CN110951802A - 一种功能性细菌纤维素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能性细菌纤维素的制备方法，属于新功能材料技术领域。该方法是将6‑羧基荧光素与葡萄糖合成为6‑羧基荧光素‑葡萄糖；将6‑羧基荧光素‑葡萄糖添加到发酵培养基中；向添加6‑羧基荧光素‑葡萄糖的发酵培养基接种木葡糖酸醋杆菌，通过静态培养使木葡糖酸醋杆菌利用6‑羧基荧光素‑葡萄糖原位发酵合成功能性细菌纤维素。与传统功能性复合材料制备方法相比，本发明方法制备的功能性细菌纤维素化学性能更稳定，应用效果更好，此外其在紫外光下发出绿色荧光，这在防伪标识方面有一定的应用前景。本发明为合成新的功能性细菌纤维素材料提供研究模型，同时也为其他生物合成系统原位合成功能性材料甚至功能性药物提供思路。

Description

一种功能性细菌纤维素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种功能性细菌纤维素的制备方法，属于新功能材料技术领域。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial cellulose)是一种由微生物发酵生成的纳米材料，产生细菌纤维素的菌属有醋酸杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、固氮菌属、气杆菌属和产碱菌属等。微生物在发酵期间，利用葡萄糖经菌体代谢聚合形成纤维素链(β-1,4-葡聚糖)，这些纤维素短链进而结晶化形成纤维素单纤维。与植物来源的纤维素相比，细菌纤维素具有纯度高的优点，成分中没有木质素、半纤维素和果胶等杂质。细菌纤维素具有独特的纳米多孔纤维结构，同时具备高结晶度、高比表面积、高聚合度、优良渗透性、高孔隙度、优良机械特性以及高含水量等优点。

除了上述的特点，细菌纤维素在改性方面具有两方面的优势。首先，它可以在发酵期间原位塑形，形成管状、膜状、球状或者薄纤维层状等结构，满足各类功能性材料对产品应用形式的需求，可实现一步合成；其次，细菌纤维素具有多羟基的分子结构，可以在发酵后进行功能化改性，如功能性化合物修饰或聚合物涂层等。因此，以细菌纤维素为基础研发的功能性材料不断涌现，在诸多领域都有应用前景，包括化学传感、生物成像、紫外屏蔽、油吸附、燃料电池、生物医用材料、离子检测、防伪标识等。

目前以细菌纤维素为基础的改性材料的制备方法主要有两种类型：一是将纳米粒子等材料均匀的分散在水中形成溶液或悬浮液，将制备好的细菌纤维素膜浸渍到上述液体中，一段时间后取出烘干制得细菌纤维素复合材料，如细菌纤维素/银纳米复合材料(Insitu synthesis of silver-nanoparticles/bacterial cellulose composites forslow-released antimicrobial wound dressing)，细菌纤维素/CdTe量子点复合材料(Color-tunable luminescent CdTe quantum dot membranes based on bacterialcellulose(BC)and application in ion detection)等；二是将纳米粒子等材料添加到发酵培养基中形成乳液或悬浮液，接种木醋杆菌，使得细菌纤维素在形成的过程中，将纳米材料包埋在细菌纤维素的网状结构中，从而形成复合材料，如细菌纤维素/明胶复合材料，细菌纤维素/氧化石墨复合材料，细菌纤维素/壳聚糖复合材料等。以上两种方法均属于利用物理方法以静电作用或氢键将其他纳米材料结合到细菌纤维素上，在应用过程中，会因摩擦，浸泡等外力作用使得纳米材料从细菌纤维素中脱离，从而影响细菌纤维素复合材料的性能。目前为止，尚无有关通过微生物利用功能性碳源分子合成制备功能性细菌纤维素的相关报道。

发明内容

为解决现有以细菌纤维素为基础的改性材料的制备多以利用物理方法以静电作用或氢键将其他纳米材料结合到细菌纤维素上，在应用过程中会因摩擦、浸泡等外力作用使得纳米材料从细菌纤维素中脱离，从而影响细菌纤维素复合材料的性能的问题，本发明提供了一种合成功能性细菌纤维素的制备方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种功能性细菌纤维素的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

