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CN110987886B - 一种全自动显微影像荧光扫描系统 - Google Patents

一种全自动显微影像荧光扫描系统 Download PDF

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CN110987886B CN201911191764.2A CN201911191764A CN110987886B CN 110987886 B CN110987886 B CN 110987886B CN 201911191764 A CN201911191764 A CN 201911191764A CN 110987886 B CN110987886 B CN 110987886B
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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Abstract

本发明涉及荧光扫描技术领域，具体地说，涉及一种全自动显微影像荧光扫描系统。其包括Z轴自动聚焦定位载玻片上细胞图像，通过对每张图片清晰度计算完成自动聚焦。该发明的设计能够根据计算结果运行到清晰位置，实现自动聚焦，采用等比缩小图像，提升算法处理效率，并对图像进行灰度化、二值化处理，提取图像边缘和细胞区域，以便于计算清晰度。同时，本发明公开了细胞内荧光原位杂交探针染色点的自动聚焦与自动识别方法，以及符合阳性细胞判读标准的自动判读方法。通过对符合细胞形态、尺寸、以及探针染色点数的细胞进行自动识别判断实现细胞的自动计数功能。

Description

一种全自动显微影像荧光扫描系统
技术领域
本发明涉及荧光扫描技术领域，具体地说，涉及一种全自动显微影像荧光扫描系统。
背景技术
随着社会的进步，光电子技术的发展，尤其是激光技术的发展，越来越多的现代显微技术迅速发展起来。利用光扫描技术对样品进行无创动态测量的荧光扫描系统，目前已经发展成为生物学和医学研究诊断的重要工具。显微影像荧光扫描以光学系统的共焦成像为基础，因此聚焦的效果直接影响到扫描最终的效果。我们专利核心在于FISH探针点自动识别与计数，包括细胞自动聚焦，细胞内染色探针点的自动识别，阳性细胞自动判读。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全自动显微影像荧光扫描系统，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种全自动显微影像荧光扫描系统，其方法包括如下步骤：
S1：设定好扫描区域，输入X轴和Y轴扫描数量；
S2：X轴、Y轴、Z轴聚焦电机到起始位；
S3：Z轴聚焦电机大范围定位，查找载玻片大概的聚焦位置；
S4：计算扫描图像的清晰度；
S5：Z轴聚焦电机根据计算结果的反馈运行到清晰位置，若反馈的清晰度值为0，X轴移动到下一个视野在继续查找清晰度，当达到阈值时停止查找；
S6：大范围聚焦完成后，在当前视野的上下小范围内再次聚焦，此次为最清晰聚焦；
S7：开始执行载玻片扫描动作，根据X轴和Y轴设定的扫描数量，开始逐行扫描；
S8：Z轴聚焦电机根据计算结果运行到清晰位置；
S9：采用关键区域的梯度累加进行计算判断；
S10：扫描过程中，若聚焦值连续多次出现为0的情况，机器会自动回零，并提示扫描失败；
S11：计算清晰度流程中的细胞提取操作；
S12：分析阳性细胞。
作为优选，所述S4中，计算扫描图像的清晰度的步骤如下：
S4.1、加载图像流A，对每张图像A[i]进行清晰度计算，清晰度为C[i]；
S4.2、计算单张图像的清晰度C[i]；
S4.3、计算出清晰度，记录A中每张图像的清晰度，得到清晰度值最大图像的索引，即为最清晰图像Abest，则完成聚焦操作。
作为优选，所述S4.2中，计算单张图像的清晰度C[i]步骤如下：
