交探针10与下游杂交探针10能特异性识别副溶血弧菌的O10抗原基因片段，上游杂交探针11与下游杂交探针11能特异性识别副溶血弧菌的O11抗原基因片段，上游杂交探针12与下游杂交探针12能特异性识别副溶血弧菌的O12抗原基因片段。

当副溶血弧菌DNA提取物中同时包含O1至O13抗原基因片段时，在进行杂交连接反应时，上游杂交探针1与下游杂交探针1均以副溶血弧菌DNA提取物中的O1抗原基因片段为目标序列，特异性识别结合其中的O1抗原基因片段，并通过杂交连接，与该O1抗原基因片段形成杂交双链。同理，上游杂交探针2～12与下游杂交探针2～12与副溶血弧菌DNA提取物相互作用时，也分别形成了含O2～O13抗原基因的杂交双链，使得杂交连接产物中同时包括含O1至O13抗原基因的杂交片段，之后通过结合PCR扩增技术和对扩增产物进行分析，可实现一次性鉴别副溶血弧菌DNA提取物中的13种O抗原基因型，特异性高，简化基因分型过程，高效快速。

在对副溶血弧菌进行基因分型时，采用本发明设计的上述组合物作为杂交探针，依次进行杂交连接、PCR扩增，可得到大量以该杂交探针为模板的扩增产物；之后，可通过本领域的常规手段对该扩增产物进行分析，进而确认待测样品中副溶血弧菌的基因型。

其中，对扩增产物进行分析的手段包括多种，常规地，采用电泳分析(例如毛细管电泳)，通过与质控片段进行比对，确认具体的O抗原基因型，然而电泳分析的过程较为繁琐，且在人为因素影响较大。

在本发明实施例中，由于上游杂交探针1～12均分别设计有熔点标签序列，上游探针序列1～12中的熔点标签序列与荧光探针结合形成的双链结合体的温度稳定性各不相同，故可对其进行熔解曲线分析，获得特异的Tm值，进而根据该Tm值可直接确定认待测副溶血弧菌的具体O抗原基因型。

在本发明实施例中，设计的上述12组上、下游杂交探针的片段长度为50～85bp，退火温度应在68℃～75℃区间。经过实验测试，在上述优选长度范围的杂交探针性能最佳，否则影响特异性，以及合成成本问题。同时，以上杂交探针的退火温度范围有利于杂交反应的进行。

另一方面，本发明实施例提供了一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的试剂盒，包括：上述组合物。

本发明试剂盒因含有本发明实施例特有的上、下游杂交探针组合物，所以在多重连接探针扩增技术的基础上，结合熔解曲线分析技术，可实现快速、简便和高通量地对副溶血弧菌的13种O抗原基因型进行同步检测，简化了副溶血弧菌的基因分型过程，从而有效缩短了副溶血弧菌的检测周期，提高了副溶血弧菌的检测效率。

作为本发明的优选实施方式，副溶血弧菌的试剂盒还包括：连接反应液，以及扩增反应液；

连接反应液至少包含：连接酶和连接酶缓冲液，连接反应液与组合物构成杂交连接反应体系；

扩增反应液至少包含：下游通用引物和荧光探针。

组合物，主要作为杂交连接反应中的杂交探针。其中，上游杂交探针1～12具有用于与荧光探针结合的熔点标签序列和用于特异性识别目标序列的上游杂交序列，下游杂交探针1～12具有用于与下游通用引物结合的下游通用引物结合序列和用于特异性识别目标序列的下游杂交序列。具体的，组合物具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示序列。

进一步的，所述组合物的工作浓度为5～10nM。

连接酶，用于催化特异性结合同一目标序列的上、下游杂交探针相互连接，形成一完整的杂交探针单链，使得杂交连接反应过程能够顺利完成，进而形成含目标序列的双链DNA结构。在本发明实施例中，连接酶选为Biolabs-Taq DNA Ligase。

