CN110945121A

CN110945121A - 修饰的高丝氨酸脱氢酶及使用其产生高丝氨酸或衍生自高丝氨酸的l-氨基酸的方法

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Publication number: CN110945121A
Application number: CN201980001666.XA
Authority: CN
Inventors: 金孝珍; 许兰; 林相曹; 金贤雅; 金亨俊; 徐昌一; 李承彬; 李知宣
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-05-21
Also published as: SG11202006718YA; MX2020007591A; TWI740150B; EP3597738A4; CN112143719B; HUE062601T2; RU2733426C1; ES2944588T3; EP3597738B1; US20210403962A1; US11236374B2; AU2019279282B2; JP2021513341A; TW202000914A; ZA202004021B; AU2019279282A1; JP6938795B2; WO2019231159A1; US20210002682A1; CN112143719A

Abstract

本公开涉及修饰的高丝氨酸脱氢酶和用于使用其产生高丝氨酸衍生的L‑氨基酸的方法。

Description

修饰的高丝氨酸脱氢酶及使用其产生高丝氨酸或衍生自高丝氨酸的L-氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及修饰的高丝氨酸脱氢酶。具体地，本公开涉及具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用异亮氨酸取代第285位氨基酸；用谷氨酰胺取代第398位氨基酸；或分别用异亮氨酸和谷氨酰胺取代在两个位置的氨基酸来进行。另外，本公开涉及使用修饰的高丝氨酸脱氢酶产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法、用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物、提高产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力的方法、或修饰的高丝氨酸脱氢酶的用途。

背景技术

在L-氨基酸中，L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸通常使用通过高丝氨酸脱氢酶(以下称为“Hom”；EC：1.1.1.3)从天冬氨酸-半醛(以下称为“ASA”)产生的高丝氨酸。因此，为了经由发酵方法产生氨基酸，必须将生物合成途径中使用的酶的活性保持在一定水平或更高水平，并且已经对其进行了深入研究。

特别地，已知作用于L-赖氨酸和L-苏氨酸的生物合成途径的分支点的高丝氨酸脱氢酶的活性受L-苏氨酸和L-异亮氨酸的调节。最近，已有几篇关于Hom对L-苏氨酸的反馈抑制的脱敏和使用其产生L-苏氨酸的方法的报道。在1991年，Eikmann等人在德国报道，Hom通过用谷氨酸取代甘氨酸——其为Hom的第378位氨基酸残基——而脱敏(Eikmanns BJ等人,Appl.Microbial Biotechnol.34:617-622,1991)；和在1991年，Archer等人报道，当Hom的C末端由于移码突变而受损时发生脱敏(Archer JA等人,Gene 107:53-59,1991)。

发明内容

[技术问题]

本发明人已经对苏氨酸的反馈抑制的脱敏进行了研究，结果他们已经发现，编码修饰的Hom的新基因被分离，以及在新基因被转导的微生物中L-氨基酸产生能力得到改善，从而完成本公开。

[技术方案]

本公开的一个目的是提供具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用另一种氨基酸取代第285位氨基酸；用另一种氨基酸取代第398位氨基酸；或用其他氨基酸取代在两个位置的氨基酸。

本公开的另一个目的是提供编码修饰的脱氢酶的多核苷酸。

本公开的又一个目的是提供一种棒杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物，其包括修饰的高丝氨酸脱氢酶。

本公开的又一个目的是提供一种产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法，其包括：在培养基中培养微生物；以及从微生物或培养基中回收高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸。

本公开的又一个目的是提供用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的组合物或包含本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物。

本公开的又一个目的是提供一种提高产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力的方法，其包括在棒杆菌属的微生物中表达本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶。

本公开的又一个目的是提供修饰的高丝氨酸脱氢酶用于产生本公开的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

本公开的又一个目的是提供多核苷酸用于产生本公开的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

本公开的又一个目的是提供棒杆菌属的微生物用于产生本公开的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

本公开的又一个目的是提供组合物用于产生本公开的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

[有益效果]

本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可广泛用于有效的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的大量产生，因为与天然或野生型相比，最终产物的反馈抑制是脱敏的。

具体实施方式

[实施发明的最佳方式]

在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受在下文提供的具体公开的限制。

为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代通过用另一种氨基酸取代第285位氨基酸或第398位氨基酸或通过其组合来进行。

具体地，本公开提供了一种具有多肽的高丝氨酸脱氢酶变体，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用异亮氨酸取代第285位氨基酸；用谷氨酰胺取代第398位氨基酸；或分别用异亮氨酸和谷氨酰胺取代两个位置的氨基酸来进行。更具体地，本公开提供修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，用异亮氨酸取代第285位氨基酸；用谷氨酰胺取代第398位氨基酸；或分别用异亮氨酸和谷氨酰胺取代两个位置的氨基酸。

在本公开中，高丝氨酸脱氢酶(EC：1.1.1.3)是指催化高丝氨酸合成的酶，高丝氨酸是植物和微生物中甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸生物合成的常见中间体。在本公开中，只要其具有上述转化活性，就可以包括高丝氨酸脱氢酶(无论其来源)，并且可以使用来源于任何生物(植物、微生物等)的酶作为高丝氨酸脱氢酶。具体地，高丝氨酸脱氢酶可以是来源于棒杆菌属的微生物，更具体地，可以是来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。例如，高丝氨酸脱氢酶可以是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质。包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质可以与术语“具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质”或“由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质”互换使用。

在本公开中，本领域熟知的各种方法可用于获得高丝氨酸脱氢酶的方法。此类方法的实例包括：包括优化密码子以便在棒杆菌属的微生物(其通常用于蛋白质的表达)中以高效获得蛋白质的基因合成技术、以及使用生物信息学基于微生物的元基因组(meta-genome)筛选有用酶资源的方法，但方法不限于此。

在本公开中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质不排除由于具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1的氨基酸序列)上游或下游的无意义的序列添加而可能发生的突变、或自然发生的突变或其中的沉默突变。另外，与包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质具有相同或相应活性的蛋白质对应于具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质。作为具体实例，具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质可以是由SEQID NO：1的氨基酸序列或与其具有至少80％、90％、95％或97％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质。

另外，尽管在本公开中描述为“包括特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但显然，只要该蛋白质具有任意上述同源性的氨基酸序列并且表现出对应于上述蛋白质的效果，则具有在序列的一部分中带有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以属于本公开的范围。例如，在本公开中，具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质可以是源自谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸脱氢酶。更具体地，具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质可以是源自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)、源自谷氨酸棒杆菌ATCC14067的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)或源自谷氨酸棒杆菌ATCC13869的高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。由于具有上述序列的高丝氨酸脱氢酶彼此显示出80％、90％、95％或97％或更高的同源性，并且由于这些高丝氨酸脱氢酶显示出与高丝氨酸脱氢酶的那些效果相应的效果，显然它们被包括在具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质中。

如本文所用，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。同源性是指与给定的氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且可以表示为百分比。在本公开中，具有与给定的氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似的活性的同源性序列表示为“％同源性”。从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域已知的技术确定。例如，可以使用用于计算诸如得分、同一性和相似性的参数的标准软件(即BLAST 2.0)或者通过经由Southern杂交实验比较序列来确认同源性，并且可以通过本领域技术人员已知的方法确定待限定的适当杂交条件(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2^nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。

如本文所用，术语“修饰”、“修饰的”或“变体”是指在一种稳定表型中显示可遗传或不可遗传交替(alternation)的培养物或个体。具体地，术语“变体”可以意指其中其活性因为与野生型、天然或未修饰型相比对应于具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被修饰而被有效增加的变体、或其中异亮氨酸、苏氨酸或其衍生物的反馈抑制被释放的变体、或其中活性增加和反馈抑制均被释放的变体。

在本公开中，术语“修饰的高丝氨酸脱氢酶”可与“高丝氨酸脱氢酶变体”互换使用。另一方面，这种变体可以是非天然发生的。

具体地，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是具有多肽的修饰的蛋白质，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用异亮氨酸取代第285位氨基酸、用谷氨酰胺取代第398位氨基酸、或其组合来进行的。具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列如上所述，并且可以是，例如，SEQ ID NO：1的氨基酸序列。另外，第285位氨基酸可以是其中苏氨酸被异亮氨酸取代的氨基酸，第398位氨基酸可以是其中精氨酸被谷氨酰胺取代的氨基酸。

另外，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是具有多肽的修饰的蛋白质，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用色氨酸取代第378位氨基酸来进行的。另外，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是具有多肽的修饰的蛋白质，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用异亮氨酸取代第285位氨基酸、用谷氨酰胺取代第398位氨基酸、或其组合来进行的；在这个修饰的高丝氨酸脱氢酶中，第378位氨基酸可进一步被色氨酸取代。更具体地，第378位氨基酸可以是其中甘氨酸被色氨酸取代的氨基酸。