1)将6-羧基荧光素与葡萄糖合成为6-羧基荧光素-葡萄糖；

2)将6-羧基荧光素-葡萄糖添加到发酵培养基中，获得含有6-羧基荧光素-葡萄糖的发酵培养基；

3)向步骤2)所得含有6-羧基荧光素-葡萄糖的发酵培养基接种木葡糖酸醋杆菌，通过静态培养使木葡糖酸醋杆菌利用6-羧基荧光素-葡萄糖原位发酵合成功能性细菌纤维素。

本发明所述的6-羧基荧光素-葡萄糖可以通过化学方法合成，如：将N,N,N’,N’-四甲基-O-(-N-琥珀酰亚胺)四氟硼酸脲溶解于N,N-二异丙基乙胺溶液中，取所得溶液加入到含6-羧基荧光素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在惰性条件下进行室温搅拌后将1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐溶解到含有N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，在室温条件、惰性和暗室环境下反应过夜，生成橘黄色的固体物质，经纯化和干燥后得6-羧基荧光素-葡萄糖。

更优选地，步骤1)所述将6-羧基荧光素与葡萄糖合成为6-羧基荧光素-葡萄糖通过如下方法实现：将20mg N,N,N’,N’-四甲基-O-(-N-琥珀酰亚胺)四氟硼酸脲溶解于100μLN,N-二异丙基乙胺溶液中，取100μL所得溶液加入到100μL含50mg 6-羧基荧光素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在惰性条件下，室温搅拌后将25mg 1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐溶解到含有N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，使1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐的终浓度为65μmol，在室温条件、惰性和暗室环境下反应过夜，生成橘黄色的固体物质，经纯化和干燥后得6-羧基荧光素-葡萄糖。

优选地，步骤2)所述6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.1mg/mL～0.95mg/mL。

更优选地，步骤2)所述6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.38mg/mL～0.95mg/mL。

最优选地，步骤2)所述6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.95mg/mL。

优选地，步骤2)所述发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。

优选地，步骤3)所述木葡糖酸醋杆菌的接种量为7％～11％(v/v)。

优选地，步骤3)所述静态培养是在30℃下静置培养5天。

优选地，步骤2)所述将6-羧基荧光素-葡萄糖添加到发酵培养基中是将6-羧基荧光素-葡萄糖固体直接添加到发酵培养基中或者是将6-羧基荧光素-葡萄糖固体溶于水后配置成母液，然后将6-羧基荧光素-葡萄糖的母液通过无菌滤膜添加到发酵培养基中。

本发明还提供了上述任一所述的制备方法获得的功能性细菌纤维素在制备防伪标示材料中的应用。

本发明制备方法中通过30℃静置培养后，在培养基表面会形成凝胶膜，该凝胶膜即为湿润的功能性细菌纤维素膜。该湿润的功能性细菌纤维素膜可以通过如下方法进一步处理：用去离子水反复冲洗样品表面，然后用2％(w/v)的氢氧化钠溶液，60℃浸泡过夜，以除去其中的培养基及菌体，之后用去离子水反复洗涤至样品表面呈中性。

本发明有益效果：

本发明提供了一种新的技术构思，首次通过微生物利用功能性碳源分子合成制备功能性细菌纤维素，首次证实了利用改性葡萄糖为发酵底物通过微生物原位发酵合成功能性细菌纤维素的可行性,该方法是将合成的6-羧基荧光素-葡萄糖作为功能性碳源分子添加到发酵培养基中，使木葡糖酸醋杆菌利用该功能性碳源分子，并且通过静态培养原位发酵合成功能性细菌纤维素。该方法制备的功能性细菌纤维素中的功能性分子6-羧基荧光素-葡萄糖是作为基础构成分子通过微生物代谢原位合成为功能性纤维素分子链。与传统功能性复合材料制备方法相比，本发明该方法成本低廉，绿色环保，工艺简单，易于操作，适用于大规模生产使用，该方法制得的功能性细菌纤维素化学性能更稳定，应用效果更好，长期保留其功能性。此外，其在保持原有细菌纤维素特征的同时还在紫外光下发出绿色荧光，这在防伪标识方面有一定的应用前景。

