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CN110945017B - 双功能化合物 - Google Patents

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CN110945017B CN201880048047.1A CN201880048047A CN110945017B CN 110945017 B CN110945017 B CN 110945017B CN 201880048047 A CN201880048047 A CN 201880048047A CN 110945017 B CN110945017 B CN 110945017B
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Abstract

本申请公开了可用于治疗糖尿病、体重减轻和/或降低心血管风险的化合物。该化合物是双功能的，因此适合作为可从使用GLP‑1受体激动剂和PCSK9抑制剂的治疗中受益的患者的简单治疗。

Description

双功能化合物
技术领域
本发明涉及抑制PCSK9并刺激GLP-1受体的双功能化合物及其药物用途。
背景
高LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)水平和血脂异常是公认的心血管疾病的驱动因素。
他汀类药物已被批准用于治疗血脂异常25年。已经证实这类药物能大幅度地且持续地减少心血管事件，具有可接受的安全性特征。最畅销的他汀类药物，即阿托伐他汀(LipitorTM)，一直是世界上最畅销的药物，其从1996年至2012年的销售额超过1250亿美元。
尽管他汀类药物和其它降脂药物可以获得并广泛应用，但许多患者并未达到他们的目标LDL-C水平并且仍处于患心血管疾病的高风险中。PCSK9(9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin)促进肝LDL-R(LDL受体)降解，由此降低肝LDL-R表面表达并因此降低LDL颗粒的清除率。相反，阻断PCSK9增加了LDL-C以及其它致动脉粥样硬化脂蛋白的清除率。事实上，LDL受体有助于清除LDL之外的致动脉粥样硬化脂蛋白，如中密度脂蛋白和残余颗粒。增加的中密度脂蛋白和残余颗粒清除率可能具有超出由LDL降低所提供的治疗益处。
经由SREBP2转录因子，他汀类药物增加LDL-R和PCSK9两者的表达。增加的PCSK9表达可减少他汀类药物对从循环中清除LDL-C的作用。通过抑制PCSK9与LDL-R的结合从而防止LDL-R降解，他汀类药物的功效得到增强。综上所述，PCSK9抑制为脂质管理提供了一种新方法。
LDL-R(LDL-R-(293-332))的EGF(A)(表皮生长因子样结构域A)序列(40个氨基酸)被公认为PCSK9结合的位点。已经显示分离的野生型EGF(A)肽以低μM范围的IC50抑制PCSK9与LDL-R的结合(Biochemical and Biophysical Research Communications 375(2008)69-73)。这种较差的效力将阻碍EGF(A)肽的实际药物用途。此外，预期这类肽的半衰期太短而无法在治疗上使用。
WO2012177741和J.Mol.Biol.(2012)422,685-696公开了EGF(A)的类似物及其Fc融合体。
最近，阿利库单抗(alirocumab)和依伏库单抗(evolocumab)这两种抗PCSK9抗体已被批准用于高LDL-C水平的治疗。这些抗体通过每两周皮下注射1ml来施用。
在WO 2015/127273中，探索了抗PCSK9抗体和GLP-1激动剂的融合，以寻求将GLP-1和抗PCSK9抗体的功能组合在一起。
有多种治疗方法可用于治疗糖尿病和心血管疾病，但是多种单独药物的组合并不总是具有吸引力的，解决两种疾病状态的单一分子对于改善治疗如疗效、依从性和便利性将是理想的。
发明内容
本发明涉及具有抑制PCSK9与LDL-R结合从而降低LDL胆固醇的能力的EGF(A)类似物。此类分子可与GLP-1受体激动剂组合形成双功能分子，从而提供进一步的治疗选择，以便用一种药物解决糖尿病和心血管疾病两者。在一方面，本发明涉及包含GLP-1激动剂和PCSK9抑制剂的化合物。
本发明的一个方面涉及包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物，其中
i.所述GLP-1类似物是由SEQ ID No:137所确定的GLP-1(7-37)的类似物，并且
ii.所述EGF(A)类似物是由SEQ ID No:1所确定的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域的类似物。
在一个实施方案中，此类化合物可包含融合多肽，该融合多肽包含任选地通过在两个类似物之间插入的间隔肽连接的两个类似物。
所述化合物可进一步包含半衰期延长部分，该半衰期延长部分可被称为与所述GLP-1类似物、EGF(A)类似物或间隔体之一的氨基酸残基连接的取代基。在一个实施方案中，所述化合物包含一个或两个连接至融合多肽的不同氨基酸残基上的取代基。
在进一步的方面，本发明涉及包含本发明化合物的药物组合物，以及本发明化合物的医药用途。
详述
本发明涉及刺激GLP-1受体并抑制PCSK9的双功能化合物。为了制备具有药学意义的化合物，需要对野生型肽进行修饰，以便既能改善功能性又能够方便地施用。
本发明的一个方面涉及包含GLP-1受体激动剂和PCSK9抑制剂的化合物。有几种GLP-1受体激动剂是本领域已知的，并且可以与各种PCSK9抑制剂组合。如本文所述，该GLP-1受体激动剂可以是人GLP-1(7-37)(SEQ ID No:137)的类似物，或诸如也已知充当GLP-1受体激动剂的艾塞那肽(Extendin 4)及其类似物。
抗体形式的PCSK9抑制剂是已知的，而本申请主要涉及LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域(SEQ ID NO:1)的类似物形式的PCSK9抑制剂。