甚至更具体地，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶是具有多肽的修饰的蛋白质，该多肽在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代是通过用异亮氨酸取代第285位氨基酸、用谷氨酰胺取代第398位氨基酸、或其组合来进行的。例如，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是包含SEQ ID NO：10、11、12或13的氨基酸序列的蛋白质。另外，不排除由于氨基酸序列上游或下游的无意义的序列添加而可能发生的突变、自然发生的突变或其中的沉默突变。另外，具有与修饰的高丝氨酸脱氢酶相同或相应活性的蛋白质对应于具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质。作为具体实例，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是由SEQ ID NO：10、11、12或13的氨基酸序列组成的蛋白质、或与上述氨基酸序列具有至少80％、90％、95％或97％同源性的蛋白质。另外，尽管在本公开中描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但显然，只要该蛋白质具有任意上述同源性的氨基酸序列并且表现出对应于上述蛋白质的效果，具有在氨基酸序列的一部分中带有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以属于本公开的范围。

另外，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶是具有多肽的修饰的高丝氨酸脱氢酶，该多肽在具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代。显然，包括其中第285或398位氨基酸被另一种氨基酸取代的修饰，并且显示出对应于高丝氨酸脱氢酶的效果的任何蛋白质都属于本公开的范围。

另外，与野生型或天然蛋白或具有高丝氨酸脱氢酶活性的未修饰蛋白不同，本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶可以是其中最终产物(即异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或高丝氨酸，其衍生物或类似物)的反馈抑制被释放或脱敏的高丝氨酸脱氢酶。如本文所用，术语“反馈抑制”意指代谢的最终产物阻止早期反应。因此，当高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制被释放或脱敏时，与反馈抑制未被释放或脱敏相比，可以提高高丝氨酸和高丝氨酸衍生的L-氨基酸的生产能力。

高丝氨酸衍生的L-氨基酸是指可以使用L-高丝氨酸作为前体进行生物合成的L-氨基酸，并且只要其是可以从L-高丝氨酸生物合成的物质，就不受限制。高丝氨酸衍生的L-氨基酸不仅可以包括高丝氨酸衍生的L-氨基酸，还可以包括其衍生物。例如，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、和/或L-甘氨酸，但不限于此。更具体地，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、和/或L-甲硫氨酸，但不限于此。

本公开的另一方面提供了编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸。

高丝氨酸脱氢酶和变体如上所述。

如本文所用，术语“多核苷酸”是由在链中共价键合的核苷酸单体组成的核苷酸聚合物，并且其实例是具有预定或更长长度的DNA或RNA链，更具体地，它是指编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸片段。只要其具有编码具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的修饰的蛋白质的多核苷酸序列，就可不受限制地包含编码本公开的修饰的蛋白质的多核苷酸。

在本公开中，编码高丝氨酸脱氢酶变体的氨基酸序列的多核苷酸可以是具体地来源于棒杆菌属的微生物，更具体地来源于谷氨酸棒杆菌，但不限于此。

另外，在编码蛋白质的多核苷酸中，由于密码子简并性或考虑到在其中待表达蛋白质的生物中优选的密码子，可以在编码区域中进行各种修饰而不改变蛋白质的氨基酸序列。具体地，多核苷酸可以是包括编码蛋白质的多核苷酸序列或与上述多核苷酸序列具有至少80％、90％、95％或者97％同源性的多核苷酸序列的多核苷酸。另外，显然，只要该多核苷酸序列编码具有上述同源性的蛋白并且表现出与上述蛋白基本相同或相应的效果，则在序列的一部分中带有缺失、修饰、取代或添加的多核苷酸序列也可以属于本公开的范围。编码具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的多核苷酸可具有编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，多核苷酸可具有SEQ ID NO：48的多核苷酸序列，但不限于此。另外，编码本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸可具有编码在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸取代的多肽的多核苷酸序列，具体地，可以具有编码SEQID NO：10、11、12或13的多核苷酸序列。例如，多核苷酸可以具有SEQ ID NO：6、7、8或9的多核苷酸序列，但是不限于此。

另外，可以从已知基因序列制备探针，例如，可不受限制地包括在严格条件下与全部或部分多核苷酸序列互补的序列杂交以编码具有本公开的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的任何序列。“严格条件”意指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献中具体地描述(例如，J.Sambrook等人，下文)。严格条件可包括，例如，具有高同源性、80％或更高同源性、具体地90％或更高同源性、更具体地95％或更高同源性、非常具体地97％或更高同源性、仍然非常具体地99％或更高同源性的基因彼此杂交，而具有比上述同源性低的同源性的基因彼此不杂交的条件；或者Southern杂交的普通洗涤条件，即在对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS，具体地60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下，洗涤一次、具体地洗涤两次或三次。杂交需要两个多核苷酸包含互补序列，尽管根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段以及与其基本相似的核苷酸序列。具体地，可以使用包括在上述条件下T_m值为55℃的杂交步骤的杂交条件来检测具有同源性的多核苷酸。进一步，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的适当地控制。用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，以及本领域熟知的这些变量(参见Sambrook等人，上述，9.50-9.51,11.7-11.8)。

本公开的又一方面提供了包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物。具体地，本公开提供了产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的棒杆菌属的微生物，其包含修饰的高丝氨酸脱氢酶。另外，本公开提供了产生L-丙氨酸的棒杆菌属的微生物，其包含修饰的高丝氨酸脱氢酶。然而，本公开不限于此。

高丝氨酸脱氢酶和变体如上所述。

具体地，包含本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物是指天生具有产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力的微生物、或者将产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力赋予其缺乏产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力的亲本菌株的微生物。具体地，包含高丝氨酸脱氢酶的微生物可以是表达修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，第285位氨基酸被异亮氨酸取代；第398位氨基酸被谷氨酰胺取代；或者两个位置的氨基酸分别被异亮氨酸和谷氨酰胺取代，但微生物不限于此。微生物可以是细胞或微生物，其包含编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸，或者是能够通过转化到包含编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸的载体中来表达修饰的多肽。对于本公开的目的，宿主细胞或微生物可以是能够产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸(其包括修饰的多肽)的任何微生物。

与野生型或包括具有修饰的高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质的微生物相比，包含本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物具有提高的产生高丝氨酸、高丝氨酸衍生的L-氨基酸或L-丙氨酸的能力。因此，高丝氨酸、高丝氨酸衍生的L-氨基酸或L-丙氨酸可以以高产地从该微生物获得。

在本公开中，包括修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物的类型没有特别限制，但可以是肠杆菌属(Enterobacter sp.)、埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwiniasp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、或短杆菌属(Brevibacteriumsp.)。更具体地，微生物可以是棒杆菌属的微生物。

在本公开中，“棒杆菌属的微生物”可具体为谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热氨基棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。更具体地，在本公开中，棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌。

同时，包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物可以是向其中引入了包含编码高丝氨酸脱氢酶变体的多核苷酸的载体的微生物，但不限于此。

如本文所用，术语“载体”是指包括编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中靶蛋白可操作地连接到合适的控制序列，使得其能够在适当的宿主中表达。控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列、以及控制转录和翻译的终止的序列。在用合适的宿主细胞转化后，载体可与宿主基因组无关地复制或起作用，或者可以被整合到宿主基因组本身中。

只要其能够在宿主细胞中复制，本公开中使用的载体就没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体；pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型可用作质粒载体。具体地，可以使用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体，但载体不限于此。

可用于本公开的载体没有特别限制，可以使用任何已知的表达载体。另外，可以通过用于染色体插入的载体插入染色体中编码靶蛋白的多核苷酸。多核苷酸插入染色体中可以通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但是方法不限于此。可以另外包括选择标志物(selection marker)以确认将基因成功地插入到染色体中。选择标志物用于筛选用载体转化的细胞，换句话说，用于确定是否插入了靶多核苷酸分子。可以使用提供可选择的表型的标志物，如抗药性、辅源营养、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白的表达。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标志物的细胞可以存活，或者细胞显示不同的表型，因此可以通过该方法选择成功转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，以这样一种方式使由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，它可以整合到宿主细胞的染色体中或置于宿主细胞的染色体中，或者它可以在染色体外存在。进一步，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸可以被引入到宿主细胞中并在其中表达，其可以以任何形式引入。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入到宿主细胞中，表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒可包括与多核苷酸、转录终止子、核糖体结合位点或翻译终止子可操作地连接的启动子。表达盒可以是自我复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以原样引入到宿主细胞中并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。转化方法包括将多核苷酸引入到细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适的标准技术来进行。该方法的实例包括电穿孔、磷酸钙(Ca(H₂PO₄)₂、CaHPO₄或Ca₃(PO₄)₂)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、醋酸锂-DMSO技术等，但不限于此。

另外，术语“可操作的连接”意指多核苷酸序列在与启动子序列功能性地连接，所述启动子序列启动并介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸的转录。可操作的连接可以使用本领域已知的基因重组技术来制备，并且可以使用已知的裂解酶和连接酶制备位点特异性DNA切割和连接，但这些不限于此。

