CN111172158A - 一种抗草甘膦棉花转化事件kjc017及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗草甘膦棉花转化事件KJC017，其特征在于，特征基因序列包含转基因表达盒，所述转基因表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。本发明还提供了用于检测棉花抗草甘膦转化事件KJC017的引物对，以及检测方法。本发明的抗草甘膦转化事件KJC017的棉花能够耐受高剂量的草甘膦，且结铃、吐絮均不受影响，有利于控制田间杂草，提高耕作效率和产量。

Description

一种抗草甘膦棉花转化事件KJC017及其应用

技术领域

本申请本发明涉及植物育种技术领域，主要涉及一种用于棉花抗草甘膦转化事件KJC017及其在棉花育种中的应用。

背景技术

棉花(陆地棉)在世界上许多地区是重要的经济作物，为了生产具有所需性状的棉花，已将生物技术方法应用于这种作物。这种所需性状是除草剂耐受性。除草剂耐受性转基因在植物中的表达能够赋予植物所需的除草剂耐受性状，但是转基因的表达可能受到转基因插入的染色体位置和基因组结果的影响。例如，已经在植物中观察到，在转基因的染色体插入位点方面不同但在其他方面都相同的单个事件之间，通常存在着转基因表达水平和模式的变异。在事件之间还可能存在不想要的和/或想要的表型或农学差异。因此，为了选择具有所需性状和使其适合于商业化目的所需的最适表型和农业特性两者的事件，通常需要产生并分析大量单个植物转化事件。这样的选择通常需要经过多年、在多个地点并在多种不同条件下对许多事件进行温室和田间试验，以便可以收集到大量农艺学、表型和分子数据。然后必须由科学家和农学家对得到的数据进行分析，其目的是选择商业上适合的事件。这样的事件一旦被选择，随后可能用于使用植物育种方法将所需性状渗入到其他遗传背景中，并由此产生含有所需性状并适当地适应于特定当地生长条件的大量不同作物品种。

发明内容

在研究过程中申请人发现了一个可使棉花获得抗草甘膦性状的转基因表达盒，转基因的棉花植株在高剂量草甘膦的情况下仍正常生长。

本发明的一个方面在于提供一种棉花抗草甘膦转化事件KJC017，其特征基因序列包含转基因表达盒，所述转基因表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

在根据本发明的一个实施方案中，所述特征基因序列还包含5'端连接序列，所述5'连接序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中的任一个。

在根据本发明的一个实施方案中,所述特征基因序列还包含3'端连接序列，所述3'端连接序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的任一个。

在根据本发明的一个实施方案中，所述特征基因序列为核苷酸序列为SEQ ID NO:10的基因序列或其互补序列。

在根据本发明的一个实施方案中，所述特征序列位于四倍体棉花的D基因组第5组染色体上。

本发明的另一方面在于提供用于检测上述的棉花抗草甘膦转化事件KJC017的引物对，所述引物对包含特异性识别侧翼序列的第一引物对和/或第二引物对，所述第一引物对由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12(P681：5’-CCAGAATCCTTGTCAGATT-3’和D5-660F：5’-AAAGAATAGGTATTG GGC-3’)组成；所述第二引物对由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成。FMV1：5’-ATAAAGGCAAAGATGCTTTTGGTAGGTG-3’和D5-R2：5’-ATGCATGCAGCAATTCATTT-3’。

本发明进一步提供了一种鉴定棉花生物样品中棉花抗草甘膦转化事件KJC017的方法，其包括:(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；(b)以提取的DNA样品为模板,使用权利要求6所述的引物对进行PCR扩增；(c)检测PCR扩增产物的长度与抗草甘膦转化事件KJC017中的理论核苷酸序列长度比较。若以第一引物对扩增得到的扩增产物的核苷酸序列长度为1082bp，或以第二引物扩增等到的扩增产物的核苷酸序列长度为891bp，则表明样品中存在抗草甘膦转化事件KJC017。

