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CN111139198B - 一株帕氏乳杆菌gbw-hb1903及其应用 - Google Patents

一株帕氏乳杆菌gbw-hb1903及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株帕氏乳杆菌GBW‑HB1903及其应用。所述的帕氏乳杆菌GBW‑HB1903的分类命名为帕氏乳杆菌Lactobacillus parafarraginis，保藏编号为CGMCC No.18391，该菌菌落为圆形，乳白色，直径1‑2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。帕氏乳杆菌GBW‑HB1903是兼性厌氧菌，在溶氧量小于0.5mg/L或大于1.0mg/L的条件下均能生长，且该菌在好氧或者缺氧条件下均具有高效降解废水中硝态氮能的能力，可应用于废水中去除总氮，促进和提高污水处理系统中总氮的去除效率，具有广阔的应用前景。

Description

一株帕氏乳杆菌GBW-HB1903及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株帕氏乳杆菌GBW-HB1903及其应用。
背景技术
随着社会经济与生活水平的不断提高，生活与工业污废水的产出量在不断增加，因此各地区的污水处理量也在持续不断地增长，从而给污水处理单位带来了巨大压力。污水的大量排放也会严重影响和破坏生态环境健康，造成大量河湖水体及近海水体的富营养化，导致藻类大量爆发，损害水体中动植物的健康与生态平衡。而污水中导致水体恶化的成分除了大量存在的COD外，氮元素也是元凶之一。污水处理系统中的含氮有机物首先会经过异养菌的氨化作用转变为氨氮，然后再经过好氧池中硝化细菌的硝化作用将氨氮转化为亚硝酸盐与硝酸盐态氮，最终使得水体中的氮主要以硝态氮的形式存在，所以在污水治理工作中会出现氨氮值达标，但总氮却很高的现象。许多发达国家在意识到这个问题后，已经开始对污水处理排放要求中的总氮指标进行了严格的规定，而我国仍有许多行业的废水排放标准中只规定了氨氮排放限值，并没有规定总氮的排放限值。
但目前随着我国环保政策的不断完善与监管部门执法力度的不断加大，我国也于2018年开始对废水排放中的总氮指标进行严格监管。因此，要想使得废水中总氮排放指标达标，当务之急解决的便是如何在短时间内提高水体中硝态氮的去除效率。而污废水的生化处理工艺已经成为大多数污水处理系统的重要组成部分，其运营简便、投入低、效果显著。但存在于系统中可显著高效利用硝态氮的微生物并不多，在短时间内想要快速去除废水中的总氮，并使其达标就比较困难，而通过在废水系统中添加使用可高效降解硝态氮的微生物菌剂成为解决这一难题的重要方法与措施。
因此，寻找可以高效降解硝态氮的菌株，不仅可以促进和提升废水中总氮的去除效率，使出水总氮达标排放，还将会进一步提升和保障污水系统抗冲击能力与运行的稳定性，具有重大意义。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的不足与缺陷，本发明提供了一株帕氏乳杆菌GBW-HB1903及其应用，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903具有高效去除废水中硝态氮的能力，且使用环保，生长迅速。
为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一株帕氏乳杆菌GBW-HB1903，其特征在于，其分类命名为帕氏乳杆菌Lactobacillus parafarraginis，保藏编号为CGMCC No.18391。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的菌落为圆形，乳白色，直径1-2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903为兼性厌氧菌，生长溶解氧浓度为0.2～3mg/L。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903最适生长溶解氧浓度为2-3mg/L。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的适宜生长温度为10～45℃，最适生长温度为25-35℃。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的适宜生长pH为6～9，最适pH值为6.5-7.5。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的适宜生长培养基中包括糖蜜和玉米浆干粉。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903培养在4h后进入对数生长期，16-18h时达到对数生长末期，菌数达到5.0×109cfu/mL。
本发明还提供了所述的帕氏乳杆菌GBW-HB1903在制备用于降解污水中硝态氮的微生物菌剂中的应用。
进一步的，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903经发酵培养获得帕氏乳杆菌发酵菌液，所述发酵条件为罐压0.1～0.2MPa，温度28～32℃，溶氧≥30％，搅拌速度150～180rpm，发酵时间为20～22h。
进一步的，所述帕氏乳杆菌发酵菌液的添加量为污水处理池体积的0.1-0.5‰。
进一步的，在好氧环境下，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的硝态氮去除率高于85％；在缺氧环境下，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的硝态氮去除率高于80％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
