CN110982886A

CN110982886A - 一种人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110982886A
Application number: CN201911395744.7A
Authority: CN
Inventors: 赵平锋
Original assignee: Wuhan Optical Valley United Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Wuhan Optical Valley United Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明公开了一种人类K‑ras基因突变检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，所述引物探针混合液包括正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，并且对引物探针浓度比进行了优化。本发明结合锁核酸技术和荧光定量PCR技术用于检测K‑ras基因突变，简便易行，特异性高，灵敏度高达0.1％，为肿瘤筛查后预后判断提供了有效手段。

Description

一种人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用。

背景技术

恶性肿瘤的形成、进展和转移与癌基因、抑癌基因不可逆的积累突变和失调有关。其中，Ras基因是从大鼠肉瘤病毒中发现的一种原癌基因，也是第一个从人类肿瘤细胞中被分离鉴定的癌基因。其编码一种21kD的免疫相关蛋白，称为p21s蛋白或RAS蛋白。RAS蛋白是GDP/GTP结合蛋白，其充当细胞内信号转导物。RAS蛋白在野生型细胞中的主要作用为调控增殖、分化和衰老。研究发现，在许多种类的癌症的发生发展过程中均有Ras基因的参与，Ras原癌基因经激活成为癌基因，常见的激活方式有点突变、表达量升高、插入突变和转位突变等。

Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因包括K-ras、N-ras和H-ras 3种。多种肿瘤中均可发生Ras基因突变，K-ras突变主要发生在结直肠癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌和子宫内膜癌中，N-ras突变常见于黑色素瘤和血液系统恶性肿瘤，H-ras突变多发于肝癌、甲状腺癌和膀胱癌，其中K-ras基因突变涉及范围最广且最为常见。17％-25％的肿瘤具有激活的K-ras基因突变，激活关键区域主要为密码子12、13、59、61和63，其中，K-ras基因突变位点几乎都集中在12、13密码子，常见的热点突变有7种，分别为第12密码子的六种突变类型(GGT>GAT，GGT>GCT，GGT>GTT，GGT>AGT，GGT>CGT，GGT>TGT)和第13密码子的一种突变类型(GGC>GAC)。K-ras基因突变情况在不同类型的肿瘤中不尽相同，其不同的突变位点在一定程度上影响患者的预后。因此，对K-ras基因在不同种肿瘤中的突变检测分析，能够为选择靶向药物、术后治疗方案的选择以及制定个体化治疗策略提供理论依据。

目前，针对K-ras基因突变检测的主要方法为传统的sanger测序法，检测耗时，操作过程复杂，容易导致污染，且灵敏度低，尤其在混合模板时检出率低，同时，检测费用比较高。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种特异性强、灵敏度高、操作简单快捷的人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于检测人类K-ras基因突变的引物探针组合物，包括正向引物、反向引物和荧光探针。

所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，5’-CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATT-3’；

所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，5’-CAAGATTTACCTCTATTGTTGGA-3’；

所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.3所示，5’-CTGCTGAAAATGACTGAA-3’，其5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物探针组合物还包括锁核酸探针，所述锁核酸探针的序列如SEQ ID NO.4所示，5’-CTACGCCACCAGCT-3’，其3’端连接有PO4基团。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述锁核酸探针序列的第3、6、7、9、10、11个碱基进行LAN修饰。

第二方面，本发明提供了一种人类K-ras基因突变检测试剂盒，包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述引物探针组合物。

在以上技术方案的基础上，优选的，人类K-ras基因突变检测试剂盒应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针混合液中正反向引物、荧光探针和锁核酸探针的浓度比为2:(1-2):(3-4)。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述阳性质控品为含K-ras基因突变片段的质粒DNA。

第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述人类K-ras基因突变检测试剂盒在检测K-ras基因突变比例中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种人类K-ras基因突变的检测方法，是采用本发明第二方面所述人类K-ras基因突变检测试剂盒，以待测样本核酸为模板，进行荧光定量PCR检测。