本发明的一个方面涉及包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物，其中所述GLP-1类似物是GLP-1(7-37)(SEQ ID No:137)的类似物，并且所述EGF(A)类似物是LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域(SEQ ID NO:1)的类似物。
术语“化合物”在本文中用来指分子实体，因此“化合物”除了具有针对每种化合物或化合物组定义的最小元件外，还可以具有不同的结构元件。因此，化合物可以是多肽或其衍生物，只要该化合物包含所定义的结构和/或功能元件即可。
术语“化合物”还旨在涵盖其药学上相关的形式，即本发明涉及本文定义的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
例如在本发明的背景下使用的术语“肽”或“多肽”是指包含通过酰胺(或肽)键相互连接的一系列氨基酸的化合物。在特定的实施方案中，该肽由通过肽键相互连接的氨基酸组成。
术语“融合”和“融合的”用于包含两个单独定义的肽序列的多肽，这两个肽序列通过肽键或通过肽间隔体连接(也通过肽键连接)。因此，融合多肽是通过肽键连接的一段连续的氨基酸残基。
术语“类似物”通常是指这样的肽，其序列与参考氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸改变。当与它们的参考序列相比时，“包含”某些指定改变的类似物可以包含进一步的改变。在特定的实施方案中，类似物“具有”或“包含”指定的改变。在其它特定的实施方案中，类似物由这类改变“组成”。当对于类似物使用术语“由...组成”或“组成”时，例如类似物由一组指定的氨基酸置换组成，或由一组指定的氨基酸置换组成的类似物，应当理解，该指定的氨基酸置换是该肽类似物中仅有的氨基酸置换。相反，“包含”一组指定的氨基酸置换的类似物可具有另外的置换。“类似物”还可包括N-末端和/或C-末端位置的氨基酸延长和/或N-末端和/或C-末端位置的截短。
通常，氨基酸残基可用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效。
氨基酸是含有氨基和羧酸基团并任选地含有一个或多个常常被称为侧链的额外基团的分子。
术语“氨基酸”包括蛋白型(proteinogenic)(或天然)氨基酸(20种标准氨基酸中的)，以及非蛋白型(或非天然)氨基酸。蛋白型氨基酸是天然地并入蛋白质中的那些氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸。非蛋白型氨基酸或者未见于蛋白质中，或者不通过标准细胞机器产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。非蛋白型氨基酸的非限制性实例是Aib(α-氨基异丁酸或2-氨基异丁酸)、正亮氨酸、正缬氨酸以及蛋白型氨基酸的D-异构体。
在下文中，未说明其光学异构体的本发明肽的每个氨基酸应当被理解为是指L-异构体(除非另有说明)。
GLP-1类似物
本发明涉及包含胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物的化合物。如本文所用的术语“GLP-1类似物”是指人胰高血糖素样肽-1(GLP-1(7-37))的类似物(或变体)，人胰高血糖素样肽-1的序列作为SEQ ID NO:137包含在序列表中。具有SEQ ID NO:137序列的肽还可被称为“天然”或野生型GLP-1。
本发明GLP-1类似物中氨基酸残基的编号(如“位置8”)遵循本领域中对天然GLP-1已确立的实践，即，第一个(N-末端)氨基酸残基被编号为或对应于位置编号7，而朝向C-末端的下游的后续氨基酸残基被编号为8、9、10等，直到最后一个(C-末端)氨基酸残基。在天然GLP-1中，C-末端氨基酸残基为Gly，编号为37。
编号在序列表中不同，其中SEQ ID NO:137的第一个氨基酸残基(His)被指定为第1号，而最后一个(Gly)被指定为第31号。然而，如上所述，在此我们遵循本领域中已确立的编号实践。
GLP-1类似物是本领域已知的，并且有几种GLP-1类似物已经上市以用于治疗2型糖尿病和肥胖症。如上所述，GLP-1类似物是野生型人GLP-1序列的变体，因此与SEQ IDNO.137相比包含一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加。
每种GLP-1类似物可参照以下两方面来描述：i)天然GLP-1(7-37)中与改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即天然GLP-1中的相应位置)，和ii)实际改变。
换言之，本发明的GLP-1类似物可以参照天然GLP-1(7-37)肽来描述，即描述为与天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:137)相比许多氨基酸残基已被改变的其变体。
这些改变可独立地表示一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。
以下是适当的类似物命名法的非限制性实例。作为GLP-1类似物#2(SEQ ID NO:139)并入并包含在化合物#1中的GLP-1类似物可被称为(8Aib,34R)GLP-1(7-37)。
当该类似物与天然GLP-1比对时，该类似物中根据该比对对应于天然GLP-1位置8的位置处的氨基酸为Aib，并且该类似物中对应于天然GLP-1位置34的位置处的氨基酸为R，而该类似物中的所有其它氨基酸与天然GLP-1中的相应氨基酸均相同。
与野生型GLP-1(SEQ ID NO:137)相比，“包含”某些指定改变的类似物可包含进一步的改变。相反，术语“组成”用来指特定的实施方案，其中类似物仅具有指定的改变，即，与野生型GLP-1(SEQ ID NO:137)相比，该GLP-1类似物没有进一步的改变。通过参考上面的例子，可以说GLP-1类似物#2(SEQ ID NO:139)是GLP-1类似物，其中置换由8Aib和34R组成，或者简称为由8Aib和34R组成的GLP-1类似物。