本发明的帕氏乳杆菌GBW-HB1903属于兼性厌氧菌，能够在溶氧量小于0.5mg/L或大于1.0mg/L的条件下均能生长，其最适生长溶解氧浓度为2-3mg/L，因此该菌在好氧或者缺氧条件下均能良好生长，并具有高效降解污水中硝态氮的能力，并且对好氧与缺氧环境污水中硝态氮的降解率分别可以达到85％与80％以上。本发明的帕氏乳杆菌GBW-HB1903不仅可应用于污水处理系统的好氧段来高效去除总氮，还可以同时用在污水处理系统的缺氧段来促进和提高总氮去除效率，进而提升系统总氮处理能力与抗冲击能力，保障污水处理系统的稳定运行，因此该菌具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903在MRS平板上的菌落形态特征。
图2为所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的生长曲线。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例中所需培养基的配方如下：
1、硝态氮降解菌富集筛选液体培养基：葡萄糖5g，NaNO3 1g，Na2CO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.4g，NaCl 5g，pH 6.0-7.0，蒸馏水1L。
2、硝态氮降解菌分离纯化固体培养基：葡萄糖5g，NaNO3 1g，Na2CO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.4g，NaCl 5g，琼脂粉15g，pH 6.0～7.0，蒸馏水1L。
3、改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(NH4)2SO4 2g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、水1L、pH 7.2～7.5。
4、改良营养肉汤(NB)固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(NH4)2SO4 2g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、琼脂粉15g、水1L、pH 7.2～7.5。
5、MRS固体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂15.0g/L，吐温801.0g/L，pH值6.2±0.2(25℃)。
6、发酵培养基：葡萄糖100g/L、玉米浆干粉20g/L、NaCl 5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、KH2PO4 0.15g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、Na2HPO4 4g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、余量为水，液体培养基的pH为6.5～7.5。
以上培养基在使用前，均需在121℃下灭菌20min，然后室温保存。
实施例1：帕氏乳杆菌GBW-HB1903的筛选、分离与鉴定
1、帕氏乳杆菌GBW-HB1903的菌种的筛选与纯化
取市政生活污水、工业污水及垃圾渗滤液水样各2mL，加入50mL的PBS缓冲溶液中，振荡5min，使样品充分混匀，1000rpm离心5min，收集样品上清液，备用。取10mL上述样品上清液，分别加入到装有200mL硝态氮降解菌富集筛选培养液的锥形瓶中，30℃，150rpm恒温摇床培养2d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μL涂布于硝态氮降解菌分离纯化固体培养基上，置于30℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在MRS固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到的单菌落，将该单菌落命名为GBW-HB1903。
如图1所示，所述菌株GBW-HB1903在MRS平板上的菌落为圆形，乳白色，直径1-2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。
2、帕氏乳杆菌GBW-HB1903的鉴定
以所述的菌株GBW-HB1903的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-HB1903的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-HB1903与Lactobacillus parafarraginis同源性最高，因此确定该菌株GBW-HB1903为帕氏乳杆菌。
将筛选到的菌株GBW-HB1903进行菌种保藏，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年08月16日；帕氏乳杆菌Lactobacillus parafarraginis的保藏编号为CGMCC No.18391。
实施例2：帕氏乳杆菌GBW-HB1903的生长特性及生理生化特征
1、帕氏乳杆菌GBW-HB1903的生长测定
将斜面培养的嗜冷芽孢杆菌GBW-HB1903接种至改良NB培养基中，在pH 6.5-7.5，25-35℃下恒温摇床培养24h，制得GBW-HB1903菌液，其中每2h取样一次，在OD600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，实验结果表明，GBW-HB1903在培养的前4h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至16-18h时达到对数生长末期，菌数达到5.0×109cfu/mL，18-22h为生长稳定期，接着进入衰亡期，从而完成整个生长周期。