包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物可以是已经被转化以在棒杆菌属微生物中包括修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物。例如，棒杆菌属的微生物可包括对2-氨基-3-羟基-戊酸(AHV)具有抗性的菌株；通过用赖氨酸取代亮氨酸(天冬氨酸激酶(LysC)的第377位氨基酸)以消除LysC(其是苏氨酸生物合成途径中作用的第一个重要酶)的反馈抑制产生L-苏氨酸的菌株；通过用丙氨酸取代ilvA基因(其在产生L-苏氨酸的菌株中编码L-苏氨酸脱水酶(在异亮氨酸的生物合成途径中起作用的第一个酶))的第323位氨基酸产生L-异亮氨酸的菌株(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,p.4345-4351)；通过使O-乙酰高丝氨酸(硫醇)裂解酶(其参与O-乙酰高丝氨酸降解途径)和胱硫醚γ-合成酶失活产生O-乙酰高丝氨酸的菌株；或通过使甲硫氨酸和半胱氨酸的转录调节因子失活产生甲硫氨酸的菌株，但不限于此。

本公开的又一方面提供了用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法，其包括：在培养基中培养微生物；以及从微生物或培养基中回收高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸。

如上所述，微生物可以是棒杆菌属的微生物，其包括本公开的高丝氨酸脱氢酶变体，更具体地可以是谷氨酸棒杆菌。另外，棒杆菌属的微生物或谷氨酸棒杆菌可以是产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的微生物。高丝氨酸衍生的L-氨基酸不仅可以包括高丝氨酸衍生的L-氨基酸，还可以包括其衍生物。例如，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、O-磷酸-L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-甘氨酸、但不限于此。更具体地，高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸和/或L-甲硫氨酸，但是不限于此。另外，棒杆菌属的微生物或谷氨酸棒杆菌可以是产生L-丙氨酸的微生物。

高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸可以是由本公开中描述的微生物产生的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的培养基、该培养基的上清液、其加工产物或其纯化形式。对于本领域技术人员显然的是，高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸不仅包括其中性形式，还包括其盐。

本领域技术人员可以在本领域已知的优化的培养条件和酶活性条件下容易地确定产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法。

在上述方法中，微生物的培养可以以本领域已知的分批方法(batch process)、连续方法、补料分批方法(fed-batch process)等进行，但培养方法不特别限于此。特别地，关于培养条件，可以用合适的碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)将培养物的pH调节至合适的pH(例如，pH 5至pH 9，具体地，pH 6至pH 8，并且最具体地，并且可以通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物来维持培养物的需氧条件。培养温度一般可以在20℃至45℃的范围内，具体地在25℃至40℃的范围内，持续约10至160小时，但培养条件不限于此。通过上述培养产生的苏氨酸、异亮氨酸或乙酰高丝氨酸可以被分泌到培养物中或可以保留在细胞中。

另外，培养基中使用的碳源的实例可包括糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油)；脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)；醇(如甘油和乙醇)；和有机酸(例如乙酸)，但不限于此。这些碳源可以单独使用或组合使用，但不限于此。培养基中使用的氮源的实例可包括含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁(meat gravy)、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等。这些氮源可以单独使用或组合使用，但不限于此。在培养基中使用的磷源的实例可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等，但不限于此。另外，培养基中可以含有金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等，它们是必需的生长促进物质。

在本公开中，用于回收在培养步骤中产生的高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法可以通过使用本领域已知的适当方法从培养液(culture broth)中收集目标产物来进行。例如，可以使用诸如离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等方法，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养物或培养的微生物中回收所需物质(其是高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸)。进一步，回收可以包括另外的纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。可以插入另外的过程以在培养步骤或回收步骤之前/之后增加目标产物的回收。

本公开的又一个方面提供了用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物，其包括本公开的修饰的高丝氨酸脱氢酶或包含修饰的高丝氨酸脱氢酶的微生物。

产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物是指能够产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物，其中该组合物包括修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在SEQID NO：1的氨基酸序列中，第285位氨基酸被异亮氨酸取代，第398位氨基酸被谷氨酰胺取代，或者两个位置的氨基酸分别被异亮氨酸和谷氨酰胺取代；编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸；或包含多核苷酸的微生物。例如，多核苷酸可包括能够不受限制地操作多核苷酸的附加的构造(additional constitution)。例如，多核苷酸可以是包含在载体中的形式，使得可操作连接的基因可以在引入的宿主细胞中表达。

另外，该组合物可进一步包括通常用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物中的任何合适的赋形剂。赋形剂可以是例如防腐剂、保湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂等，但不限于此。

本公开的又一个方面提供了一种提高在微生物中产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力的方法，该方法包括在具有高亮氨酸脱氢酶活性的SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，用异亮氨酸取代第285位氨基酸；用谷氨酰胺取代第398位氨基酸；或分别用异亮氨酸和谷氨酰胺取代在两个位置的氨基酸。

术语“高丝氨酸脱氢酶”和“高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸”如上所述。

本公开的又一个方面提供了修饰的高丝氨酸脱氢酶用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

本公开的又一个方面提供了编码修饰的高丝氨酸脱氢酶的多核苷酸用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

本公开的又一个方面提供了棒杆菌属的微生物用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途，棒杆菌属的微生物包含修饰的高丝氨酸脱氢酶。

本公开的又一个方面提供了用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

[实施发明的方式]

在下文中，将结合示例性实施方式详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，不应被解释为限制本公开的范围。

实施例1：通过人工修饰筛选AHV抗性的微生物

在此实施例中，使用谷氨酸棒杆菌KFCC10881(韩国专利号0159812)作为亲本菌株，进行赋予对作为L-苏氨酸类似物的2-氨基-3-羟基戊酸(以下称为“AHV”)的抗性，以释放高丝氨酸脱氢酶(以下称为“Hom”，EC：1.1.1.3)的L-苏氨酸的反馈抑制的实验。

通过使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(下文称为“NTG”)的人工修饰方法诱导修饰。将已在种子培养基(seed medium)中培养18小时的KFCC10881菌株接种到4mL的种子培养基中，然后培养直至OD₆₆₀达到约1.0。离心培养基以回收细胞，然后用50mM Tris-苹果酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤细胞两次，并悬浮在最终4ml的相同缓冲液中。将(在0.05M Tris-苹果酸盐缓冲液(pH6.5)中为2mg/mL)NTG溶液加入到细胞悬浮液中，以使其终浓度为150mg/L，然后使其在室温下静置20分钟。此后，通过离心回收细胞，并用相同的缓冲液洗涤两次以除去NTG。将最终洗涤的细胞悬浮在4mL的20％甘油溶液中，然后在-70℃下储存直至使用。将NTG处理的菌株平皿接种(plated)在含有3g/L的AHV的基本培养基上，然后通过上述程序获得155种抗AHV抗性的KFCC10881菌株。

种子培养基 (pH 7.0)

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO₄ 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄7H₂O0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)

基本培养基(pH7.2)

葡萄糖5g、KH₂PO₄ 1g、(NH₄)₂SO₄ 5g、MgSO₄ 7H₂O 0.4g、NaCl 0.5g、生物素200μg、硫胺素HCl 100μg、泛酸钙100μg、烟酰胺0.03g、尿素2g、Na₂B₄O₇ 10H₂O 0.09mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₇4H₂O 0.04mg、ZnSO₄ 7H₂O 0.01mg、CuSO₄ 5H₂O、MnCl₂ 4H₂O 0.01mg、FeCl₃6H₂O 1mg、CaCl₂0.01mg(基于1L蒸馏水)

实施例2：用于AHV抗性的KFCC10881菌株的L-苏氨酸产生测试

对实施例1中获得的155种AHV抗性的菌株进行L-苏氨酸产生能力测试。将实施例1中获得的155种菌株接种到含有种子培养基(25ml)的角挡板烧瓶(corner-baffled flask)(250ml)中，然后在30℃下、以200rpm振荡培养20小时。将种子培养基(1mL)接种到含有以下L-苏氨酸产生培养基(24mL)的角挡板烧瓶(250mL)中，然后在30℃下、以200rpm振荡培养持续48小时。

L-苏氨酸产生培养基(pH 7.2)

葡萄糖30g、KH₂PO₄ 2g、尿素3g、(NH₄)₂SO₄40克、蛋白胨2.5克、CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO₄ 7H₂O 0.5g、亮氨酸400mg、CaCO₃ 20g(基于1L蒸馏水)

培养后，使用HPLC测量产生的各种氨基酸的量。表1中显示了22种菌株的培养基的氨基酸的浓度，所述22种菌株在155种测试菌株中显示出优异的L-苏氨酸生产能力。将通过上述程序确认的22种菌株的候选菌株命名为KFCC10881-1至KFCC10881-22。

[表1]

优异的AHV抗性的菌株的L-苏氨酸产生测试

如表1中所示，与对照组相比，22种类型的对AHV具有抗性的菌株产生的L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸和L-异亮氨酸的量增加，而L-赖氨酸的量减少。

L-苏氨酸和L-赖氨酸的生物合成途径以天冬氨酸半醛(下文称为“ASA”)为起点分离。也就是说，随着L-苏氨酸产生的量增加，L-赖氨酸产生的量减少。因此，高丝氨酸(HSE)、L-甘氨酸(Gly)和L-异亮氨酸(Ile)(它们可以是L-苏氨酸生物合成途径中的副产物)的量可以随着L-苏氨酸产生量的增加而增加，因此也确认了其产生(Thr+Hse+Gly+Ile)的总量。