现有的以细菌纤维素为基础的改性材料的制备多以利用物理方法以静电作用或氢键将其他纳米材料结合到细菌纤维素上，在应用过程中会因摩擦、浸泡等外力作用使得纳米材料从细菌纤维素中脱离，从而影响细菌纤维素复合材料的性能的，而本发明方法是将6-羧基荧光素-葡萄糖与葡萄糖通过微生物代谢作用连接在一起，最终形成细菌纤维素，因此6-羧基荧光素是以化学键结合在细菌纤维素上，与传统物理方法改性相比，6-羧基荧光素不易脱落，可长期保留功能性。

附图说明

图1为6CF-Glc的UV-Vis检测图。

图2为不同样品在白光、紫外光(365nm)下的观察图；图中：a为在白光下观察到的Ch-6CF/BC的图像；b为在紫外光(365nm)下观察到的Ch-6CF/BC的图像；c为在紫外光(365nm)下观察到的HC-6CF-BC的图像；图中比例尺均为2cm。

图3为Ch-6CF/BC和BC样品的FT-IR ATR分析图。

图4为HC-6CF-BC，LC-6CF-BC，Im-6CF/BC和BC的荧光强度的检测结果；图中：a1为HC-6CF-BC在488nm激发光下的荧光照片；a2为HC-6CF-BC在白光下的照片；a3为a1和a2的合成图；a4为HC-6CF-BC在488nm激发光下的荧光强度结果；b1为LC-6CF-BC在488nm激发光下的荧光照片；b2为LC-6CF-BC在白光下的照片；b3为b1和b2的合成图；b4为LC-6CF-BC在488nm激发光下的荧光强度结果；c1为Im-6CF-BC在488nm激发光下的荧光照片；c2为Im-6CF-BC在白光下的照片；c3为c1和c2的合成图；c4为Im-6CF-BC在488nm激发光下的荧光强度结果；d1为BC在488nm激发光下的荧光照片；d2为BC在白光下的照片；d3为d1和d2的合成图；d4为BC在488nm激发光下的荧光强度结果。

图5为不同样品的表征测试图；其中：a为FT-IR ATR分析图；b为X射线衍射分析图；c为热重分析图；d为热重一次微分分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中采用木葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter xylinum为例进行说明，购买自美国ATCC菌种库，其保藏编号为NCIB 8034；其他木葡糖酸醋杆菌也同样可以实现本发明目的。

实施例1

本实施例提供了一种6羧基荧光素-葡萄糖(6CF-Glc)的化学合成方法，该方法为：

将20mg N,N,N’,N’-四甲基-O-(-N-琥珀酰亚胺)四氟硼酸脲加入100μL N,N-二异丙基乙胺溶液中，取100μL所得溶液加入到100μL含50mg 6-羧基荧光素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，惰性条件下，室温搅拌30min。然后将25mg 1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐溶解到含有N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，使1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐在N,N-二甲基甲酰胺(含N,N-二异丙基乙胺)中的终浓度为65μmol。在室温条件、惰性和暗室环境下反应过夜，生成橘黄色的固体物质。取出15mg橘黄色固体加入3mL NaOH(0.01M)进行脱乙酰，所得溶液超声5s后，在室温下搅拌10min，然后加入3mL HCl(0.01M)将溶液pH调回7.0终止脱乙酰反应。溶液通过真空干燥法回收得到6羧基荧光素-葡萄糖(6CF-Glc)固体。

脱乙酰度利用薄层色谱法测定，具体操作如下：将得到的橘黄色固体物质点样于薄层层析板(固定相为硅胶GF)上，然后置于展开室的展开剂(二氯甲烷/MeOH的体积比10:1)中，深度为距薄层板底边0.5-1cm，封闭室盖，待展开10-15cm时，取出薄层板，对色谱斑点扫描定量，测定脱乙酰度。