进一步的，上述用途包括具备抗草甘膦转化事件KJC017的棉花植株、棉花植物细胞、种子、子代植株、杂交植株、棉油、棉花蛋白质。

本发明的另一方面在于提供上述的转化事件KJC017以提高棉花草甘膦抗性，进行棉花育种或用作分子标记的用途。

附图说明

图1所示为棉花抗草甘膦基因转化事件KJC017中基因表达盒在包含事件KJC017的棉花植物的基因组中的结构。

图2为棉花抗草甘膦转化事件KJC017 T1代草甘膦测试，其中，左侧为对照组的非转基因新陆早45，右侧为本发明的抗草甘膦转化事件T1代棉花。

图3为于2019年3月吐絮期喷施了草甘膦的抗草甘膦转化事件KJC017棉花正常结铃、吐絮照片。

图4为草甘膦耐受试验结果图，其中，对照(CK)为非转基因受体新陆早45，另外4个为KJC017事件的实验株在棉花4叶期分别喷施浓度1×(840g ae/ha)、4×、8×、12×草甘膦，对照喷施1×草甘膦，喷施10天后拍照。

图5为棉花抗草甘膦转化事件KJC017的检测结果图，其中，M：Trans 2K plus II，分子量标准从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；

泳道1-7以KJC017 T3代的7个单株DNA为模板扩增产物(1082bp)，泳道8以新陆早45DNA为对照模板扩增产物，泳道9以ddH2O为模板PCR产物；

图6为棉花抗草甘膦转化事件KJC017的检测结果图，其中，M：Trans 2K plus II，分子量标准从上到下依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-7以KJC017 T3代的7个单株DNA为模板扩增产物(891bp)，泳道8以新陆早45DNA为模板扩增产物，泳道9以ddH2O为模板PCR产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

“引物”通常是高度纯化的分离的多核苷酸，其被设计用于涉及热扩增的特异性退火或杂交方法中。一对引物可以与模板DNA例如棉花基因组DNA样品一起使用在热扩增例如聚合酶链反应(PCR)中，以产生扩增子，其中从这样的反应产生的扩增子具有与位于引物杂交到模板处的两个位点之间的模板DNA的序列相对应的DNA序列。当在本文中使用时，“扩增子”是使用扩增技术合成的DNA碎片或片段。本发明的扩增子包含至少一个以SEQ ID NO：1-10提供的序列。引物通常被设计成与互补的靶DNA链杂交以在引物与靶DNA链之间形成杂交体，并且引物的存在是聚合酶使用靶DNA链作为模板开始引物延伸(即另外的核苷酸聚合到伸长的核苷酸分子中)的识别位点。当在本发明中使用时，引物对意图指使用结合双链核苷酸片段的相反链的两个引物以通常在热扩增反应或其他常规核酸扩增方法中实现线性扩增由引物对的单个成员的结合所靶定的位置之间的多核苷酸片段的目的。

本文中术语“分离的”是指分子至少部分地与在天源或自然状态下通常与其相伴的其他分子分离。在一种实施方式中，术语“分离的”是指DNA分子与在天源或自然状态下通常邻接所述DNA分子的核酸至少部分地分离。因此，例如作为重组技术的结果，与正常情况下不与其相关的调节或编码序列融合的DNA分子在本文中被认为是分离的。即使在整合到宿主细胞的染色体中或与其他DNA分子一起存在于核酸溶液中时，这样的分子也被认为是分离的。

可以使用本领域技术人员公知的大量方法来分离和操作本发明中公开的DNA分子或其片段。例如，可以使用PCR(聚合酶链反应)技术来扩增特定的起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可以通过其他技术来获得，例如通过使用化学手段直接合成所述片段，正如通常通过使用自动化寡核苷酸合成仪所实现的。

实施例1：棉花的转化和KJC017事件选择

本实施例描述了转化事件KJC017的产生、分析和选择。

耐受草甘膦的转基因棉花转化事件KJC017利用包含图1中示出的表达盒的植物转化载体，通过土壤杆菌介导的棉花转化产生。为了产生KJC017事件，将新陆早45棉花材料用于植物转化。将棉花细胞转化并再生成完整棉花植物。选择具有正常表型特征的生根植物，并将其转移至土壤进行生长和进一步评估。