因此，在上述AHV抗性的菌株中，选择L-赖氨酸产生量减少、L-苏氨酸产生量增加、和Thr+Hse+Gly+Ile总产生量增加的4种类型的菌株(KFCC10881-1、KFCC10881-14、KFCC10881-19和KFCC10881-22)作为最优异的AHV抗性的菌株。

实施例3：分析来源于KFCC10881的具有产生苏氨酸的优异能力的菌株的核苷酸序列

为了分析上述实施例1中选择的菌株的L-苏氨酸生物合成酶的核苷酸序列，进行以下实验。基于由《京都基因和基因组百科全书》(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)(KEGG)提供的基因信息，获得编码谷氨酸棒杆菌ATCC13032的高丝氨酸脱氢酶的hom(SEQ ID NO：1，NCgl1136)的核苷酸序列和编码高丝氨酸激酶的thrB(SEQ ID NO：2，基因编号NCgl1137)的核苷酸序列中的每一个。已知hom和thrB由操纵子结构组成(Peoples等人,Mol.Biol.2(1):63-72,1988)。

为了获得含有所选菌株的hom-thrB操纵子的DNA片段，使用菌株的基因组DNA作为模板以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组合进行PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：在96℃下变性30秒；在52℃下退火30秒；以及在72℃下聚合3分钟，并且重复总共30个循环。结果，可以扩增基因片段(2778bp；SEQ ID NO：5)，其包括含有SEQ ID NO：1的起始密码子上游的启动子位点的核苷酸序列(300bp)至SEQ ID NO：2的终止密码子下游的200bp。

使用上述制备的引物，通过ABI PRISM 3730XL分析仪(96毛细管型；AppliedBiosystems)测定核苷酸序列。在对应于KFCC10881-1中hom-thrB操纵子中的hom的核苷酸序列中，胞嘧啶(其是SEQ ID NO：1的第854位核苷酸)突变为硫胺素，因此编码苏氨酸残基的ACT密码子突变为编码异亮氨酸残基的ATT密码子(下文称为“T285I修饰”；SEQ ID NO：6)。另外，在对应于KFCC10881-14中的hom-thrB操纵子的核苷酸序列中，鸟嘌呤(其是SEQID NO：1的第1193位核苷酸)突变为腺嘌呤，因此编码精氨酸残基的CGA密码子突变为编码谷氨酰胺残基的CAA密码子(下文称为“R398Q修饰”；SEQ ID NO：7)。另外，在对应于KFCC10881-19中的hom-thrB操纵子的核苷酸序列中，鸟嘌呤(其是SEQ ID NO：1的第1132位核苷酸)突变为胞嘧啶，因此编码甘氨酸残基的GGG密码子突变为编码色氨酸残基的TGG密码子(下文称为“G378W修饰”；SEQ ID NO：8)。另外，在对应于KFCC10881-22中的hom-thrB操纵子的核苷酸序列中，鸟嘌呤(其为SEQ ID NO：1的第1132位核苷酸)突变为腺嘌呤，鸟嘌呤(其为第1134位核苷酸)突变为胞嘧啶，因此编码甘氨酸残基的GGG密码子突变为编码丝氨酸残基的AGC密码子(下文称为“G378S修饰”；SEQ ID NO：9)。同时，在对应于SEQ ID NO：2的thrB中未发现修饰。

鉴于上述核苷酸序列分析，因此可以确认，当在KFCC10881-1中表达的Hom(SEQ IDNO:10)中，苏氨酸(其是在第285位氨基酸残基)被突变为异亮氨酸(T285I修饰)；在KFCC10881-14中表达的Hom(SEQ ID NO：11)中，精氨酸(其是第398位氨基酸残基)突变为谷氨酰胺(R398Q修饰)；在KFCC10881-19中表达的Hom(SEQ ID NO：12)中，甘氨酸(其为第378位氨基酸残基)突变为色氨酸(G378W修饰)；和在KFCC10881-22中表达的Hom(SEQ ID NO：13)中，甘氨酸(其是第378位氨基酸残基)突变为丝氨酸(G378S修饰)时，L-苏氨酸的反馈抑制被脱敏。

实施例4：引入高丝氨酸脱氢酶的新菌株的制备

制备SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的引物以制备将实施例2中鉴定的变体(T285I、R398Q、G378W和G378S)引入到野生型菌株的菌株。

为了制备引入T285I、R398Q、G378W和G378S hom修饰中的一个的菌株，使用从KFCC10811-1、KFCC10811-14、KFCC10811-19和KFCC10811-22菌株中的每种提取的基因组DNA作为模板并使用SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的引物进行PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟，并且重复总共28个循环。结果，获得了包含hom基因(1338bp)的启动子位点(约300bp)的基因片段(1668bp)。使用PCR纯化试剂盒(QUIAGEN)纯化扩增的产物，然后将其用作插入DNA片段，用于载体的制备。同时，用限制酶smaI处理后，在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过上述PCR扩增的插入DNA片段的摩尔浓度(M)的比率被设定为1:2，然后根据其手册使用输注克隆试剂盒(Infusion Cloning Kit)(TaKaRa)克隆这些克隆。此后，制备用于在染色体上引入T285I、R398Q、G378W和G378S修饰的载体，即pDZ-T285I、pDZ-R398Q、pDZ-G378W和pDZ-G378S。

通过电穿孔用每种制备的载体转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032。在第二次交换后，获得了染色体上被每种修饰的核苷酸取代的菌株。通过使用下面列出的引物和使用MASA(突变等位基因特异性扩增(Mutant Allele Specific Amplification)PCR技术的组合(Takeda等人,Hum.Mutation,2,112-117(1993))，取代的适当性主要通过在对应于每种修饰序列(CTR-T285I：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；CTR-R398Q：SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：18；CTR-G378W：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：19；和CTR-G378S：SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：20)的引物组合中选择扩增菌株来确定。另外，通过使用SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：21并且通过以与实施例2相同的方式分析修饰的序列，进行所选菌株的hom序列的分析，以二次确认取代的适当性。用修饰的核苷酸中的每种取代的菌株分别被命名为CTR-T285I、CTR-R398Q、CTR-G378W和CTR-G378S。

实施例5：高丝氨酸脱氢酶活性的测量

在制备的菌株中测量酶Hom的活性。将对照组中的野生型菌株ATCC13032和实施例4中制备的CTR-T285I、CTR-R398Q、CTR-G378W和CTR-G378S接种到25mL的种子培养基中，然后培养直至达到对数期晚期(late log phase)。通过离心回收细胞，用0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.6)洗涤两次，最后悬浮于2mL的含有浓度为30％的甘油的相同缓冲液中。通过常规玻璃珠涡旋法(glass bead vortexing method)将细胞悬浮液物理破碎10分钟，然后通过两次离心(13,000rpm、4℃、30分钟)回收上清液并用作粗提取物，用于测量酶Hom的活性。为了测量Hom的活性，将辅酶溶液(0.1mL)加入到用于测量酶活性的反应溶液中(磷酸钾(pH7.0)缓冲液、25mM NADPH、5mM天冬氨酸半醛)，然后在30℃下反应。Hom活性U定义为根据L-苏氨酸(0mM、10mM)的存在每分钟消耗的NADPHμmol的数量，并且酶活性的结果显示在下表2中。

[表2]

Hom活性(U)与L-苏氨酸的脱敏作用的测量

作为实验的结果，确认与野生型Hom不同，在含有T285I、R398Q、G378W和G378S修饰中的每一种的Hom中，在含有10mM L-苏氨酸的条件下，活性的抑制降低，因此发生了对L-苏氨酸的脱敏。

实施例6：具有L-苏氨酸产生能力的棒杆菌属的微生物菌株的制备和评价

从野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中发展出(developed)产生L-苏氨酸的菌株。具体地，为了解决天冬氨酸激酶(LysC)(其是在苏氨酸生物合成途径中首先起作用的重要酶)的反馈抑制，用赖氨酸取代亮氨酸(其是位于LysC第377位氨基酸)(SEQ ID NO：22)。

更具体地，为了制备其中引入LysC(L377K)修饰的菌株，使用ATCC13032的染色体作为模板以及使用SEQ ID NO：23和24或SEQ ID NO：25和26的引物进行PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为PCR反应的聚合酶。PCR条件如下：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，并且重复总共28个循环。结果，以lysC基因的修饰位点为中心，各自获得5’上游区域的DNA片段(515bp)和3’下游区域的DNA片段(538bp)。使用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26的引物，用两个扩增的DNA片段作为模板进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共28个循环的PCR：在95℃下变性30秒；在55℃退火30秒；以及在72℃下聚合2分钟。此后，在72℃下进行聚合反应5分钟。结果，扩增了包含lysC基因修饰的DNA片段(1023bp)，其编码天冬氨酸激酶变体，其中第377位亮氨酸被赖氨酸取代。使用PCR纯化试剂盒(QUIAGEN)纯化扩增的产物，并将其用作插入DNA片段，用于载体的制备。同时，用限制酶SmaI处理后，在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过上述PCR扩增的插入DNA片段的摩尔浓度(M)的比率被设定为1:2，然后根据其手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆这些克隆。此后，制备用于在染色体上引入L377K修饰的载体pDZ-L377K。