本文使用表述“等同于...的位置”或“相应位置”来参照参考序列如天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:137)表征变异GLP-1(7-37)序列中的变化位点。等同或相应位置，以及改变的编号，例如通过简单的书写和目视检查来容易地推断；以及/或者可使用标准蛋白质或肽比对程序，如基于Needleman-Wunsch算法的“align”。该算法在Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48:443-453中描述，而align程序由Myers和W.Miller在"Optimal Alignments in Linear Space"CABIOS(computer applicationsin the biosciences)(1988)4:11-17中描述。为了比对，可以使用默认的打分矩阵BLOSUM62和默认的单位矩阵(identity matrix)，并可将空位中的第一残基的罚分设置为-12，或优选-10，而将空位中的其它残基的罚分设置为-2，或优选-0.5。
下面插入了SEQ ID NO:137的天然GLP-1及其由SEQ ID NO:139所确定的类似物的这类比对的一个例子：
#＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
#
#比对的序列：2
#1：SEQ_ID_NO_137
#2：SEQ_ID_NO_139
#矩阵：EBLOSUM62
#空位罚分：10.0
#延伸罚分：0.5
#
#长度：31
#同一性：29/31(93.5％)
#相似性：30/31(96.8％)
#空位：0/31(0.0％)
#得分：154.0
#
#
#＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
当在该比对中所示的位置编号(例如，SEQ ID NO 137中的“1”和“31”)上加6时，得到本文所用的位置编号。例如，在野生型GLP-1(与SEQ ID NO:137相同)中，N-末端氨基酸(H)的位置编号为7，而C-末端氨基酸(G)的编号为37。关于GLP-1类似物#2(SEQ ID NO139)，N-末端氨基酸(H)的编号为7，而C-末端氨基酸(G)的编号像野生型GLP-1一样为37，同时残基2和28被置换并分别编号为8和34。
如果在序列中包含没有单字母代码的特定氨基酸残基等(如2-氨基-2-甲基丙酸(Aib))，出于比对的目的，可将它们替换为例如X。如需要，以后可以手动改正X。
下面是由上述比对可以推出的非限制性实例：
作为一个实例，可以推断出与序列1相比，序列2具有2个氨基酸改变(即，在比对中示出句号(“.”)、冒号(“:”)或水平连字符(“-”)的所有那些位置处)。
在下文中，没有说明光学异构体的本发明GLP-1类似物的所有氨基酸都应被理解为是指L-异构体(除非另外说明)。
在一个实施方案中，本发明的GLP-1类似物是由26至36个氨基酸残基组成的GLP-1(7-37)的类似物。
在一个实施方案中，与人GLP-1(7-37)相比，GLP-1类似物具有至多10个氨基酸置换。在进一步的实施方案中，与人GLP-1(7-37)相比，GLP-1类似物具有至多8个，如至多7、6、5、4、3或2个氨基酸置换。
以前已经描述了许多GLP-1类似物及其作为GLP-1受体激动剂的功能。
SEQ ID NO:137的野生型GLP-1肽在位置26和34处包含两个Lys残基。如下文所见，当欲制备包含经由Lys残基连接的取代基的化合物时，Lys残基是特别有意义的。
在一个实施方案中，根据本发明的GLP-1类似物包含零个、一个或两个Lys残基。在一个实施方案中，该GLP-1类似物包含一个或两个Lys残基，其选自野生型Lys残基和通过氨基酸置换引入该GLP-1类似物中的Lys残基。通过氨基酸置换引入的Lys残基可以被称为另外的Lys残基。在一个实施方案中，该GLP-1类似物包含另外的Lys残基。另外的Lys可以在GLP-1类似物的各个位置引入，例如在选自位置12、21、23、24、25、27、30、31、32、33和36K的一个或多个位置引入。在一个实施方案中，该GLP-1类似物包含选自下组的另外的Lys：12K、21K、23K、24K、25K、27K、30K、31K、32K、33K和36K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或两个选自下组的Lys残基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K和36K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或两个选自下组的Lys残基：21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K和34K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好两个选自下组的Lys残基：12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K和36K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好两个选自下组的Lys残基：21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K和34K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好两个选自以下对的Lys残基：
a)21K和26K
b)23K和26K
c)24K和26K
d)25K和26K
e)27K和26K
f)30K和26K
g)31K和26K
h)32K和26K
i)33K和26K
j)34K和26K