将T0植物转移至土壤，PCR鉴定并选择含T-DNA表达盒的T0植物。T-DNA表达盒含有P-FMV tsf1启动子，该启动子包含：玄参花叶病毒(FMV)增强子，拟南芥transcriptionfactor 1启动子及其5’UTR调控序列；可操作地与编码来自于拟南芥的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的叶绿体转运肽的N-端叶绿体转运肽的DNA分子(CTP2)连接；可操作地与编码来自于土壤农杆菌CP4的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)连接；可操作地与豌豆的rbcs2 E9基因3’UTR DNA分子(T-E9)连接；

以草甘膦1×的田间施用量(840g ae/ha)进行除草剂筛选T1代，抗性单株自交收取种子。分别用1×、4×、8×、12×草甘膦测试T2代的耐受能力。筛选到最抗的转化事件KJC017。T3代Taqman分析CP4-EPSPS为单拷贝插入。

实施例2：转化事件KJC017序列的表征

使用包括植物表达盒的完整编码区及其相应的调控元件、启动子、内含子和多腺苷化序列的分子DNA探针。分析显示，KJC017含有单一转基因DNA插入，其具有表达盒的一个拷贝。进行Hi-Tail PCR和DNA序列分析以确定插入片段-植物基因组的5’和3’接合部，证实插入片段内元件的组织(图1)，并确定包含转化事件KJC017的棉花植物中插入片段的完整DNA序列(在本文中提供为SEQ ID NO：9)。在基因组中包含图1中示出的连接的转基因遗传元件并且对草甘膦除草剂抗性的棉花植物是本发明的一个方面。

SEQ1SEQ ID NO：1是20个核苷酸的序列，其表示棉花基因组DNA与整合的转基因表达盒的5’连接区域。SEQ ID NO：1位于SEQ ID NO：10中661—680核苷酸位置处。

SEQ ID NO：2是20个核苷酸的序列，其表示棉花基因组DNA与整合的转基因表达盒的3’连接区域。SEQ ID NO：2位于SEQ ID NO：10中4930—4949核苷酸位置处。

SEQ ID NO：3是60个核苷酸的序列，其表示棉花基因组DNA与整合的转基因表达盒的5’连接区域。

SEQ ID NO：4是60个核苷酸的序列，其表示棉花基因组DNA与整合的转基因表达盒的3’连接区域。

SEQ ID NO：5是100个核苷酸的序列，其表示棉花基因组DNA与整合的转基因表达盒的5’连接区域。

SEQ ID NO：6是100个核苷酸的序列，其表示棉花基因组DNA与整合的转基因表达盒的3’连接区域。

SEQ ID NO：7是侧邻KJC017的插入DNA直到并包括一部分整合的转基因表达盒的5’序列。

SEQ ID NO：8是侧邻KJC017的插入DNA直到并包括一部分整合的转基因表达盒的3’序列。

SEQ ID NO：9是整合的转基因表达盒的序列，其中第1bp的“G”是T-DNA整合时随机引入的。

SEQ ID NO：10是侧邻插入DNA的5’序列(SEQ ID NO：7)、整合的转基因表达盒(SEQID NO：9)和侧邻插入DNA的3’序列(SEQ ID NO：8)的连续核苷酸序列。SEQ ID NO：10包含SEQ ID NO：1-9。

实施例3.棉花转化事件KJC017筛选鉴定

1.棉花抗草甘膦转化事件KJC017 T1代草甘膦测试：

试验时间：2018年12月，试验地点：海南三亚崖州区南滨，测试对照为非转基因受体新陆早45，于棉花4叶期喷施浓度1×草甘膦(41％草甘膦异丙胺盐水剂，840g ae/ha)，喷施10天后记录、拍照，在全生育期跟踪棉花生长情况。

大田喷洒1×草甘膦(840g ae/ha)10天后(2018.12)。

试验结果：结果如图2所示。对4叶期使用1×草甘膦(840g ae/ha)，KJC017事件叶片无枯斑，生长点正常，叶片绿色，表明对草甘膦有良好的抗性。

喷施草甘膦的转基因棉花正常结铃、吐絮，表明草甘膦对棉花全生育期生长没有影响，如图3所示。

2.转化事件KJC017 T2代草甘膦耐受试验

试验时间：2019年5月，试验地点：北京顺义区赵全营镇忻州营村公司试验基地，对照为非转基因受体新陆早45，KJC017事件在棉花4叶期喷施浓度1×(840g ae/ha)、4×、8×、12×草甘膦，对照喷施1×草甘膦，喷施10天后记录、拍照。