实施例2

本实施例提供了一种功能性细菌纤维素的制备方法，该方法具体步骤为：

将实施例1制备的6-羧基荧光素-葡萄糖(6CF-Glc)固体直接添加到发酵培养基中，使6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.38mg/mL，或者是将实施例1制备的6-羧基荧光素-葡萄糖(6CF-Glc)固体溶于水中配置成母液，将6-羧基荧光素-葡萄糖的母液通过0.22μm的无菌滤膜加入到灭菌后的发酵培养基中，使6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.38mg/mL；其中：发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。按照7％(v/v)的接种量将木葡糖酸醋杆菌种子液接种至上述发酵培养基中，于30℃静置培养5天，收集培养基表面形成的凝胶膜，即为低浓度的功能性细菌纤维素(LC-6CF-BC)(为了后面效果实验引用方便，此处将实施例2所得功能性细菌纤维素命名为LC-6CF-BC，其与实施例3获得的功能性细菌纤维素本质相同，均为功能性细菌纤维素(6CF-BC)，其与实施例3所获得的功能性细菌纤维素的区别在于实施例2所得功能性细菌纤维素的6-羧基荧光素取代度相比于实施例3低)。用去离子水反复冲洗样品表面，然后将样品浸泡于2％(w/v)的氢氧化钠溶液中，60℃过夜，以除去其中的培养基及菌体，之后用去离子水反复洗涤至样品表面呈中性。

实施例3

本实施例提供了一种功能性细菌纤维素的制备方法，该方法具体步骤为：

将实施例1制备的6-羧基荧光素-葡萄糖(6CF-Glc)固体添加到发酵培养基中，使6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.95mg/mL，或者是将实施例1制备的6-羧基荧光素-葡萄糖(6CF-Glc)溶于水中配置成母液，将6-羧基荧光素-葡萄糖的母液通过0.22μm的无菌滤膜加入到灭菌后的发酵培养基中，使6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.95mg/mL；其中：发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。按照7％(v/v)的接种量将木葡糖酸醋杆菌种子液接种至上述发酵培养基中，于30℃静置培养5天，收集培养基表面形成的凝胶膜，即为高浓度的功能性细菌纤维素(HC-6CF-BC)(为了后面效果实验引用方便，此处将实施例3所得功能性细菌纤维素命名为HC-6CF-BC，其与实施例2获得的功能性细菌纤维素本质相同，均为功能性细菌纤维素(6CF-BC)，其与实施例2所获得的功能性细菌纤维素的区别在于实施例3所得功能性细菌纤维素的6-羧基荧光素取代度相比于实施例2高)。用去离子水反复冲洗样品表面，然后将样品浸泡于2％(w/v)的氢氧化钠溶液中，60℃过夜，以除去其中的培养基及菌体，之后用去离子水反复洗涤至样品表面呈中性。

实施例4

本实施例与实施例3的区别在于：6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.1mg/mL。

实施例5

本实施例与实施例3的区别在于：木葡糖酸醋杆菌的接种量为11％(v/v)。

为说明本发明方法合成功能性细菌纤维素所能够获得的效果，设置如下对照例：

对比例1

发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。在发酵培养基中按照7％(v/v)的接种量接种木葡糖酸醋杆菌种子液，30℃静置培养5天，收集培养基表面形成的凝胶膜，即为细菌纤维素(BC)。用去离子水反复冲洗样品表面，然后将样品浸泡于2％(w/v)的氢氧化钠溶液中，60℃过夜，以除去其中的培养基及菌体，之后用去离子水反复洗涤至样品表面呈中性。

对比例2

发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。在发酵培养基中按照7％(v/v)的接种量接种木葡糖酸醋杆菌种子液，30℃静置培养5天，收集培养基表面形成的凝胶膜，即为细菌纤维素(BC)。用去离子水反复冲洗样品表面，然后将样品浸泡于2％(w/v)的氢氧化钠溶液中，60℃过夜，以除去其中的培养基及菌体，之后用去离子水反复洗涤至样品表面呈中性。将处理后的BC浸泡在浓度为0.95mg/mL的6CF-Glc水溶液中，30℃孵育24h，之后用去离子水反复冲洗样品表面，至水溶液中无浮色，得到的样品即为Im-6CF/BC。