通过电穿孔用制备的载体转化ATCC13032。在第二次交换后，获得其中核苷酸修饰中的每种被修饰的核苷酸取代的菌株，并将菌株命名为CJP1。

为了清楚地确认菌株的L-苏氨酸产生变化，将实施例4中鉴定的每种修饰引入到编码高丝氨酸脱氢酶的基因中。具体地，为了将T285I、R398Q、G378W和G378S修饰中的每种引入到CTR-L377K菌株，用通过电穿孔在实施例4中制备的pDZ-T285I、pDZ-R398Q、pDZ-G378W和pDZ-G378S载体中的每种转化CJP1，然后用与实施例4中相同的方式通过二次交换获得其中在染色体上每种核苷酸修饰被修饰的核苷酸取代的菌株。用修饰的核苷酸中的每种取代的菌株命名为CJP1-T285I、CJP1-R398Q、CJP1-G378W和CJP1-G378S。

菌株CJP1-T285I和CJP1-R398Q于2017年9月26日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)(其是布达佩斯条约下的国际保藏机构)，登录号分别为KCCM12119P和KCCM12120P。

[表3]

4种制备的菌株的L-苏氨酸-产生能力的确认

结果，与CJP1菌株相比，在其中引入每种修饰的菌株中，L-赖氨酸的产生量减少，而L-苏氨酸的产生量增加0.7g/L至0.9g/L。

同时，为了同时获得包括T285I和R398Q修饰的菌株，用pDZ-R398Q载体转化CJP1-T285I菌株，然后通过与上述相同的方法获得菌株(CJP1-T285I,R398Q)。另外，为了同时获得包括G378W和R398Q修饰的菌株，用pDZ-R398Q载体转化CJP1-G378W菌株，然后通过与上述相同的方法获得菌株(CJP1-G378W,R398Q)。另外，为了同时获得包括T285I和G378W修饰的菌株，用pDZ-G378W载体转化CJP1-T285I菌株，然后通过与上述相同的方法获得菌株(CJP1-T285I,G378W)。通过实施例2中描述的方法进行产生L-苏氨酸的能力的测试，其结果显示在下表4中。

[表4]

3种制备的菌株的L-苏氨酸-产生能力的确认

结果，与实施例中显示苏氨酸产生能力最高的CJP1-G378W菌株相比，当引入本公开的两种类型的修饰时，确认苏氨酸产生能力更高。与CJP1菌株(其是对照组)相比，其中引入两种修饰的菌株中，苏氨酸的产生量增加了1.1g/L至1.7g/L，因此确认了Hom的脱敏效果大大提高。

实施例7：产生L-异亮氨酸的棒杆菌属的微生物菌株的制备和评价

为了生产产生异亮氨酸的菌株，制备用于增强修饰的ilvA(V323A)基因的表达的载体(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,p.4345-4351)，ilvA基因在实施例6中制备的菌株中编码已知的L-苏氨酸脱水酶(异亮氨酸生物合成途径中的第一个酶)。

具体地，为了制备用于引入靶向ilvA基因的修饰的载体，以修饰位点为中心设计了用于扩增5’上游区域的一对引物(SEQ ID NO：27和28)和用于扩增3’下游区域的一对引物(SEQ ID NO：29和30)。将BamHI限制酶位点(下划线)插入SEQ ID NO：27和30的引物的每个末端，并设计SEQ ID NO：28和29的引物，使得核苷酸取代的修饰(下划线)位于要引发交换(cross-over)的区域。

[表5]

SEQ ID NO：	核苷酸序列
		27	AC<u>GGATCC</u>CAGACTCCAAAGCAAAAGCG
28	ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
		29	CTGGTTCTG<u>c</u>CGTGGTGTGCATCATCTCTG
30	AC<u>GGATCC</u>AACCAAACTTGCTCACACTC

使用SEQ ID NO：27、28、29和30的引物，以野生型染色体作为模板进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合30秒。此后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，以ilvA基因的修饰位点为中心，获得5’上游区域的DNA片段(627bp)和3’下游区域的DNA片段(608bp)。

使用SEQ ID NO：27和30的引物，用两个扩增的DNA片段作为模板进行PCR。在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在95℃下变性30秒；在55℃下退火30秒；以及在72℃下聚合60秒。此后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，扩增了DNA片段(1217bp)，其包括编码IlvA变体的ilvA基因的修饰，其中第323位的缬氨酸被丙氨酸取代。载体pECCG117(韩国专利号10-0057684)和DNA片段(1011bp)用限制酶BamHI处理，使用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒。将由此获得的质粒命名为pECCG117-ilvA(V323A)。

通过电穿孔将pECCG117-ilvA(V323A)载体引入到实施例6中制备的CJP1-T285I,R398Q、CJP1-G378W,R398Q和CJP1-T285I,G378W菌株中的每一个，并涂抹在含有卡那霉素(25mg/L)的选择性培养基上以获得转化菌株。通过与实施例2相同的烧瓶培养方法培养由此获得的转化菌株，并分析培养基中L-异亮氨酸的浓度。其结果如表6中所示。

[表6]

制备的菌株的评价

菌株	L-异亮氨酸(g/L)
		CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)	0.7
CJP1-G378W/pECCG117-ilvA(V323A)	0.9
		CJP1-T285I,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A)	1.1
CJP1-G378W,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A)	1.2
		CJP1-T285I,G378W/pECCG117-ilvA(V323A)	1.0

结果，确认在包括hom(G378W)修饰的菌株中，L-异亮氨酸的浓度相比于对照菌株提高了0.2g/L。另外，在同时引入两种修饰的包括hom修饰的菌株中，与对照菌株相比，产生L-异亮氨酸的能力进一步提高0.3g/L至0.5g/L。进一步，在制备的菌株中，在包含T285I和R398Q修饰的CJP1-T285I,R398Q/pECCG117-ilvA(V323A)菌株中产生1.1g/L的L-异亮氨酸。

实施例8：用修饰的Hom取代的O-乙酰-高丝氨酸(OAH)-产生菌株的制备和评价

8-1.用修饰的Hom取代的ATCC13032菌株的制备

以与实施例7中相同的方式将两种类型的修饰(T285I和R398Q)引入到ATCC13032菌株中，并将由此制备的菌株命名为ATCC13032::Hom^FBR。

8-2.metB基因的缺失

在该实施例中，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，通过PCR获得编码O-乙酰-高丝氨酸降解途径中的胱硫醚γ-合酶的metB基因。基于美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的GenBank(NIH GenBank)，获得了metB的核苷酸序列的信息(NCBI注册号Ncgl2360；SEQ ID NO：31)。另外，基于此，合成了含有metB基因的N-末端和连接体序列的引物(SEQ ID NO：32和33)和含有metB基因的C-末端和连接体序列的引物(SEQ ID NO：34和35)。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，使用SEQ IDNOS：32和33以及SEQ ID NOS：34和35的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物进行PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶。PCR条件如下：在96℃下变性30秒；在53℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，并且总共重复30个循环。结果，获得了含有metB基因的N-末端和连接体的扩增基因(500bp)和含有metB基因的C-末端和连接体的扩增基因(500bp)。

在以下条件下使用由此获得的两个扩增基因作为模板进行PCR，总共10个循环：在96℃下变性60秒；在50℃下退火60秒；以及在72℃下聚合1分钟。此后，向其中加入SEQ IDNO：32和35的核苷酸序列，然后重复总共20个循环。结果，获得了扩增的ΔmetB基因(1000bp)，其是含有metB基因的N-末端-连接体-C-末端的metB失活盒(inactivationcassette)。通过PCR获得的metB基因用包含在末端的限制酶XbaI和SalI处理，然后经由连接克隆到pDZ(KR 0924065)载体中，其中处理限制酶XbaI和SalI。此后，制备其中最终克隆了metB失活盒的重组pDZ-ΔmetB载体。

用由此制备的pDZ-ΔmetB载体转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032和ATCC13032::Hom^FBR。在二次交换后，获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032ΔmetB和ATCC13032::Hom^FBRΔmetB，其中metB基因在染色体上失活。通过使用SEQ ID NO：32和25的引物进行PCR，最终确认了失活的metB基因，然后将其与其中metB基因未失活的ATCC13032进行比较。

8-3.metY基因的缺失

在此实施例中，使用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，通过PCR获得编码O-乙酰-高丝氨酸降解途径中的O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶的metY基因。基于美国国立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)，获得了metY基因的核苷酸序列的信息(NCBI登记号Ncgl0625；SEQ ID NO：36)。另外，基于此，合成了含有metY基因的N-末端和连接体序列的引物(SEQ ID NO：37和38)和含有metY基因的C-末端和连接体序列的引物(SEQ ID NO：39和40)。