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含Lys残基26K和34K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好一个选自12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K和36K的Lys残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好一个选自21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K和34K的Lys残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好一个选自21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K的Lys残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含恰好一个Lys残基，其为26K。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含26K和34K之一或两者的置换或缺失。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物不包含26K。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含26K的缺失。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含26K的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含26R。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物不包含34K。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含34K的缺失。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含34K的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含34R或34Q。
如上所述，根据本发明的GLP-1类似物在长度上与野生型GLP-1相似。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含至少26个，如至少28个或至少30个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含至少31个，如至少32个或至少33个氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物在C-末端具有1-5个氨基酸的缺失。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含AA 35-37、AA 34-37或AA 33-37的缺失。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含33L。
如上所述，与野生型GLP-1相比，所述GLP-1类似物可包含一个或多个氨基酸置换，如至多5个氨基酸置换，如至多4个氨基酸置换，如至多3个氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物与SEQ ID NO.:127具有至少75％的同一性，如80％，如85％，如90％或甚至95％的同一性，对应于在无截短的情况下，相对于SEQ ID NO1分别有多达7、6、4、3和1个氨基酸置换。
除通过氨基酸置换引入的另外的Lys残基之外或作为其替代，所述GLP-1类似物可包含一个或多个氨基酸置换，用不同的氨基酸残基置换野生型残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8A的氨基酸置换，如8A至8G或8W的置换，其也可以称为A8G和A8W。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8A的氨基酸置换，如8A至非蛋白型氨基酸残基如Aib的置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8A至G、W或非蛋白型氨基酸残基Aib的氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或多个氨基酸置换，其选自位置8、12、21、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33、34和36处的氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或多个氨基酸置换，其选自位置8、21、23、24、25、26、27、29、30、31、32、33和34处的氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或多个氨基酸置换，其选自位置8、21、23、24、25、27、29、30、31、32或33处的氨基酸置换。在一个实施方案中，位置8、21、23、24、25、27、29、30、31、32或33处的野生型氨基酸残基被G、V、A、T、L或I残基置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8A和34K的置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8Aib和34R。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8Aib和34R和在选自位置21、23、24、25、27、29、30、31、32和33的位置处的置换。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8Aib和34R。在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含8Aib和34R和在选自位置21、23、24、25、27、29、30、31、32和33的位置处的置换，其中位置21、23、24、25、27、29、30、31、32或33处的置换为G、V、A、T、L或I残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或两个Lys残基和一组选自以下的置换：
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含一个或两个Lys残基和一组选自以下的置换：