S4.2.1、等比缩小图像，图像尺寸为w*h，如果w>h，A[i]＝resize(A[i]，Size(800，h*800/w))；如果w<h，A[i]＝resize(A[i]，Size(w*800/h，800))；
S4.2.2、图像灰度化，G＝A[i]Gray＝A[i]R*0.299+A[i]G*0.587+A[i]B*0.114；
S4.2.3、图像二值化，对于G的二值化，用Threshold(gray，bin，10，255，ThresholdType.Binary)，算法细节为，对于G的每个像素，大于10则置为255，否则置为0得到二值图B；
S4.2.4、提取图像边缘，结合形态学处理使细胞边缘轮廓闭合；
S4.2.5、提取细胞区域，使用FindContours中的ChainApproxSimple算法进行轮廓提取；
S4.2.6、计算清晰度，对Scell-i进行局部灰度图提取Gi，并累计梯度计算，使用sobel算子在x，y两个方向上计算梯度累加，n为筛出的细胞轮廓数量：
Ts-i＝sobelx(Gi)+sobely(Gi)
Figure BDA0002293748770000021
C[i]＝Ts。
作为优选，所述S6中，小范围内再次聚焦具体为：Z轴聚焦电机先向下移动0.1-2圈，在以每次0.1圈的距离向上运行30-50步，拍摄30-50张图，Z轴聚焦电机根据计算结果运行到清晰位置。
作为优选，所述S12中，阳性细胞的分析过程如下：
S12.1、加载细胞大图B，需要分割出所有细胞；
S12.2、分割出提取符合要求的细胞之后，再进行单个细胞的矩形区域ROI提取为Ri；
S12.3、对单个提取的区域进行红点提取；
S12.4、若包含NR个红点符合阳性细胞的定义，则判断该细胞为阳性细胞，否则不是阳性细胞。
作为优选，所述S12.1中，分割出所有细胞的步骤如下：
S12.1.1、提取出所有可能是阳性细胞的区域集合N，N中还包含不符合的区域；
S12.1.2、从N中筛选合格的区域用到以下属性判断：
a.区域外包围矩形的宽高比：
Figure BDA0002293748770000031
范围是[0.65f，1.5f]；
b.区域最小外围矩形的宽高比：
Figure BDA0002293748770000032
范围是[0.65f，1.5f]；
c.区域占空比：
Figure BDA0002293748770000033
其中Si是区域面积，w1，h1为区域外包框的长宽，范围[0.5f，1.0f]；
d.区域面积约束：
Si>250；
e.区域圆度：
Fi>0.5。
作为优选，所述S12.3中，对单个提取的区域红点提取的步骤如下：
S12.3.1、对Ri进行BGR三通道分离，取红色通道图像，即可分离出所有红点，该步得到Ri[R],方便记作R；
S12.3.2、对R进行二值化操作，阈值为R的灰度均值MR：
使得R中的像素P，如果P>＝MR，则p＝255；
如果P<MR,p＝0，这样得到二值图BR；
S12.3.3、对BR进行轮廓分析，以满足条件的红点区域面积分离出合格的红点区域；
S12.3.4、统计合格的红点区域个数NR。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、该全自动显微影像荧光扫描系统中，先通过Z轴聚焦电机大范围定位，查找载玻片大概的聚焦位置，在大范围聚焦完成后，需要在当前视野的上下小范围内再次聚焦，此次为最清晰聚焦，Z轴聚焦电机根据计算结果运行到清晰位置，实现自动聚焦。
2、该全自动显微影像荧光扫描系统中，采用等比缩小图像，提升算法处理效率，并对图像进行灰度化、二值化处理，提取图像边缘和细胞区域，以便于计算清晰度。
3、本发明通过多色一体通道，对细胞内染色探针点进行自动聚焦，自动识别阳性细胞，自动判读细胞内探针点数，从而实现细胞荧光原位杂交染色的自动扫描与自动识别功能。
附图说明
图1为本发明的整体流程框图；
图2为本发明的选定恰当的分辨率计算流程框图；