对比例3

发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。在发酵培养基中按照7％(v/v)的接种量接种木葡糖酸醋杆菌种子液，30℃静置培养5天，收集培养基表面形成的凝胶膜，即为细菌纤维素(BC)。用去离子水反复冲洗样品表面，然后将样品浸泡于2％(w/v)的氢氧化钠溶液中，60℃过夜，以除去其中的培养基及菌体，之后用去离子水反复洗涤至样品表面呈中性。将处理后的BC浸泡在含50mg 6CF的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温孵育30min，取出后80℃干燥24h，之后先用大量DMF冲洗，去除表面多余的6CF，再用过量去离子水洗涤，去除DMF，得到化学法制备的功能性细菌纤维素Ch-6CF/BC。

为说明本发明方法合成功能性细菌纤维素所能够获得的效果，对实施例1-3和对照例1-3进行了如下实验：

1、将实施例1制备6CF-Glc进行UV-Vis检测，测试结果如图1。

图1中6CF的吸收峰为231/455/477nm，6CF-Glc的吸收峰为232/457/481nm，可以观察到合成的6CF-Clc的UV-Vis图中的吸收峰具有轻微红移，这证明了6-羧基荧光素与葡萄糖的缀合。

2、将实施例3制备的HC-6CF-BC、对比例3制备的Ch-6CF/BC分别在白光、紫外光(365nm)下观察，结果如图2所示。

图2中在Ch-6CF/BC和HC-6CF-BC上均观察到绿色荧光，而HC-6CF-BC的荧光分布比CH-6CF/BC的荧光分布更均匀。

3、对Ch-6CF/BC、BC进行傅里叶变换红外光谱(FT-IR ATR)分析检测，结果如图3所示。

从图3可知Ch-6CF/BC与BC有一样的吸收峰，并没有在1740cm^-1处出现C＝O的伸缩振动峰，说明得到的Ch-6CF/BC中并没有形成酰胺键，该化学改性方法并不适用于细菌纤维素的改性。

4、在相同的参数设置下使用CLSM(激发波长488nm，放大倍数1000倍)对制备的HC-6CF-BC、LC-6CF-BC、Im-6CF/BC、BC样品进行激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察，结果如图4所示。

从图4可以看出HC-6CF-BC、LC-6CF-BC显示绿色荧光，平均荧光强度分别为1492a.u.和612a.u.，而Im-6CF/BC和BC不显示荧光，荧光强度为0。

5、将合成的样品HC-6CF-BC、LC-6CF-BC、BC经过60℃干燥，分别检测FT-IR ATR，X射线衍射、热重分析，结果如图5所示。

从图5可以看出：与BC相比，在6CF-BC的光谱中出现1530cm^-1(C＝O伸缩振动)，1650cm^-1(-CO-NH中C＝O伸缩振动)和1453cm^-1(苯环振动)的新峰。这表明6CF-BC中引入了新的功能性基团—6CF。X射线衍射图(XRD)显示所有样品具有两个吸收峰，出现在14.5°和22.6°，对应于纤维素形式I-β的(110)和(200)面。这些结果表明6CF的引入对BC的晶体结构没有显着影响，表明6CF修饰可能主要发生在BC的无定形区域。然而，HC-6CF-BC(71.8％)和LC-6CF-BC(90.0％)的结晶度低于BC(98.3％)，表明6CF-Glc干扰BC链的有序排列并减少结晶度，并且随着6CF-Glc浓度的增加，结晶度降低。热重(TG)分析显示HC-6CF-BC和LC-6CF-BC在230℃开始热分解，BC为300℃。热重一次微分分析(DTG)显示HC-6CF-BC和LC-6CF-BC的最低吸热峰分别为330℃和335℃，而BC最低吸热峰为365℃。此时发生最大重量损失率，对应于β-1,4-糖苷键的热解。6CF-BC的吸热峰较宽(从220℃到450℃)并且强度较低，而BC的吸热峰更尖锐(从280℃到390℃)且强度更高。6CF-BC的结晶温度低于BC的结晶温度30-35℃，表明6CF-BC的热稳定性比BC差，并且6CF-BC中的无定形纤维素含量增加。这些结果与XRD的结果一致。