作为优选，所述连接酶的工作浓度为0.29～0.58U/μL。

更进一步的，本发明实施例的杂交连接反应体系具体包括：以杂交连接反应体系总计10μL，1.5μL上述组合物(10nM)、1μL连接酶(ligase，1U/μL)、11U/μL连接酶缓冲液(ligase buffer)、超纯水(DDW)、5μL副溶血弧菌DNA提取物。

试剂盒中的扩增反应液，主要用于为PCR扩增反应提供一个扩增反应体系。其中，扩增反应液至少包含：下游通用引物和荧光探针。

下游通用引物，为通用引物，其与下游杂交探针中的下游通用引物结合序列结合，启动针对杂交探针的不对称扩增反应。扩增反应液反应液中仅含下游通用引物，扩增反应仅以杂交探针为扩增模板进行不对称扩增，由于扩增反应体系中不存在上游通用引物，目标序列作为扩增模板参与扩增。因而，在本发明实施例所提供的扩增反应体系中，主要以杂交探针为扩增模板进行不对称扩增，且得到的扩增产物主要为与杂交探针互补配对的单链DNA片段。

在一实施例中，下游通用引物具有SEQ ID NO.26所示序列。

荧光探针，不仅用于对扩增产物进行标记跟踪，监控扩增反应过程，其作用更在于：与扩增产物中的熔点标签序列结合，形成双链结合体，在进行熔解曲线分析之后，能够获取与特定的O抗原基因特异的熔解温度值。

在一实施例中，荧光探针包括：标记有荧光基团ROX的荧光探针，以及标记有荧光基团FAM的荧光探针。经过实验测试，ROX/FAM通道信号最好。

作为优选，标记有荧光基团ROX的所述荧光探针具有SEQ ID NO.27所示序列，其中，荧光基团ROX标记在序列的5'-端，报告基团BHQ2标记在序列的3'-端；标记有荧光基团FAM的所述荧光探针具有SEQ ID NO.28所示序列，其中，荧光基团FAM标记在序列的5'-端，报告基团BHQ1标记在序列的3'-端(TCGGTCCTTCATCGCTCAGCCTTCACCGG)。经过试验，选择这两种荧光探针应用于本发明实施例的扩增反应体系中，可获得最佳的效果。

作为优选，荧光探针的工作浓度为20～100μM。经过试验，处于该浓度范围的荧光探针应用于本发明实施例的扩增反应体系中，可获得最佳的效果。

作为本发明的优选实施方式，扩增反应液还包含：上游通用引物；其中，所述上游通用引物的浓度为0.015～0.020μM，所述下游通用引物的浓度为0.3～0.4μM。

在扩增反应液中加入少量的上游通用引物，先富集一定量的双链出来，可以促进与杂交探针互补配对的单链基因片段大量扩增。

在本发明一实施例中，上游通用引物具有序列SEQ ID NO.25。

基于上述试剂盒，本发明实施例还提供了一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的方法，包括以下步骤：

S01、提供副溶血弧菌DNA提取物和上述试剂盒，将所述副溶血弧菌DNA提取物与组合物混合，然后在杂交连接反应体系中进行杂交连接反应，获得杂交连接产物；

S02、将所述杂交连接产物进行不对称扩增，获得扩增产物；

S03、对所述扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度值，并根据所述熔解温度值确认所述副溶血弧菌的基因型。

具体的，在步骤S01中，提供副溶血弧菌DNA提取物，用于作为杂交连接的DNA模板。副溶血弧菌DNA提取物到的制备方法，本发明实施例不作具体限定，包括但不限于，采用市售商品细菌提取试剂盒进行核算提取。

将所述副溶血弧菌DNA提取物加入所述试剂盒的与组合物混合，然后在杂交连接反应体系中进行杂交连接反应，这一步骤的具体实施过程可参考本领域的常规操作，本发明实施例不作具体限定。通过这一步骤，将作为杂交模板的副溶血弧菌DNA提取物与组合物中的各上、下游杂交探针混匀，促进杂交连接反应的进行。