本发明的人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明设计和合成PCR扩增K-ras基因片段的引物，利用锁核酸的特性，围绕K-ras的第12,13密码子设计合成锁核酸标记的探针，将锁核酸作为探针与DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使DNA的熔解温度大幅下降，在PCR扩增过程中，锁核酸能够与野生型序列结合，从而阻滞PCR延伸，导致野生型基因PCR扩增失败，而锁核酸不能与突变型序列结合，使得K-ras基因突变型得以扩增富集，从而提高了K-ras基因突变的检出率；

(2)本发明试剂盒中提供的特异性引物探针组合物能够高灵敏地检测K-ras基因是否发生突变，将锁核酸探针技术与实时荧光PCR技术结合，可以一次反应把野生型和突变型完全分开，同时，由于直接闭管操作，减少了配胶、电泳以及测序等过程，大大降低了污染几率，降低假阳性率，整个过程简单易行，检测的灵敏度可达0.1％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中K-ras基因12和13号密码子野生型模板和突变型模板的扩增曲线图。

图2为实施例2中K-ras基因12和13号密码子野生型模板和突变型模板的扩增产物凝胶电泳图，其中1-7号泳道为突变型模板的扩增产物，8号为野生型模板扩增产物，9号为TE缓冲液为模板的扩增产物，M代表DNA marker。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。实施例中所用的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1、人类K-ras基因突变检测试剂盒

S1、引物及探针的设计与合成

用于K-ras基因突变检测的引物探针序列如下：

正向引物：5’-CTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATT-3’；

反向引物：5’-CAAGATTTACCTCTATTGTTGGA-3’；

荧光探针：5’-FAM-CTGCTGAAAATGACTGAA-BHQ1-3’；

锁核酸探针：5’-CTACGCCACCAGCT-PO4-3’，其中序列的第3、6、7、9、10、11个碱基进行LAN标记。

S2、其他试剂组成

(1)2×PCR反应液中包含：Tris-HCl缓冲液(pH8.3)20mmol/L，MgCl₂ 4mmol/L，KCl100mmol/L，dNTPs 2mmol/L，Taq DNA聚合酶0.08U/μL；

(2)阳性质控品为含K-ras基因突变片段的人工质粒；

(3)阴性质控品为不含核酸的TE缓冲液和含K-ras野生型基因的人工质粒。

实施例2、用荧光定量PCR检测K-ras基因12和13号密码子的突变

S1、人工质粒合成和抽提

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成含有K-ras基因12、13号密码子及其上下游各200bp同源序列的质粒，同时分别在质粒中引入12号密码子的6种突变(GGT>GAT，GGT>GCT，GGT>GTT，GGT>AGT，GGT>CGT，GGT>TGT)和13号密码子的1种突变(GGC>GAC)，最终得到野生型质粒和7种突变型质粒。用质粒抽提试剂盒(上海生工)按照其操作说明书纯化K-ras野生型和7种突变型人工质粒。纯化后的8种质粒用NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，并用去离子水稀释至1000拷贝/μL。同时按1:1000的比例混合突变型质粒和野生型质粒，最终得到的混合质粒中突变型质粒含量为是0.1％。

S2、荧光定量PCR

分别以7种突变型质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，配制PCR反应体系：2×PCR反应液12.5μL，引物探针混合液2μL，DNA模板2μL，补ddH₂O至25μL。该扩增反应体系中，正反向引物浓度分别为0.2μmol/L，荧光探针浓度为0.2μmol/L，锁核酸探针浓度为0.3μmol/L。用不含核酸的TE缓冲液和纯的野生型模板作为对照。