综上可知：本发明提出的微生物原位合成方法适用于细菌纤维素的功能化改性，合成的功能性细菌纤维素具有荧光性，且功能基团(即6-羧基荧光素)是通过化学键连接在细菌纤维素上，不易脱落，具有耐用性。本发明首次证实了利用改性葡萄糖为发酵底物通过微生物原位发酵合成功能性细菌纤维素的可行性。

本发明实施例2和3与对照例1比较，可以说明，本发明方法中使用6CF-GLc可以被菌体代谢进而合成到细菌纤维素中，实现对细菌纤维素的改性；本发明方法中将6CF-GLc添加到培养基中，相比于未添加在培养基中，直接以浸泡方式的对比例2相比较，可知：对比例2中细菌纤维素经过浸泡和冲洗后未显示有荧光性，而实施例2和3中获得细菌纤维素具有荧光性，证明实施例2和3中的6CF-GLc是被菌体代谢进而合成到细菌纤维素中，排除了是物理浸泡导致荧光性出现的可能性；本发明实施例2和3与对照例3比较可以证明利用微生物原位发酵方法合成的功能性细菌纤维素其荧光性分布比化学改性(即对照例3)方法更均匀，同时由于细菌纤维素本身难改性的原因使得化学改性困难，使用了很多毒性试剂，相比较而言更加突显了微生物合成法的绿色环保性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种功能性细菌纤维素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

1)将6-羧基荧光素与葡萄糖合成为6-羧基荧光素-葡萄糖；

2)将6-羧基荧光素-葡萄糖添加到发酵培养基中，获得含有6-羧基荧光素-葡萄糖的发酵培养基；

3)向步骤2)所得含有6-羧基荧光素-葡萄糖的发酵培养基接种木葡糖酸醋杆菌，通过静态培养使木葡糖酸醋杆菌利用6-羧基荧光素-葡萄糖原位发酵合成功能性细菌纤维素。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述将6-羧基荧光素与葡萄糖合成为6-羧基荧光素-葡萄糖通过如下方法实现：将N,N,N’,N’-四甲基-O-(-N-琥珀酰亚胺)四氟硼酸脲溶解于N,N-二异丙基乙胺溶液中，取所得溶液加入到含6-羧基荧光素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在惰性条件下进行室温搅拌后将1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐溶解到含有N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，在室温条件、惰性和暗室环境下反应过夜，生成橘黄色的固体物质，经纯化和干燥后得6-羧基荧光素-葡萄糖。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述将6-羧基荧光素与葡萄糖合成为6-羧基荧光素-葡萄糖通过如下方法实现：将20mg N,N,N’,N’-四甲基-O-(-N-琥珀酰亚胺)四氟硼酸脲溶解于100μL N,N-二异丙基乙胺溶液中，取100μL所得溶液加入到100μL含50mg 6-羧基荧光素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在惰性条件下，室温搅拌后将25mg 1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐溶解到含有N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺中，使1,3,4,6-四-O-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖盐酸盐的终浓度为65μmol，在室温条件、惰性和暗室环境下反应过夜，生成橘黄色的固体物质，经纯化和干燥后得6-羧基荧光素-葡萄糖。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述将6-羧基荧光素-葡萄糖添加到发酵培养基中是将6-羧基荧光素-葡萄糖固体直接添加到发酵培养基中或者是将6-羧基荧光素-葡萄糖固体溶于水后配置成母液，然后将6-羧基荧光素-葡萄糖的母液通过无菌滤膜添加到发酵培养基中。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.1mg/mL～0.95mg/mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述6-羧基荧光素-葡萄糖在发酵培养基中的终浓度为0.95mg/mL。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养基由葡萄糖，酵母膏，蛋白胨，一水合柠檬酸，磷酸氢二钠，无水乙醇和水配制而成，其中每100mL发酵培养基中各组分的含量为：葡萄糖2.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，一水合柠檬酸0.0115g，磷酸氢二钠0.27g，无水乙醇1g。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述木葡糖酸醋杆菌的接种量为7％～11％(v/v)。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述静态培养是在30℃下静置培养5天。

10.权利要求1-9任一所述的制备方法获得的功能性细菌纤维素在制备防伪标示材料中的应用。

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