试验结果：

结果如图4所示：在棉花4叶期喷施浓度1×(840g ae/ha)、4×、8×、12×草甘膦，转化事件KJC017 4叶期在最高12×(10080g ae/ha)草甘膦，新叶、老叶、生长点均正常，药害指数为0；而对照新陆早植株在1×浓度下全部死亡，表明转化事件KJC017对草甘膦有良好的抗性，可耐受12×浓度的草甘膦。

实施例4.Taqman分析

用本领域常用的植物DNA提取方法提取含有转化事件KJC017的棉花材料的基因组DNA，在50ul水中溶解。取1ul为模板DNA，以(SEQ ID NO:15)5’-GGCAGCCTTCGTATCGGAG-3’和(SEQ ID NO:16)5’-CTCGTGTCGGAAAACCCTGT-3’为引物，(SEQ ID NO:17)FAM-CAGGTCCATGAACTCCGGGAAGCTC-BHQ1为探针，检测CP4-EPSPS拷贝数。经过分析，转化事件KJC017为单拷贝。

实施例5.侧翼序列分析

按照参考文献(Liu Y G，et al.,2007)的Hi-TailPCR方法，获得KJC017事件插入片段的侧翼序列。在CP4-EPSPS基因上设计3条特异引物，SP3(SEQ ID NO:18)：5’-AACTCTCCGATACGAAGGCTGCCTGA-3’，SP2(SEQ ID NO:19)：5’-ACGATGGACTCCAGTCGGTGGACGATGCC ACGATGATCG-3’，SP1(SEQ ID NO:20)：5’-GATCACCGCATCGCCAT GAGCTT-3’，简并引物同文献(Liu Y G,Chen Y.High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flankingsequences[J].BioTechniques,2007,43(5):649-656)。

Hi-Tail PCR扩增体系以及扩增流程

表1扩增体系：

表2扩增程序：

Tail II PCR和Tail III PCR的产物以1％琼脂糖凝胶电泳后分析，挑选长度大于1000bp且Tail II PCR比Tail III PCR产物大的目的条带进行测序。通过测序发现T-DNA的LB与300bp的未知序列相邻。利用公布的棉花(Gossypium hirsutum)基因组序列(https://www.cottongen.org/)Gossypium hirsutum(AD1)TM-1genome ZJU-Improved v2.1_a1进行对比分析，该片段与D05染色体上的序列高度同源。

参照基因组序列，在同源序列的上下游设计引物D5-660F和D5-R2引物，然后运用D5-660F(SEQ ID NO:12)和P681(SEQ ID NO:11)(插入序列T-E9上的引物)，D5-R2(SEQ IDNO:14)和FMV1(SEQ ID NO:13)(插入序列P-FMV上的引物)分别PCR扩增KJC017基因组DNA，得到1082bp和891bp片段。测序获得与插入序列接合的棉花侧翼DNA序列。

实施例6.染色体定位

根据所获得的棉花侧翼序列，利用公布的棉花(Gossypium hirsutum)基因组序列(https://www.cottongen.org/)Gossypium hirsutum(AD1)TM-1genome ZJU-Improvedv2.1_a1进行对比分析，可知转化事件KJC017中，与插入序列接合的棉花侧翼DNA序列与D05染色体上的序列高度同源，因此可知，转化事件KJC017中外源DNA插入序列的整合位点位于受体四倍体棉花的D基因组第5组染色体上。

实施例7.转化事件KJC017检测

使用DNA引物对进行PCR扩增以检测KJC017事件，以转化事件KJC017的DNA为模板，P681(SEQ ID NO:11)和D5-660F(SEQ ID NO:12)为引物，55℃退火，72℃延伸1min，华大2ⅹSuper PCR Mix扩增得到T-E9到LB侧翼序列片段1082bp。以KJC017事件DNA为模板，FMV1(SEQ ID NO:13)：和D5-R2(SEQ ID NO:14)：为引物，55℃退火，72℃延伸1min，华大2ⅹSuper PCR Mix扩增得到P-FMV到RB侧翼序列片段891bp。