图3为本发明的阳性细胞分析过程框图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-图3所示，本发明提供一种技术方案：
本发明提供一种全自动显微影像荧光扫描系统，如图1-图3所示，其方法包括如下步骤：
S1：设定好扫描区域，输入X轴和Y轴扫描数量；
S2：X轴、Y轴、Z轴聚焦电机到起始位；
S3：Z轴聚焦电机大范围定位，查找载玻片大概的聚焦位置，因为载玻片的厚度不统一，会相差50-100um的厚度，所以先执行大范围定位，电机从起始位带动载物台向上运行，每次走0.05圈，执行30-50步，拍摄30-50张图；
S4：计算扫描图像的清晰度；
其中，计算扫描图像的清晰度的步骤如下：
S4.1、加载图像流A，对每张图像A[i]进行清晰度计算，清晰度为C[i]；
S4.2、计算单张图像的清晰度C[i]，计算单张图像的清晰度C[i]步骤如下：
S4.2.1、等比缩小图像，图像尺寸为w*h，如果w>h，A[i]＝resize(A[i]，Size(800，h*800/w))；如果w<h，A[i]＝resize(A[i]，Size(w*800/h，800))；
S4.2.2、图像灰度化，G＝A[i]Gray＝A[i]R*0.299+A[i]G*0.587+A[i]B*0.114；
S4.2.3、图像二值化，对于G的二值化，用Threshold(gray，bin，10，255，ThresholdType.Binary)，算法细节为，对于G的每个像素，大于10则置为255，否则置为0得到二值图B；
S4.2.4、提取图像边缘，结合形态学处理使细胞边缘轮廓闭合；
值得说明的是，利用Canny算子对B实现边缘信息提取得到E1，阈值30,90,3，形态学膨胀算法，使用3*3椭圆形的形态学模板处理，得到轮廓闭合的边缘图E2；
S4.2.5、提取细胞区域，使用FindContours中的ChainApproxSimple算法进行轮廓提取，计算所有轮廓面积S,筛选过滤面积大于100的轮廓集合Scell；
S4.2.6、计算清晰度，对Scell-i进行局部灰度图提取Gi，并累计梯度计算，使用sobel算子在x，y两个方向上计算梯度累加，n为筛出的细胞轮廓数量：
Ts-i＝sobelx(Gi)+sobely(Gi)
Figure BDA0002293748770000051
C[i]＝Ts。
S4.3、计算出清晰度，记录A中每张图像的清晰度，得到清晰度值最大图像的索引，即为最清晰图像Abest，则完成聚焦操作。
S5：Z轴聚焦电机根据计算结果的反馈运行到清晰位置，若反馈的清晰度值为0，X轴移动到下一个视野在继续查找清晰度，当达到阈值时停止查找；
S6：大范围聚焦完成后，在当前视野的上下小范围内再次聚焦，此次为最清晰聚焦；具体为，Z轴聚焦电机先向下移动0.1-2圈，在以每次0.1圈的距离向上运行30－50步，拍摄30-50张图，Z轴聚焦电机根据计算结果运行到清晰位置。
S7：开始执行载玻片扫描动作，根据X轴和Y轴设定的扫描数量，开始逐行扫描，在扫描过程中，只有第一个视野、第二个视野、最后一个视野每次需要小范围聚焦，在这一行里需要间隔多少个视野小范围聚焦一次，可以通过软件设定，为了提高扫描速度，相机曝光值需设定在80-100以下，采用高精度载物台，保证载玻片绝对水平，聚焦间隔在5到20之间；
S8：为了节省时间，在逐行扫描运行过程中，使用的是小范围聚焦，Z轴聚焦电机先向下移动0.02圈，在以每次0.01圈的距离向上运行5步，拍摄5张图，Z轴聚焦电机根据计算结果运行到清晰位置；
S9：考虑计算复杂度和耗时，同时又要保证算法准确性，因此需要选定恰当的分辨率进行计算，如图2描述在灰度化之前应当做等比resize操作，缩放至恰当的分辨率，可大大提升识别效率，从原理来说由于梯度越大对应得清晰度越大，聚焦旨在实现细胞最清晰时的状态，因此采用关键区域的梯度累加进行计算判断，其中梯度值的计算采用sobel算子得opencv实现版本进行计算，可以准确计算关键细胞区域得梯度累加；