作为优选的实施方式，杂交连接反应的反应条件为：将所述副溶血弧菌DNA提取物和组合物于95～100℃变性5min，在75℃加入连接酶，再60℃60～80min，95～100℃5min，4℃停止。

在步骤S02中，将所述杂交连接产物加入所述试剂盒的扩增反应液中，目的在于，通过将杂交连接产物作为模板，参与扩增反应。这一步骤的具体实施过程可参考本领域的常规操作，本发明实施例不作具体限定。

进行不对称扩增的目的在于：大量扩增与杂交探针互补配对的单链基因片段，使得更多的荧光探针与该单链基因片段的熔点标签序列结合，进而增强荧光强度，使得检测结果更为准确。

作为优选的实施方式，所述不对称扩增的反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，57℃退火20s，72℃延伸20s，循环38次。

在步骤S03中，对所述扩增产物进行熔解曲线分析，其目的在于获得熔解温度值，用于确认待测的副溶血弧菌的基因型。

作为优选的，进行熔解曲线分析的具体过程包括：将所述扩增产物95℃变性1min，40℃2min，从40℃按0.5℃温度梯度增加至85℃，收集荧光值，进行熔解曲线分析。

综上，本发明实施例副溶血弧菌的检测方法利用了本发明实施例特有的上、下游杂交探针组合物，其中，各上游杂交探针中设计熔点标签序列，该熔点标签序列在不对称扩增过程中与荧光探针互补结合形成温度稳定性各不相同的双链结合体，通过对该双链结合体进行熔解曲线分析可获得特定的Tm值，进而确认待测副溶血弧菌的具体O抗原基因型。因而，本发明实施例在多重连接探针扩增技术与熔解曲线分析技术相结合的基础上，实现了快速、简便和高通量地对副溶血弧菌的13种O抗原基因型进行同步检测，简化了副溶血弧菌的基因分型过程。

在本发明实施例副溶血弧菌的检测方法的具体应用过程中，当副溶血弧菌DNA提取物中存在O1至O13抗原基因片段中的任一种时，仅检测得到一个Tm值，根据该具体的Tm值，可确认相应的副溶血弧菌O抗原基因类型；当副溶血弧菌DNA提取物中存在O1至O13抗原基因片段中的多种时，检测得到多个Tm值，根据该具体的Tm值，可确认相应的几种副溶血弧菌O抗原基因类型。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例一种组合物、副溶血弧菌的试剂盒和检测方法的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。

实施例1

本实施例提供了一种检测副溶血弧菌O抗原基因类型的方法，具体包括如下步骤：

1、提供副溶血弧菌菌株，采用革兰氏阴性菌基因组提取试剂盒，按照其说明书提取副溶血弧菌的核苷酸序列，获得副溶血弧菌DNA提取物，作为杂交连接反应的DNA模板。

2、杂交连接反应

1)基于副溶血弧菌O1至O13抗原基因的保守片段，设计12组分别针对各O抗原基因的上、下游杂交探针；

2)使用TE缓冲液将12组上、下游杂交探针溶解并稀释到5μM，作为备用母液；将活度为1U/uL的连接酶与连接酶缓冲液和超纯水混合，配制连接反应液；

3)根据表3所示杂交连接反应体系，进行备料；然后，采用TE缓冲液将上、下游杂交连接探针组合物稀释至浓度10nM，吸取1.5μL至EP管中，加入1.5μL副溶血弧菌DNA提取物，混合，然后上机(普通PCR仪Biometra T3)进行连接反应，获得杂交连接产物；同时，采用TE缓冲液代替模板DNA为阴性对照(LDR)进行同步扩增；

反应程序设置为：95℃变性5min，在75℃加入连接反应液，再60℃80min，95～100℃3min，4℃停止。

表3杂交连接反应体系(总计10μL/管)