利用上述引物对进行PCR鉴定使用本领域常用的方法。利用引物对分别扩增转化事件KJC017、新陆早45的棉花样品的结果如图5和图6所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。

序列表

<110> 科稷达隆生物技术有限公司

<120> 一种抗草甘膦棉花转化事件KJC017及其应用

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ttgcgccatg gtagttctct ggtcaacaaa tctgcaaaaa aaagaacaat caaatattga 2580

atcaataaaa acagtagaca tatataacca ttatgaaaat catctttaac acaaaacaat 2640

catagtaaaa agccgctatc ggagtcaaac cgatttctac cacaaaaatt gtggtgctct 2700

atcatctgag ctaagcgagc taaattcaat caaatcggca atttcaagag atataaagca 2760

aacaatccga gaattaccct tagaaaaagg gaacactgga tttgttatgc tactccagaa 2820

ttacccaatc acaattcaaa tcgacataca tcttaaatac gcaaatcaac aagttcactc 2880

gtatatagat ccaccaacca acaatcaatc gaacaaatta aaatctcaaa acaagatcga 2940

tcagaatggg aaaatagttt catgaataaa ttatcgttta gaagcagtga aacgttgata 3000

ttaacaatcg ataaaatcta aacaacagat cagaattttc agaacgatca atcaacaaag 3060

agcatcgaat ccaacaatca tcgaaataat atgagcaacg atcagcagac gaaaaagaaa 3120

aagaacgatc taagggtacg ttaacgctta cctcagagat atcgcagaaa agtgtgtagc 3180

ggctagggtc aataagaacg ataaatggaa tcagcaacga gagtggtttt atttatagcg 3240

ttgaatccga aaccaatgtt agggtttaac ataaaataat atcattcttt aaattaccat 3300

tatgcccctg tttagccgtg aatactcaat acctcttggg ttggttgtgt tttatgaatg 3360

tttagtacta catgttacaa acatcattta atcacacctt ttaattaagg ttattcaagc 3420

aaatggttat acatgttcgt ctcccaaaaa tttcattgat tgtggaccat caatctatat 3480

gacactcttc tctagagtaa atatttgata tctcaatgaa tgcagattat caagagccat 3540

ttatatcatt tattcaaaca ccaaataaaa taatgaacaa gtaaagtata tattaacctc 3600

aaaatctcat gacaatggaa atggtttatt ataacaacca tatgtgtccc attccacgag 3660

caacctccct caagagagaa acttccagat ctcttcctta caaacctttg aggatgggag 3720

ttccttcttg gttttggcga taccaatttg aataaagtga tatggctcgt accttgttga 3780

ttgaacccaa tctggaatgc tgctaaatcc tgagctcaag ctaattcttt tgtggtcgtc 3840

actgcgttcg tcatacgcat tagtgagtgg gctgtcagga cagctctttt ccacgttatt 3900

ttgttcccca cttgtactag aggaatctgc tttatctttg caataaaggc aaagatgctt 3960

ttggtaggtg cgcctaacaa ttctgcacca ttcctttttt gtctggtccc cacaagccag 4020

ctgctcgatg ttgacaagat tactttcaaa gatgcccact aactttaagt cttcggtgga 4080

tgtctttttc tgaaacttac tgaccatgat gcatgtgctg gaacagtagt ttactttgat 4140

tgaagattct tcattgatct cctgtagctt ttggctaatg gtttggagac tctgtaccct 4200

gaccttgttg aggctttgga ctgagaatta agctgctaga ttgtcgtttc ccgccttcag 4260

tttaaacta 4269

<210> 10

<211> 5503

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aaagaatagg tattgggcta tacttaatga attaatatta aatataagat ttaaaaaaac 60