在PCR仪上按照表1所示设置PCR反应条件，并完成荧光定量PCR反应。

表1荧光定量PCR反应条件

观察PCR反应结果，如图1所示，以突变型质粒为模板的扩增曲线均呈S型且Ct值在20-30之间，可见能有效扩增出产物；而以不含核酸的TE缓冲液和纯的野生型模板的对照组扩增曲线均是平直的且Ct值大于36，说明均不能有效扩增。并且，用凝胶电泳的方法检测PCR产物，如图2所示，发现用不含核酸的TE缓冲液和纯的野生型质粒为模板的扩增产物极少，胶上不可见，而用突变型质粒为模板扩增出产物量很多，且大小符合。说明采用本发明试剂盒可以检测混合液中低至0.1％的突变。

S3、引物探针比例优化

分别选取含K-ras基因13密码子突变型的重组质粒和野生型质粒作为模板，按照S2所述同样方法进行多次扩增：当PCR反应体系中正反向引物、荧光探针、锁核酸探针浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L时，突变型质粒扩增结果Ct值为25.73-28.25，野生型质粒扩增结果Ct值均大于36；当PCR反应体系中正反向引物、荧光探针、锁核酸探针浓度分别为0.2μmol/L、0.1μmol/L、0.4μmol/L时，突变型质粒扩增结果Ct值为23.18-25.86，野生型质粒扩增结果Ct值均大于36；当PCR反应体系中正反向引物、荧光探针、锁核酸探针浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L时，突变型质粒扩增结果Ct值为26.69-29.55，野生型质粒扩增结果Ct值均大于36。

实施例3、对石蜡组织样本进行K-ras基因突变检测

S1、组织样本基因组DNA的提取纯化

选取200名非小细胞肺癌患者作为受试者，10％中性福尔马林固定石蜡包埋非小细胞肺肿瘤组织切片，用TIANGEN公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒对样本石蜡包埋组织切片提取基因组DNA，操作步骤详见该试剂盒说明书。提取后的基因组DNA用NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，并用去离子水稀释至浓度为20ng/μL。

S2、荧光定量PCR

按照实施例2步骤S2所述操作方法对提取纯化的组织样本基因组DNA进行检测，以实施例2制备的7种突变型人工质粒中任一作为阳性质控品，以不含核酸的TE缓冲液作为阴性质控品；同时用DNA直接测序法对其进行检测。检测结果如表2所示。

表2不同方法对组织样本的检测结果

检测方法	K-ras突变	K-ras野生型	阳性检出率
				本发明检测方法	122	78	61％
DNA测序	107	93	53.5％

如表2可见，采用本发明试剂盒对组织样本阳性检出率为61％，明显高于DNA直接测序，因为实际组织样本中混有野生型DNA，突变型浓度相对较低，会干扰DNA直接测序结果，而采用本发明试剂盒检测，野生型DNA的扩增被抑制，突变型扩增得到富集，提高了检测的灵敏度和特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉光谷联合医学检验所股份有限公司

<120> 一种人类K-ras基因突变检测试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

ctggtggagt atttgatagt gtatt 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

caagatttac ctctattgtt gga 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

ctgctgaaaa tgactgaa 18

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

ctacgccacc agct 14

Claims

1.一种用于检测人类K-ras基因突变的引物探针组合物，其特征在于：包括正向引物、反向引物和荧光探针，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：还包括锁核酸探针，所述锁核酸探针的序列如SEQ ID NO.4所示，其3’端连接有PO4基团。

3.如权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于：所述锁核酸探针序列的第3、6、7、9、10、11个碱基进行LAN修饰。

4.一种人类K-ras基因突变检测试剂盒，包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于：所述引物探针混合液包括权利要求2所述的引物探针组合物。

5.如权利要求4所述的人类K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于：应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针混合液中正反向引物、荧光探针和锁核酸探针的浓度比为2:(1-2):(3-4)。

6.如权利要求4所述的人类K-ras基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为含K-ras基因突变片段的质粒DNA。

7.权利要求4所述的人类K-ras基因突变检测试剂盒在检测K-ras基因突变比例中的应用。

8.一种人类K-ras基因突变的检测方法，其特征在于：采用权利要求4所述的人类K-ras基因突变检测试剂盒，以待测样本核酸为模板，进行荧光定量PCR检测。