使用SEQ ID NO：39和40的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板进行PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶。PCR条件如下：在96℃下变性30秒；在53℃下退火30秒；以及在72℃下聚合1分钟，并且重复总共30个循环。结果，获得了含有metY基因的N末端和连接体的扩增基因(500bp)和含有metY基因的C末端和连接体的扩增基因(500bp)。在以下条件下使用由此获得的两个扩增基因作为模板进行PCR，总共10个循环：在96℃下变性60秒；在50℃下退火60秒；以及在72℃下聚合1分钟。此后，向其中加入SEQ ID NO：37和40的核苷酸序列，然后重复总共20个循环。结果，获得了扩增的ΔmetY基因(1000bp)，其是含有metY基因的N-末端-连接体-C-末端的metB失活盒。

通过PCR获得的metY基因用包含在末端的限制酶XbaI和SalI处理，然后经由连接克隆到pDZ(KR2008-0025355)载体中，其中处理限制酶XbaI和SalI。此后，制备其中最终克隆了metY失活盒的重组pDZ-ΔmetY载体。

用由此制备的pDZ-ΔmetY载体转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032、ATCC13032::Hom^FBR、ATCC13032ΔmetB和ATCC13032::Hom^FBRΔmetB菌株。在二次交换后，获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032ΔmetY、ATCC13032::Hom^FBRΔmetY、ATCC13032ΔmetBΔmetY和ATCC13032::Hom^FBRΔmetBΔmetY，其中metY基因在染色体上失活。通过使用SEQ ID NO：37和40的引物进行PCR，最后确认了失活的metY基因，然后将其与其中metY基因未失活的ATCC13032进行比较。

8-4.产生O-乙酰-高丝氨酸的菌株的制备和评价

在实施例8-1至8-3中制备的ATCC13032、ATCC13032ΔmetB、ATCC13032ΔmetY、ATCC13032ΔmetBΔmetY、ATCC13032::Hom^FBR、ATCC13032::Hom^FBRΔmetB、ATCC13032::Hom^FBRΔmetY和ATCC13032::Hom^FBRΔmetBΔmetY菌株的产生O-乙酰高丝氨酸的能力进行了比较，其中缺失metB、metY、metBY基因并且修饰的hom基因被取代。

具体地，将单菌落在32℃培养箱中于LB固体培养基中培养过夜，并将每个单菌落的一个菌环量接种在O-乙酰-高丝氨酸滴定培养基(25mL)上，然后将所得物在32℃下，以250rpm培养42至64小时。通过HPLC分析来自每种培养产物的O-乙酰-高丝氨酸，其结果显示在下表7中。

L-O-乙酰高丝氨酸产生培养基(pH 7.2)

葡萄糖30g、KH₂PO₄ 2g、尿素3g、(NH₄)₂SO₄ 40g、蛋白胨2.5g，CSL(Sigma)5g(10mL)、MgSO₄·7H₂O 0.5g、甲硫氨酸400mg、亮氨酸400mg、CaCO₃ 20g(基于1L蒸馏水)

[表7]

O-乙酰高丝氨酸产生的评价

结果，如上表7中所示，当培养谷氨酸棒杆菌ATCC13032(对照菌株)时，O-乙酰高丝氨酸没有积累；而在ATCC13032ΔmetB、ATCC13032ΔmetY和ATCC13032ΔmetBΔmetY菌株中分别积累0.3g/L、0.3g/L和0.5g/L的O-乙酰高丝氨酸中之一，其中metB、metY、和metBY基因被失活。

另外，在其中hom基因以突变体形式被取代的ATCC13032::Hom^FBR菌株的情况下，在ATCC13032::Hom^FBRΔmetB、ATCC13032::Hom^FBRΔmetY和ATCC13032::Hom^FBRΔmetBΔmetY菌株中metB、metY和metBY基因分别被灭活，确认这些菌株中的每个的O-乙酰高丝氨酸累积量为1.2g/L、1.4g/L和3.5g/L。

因此，根据上述结果，确认了通过使用本公开的修饰的hom，使用高丝氨酸作为前体的目标氨基酸的产生量可以大大增加。

实施例9：产生甲硫氨酸的菌株的制备和评价(Met)

实施例9-1：用于mcbR基因缺失的重组载体的制备

在此实施例中，为了制备产生甲硫氨酸的菌株，制备了用于mcbR基因失活的载体(J.Biotechnol.103:51-65,2003)，mcbR基因在实施例6中制备的菌株中编码已知的甲硫氨酸和半胱氨酸转录调节蛋白。

具体地，使用以下方法制备重组质粒载体，以敲除棒杆菌ATCC13032(Corynebacterium ATCC13032)染色体上的mcbR基因。基于在美国国立卫生研究院的Genbank(NIH GenBank)中报道的核苷酸序列，获得了谷氨酸棒杆菌的mcbR基因及其周围序列(SEQ ID NO：41)。

为了获得mcbR缺失的基因，用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：42和43以及SEQ ID NOS：44和45的引物，进行PCR。在95℃下变性5分钟，在下列条件下进行总共30个循环的PCR：在95℃下变性30秒；在53℃下退火30秒；在72℃下聚合30秒。结果，获得了DNA片段(700bp)。

用限制酶smaI处理pDZ载体(其不能在谷氨酸棒杆菌中克隆)(韩国专利号10-0924065)和扩增的mcbR基因片段，用于染色体引入。此后，使用DNA连接酶连接它们，然后用大肠杆菌(E.coli)DH5α转化，随后将其涂抹在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择用载体(其中通过PCR插入靶基因缺失的片段)转化的菌落，并使用质粒提取方法获得质粒。这样获得的质粒命名为pDZ-ΔmcbR。

实施例9-2：产生L-甲硫氨酸的棒杆菌属的微生物菌株的制备和评价

使用电穿孔用在实施例9中制备的pDZ-ΔmcbR载体转化已在实施例6中通过在染色体上同源重组制备的CJP1-G378W、CJP1-T285I,R398Q、CJP1-G378W,R398Q、CJP1-T285I,G378W和CJP1菌株中的每个(van der Rest等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.52:541-545,1999)。此后，在含有X-gal的固体培养基上进行二次重组。使用SEQ ID NO：46和47的引物，通过PCR方法用转化的谷氨酸棒杆菌菌株(其中已经完成了二次重组)确认了其中缺失mcbR基因的菌株。这些重组菌株被分别命名为谷氨酸棒杆菌CJP1-G378W/ΔmcbR、CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR、CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR、CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR和CJP1/ΔmcbR。

为了分析制备的CJP1-G378W/ΔmcbR、CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR、CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR和CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR菌株的L-甲硫氨酸产生能力，将这些菌株与它们的亲本菌株(谷氨酸棒杆菌CJP1/ΔmcbR)以下列方式一起培养。

将谷氨酸棒杆菌CJP1/ΔmcbR和本发明的菌株(谷氨酸棒杆菌CJP1-G378W/ΔmcbR、CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR、CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR和CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR)接种到含有下面的种子培养基(25mL)的角挡板烧瓶(250mL)中，然后在30℃下，以200rpm振荡培养20小时。此后，将种子培养基(1mL)接种到含有下面的产生培养基(24mL)的角形挡板烧瓶(250mL)中，然后在30℃下，以200rpm振荡培养48小时。种子培养基和产生培养基的组成如下。

<种子培养基(pH7.0)>

葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH₂PO 4g、K₂HPO₄ 8g、MgSO₄·7H₂O0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺2,000μg(基于1L蒸馏水)

<产生培养基(pH 8.0)>

葡萄糖50g、(NH₄)₂S₂O₃ 12g、酵母提取物5g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 1.2g、生物素100μg、硫胺素HCl 1,000μg、泛酸钙2,000μg、烟酰胺3000μg、CaCO₃ 30g(基于1L蒸馏水)

使用上述培养方法培养后，分析各培养基中L-甲硫氨酸的浓度，结果如表8中所示。

[表8]

制备的菌株的评价

菌株	L-甲硫氨酸(g/L)
		CJP1/ΔmcbR	0.01
CJP1-G378W/ΔmcbR	0.13
		CJP1-T285I,R398Q/ΔmcbR	0.18
CJP1-G378W,R398Q/ΔmcbR	0.20
		CJP1-T285I,G378W/ΔmcbR	0.17

结果，确认在包含G378W hom修饰的菌株中，与对照菌株相比，L-甲硫氨酸-产生能力提高了0.12g/L。另外，在其中同时引入两种修饰的包含hom修饰的菌株中，L-甲硫氨酸的产生能力相比于对照菌株提高了0.16g/L至0.19g/L。

基于上述结果，确认通过使用本公开的修饰的hom可以大大增加L-甲硫氨酸的产生量。

虽然已经参照特定说明性实施方式描述了本公开，但是本公开所属领域的技术人员将理解，在不脱离本公开的技术精神或基本特征的情况下，本公开可以以其它特定形式来实施。因此，上述实施方式被认为在所有方面都是说明性的，而不是限制性的。此外，本公开的范围由所附权利要求而不是详细说明来限定，并且应当理解，衍生自本公开的含义和范围的所有修改或变化及其等同物都包括在所附权利要求的范围中。

[登录号]

保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国际保藏单位)

保藏号：KCCM12119P

保藏日期：2017年9月26日

保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国际保藏单位)