ccaaattaaa agaaatgtat tgttttcaat taataaaact aaaattaatt gagcatatag 120

aatacaaaaa aaaatcatat ataaattgat tatttttgct acatcataaa atataacatt 180

gttagtatat tggagtaatt cataaaacgt ttgacaagta ccaaatcgaa caaaaaaaga 240

gcaggtacca aattaggaaa aagagtcgaa ttgaagcact agattggacc cccaaaaagt 300

ttaagtatca acttaagaaa aagttgtcaa gtttaaatac cgaatattat attaaaccta 360

ttattttatt aaatttaaaa tatttattaa ttacattcat atatatatat atcactttaa 420

ttgattaatt agtgtatttg atctataaaa tagtaaatgc ttataattaa atatctattt 480

aacacgaatt tgtataatct atttttagtc ttgagttgaa ttccagctat atatatttat 540

ttataaattg gatgggtggt tttgtgtgaa ttttgttttg gaagccgata gatactagag 600

agtagttttc atttaatttt ggatattcgt taggtgtaaa ttaatgaagt gaagcaatgc 660

aaatattgta gatggcttca tgtccgggaa atctacatgg atcagcaatg agtatgatgg 720

tcaatatgga gaaaaagaaa gagtaattac caattttttt tcaattcaaa aatgtagatg 780

tccgcagcgt tattataaaa tgaaagtaca ttttgataaa acgacaaatt acgatccgtc 840

gtatttatag gcgaaagcaa taaacaaatt attctaattc ggaaatcttt atttcgacgt 900

gtctacattc acgtccaaat gggggcttag atgaggcgcg ccggtaccgt cgacattgat 960

gcatgttgtc aatcaattgg caagtcataa aatgcattaa aaaatatttt catactcaac 1020

tacaaatcca tgagtataac tataattata aagcaatgat tagaatctga caaggattct 1080

ggaaaattac ataaaggaaa gttcataaat gtctaaaaca caagaggaca tacttgtatt 1140

cagtaacatt tgcagctttt ctaggtctga aaatatattt gttgcctagt gaataagcat 1200

aatggtacaa ctacaagtgt tttactcctc atattaactt cggtcattag aggccacgat 1260

ttgacacatt tttactcaaa acaaaatgtt tgcatatctc ttataatttc aaattcaaca 1320

cacaacaaat aagagaaaaa acaaataata ttaatttgag aatgaacaaa aggaccatat 1380

cattcattaa ctcttctcca tccatttcca tttcacagtt cgatagcgaa aaccgaataa 1440

aaaacacagt aaattacaag cacaacaaat ggtacaagaa aaacagtttt cccaatgcca 1500

taatactcaa actcagtagg attctggtgt gtgcgcaatg aaactgatgc attgaacttg 1560

acgaacgttg tcgaaaccga tgatacgaac gaaagctgaa ttctcaggca gccttcgtat 1620

cggagagttc gatcttcgcg cccagcccgg ccatcaggtc catgaactcc gggaagctcg 1680

tggcgatcat cgtggcatcg tccaccgtga cagggttttc cgacacgagg cccatgacga 1740

ggaagctcat ggcgatgcgg tgatcgagat gggtggcgac ggcggcgccc gaggcgttgc 1800

cgagcccctt gccgtcaggg cggccacgca cgacgagcga cgtctcgccc tcatcgcaat 1860

ccacgccatt gagcttgagg ccattggcga cggccgagag gcggtcgctt tccttgacgc 1920

ggagttcttc cagaccgttc atcacggtcg ccccttccgc gaaggcggcg gcgacagcga 1980

gaatcggata ttcgtcgatc atcgaaggcg cgcggtcttc cggcaccgtg acgcccttca 2040

gcgtggagga gcgaacgcgc aggtccgcca cgtcttcgcc gccggcaagg cgcgggttga 2100

tgacttcgat gtcggcgccc atttcctgca gcgtcaggat gaggccggtg cgggtggggt 2160

tcatcagcac gttgaggatg gtgacgtcgg agcccggaac aagcagggcc gcaaccagcg 2220

ggaaggccgt cgaggacggg tcgcccggca cgtcgatgac ttggccggtg agcttgccgc 2280

ggccttccag gcggatggtg cgcacgccgt ccgcatccgt ctcgacggta aggttggcgc 2340

caaagccctg cagcatcttt tccgtatgat cgcgcgtcat gatcggctcg atgaccgtcg 2400