3、荧光PCR反应

完成杂交连接反应后，吸取5μL杂交连接产物用于荧光PCR扩增检测，表4为本实施例的荧光PCR扩增检测反应体系。将该反应体系置于BIO-RADC1000荧光PCR仪上进行不对称PCR扩增，获得扩增产物；

反应程序：95℃预变性3min，95℃变性10s，57℃退火20s，72℃延伸20s，循环38次，在57℃退火10s阶段收集荧光值。

表4荧光PCR扩增检测反应体系(总计50uL/管)

试剂	用量
		10×Buffer(Mg<sup>2+</sup>free)	5μL
dNTP(2.5mM)	4μL
		Mg<sup>2+</sup>(1.5mM)	3mL
上游通用引物(2.5μM)	0.3μL
		下游通用引物(50μM)	0.3μL
荧光探针(ROX，20μM)	0.2uL
		荧光探针(FAM，20μM)	0.2μL
rTaq(5U/μL)	0.2μL
		DDW	31.5μL
杂交连接产物	5uL

4、熔解曲线分析

在步骤3的基础上，直接在BIO-RAD C1000荧光PCR仪上进行熔解曲线分析，将所述扩增产物95℃变性1min，然后从40℃按0.5℃温度梯度增加至85℃，收集荧光值，绘制熔解曲线。图1～2为检测结果，表5为各副溶血弧菌O抗原基因对应的熔解温度(Tm)值，其中，图1和图2中，LDR结果显示为阴性，且各O抗原基因型对应的Tm值之间的区别较为明显。

表5

测试例

1、最低检测限考察

选取13株不同O抗原基因型的标准副溶血弧菌菌株，用于最低检出限测定；然后分别在平板上划线分离，37℃，培养12h，用一次性棉签刮取单菌落到加有生理盐水的比浊管中充分混匀并定量稀释到0.5麦氏单位(约为108CFU/mL)。然后取1mL混合液用热裂解法提取菌株核酸并离心取上清液，将提取到的核酸测核酸浓度，初始浓度定为10²ng/uL，按10倍梯度稀释，一直稀释到10^-2ng/uL。然后，采用实施例1的检测方法检测副溶血弧菌的O抗原基因型，每个浓度梯度设3次平行检测实验，以保证结果可靠性。表6为检测结果，如结果所示，采用本发明检测方法对副溶血弧菌基因分型的最低检测限低至0.1ng/uL，说明本发明检测方法的灵敏度高。

表6最低检测限

2、方法学评价

本测试例共选取382株临床副溶血弧菌菌株用于评估，与传统的溶血性实验做比较，以考察本发明检测方法的灵敏度和特异性。表7为检测结果，结果显示，本发明检测方法的灵敏度为99.2％，特异度为100％，Kappa值为0.77(大于0.75)，这说明本发明检测方法与传统血清法的一致性极好，说明本发明检测方法可作为一种副溶血弧菌O抗原快速分型检测方法。

表7

注：荧光探针熔解曲线灵敏度：阳性符合率＝A/(A+B)×100％＝99.2％；

荧光探针熔解曲线特异度：阴性符合率＝D/(C+D)×100％＝100％；

荧光探针熔解曲线Kappa＝(Po-Pe)/(1-Pe)＝0.77。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市疾病预防控制中心

<120> 用于副溶血弧菌基因分型的组合物、试剂盒和方法

<130> 2018

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 1

gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga cactggctgc tggtccgtga cgacaacata 60

accacgtctg aaccagaact gatact 86

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 2

gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctagctgc tcgttcgtga cgcacccaag 60

aatggcaaca tgttattacc ataagtc 87

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 3

gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctgtcttc tcgttcgtga cgatgtaagg 60

aaacggattt atgtatagtg tcacttga 88

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 4

gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctatggcttc tcgttggtga cgcctgtgca 60