S10：扫描过程中，若聚焦值连续多次出现为0的情况，机器会自动回零，并提示扫描失败；所有视野扫描完成后下一步是分析扫描图片；
S11：细胞分割算法同聚焦算法一样，计算清晰度流程中的细胞提取操作；
其中，切分出来的roi区域进行判断，通过颜色通道提取红色、蓝色、绿色三个通道，并设定相应的像素值，面积大小、圆度、长宽比值、周长比等阈值进行是否合格的判定，多个条件进行参数调节，获得最佳结果；
进一步的，对红点的判断，采用轮廓提取，红点亮度获取，面积大小分析，过滤不合格的红点；
S12：分析阳性细胞，阳性细胞的分析过程如下：
S12.1、加载细胞大图B，需要分割出所有细胞；
其中，分割出所有细胞的步骤如下：
S12.1.1、提取出所有可能是阳性细胞的区域集合N，N中还包含不符合的区域；
S12.1.2、从N中筛选合格的区域用到以下属性判断：
a.区域外包围矩形的宽高比：
Figure BDA0002293748770000071
范围是[0.65f，1.5f]；
b.区域最小外围矩形的宽高比：
Figure BDA0002293748770000072
范围是[0.65f，1.5f]；
c.区域占空比：
Figure BDA0002293748770000073
其中Si是区域面积，w1，h1为区域外包框的长宽，范围[0.5f，1.0f]；
d.区域面积约束：
Si>250；
e.区域圆度：
Fi>0.5。
S12.2、分割出提取符合要求的细胞之后，再进行单个细胞的矩形区域ROI提取为Ri；
S12.3、对单个提取的区域进行红点提取；
其中，对单个提取的区域红点提取的步骤如下：
S12.3.1、因细胞图原本由三色图合成，因此对Ri进行BGR三通道分离，取红色通道图像，即可分离出所有红点，该步得到Ri[R],方便记作R；
S12.3.2、对R进行二值化操作，阈值为R的灰度均值MR：
使得R中的像素P，如果P>＝MR，则p＝255；
如果P<MR,p＝0，这样得到二值图BR；
S12.3.3、对BR进行轮廓分析，以满足条件的红点区域面积分离出合格的红点区域；
S12.3.4、统计合格的红点区域个数NR。
S12.4、若包含NR个红点符合阳性细胞的定义，则判断该细胞为阳性细胞，否则不是阳性细胞。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种全自动显微影像荧光扫描方法，包括如下步骤：
S1：设定好扫描区域，输入X轴和Y轴扫描数量；
S2：X轴、Y轴、Z轴聚焦电机到起始位；
S3：Z轴聚焦电机大范围定位，查找载玻片大概的聚焦位置；
S4：计算扫描图像的清晰度；
S5：Z轴聚焦电机根据计算结果的反馈运行到清晰位置，若反馈的清晰度值为0，X轴移动到下一个视野再继续查找清晰度，当达到阈值时停止查找；
S6：大范围聚焦完成后，在当前视野的上下小范围内再次聚焦，此次为最清晰聚焦；
S7：开始执行载玻片扫描动作，根据X轴和Y轴设定的扫描数量，开始逐行扫描；
S8：在逐行扫描运行过程中，使用小范围聚焦，Z轴聚焦电机根据清晰度计算结果运行到清晰位置；
S9：在进行小范围聚焦时，采用关键区域的梯度累加进行清晰度计算；
S10：扫描过程中，若聚焦值连续多次出现为0的情况，机器会自动回零，并提示扫描失败；
S11：计算清晰度流程中的细胞提取操作，具体为：对切分出来的ROI区域进行判断，通过颜色通道提取红色、蓝色、绿色三个通道， 并设定相应的像素值，通过面积大小、圆度、长宽比值和周长比的阈值进行是否合格的判定；
S12：分析阳性细胞；
所述S12中，阳性细胞的分析过程如下：
S12.1、加载细胞大图B，需要分割出所有细胞；
S12.2、分割提取出符合要求的细胞之后，再将单个细胞的矩形区域ROI提取为Ri；
S12.3、对单个细胞提取的Ri进行红点提取；
S12.4、若包含NR个红点符合阳性细胞的定义，则判断该细胞为阳性细胞，否则不是阳性细胞；
所述S12.3中，对单个细胞提取的Ri进行红点提取的步骤如下：