保藏号：KCCM12120P

保藏日期：2017年9月26日

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 修饰的高丝氨酸脱氢酶及使用其产生高丝氨酸或衍生自高丝氨酸的L-氨基酸的方法

<130> OPA18570

<150> KR 10-2018-0060445

<151> 2018-05-28

<160> 50

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 高丝氨酸脱氢酶

<400> 1

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 2

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> thrB基因

<400> 2

atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca 60

aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120

gtggaaatta ttccatctgg cttggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggcgaagtc 180

cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240

gctgaagttc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300

ggctcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgctgcag ctaatggttt ggcggatttc 360

ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420

gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480

aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540

gcgctggttc ctaatttcca cgcatccacc gaagctgtgc gccgagtcct tcccactgaa 600

gtcactcaca tcgatgcgcg atttaacgtg tcccgcgttg cagtgatgat cgttgcgttg 660

cagcagcgtc ctgatttgct gtgggagggt actcgtgacc gtctgcacca gccttatcgt 720

gcagaagtgt tgcctattac ctctgagtgg gtaaaccgcc tgcgcaaccg tggctacgcg 780

gcataccttt ccggtgccgg cccaaccgcc atggtgctgt ccactgagcc aattccagac 840

aaggttttgg aagatgctcg tgagtctggc attaaggtgc ttgagcttga ggttgcggga 900

ccagtcaagg ttgaagttaa ccaaccttag 930

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

ctgcgacagc atggaact 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

caacgacaaa cgcccatc 18

<210> 5

<211> 2778

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 基因片段

<400> 5

ctgcgacagc atggaactca gtgcaatggc tgtaaggcct gcaccaacaa tgattgagcg 60

aagctccaaa atgtcctccc cgggttgata ttagatttca taaatatact aaaaatcttg 120

agagtttttc cgttgaaaac taaaaagctg ggaaggtgaa tcgaatttcg gggctttaaa 180

gcaaaaatga acagcttggt ctatagtggc taggtaccct ttttgttttg gacacatgta 240

gggtggccga aacaaagtaa taggacaaca acgctcgacc gcgattattt ttggagaatc 300

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 360

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 420

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 480

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 540

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 600

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 660

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 720

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 780

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 840

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 900

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 960

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 1020

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 1080

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 1140

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 1200

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 1260

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1320

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1380

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1440

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1500

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1560

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1620

cgcctcgaaa gggactaatt ttactgacat ggcaattgaa ctgaacgtcg gtcgtaaggt 1680

taccgtcacg gtacctggat cttctgcaaa cctcggacct ggctttgaca ctttaggttt 1740

ggcactgtcg gtatacgaca ctgtcgaagt ggaaattatt ccatctggct tggaagtgga 1800

agtttttggc gaaggccaag gcgaagtccc tcttgatggc tcccacctgg tggttaaagc 1860

tattcgtgct ggcctgaagg cagctgacgc tgaagttcct ggattgcgag tggtgtgcca 1920

caacaacatt ccgcagtctc gtggtcttgg ctcctctgct gcagcggcgg ttgctggtgt 1980

tgctgcagct aatggtttgg cggatttccc gctgactcaa gagcagattg ttcagttgtc 2040

ctctgccttt gaaggccacc cagataatgc tgcggcttct gtgctgggtg gagcagtggt 2100

gtcgtggaca aatctgtcta tcgacggcaa gagccagcca cagtatgctg ctgtaccact 2160

tgaggtgcag gacaatattc gtgcgactgc gctggttcct aatttccacg catccaccga 2220

agctgtgcgc cgagtccttc ccactgaagt cactcacatc gatgcgcgat ttaacgtgtc 2280

ccgcgttgca gtgatgatcg ttgcgttgca gcagcgtcct gatttgctgt gggagggtac 2340

tcgtgaccgt ctgcaccagc cttatcgtgc agaagtgttg cctattacct ctgagtgggt 2400

aaaccgcctg cgcaaccgtg gctacgcggc atacctttcc ggtgccggcc caaccgccat 2460

ggtgctgtcc actgagccaa ttccagacaa ggttttggaa gatgctcgtg agtctggcat 2520

taaggtgctt gagcttgagg ttgcgggacc agtcaaggtt gaagttaacc aaccttaggc 2580

ccaacaagga aggccccctt cgaatcaaga agggggcctt attagtgcag caattattcg 2640

ctgaacacgt gaaccttaca ggtgcccggc gcgttgagtg gtttgagttc cagctggatg 2700

cggttgtttt caccgaggct ttcttggatg aatccggcgt ggatggcgca gacgaaggct 2760

gatgggcgtt tgtcgttg 2778

<210> 6

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T285I

<400> 6

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgattctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 7

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R398Q

<400> 7

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccaacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 8

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G378W

<400> 8

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gtgggttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 9

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G378S

<400> 9

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gagcgttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 10

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom (KFCC10881-1)

<400> 10

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Ile Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 11

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom (KFCC10881-14)

<400> 11

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Gln Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 12

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom (KFCC10881-19)

<400> 12

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Trp Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 13

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hom (KFCC10881-22)

<400> 13

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Ser Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

tcgagctcgg tacccctgcg acagcatgga actc 34

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctctagagga tccccttagt ccctttcgag gcgg 34

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

caccggcgct gactatgc 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

aatcgggtgc acgcgagc 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

ttggattgta cgcaggga 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

ccacacgcga tcttccac 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

gctcacgcga tcttccac 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ttagtccctt tcgaggcg 18

<210> 22

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> lysC(L377K)

<400> 22

Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca 30

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

acggatccca gactccaaag caaaagcg 28

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg 30

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28

<210> 31

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> metB基因

<400> 31

ttgtcttttg acccaaacac ccagggtttc tccactgcat cgattcacgc tgggtatgag 60

ccagacgact actacggttc gattaacacc ccaatctatg cctccaccac cttcgcgcag 120

aacgctccaa acgaactgcg caaaggctac gagtacaccc gtgtgggcaa ccccaccatc 180

gtggcattag agcagaccgt cgcagcactc gaaggcgcaa agtatggccg cgcattctcc 240

tccggcatgg ctgcaaccga catcctgttc cgcatcatcc tcaagccggg cgatcacatc 300

gtcctcggca acgatgctta cggcggaacc taccgcctga tcgacaccgt attcaccgca 360

tggggcgtcg aatacaccgt tgttgatacc tccgtcgtgg aagaggtcaa ggcagcgatc 420

aaggacaaca ccaagctgat ctgggtggaa accccaacca acccagcact tggcatcacc 480

gacatcgaag cagtagcaaa gctcaccgaa ggcaccaacg ccaagctggt tgttgacaac 540

accttcgcat ccccatacct gcagcagcca ctaaaactcg gcgcacacgc agtcctgcac 600

tccaccacca agtacatcgg aggacactcc gacgttgttg gcggccttgt ggttaccaac 660

gaccaggaaa tggacgaaga actgctgttc atgcagggcg gcatcggacc gatcccatca 720

gttttcgatg catacctgac cgcccgtggc ctcaagaccc ttgcagtgcg catggatcgc 780

cactgcgaca acgcagaaaa gatcgcggaa ttcctggact cccgcccaga ggtctccacc 840

gtgctctacc caggtctgaa gaaccaccca ggccacgaag tcgcagcgaa gcagatgaag 900

cgcttcggcg gcatgatctc cgtccgtttc gcaggcggcg aagaagcagc taagaagttc 960

tgtacctcca ccaaactgat ctgtctggcc gagtccctcg gtggcgtgga atccctcctg 1020

gagcacccag caaccatgac ccaccagtca gctgccggct ctcagctcga ggttccccgc 1080

gacctcgtgc gcatctccat tggtattgaa gacattgaag acctgctcgc agatgtcgag 1140

caggccctca ataaccttta g 1161

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

tctagacgcc cgcatactgg cttc 24

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

cccatccact aaacttaaac agatgtgatc gcccggc 37

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tgtttaagtt tagtggatgg ggaagaacca cccaggcc 38

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gtcgaccaat cgtccagagg gcg 23