ttactttttt acagccttta cgttatttca 90

<210> 5

<211> 85

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 5

gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctagctgc ttgttcgtga cgcctcaaga 60

atcttatgtg ttagcagtgt catgg 85

<210> 6

<211> 87

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 6

gtggcagggc gctacgaaca atcctatcgg tcctttatcg ctcacccttc accggcatct 60

caatgttaaa cggtatgttt gcaatca 87

<210> 7

<211> 90

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 7

gtggcagggc gctacgaaca atcctatccg ttctttatcg ctcagccttc atcggcattg 60

aaccagaccg tgtggccaag ccaattattg 90

<210> 8

<211> 86

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 8

gtggcagggc gctacgaaca atcctatcgg tccttcatcg ctcggccttc accgggccca 60

acgaagcaga gtcagcatac aagtta 86

<210> 9

<211> 90

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 9

gtggcagggc gctacgaaca atcctatcgg tccttcatgg ctcagtcttc accgggctat 60

ctcaagatga atctgagtgt attgcaaaag 90

<210> 10

<211> 89

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 10

gtggcagggc gctacgaaca atcctatcgg tccttcatcg ctcagccttc accggcgcga 60

gtctctctga aggatatgat tcattaatg 89

<210> 11

<211> 87

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 11

gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctagcttc tcgttagtga cggatgtatc 60

tctaggttgt tcgggatacg tatatgg 87

<210> 12

<211> 88

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 12

gtggcagggc gctacgaaca atcctatcgc tccttcatag ctcagacttc atcggaccgt 60

cattaatgaa tcatagcctt ccatgagt 88

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 13

gtgtcatcaa gatacagtat caaagatcat gagtgagatt ggatcttgct gggc 54

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 14

gagacaaccg cagtattaca gtccctgaga ttggatcttg ctgggc 46

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 15

cgaggataat tatactaaaa gtttgcattt aggtgttctg agattggatc ttgctgggc 59

<210> 16

<211> 53

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 16

gatcagcctc atctggtatt tacaattcca tttgagattg gatcttgctg ggc 53

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 17

cgctggatga ttagagatgt cgaagatgag attggatctt gctgggc 47

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 18

gtatttacga taagcgcata gacactatgt ttctgagatt ggatcttgct gggc 54

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 19

atcttggatg actgttcacc tgatgatgag attggatctt gctgggc 47

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 20

ggtattattc cgcattacaa caataagaac gactgagatt ggatcttgct gggc 54

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 21

tttatcgatt gattataacg agcggaacgg attgagattg gatcttgctg ggc 53

<210> 22

<211> 47

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 22

acggtaaaag agctgcgcgg ttttattgag attggatctt gctgggc 47

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 23

tctttggctt gctcacatga tgatagagtg agattggatc ttgctgggc 49

<210> 24

<211> 57

<212> DNA

<213> 副溶血弧菌

<400> 24

gcttgattat actgtttgat aatagcgcta taaccttgag attggatctt gctgggc 57

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 通用引物

<400> 25

gtggcagggc gctacgaaca at 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 通用引物

<400> 26

gcccagcaag atccaatctc a 21

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 荧光探针

<400> 27

acgactctgg ctgctcgttc gtgacg 26

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 荧光探针

<400> 28

tcggtccttc atcgctcagc cttcaccgg 29

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgactctag ctgctcgttc gtgacg 26

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acgactctgt cttctcgttc gtgacg 26

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

acgactctag ctgcttgttc gtgacg 26

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acgacactgg ctgctggtcc gtgacg 26

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

acgactctag cttctcgtta gtgacg 26

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

acgactatgg cttctcgttg gtgacg 26

<210> 35

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tcggtccttc atcgctcagc cttcaccgg 29

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

tcggtccttc atcgctcggc cttcaccgg 29

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tcggtccttt atcgctcacc cttcaccgg 29

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tcggtccttc atggctcagt cttcaccgg 29

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tccgttcttt atcgctcagc cttcatcgg 29