2、帕氏乳杆菌GBW-HB1903的生理生化特征
将制得的GBW-HB1903菌液在NB培养基中进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》的菌株生理生化检测方法对嗜冷芽孢杆菌GBW-HB1903进行检测。结果如表1所示，帕氏乳杆菌GBW-HB1903在10～45℃温度范围内均能正常生长繁殖，而其最适生长温度为25～35℃；在pH值6～9的范围内均能生长，最适生长pH值为6.5～7.5；并且该菌能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，能够降解或分解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐和半固体琼脂。另外，适合培养帕氏乳杆菌GBW-HB1903的培养基为糖蜜100g/L、玉米浆干粉20g/L、NaCl 5g/L、NaNO32g/L、KH2PO4 0.15g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、Na2HPO4 4g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、余量为水，液体培养基的pH为6.5～7.5。
表1帕氏乳杆菌GBW-HB1903的生理生化特征
Figure BDA0002337291240000051
注：<+>表示阳性，<->表示阴性。
实施例3：不同氧气含量条件下菌株GBW-HB1903的生长对比试验
为了检验帕氏乳杆菌GBW-HB1903在不同氧含量条件下的存活性能，对其在不同氧气含量下的生长情况进行检测。将帕氏乳杆菌GBW-HB1903等量接种至不同氧气含量条件下的NB液体培养基中，控制其pH为6.5-7.5，培养20h后得到帕氏乳杆菌GBW-HB1903菌液，观察其在不同氧气含量条件下培养基中的生长状况。结果如表2所示，帕氏乳杆菌GBW-HB1903在溶氧含量小于0.5mg/L或大于1.0mg/L范围内都能正常生长，最适宜的溶氧量为2-3mg/L，且菌株GBW-HB1903属于兼性厌氧菌。
表2帕氏乳杆菌GBW-HB1903在不同氧含量中生长情况
Figure BDA0002337291240000061
实施例4：总氮(硝态氮)去除率测试
采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法GB11894-89检测水体总氮浓度。模拟缺氧(温度30℃、pH7.0、溶解氧≤0.5mg/L)与好氧(温度30℃、pH7.0、溶解氧≥2mg/L)的条件，帕氏乳杆菌GBW-HB1903对含有不同初始浓度的硝态氮水体的48h处理实验，并计算硝态氮去除率，每浓度梯度设3个重复实验。
将帕氏乳杆菌GBW-HB1903种子液按10％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1MPa，温度28～32℃，溶氧≥30％，搅拌速度为150rpm，发酵20h，得到帕氏乳杆菌GBW-HB1903发酵菌液。取120mL发酵菌液离心，随后加入30mL无菌水将沉淀了的菌体重悬混匀，然后各取2mL菌悬液分别加入到体系均为200mL的5个不同初始硝态氮浓度的测试液中，随后控制其分别在好氧与缺氧条件下进行48h的硝态氮去除率试验。
由表3与表4中结果显示，经过48h处理后帕氏乳杆菌GBW-HB1903同时在好氧与缺氧条件下对多种不同初始浓度的硝态氮都具备较好的去除效果，去除率分别在85％与80％以上，表明离纯化出的菌株GBW-HB1903同时具有在好氧或缺氧条件下高效降解硝态氮的特性，该菌株不仅可应用在污水处理系统的好氧段用于高效去除总氮，还可以同时用在污水处理系统的缺氧段用于促进和提高总氮去除效率，提升系统总氮处理能力，鉴于该菌株所具备特殊性质，故将其作为生物强化菌剂产品用于废水中总氮的去除方面具备重大应用价值与意义。
表3帕氏乳杆菌GBW-HB1903的48h好氧条件下硝态氮去除率
Figure BDA0002337291240000062
本发明所述的帕氏乳杆菌GBW-HB1903在实际应用中使用简单，其步骤如下：将帕氏乳杆菌GBW-HB1903在罐压为0.1MPa，温度28～32℃，溶氧≥30％，搅拌速度为150rpm的条件下，发酵20h后得到发酵菌液，然后直接从厌氧或缺氧池进水口加入污水生化处理厌氧或缺氧池体积的0.1-0.5‰的发酵菌液即可。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一株帕氏乳杆菌GBW-HB1903，其特征在于，其分类命名为帕氏乳杆菌Lactobacillus parafarraginis，保藏编号为CGMCC No.18391。
2.权利要求1所述的帕氏乳杆菌GBW-HB1903在制备用于降解污水中硝态氮的微生物菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903经发酵培养获得帕氏乳杆菌发酵菌液；所述发酵温度是28~32℃，发酵时间为20~22h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述帕氏乳杆菌发酵菌液的添加量为污水处理池体积的0.1-0.5‰。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在好氧环境下，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的硝态氮去除率高于85%；在缺氧环境下，所述帕氏乳杆菌GBW-HB1903的硝态氮去除率高于80%。
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