<210> 36

<211> 1314

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> metY基因

<400> 36

atgccaaagt acgacaattc caatgctgac cagtggggct ttgaaacccg ctccattcac 60

gcaggccagt cagtagacgc acagaccagc gcacgaaacc ttccgatcta ccaatccacc 120

gctttcgtgt tcgactccgc tgagcacgcc aagcagcgtt tcgcacttga ggatctaggc 180

cctgtttact cccgcctcac caacccaacc gttgaggctt tggaaaaccg catcgcttcc 240

ctcgaaggtg gcgtccacgc tgtagcgttc tcctccggac aggccgcaac caccaacgcc 300

attttgaacc tggcaggagc gggcgaccac atcgtcacct ccccacgcct ctacggtggc 360

accgagactc tattccttat cactcttaac cgcctgggta tcgatgtttc cttcgtggaa 420

aaccccgacg accctgagtc ctggcaggca gccgttcagc caaacaccaa agcattcttc 480

ggcgagactt tcgccaaccc acaggcagac gtcctggata ttcctgcggt ggctgaagtt 540

gcgcaccgca acagcgttcc actgatcatc gacaacacca tcgctaccgc agcgctcgtg 600

cgcccgctcg agctcggcgc agacgttgtc gtcgcttccc tcaccaagtt ctacaccggc 660

aacggctccg gactgggcgg cgtgcttatc gacggcggaa agttcgattg gactgtcgaa 720

aaggatggaa agccagtatt cccctacttc gtcactccag atgctgctta ccacggattg 780

aagtacgcag accttggtgc accagccttc ggcctcaagg ttcgcgttgg ccttctacgc 840

gacaccggct ccaccctctc cgcattcaac gcatgggctg cagtccaggg catcgacacc 900

ctttccctgc gcctggagcg ccacaacgaa aacgccatca aggttgcaga attcctcaac 960

aaccacgaga aggtggaaaa ggttaacttc gcaggcctga aggattcccc ttggtacgca 1020

accaaggaaa agcttggcct gaagtacacc ggctccgttc tcaccttcga gatcaagggc 1080

ggcaaggatg aggcttgggc atttatcgac gccctgaagc tacactccaa ccttgcaaac 1140

atcggcgatg ttcgctccct cgttgttcac ccagcaacca ccacccattc acagtccgac 1200

gaagctggcc tggcacgcgc gggcgttacc cagtccaccg tccgcctgtc cgttggcatc 1260

gagaccattg atgatatcat cgctgacctc gaaggcggct ttgctgcaat ctag 1314

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

tctagaccat cctgcaccat ttag 24

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

cccatccact aaacttaaac acgctcctgc caggttc 37

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

tgtttaagtt tagtggatgg gcttggtacg caaccaagg 39

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gtcgacgatt gctccggctt cgg 23

<210> 41

<211> 2213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mcbR基因

<400> 41

aatctggatt tccgccaggt tttggcacgc ccgtctggtt taggcaatga gataccgaac 60

acacgtgcca aaagttcggc tttttcgccg atcttgtcac gcctgcctgg tttgtcttgt 120

aaagagtgat ttcatggccg agactcctaa aagtttgacc tcacaggatt gcttctaagg 180

gcctctccaa tctccactga ggtacttaat ccttccgggg aattcgggcg cttaaatcga 240

gaaattaggc catcaccttt taataacaat acaatgaata attggaatag gtcgacacct 300

ttggagcgga gccggttaaa attggcagca ttcaccgaaa gaaaaggaga accacatgct 360

tgccctaggt tggattacat ggatcattat tggtggtcta gctggttgga ttgcctccaa 420

gattaaaggc actgatgctc agcaaggaat tttgctgaac atagtcgtcg gtattatcgg 480

tggtttgtta ggcggctggc tgcttggaat cttcggagtg gatgttgccg gtggcggctt 540

gatcttcagc ttcatcacat gtctgattgg tgctgtcatt ttgctgacga tcgtgcagtt 600

cttcactcgg aagaagtaat ctgctttaaa tccgtagggc ctgttgatat ttcgatatca 660

acaggccttt tggtcatttt ggggtggaaa aagcgctaga cttgcctgtg gattaaaact 720

atacgaaccg gtttgtctat attggtgtta gacagttcgt cgtatcttga aacagaccaa 780

cccgaaagga cgtggccgaa cgtggctgct agcgcttcag gcaagagtaa aacaagtgcc 840

ggggcaaacc gtcgtcgcaa tcgaccaagc ccccgacagc gtctcctcga tagcgcaacc 900

aaccttttca ccacagaagg tattcgcgtc atcggtattg atcgtatcct ccgtgaagct 960

gacgtggcga aggcgagcct ctattccctt ttcggatcga aggacgcctt ggttattgca 1020

tacctggaga acctcgatca gctgtggcgt gaagcgtggc gtgagcgcac cgtcggtatg 1080

aaggatccgg aagataaaat catcgcgttc tttgatcagt gcattgagga agaaccagaa 1140

aaagatttcc gcggctcgca ctttcagaat gcggctagtg agtaccctcg ccccgaaact 1200

gatagcgaaa agggcattgt tgcagcagtg ttagagcacc gcgagtggtg tcataagact 1260

ctgactgatt tgctcactga gaagaacggc tacccaggca ccacccaggc gaatcagctg 1320

ttggtgttcc ttgatggtgg acttgctgga tctcgattgg tccacaacat cagtcctctt 1380

gagacggctc gcgatttggc tcggcagttg ttgtcggctc cacctgcgga ctactcaatt 1440

tagtttcttc attttccgaa ggggtatctt cgttggggga ggcgtcgata agccccttct 1500

ttttagcttt aacctcagcg cgacgctgct ttaagcgctg catggcggcg cggttcattt 1560

cacgttgcgt ttcgcgcctc ttgttcgcga tttctttgcg ggcctgtttt gcttcgttga 1620

tttcggcagt acgggttttg gtgagttcca cgtttgttgc gtgaagcgtt gaggcgttcc 1680

atggggtgag aatcatcagg gcgcggtttt tgcgtcgtgt ccacaggaag atgcgctttt 1740

ctttttgttt tgcgcggtag atgtcgcgct gctctaggtg gtgcactttg aaatcgtcgg 1800

taagtgggta tttgcgttcc aaaatgacca tcatgatgat tgtttggagg agcgtccaca 1860

ggttgttgct gacccaatag agtgcgattg ctgtggggaa tggtcctgtg aggccaaggg 1920

acagtgggaa gatcggcgcg aggatcgaca tcacgatcat gaacttcagc atgccgttag 1980

agaatccgga tgcgtaatcg ttggtttgga agctgcggta catggacatc gccatgttga 2040

ttgcggtgag gattgcggct gtgatgaaca gtggcaaaac gaaactaaga acttccgcct 2100

gcgtggtgct caaatatttt agctgctcag tgggcatcga aacataagcg ggcagaggca 2160

cattgctcac gcgaccagcg aggaaagatt ccacttcctc aggagttagg aag 2213

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

ggcccgggcc tgcctggttt gtcttgta 28

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg 35

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

atcccggggt ttcgatgccc actgagca 28

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

aatctggatt tccgccaggt 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

cttcctaact cctgaggaag 20

<210> 48

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 野生型hom基因

<400> 48

atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 60

attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120

ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180

gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240

ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300

cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360

cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420

tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480

gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540

gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600

ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660

gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720

ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780

aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840

cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900

aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960

ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020

gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080

ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140

gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200

gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260

tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320

cgcctcgaaa gggactaa 1338

<210> 49

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ATCC14067 hom (NCgl1136)

<400> 49

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 50

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ATCC13869 hom

<400> 50

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

PCT/RO/134表

Claims

1.修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，第285位氨基酸被异亮氨酸取代；第398位氨基酸被谷氨酰胺取代；或两个位置的所述氨基酸分别被异亮氨酸和谷氨酰胺取代。

2.根据权利要求1所述的修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在SEQ ID NO：1的所述氨基酸序列中，第378位氨基酸进一步被色氨酸取代。

3.多核苷酸，其编码选自权利要求1和2中任一项所述的修饰的高丝氨酸脱氢酶。

4.棒杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物，其包含所述修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，第285位氨基酸被异亮氨酸取代；第398位氨基酸被谷氨酰胺取代；或两个位置的所述氨基酸分别被异亮氨酸和谷氨酰胺取代。

5.根据权利要求4所述的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的棒杆菌属的微生物。

6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述高丝氨酸衍生的L-氨基酸是选自由L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰高丝氨酸和L-甲硫氨酸组成的组中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物产生L-丙氨酸。

8.根据权利要求4所述的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

9.用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的方法，其包括：

在培养基中培养棒杆菌属的微生物，其包含修饰的高丝氨酸脱氢酶，其中在SEQ IDNO：1的氨基酸序列中，第285位氨基酸被异亮氨酸取代；第398位氨基酸被谷氨酰胺取代；或者两个位置的所述氨基酸分别被异亮氨酸和谷氨酰胺取代；以及

从所述微生物或培养基中回收高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述高丝氨酸衍生的L-氨基酸是选自由L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰高丝氨酸和L-甲硫氨酸组成的组中的至少一种。

11.用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的组合物，其包含权利要求1所述的修饰的高丝氨酸脱氢酶或权利要求4所述的微生物。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述高丝氨酸衍生的L-氨基酸是选自由L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸和L-甲硫氨酸组成的组中的至少一种。

13.用于提高在棒杆菌属的微生物中产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的能力的方法，其包括在具有高亮氨酸脱氢酶活性的SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，用异亮氨酸取代第285位氨基酸；用谷氨酰胺取代第398位氨基酸；或分别用异亮氨酸和谷氨酰胺取代在两个位置的所述氨基酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述高丝氨酸衍生的L-氨基酸是选自由L-苏氨酸、L-异亮氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸和L-甲硫氨酸组成的组中的至少一种。

15.权利要求1所述的修饰的高丝氨酸脱氢酶用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

16.权利要求3所述的多核苷酸用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。

17.权利要求4所述的棒杆菌属的微生物用于产生高丝氨酸或高丝氨酸衍生的L-氨基酸的用途。