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tcgctccttc atagctcaga cttcatcgg 29

Claims

1.一种非诊断目的检测副溶血弧菌O抗原基因类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供副溶血弧菌DNA提取物和试剂盒，所述试剂盒包括以下组合物：基于13种O抗原基因的12组杂交探针，每组杂交探针均包括上游杂交探针和下游杂交探针，且12组杂交探针的序列如下所示：针对O1抗原基因的上游杂交探针1：SEQ ID NO.1和下游杂交探针1：SEQID NO.13，针对O2抗原基因的上游杂交探针2：SEQ ID NO.2和下游杂交探针2：SEQ IDNO.14，针对O3和O13抗原基因的上游杂交探针3：SEQ ID NO.3和下游杂交探针3：SEQ IDNO.15，针对O4抗原基因的上游杂交探针4：SEQ ID NO.4和下游杂交探针4：SEQ ID NO.16，针对O5抗原基因的上游杂交探针5：SEQ ID NO.5和下游杂交探针5：SEQ ID NO.17，针对O6抗原基因的上游杂交探针6：SEQ ID NO.6和下游杂交探针6：SEQ ID NO.18，针对O7抗原基因的上游杂交探针7：SEQ ID NO.7和下游杂交探针7：SEQ ID NO.19，针对O8抗原基因的上游杂交探针8：SEQ ID NO.8和下游杂交探针8：SEQ ID NO.20，针对O9抗原基因的上游杂交探针9：SEQ ID NO.9和下游杂交探针9：SEQ ID NO.21，针对O10抗原基因的上游杂交探针10：SEQ ID NO.10和下游杂交探针10：SEQ ID NO.22，针对O11抗原基因的上游杂交探针11：SEQ ID NO.11和下游杂交探针11：SEQ ID NO.23，针对O12抗原基因的上游杂交探针12：SEQID NO.12和下游杂交探针12：SEQ ID NO.24，所述上游杂交探针1~12具有熔点标签序列；

将所述副溶血弧菌DNA提取物与所述12组杂交探针混合，然后在杂交连接反应体系中进行杂交连接反应，获得杂交连接产物；

将所述杂交连接产物进行不对称扩增，获得扩增产物；

对所述扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度值，并根据所述熔解温度值确认所述副溶血弧菌的O抗原基因类型；

其中，针对各O抗原基因的上游杂交探针上的熔点标签序列如下表所述：

。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合物还包括：连接反应液，以及扩增反应液；

所述连接反应液至少包含：连接酶和连接酶缓冲液，所述连接反应液与所述12组杂交探针构成杂交连接反应体系；

所述扩增反应液至少包含：下游通用引物、荧光探针和上游通用引物；

其中，所述下游通用引物具有SEQ ID NO.26所示序列，所述上游通用引物具有SEQ IDNO.25所示序列；

所述荧光探针包括：标记有荧光基团ROX的荧光探针以及标记有荧光基团FAM的荧光探针，且标记有荧光基团ROX的所述荧光探针具有SEQ ID NO.27所示序列，标记有荧光基团FAM的所述荧光探针具有SEQ ID NO.28所示序列；

所述上游通用引物的工作浓度为0.015μM，所述下游通用引物的工作浓度为0.3μM。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连接酶的工作浓度为0.1 U/μL；和/或

所述杂交探针的工作浓度为1.5nM。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述杂交连接反应的反应条件为：

将所述副溶血弧菌DNA提取物与所述12组杂交探针混合，于95~100℃变性5 min，在75℃加入连接反应液，再60℃ 60~80min，95~100℃ 3min，4℃停止。

5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述不对称扩增的反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，57℃退火20s，72℃延伸20s，循环38次；和/或

对所述扩增产物进行熔解曲线分析，其具体过程包括：将所述扩增产物95℃变性1min，从40℃按0.5℃温度梯度增加至85℃，收集荧光值，进行熔解曲线分析。