tgatgccggg cgtgttgagg ccggcgagca gcacggcgga cttcacctgt gcggaggcca 2460

tcggcacgcg gtaggtgatc ggcgtcggcg tcttcggccc gcgcaaggta acgggaagac 2520

ggtcaccgtc ttccgatttc acctgcacgc ccatttcgcg cagcgggttc aacacgcggc 2580

ccatcgggcg ctttgtgagc gaggcgtcgc cgatgaaggt gctgtcgaaa tcgtagaccc 2640

cgacgaggcc catcgtcagg cggcagcccg tggcggcatt gccgaaatcg agcggcgcct 2700

caggcgccag gaggccgcca ttgccgacgc catcgatgat ccaggtgtcg ccttccttac 2760

ggatgcgggc gcccatcgcc tgcatggcct tgcccgtatt gatgacgtcc tcgccttcca 2820

gaaggccggt gatgcgcgtt tcaccgctcg cgagaccgcc gaacatgaag gaccggtggg 2880

agatcgactt gtcgccggga atgcggacgg ttccggaaag gccagaggat ttgcgggcgg 2940

ttgcgggccg gctgcttgca ccgtgaagca tgcacgccgt ggaaacagaa gacatgacct 3000

taagaggacg aagctcagag ccaattaacg tcatcccact cttcttcaat ccccacgacg 3060

acgaaatcgg ataagctcgt ggatgctgct gcgtcttcag agaaaccgat aagggagatt 3120

tgcgttgact ggatttcgag agattggaga taagagatgg gttctgcaca ccattgcaga 3180

ttctgctaac ttgcgccatg gtagttctct ggtcaacaaa tctgcaaaaa aaagaacaat 3240

caaatattga atcaataaaa acagtagaca tatataacca ttatgaaaat catctttaac 3300

acaaaacaat catagtaaaa agccgctatc ggagtcaaac cgatttctac cacaaaaatt 3360

gtggtgctct atcatctgag ctaagcgagc taaattcaat caaatcggca atttcaagag 3420

atataaagca aacaatccga gaattaccct tagaaaaagg gaacactgga tttgttatgc 3480

tactccagaa ttacccaatc acaattcaaa tcgacataca tcttaaatac gcaaatcaac 3540

aagttcactc gtatatagat ccaccaacca acaatcaatc gaacaaatta aaatctcaaa 3600

acaagatcga tcagaatggg aaaatagttt catgaataaa ttatcgttta gaagcagtga 3660

aacgttgata ttaacaatcg ataaaatcta aacaacagat cagaattttc agaacgatca 3720

atcaacaaag agcatcgaat ccaacaatca tcgaaataat atgagcaacg atcagcagac 3780

gaaaaagaaa aagaacgatc taagggtacg ttaacgctta cctcagagat atcgcagaaa 3840

agtgtgtagc ggctagggtc aataagaacg ataaatggaa tcagcaacga gagtggtttt 3900

atttatagcg ttgaatccga aaccaatgtt agggtttaac ataaaataat atcattcttt 3960

aaattaccat tatgcccctg tttagccgtg aatactcaat acctcttggg ttggttgtgt 4020

tttatgaatg tttagtacta catgttacaa acatcattta atcacacctt ttaattaagg 4080

ttattcaagc aaatggttat acatgttcgt ctcccaaaaa tttcattgat tgtggaccat 4140

caatctatat gacactcttc tctagagtaa atatttgata tctcaatgaa tgcagattat 4200

caagagccat ttatatcatt tattcaaaca ccaaataaaa taatgaacaa gtaaagtata 4260

tattaacctc aaaatctcat gacaatggaa atggtttatt ataacaacca tatgtgtccc 4320

attccacgag caacctccct caagagagaa acttccagat ctcttcctta caaacctttg 4380

aggatgggag ttccttcttg gttttggcga taccaatttg aataaagtga tatggctcgt 4440

accttgttga ttgaacccaa tctggaatgc tgctaaatcc tgagctcaag ctaattcttt 4500

tgtggtcgtc actgcgttcg tcatacgcat tagtgagtgg gctgtcagga cagctctttt 4560

ccacgttatt ttgttcccca cttgtactag aggaatctgc tttatctttg caataaaggc 4620

aaagatgctt ttggtaggtg cgcctaacaa ttctgcacca ttcctttttt gtctggtccc 4680

cacaagccag ctgctcgatg ttgacaagat tactttcaaa gatgcccact aactttaagt 4740

cttcggtgga tgtctttttc tgaaacttac tgaccatgat gcatgtgctg gaacagtagt 4800