S12.3.1、对Ri进行BGR三通道分离，取红色通道图像，即可分离出所有红点，该步得到Ri[R]，记作R；
S12.3.2、对R进行二值化操作，阈值为R的灰度均值MR；
使得R中的像素P，如果P≥MR，则p＝255；
如果P<MR，则p＝0，从而得到二值图BR；
S12.3.3、对BR进行轮廓分析，以满足条件的红点区域面积分离出合格的红点区域；
S12.3.4、统计合格的红点区域个数NR；
所述S4中，计算扫描图像的清晰度的步骤如下：
S4.1、加载图像流A，对每张图像A[i]进行清晰度计算，清晰度为C[i]；
S4.2、计算单张图像的清晰度C[i]；
S4.3、计算出清晰度，记录A中每张图像的清晰度，得到清晰度值最大图像的索引，即为最清晰图像Abest，则完成聚焦操作；
所述S4.2中，计算单张图像的清晰度C[i]步骤如下：
S4.2.1、等比缩小图像，图像尺寸为w*h，如果w>h，A[i]＝resize(A[i]，Size(800，h*800/w))；如果w<h，A[i]＝resize(A[i]，Size(w*800/h，800))；其中，w为图像的宽度；h为：图像的高度；
S4.2.2、图像灰度化，G＝A[i]Gray＝A[i]R*0.299+A[i]G*0.587+A[i]B*0.114；
S4.2.3、图像二值化，对于G的二值化，用Threshold(gray，bin，10，255，ThresholdType.Binary)，算法细节为，对于G的每个像素，大于10则置为255，否则置为0得到二值图B；
S4.2.4、提取图像边缘，结合形态学处理使细胞边缘轮廓闭合；
S4.2.5、提取细胞区域，使用FindContours中的ChainApproxSimple算法进行轮廓提取，计算所有轮廓面积S，筛选过滤面积大于100的轮廓集合Scell；
S4.2.6、计算清晰度，对Scell-i进行局部灰度图提取Gi，并累计梯度计算，使用sobel算子在x，y两个方向上计算梯度累加，n为筛出的细胞轮廓数量：
Ts-i＝sobelx(Gi)+sobely(Gi)
Figure DEST_PATH_IMAGE002
C[i]＝Ts，其中，Ts-i为单层细胞轮廓累计梯度灰度值，Ts为：从1至n层细胞轮廓累计梯度灰度值。
2.根据权利要求1所述的全自动显微影像荧光扫描方法，其特征在于：所述S6中，小范围内再次聚焦具体为：Z轴聚焦电机先向下移动0.1-2圈，再以每次0.1圈的距离向上运行30-50步，拍摄30-50张图，Z轴聚焦电机根据计算结果运行到清晰位置。
3.根据权利要求1所述的全自动显微影像荧光扫描方法，其特征在于：所述S12.1中，分割出所有细胞的步骤如下：
S12.1.1、提取出所有可能是阳性细胞的区域集合N，N中还包含不符合的区域；
S12.1.2、从N中筛选合格的区域用到以下属性判断：
a.区域外包围矩形的宽高比：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，区域外包围矩形的宽高比的范围是[0.65f，1.5f]，其中，w1为：区域外包围矩形的宽度，h1为：区域外包围矩形的高度；
b.区域最小外围矩形的宽高比：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
，区域最小外围矩形的宽高比的范围是[0.65f，1.5f]，其中，w2为：区域最小外围矩形的宽度，h2为：区域最小外围矩形的高度；
c.区域占空比：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，其中Si是区域面积，w1，h1分别为区域外包围矩形的宽度和高度，区域占空比的范围为[0.5f，1.0f]；
d.区域面积约束：
Si>250，Si为区域面积；
e.区域圆度：
Fi>0.5，Fi为区域圆度。
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