ttactttgat tgaagattct tcattgatct cctgtagctt ttggctaatg gtttggagac 4860

tctgtaccct gaccttgttg aggctttgga ctgagaatta agctgctaga ttgtcgtttc 4920

ccgccttcag tttaaactaa gcaggcgttc cttattaact tatcctttct tttttctcat 4980

attaaccacc atgaccaaaa atgttcatgc tcattttctt tcattttact ttttatattt 5040

cctatcaacc accctcaatt tttctttact ttttattagt caaaatttaa attaaaaatt 5100

ttcaacaaaa atgaatatag aaaaaagaaa aaagaaccta aaatccctaa aaagtaaaac 5160

tcgtccattc ctctcgtgga atccatagtc atttttgacc gtcctaaatc cgaaagtctt 5220

aaattaagtt agaggtttat gatgtacaaa tagatgtgta aaattttaaa tttatgaaat 5280

gaaaacaagc acctagtagg tttttaaaga aaaatgtcaa aactcacttt agagagcatt 5340

aagatttaaa ttaaatattg agaatttttt atatataaaa aaaactagaa taagactttt 5400

aaaaccaaag tttttaatta acggaaattg ttaacctcac attaattttt tttatttact 5460

caattttaaa tattataaag acgaaatgaa ttgctgcatg cat 5503

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccagaatcct tgtcagatt 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aaagaatagg tattgggc 18

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ataaaggcaa agatgctttt ggtaggtg 28

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

atgcatgcag caattcattt 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ggcagccttc gtatcggag 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ctcgtgtcgg aaaaccctgt 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

caggtccatg aactccggga agctc 25

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 18

aactctccga tacgaaggct gcctga 26

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 19

acgatggact ccagtcggtg gacgatgcca cgatgatcg 39

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 20

gatcaccgca tcgccatgag ctt 23

Claims (9)

1.一种抗草甘膦棉花转化事件KJC017，其特征在于，特征基因序列包含转基因表达盒，所述转基因表达盒的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。

2.如权利要求1所述的抗草甘膦棉花转化事件KJC017，其特征在于，所述特征基因序列还包含5'端连接序列，所述5'连接序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQID NO:7中的任一个。

3.如权利要求2所述的抗草甘膦棉花转化事件KJC017，其特征在于，所述特征基因序列还包含3'端连接序列，所述3'端连接序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的任一个。

4.如权利要求3中所述的抗草甘膦棉花转化事件KJC017，其特征在于，所述特征基因序列为核苷酸序列为SEQ ID NO:10的基因序列或其互补序列。

5.如权利要求4所述的抗草甘膦棉花转化事件KJC017，其特征在于，所述特征序列位于四倍体棉花的D基因组第5组染色体上。

6.用于检测权利要求1-5中任一项所述的抗草甘膦棉花转化事件KJC017的引物对，其特征在于，所述引物对包含特异性识别侧翼序列的第一引物对和/或第二引物对，所述第一引物对由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成；所述第二引物对由SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14组成。

7.权利要求1-5中任一项所述的抗草甘膦棉花转化事件KJC017用于提高棉花抗草甘膦性状、进行棉花育种或用作分子标记的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，包括具备抗草甘膦转化事件KJC017的棉花植株、棉花植物细胞、种子、子代植株、杂交植株、棉油、棉花蛋白质。

9.一种鉴定棉花生物样品中棉花抗草甘膦转化事件KJC017的方法，其包括:(a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；(b)以提取的DNA样品为模板,使用权利要求6所述的引物对进行PCR扩增；(c)检测PCR扩增产物的长度与抗草甘膦转化事件KJC017中的理论核苷酸序列长度比较。

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