在一个实施方案中，这样的GLP-1类似物包含一个或两个如上文所述的Lys残基，如26K和/或34K，或如26K，和/或通过置换与K34R一起引入的Lys。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物具有由SEQ ID NO 187定义的序列：
H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37，其中
X8为A、G、W或Aib，
X12为F或K
X21为E、G或K
X23为Q、G或K
X24为A、G、V或K
X25为A、G、V或K
X26为K或R
X27为E、G或K
X29为I、A或V
X30为A、G或K
X31为W、G或K
X32为L、G、T、V、I或K
X33为V、G、I、L、K或不存在
X34为K、R、Q或不存在
X35为G或不存在
X36为R、K或不存在
X37为G或不存在。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物具有由SEQ ID NO 87定义的序列：
H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37其中
X8为A、G、W或Aib，
X12为F或K
X21为E、G或K
X23为Q、G或K
X24为A、G、V或K
X25为A、G、V或K
X26为K或R
X27为E、G或K
X29为I或V
X30为A、G或K
X31为W、G或K
X32为L、G、T、V、I或K
X33为V、G、I、L、K或不存在
X34为K、R、Q或不存在
X35为G或不存在
X36为R、K或不存在
X37为G或不存在。
在一个实施方案中，GLP-1类似物具有由SEQ ID NO 187定义的序列：
H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37，其中
X8为A、G、W或Aib，
X12为F或K
X21为E、G或K
X23为Q、G或K
X24为A、G、V或K
X25为A、G、V或K
X26为K或R
X27为E、G或K
X29为I、A或V
X30为A、G或K
X31为W、G或K
X32为L、T、V、I或K
X33为V、G、I、L、K或不存在
X34为K、R、Q或不存在
X35为G或不存在
X36为R、K或不存在
X37为G或不存在。
在一个实施方案中，GLP-1类似物具有由SEQ ID NO 187定义的序列：
H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37，其中
X8为A、G、W或Aib，
X12为F或K
X21为E、G或K
X23为Q、G或K
X24为A、G、V或K
X25为A、G、V或K
X26为K或R
X27为E、G或K
X29为I或V
X30为A、G或K
X31为W、G或K
X32为L、V、I或K
X33为V、G、I、L、K或不存在
X34为K、R、Q或不存在
X35为G或不存在
X36为R、K或不存在
X37为G或不存在。
可以看出，本文的实施例包含超过40种GLP-1类似物，在包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物两者的化合物的背景下也可以想到这些GLP-1类似物。这些类似物在下表中确定，其中显示了与野生型残基相比的氨基酸变化(如上文所述)以及类似物中存在的Lys残基。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:138-186定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:138-142和144-186定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:138-142和144-166、168、169-186定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:138-142和144-161、163-166、168、169-186定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:138-142和145-161、163-166、168、169-186定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:139和147-154定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:138和174-182和184-186定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:166-170定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含选自由SEQ ID NO.:163-166定义的类似物的类似物或由其组成。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含由SEQ ID NO.:164定义的类似物或由其组成。
EGF(A)类似物
本文中的术语“EGF(A)类似物”是指LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域(SEQ ID NO:1)的变体。如上文针对GLP-1类似物所描述的，类似的命名法适用于EGF(A)类似物。
如本文使用的术语“LDL-R的EGF(A)结构域”、“LDL-R(293-332)”、“天然LDL-R(293-332)、“EGF(A)(293-332)”、“野生型EGF(A)”、“wt-EGF(A)”或“天然EGF(A)”是指由序列SEQ ID NO:1组成的肽。
SEQ ID NO:1为：
Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu。
在本申请中，氨基酸残基的编号遵循LDL-R(LDL-R-(293-332))的EGF(A)结构域的编号，其中第一个(N-末端)氨基酸残基被编号为第293号或被给予第293号的位置，并且后续的朝向C-末端的氨基酸残基被编号为294、295、296等，直到LDL-R的EGF(A)结构域中的最后一个(C-末端)氨基酸残基是编号为332的Glu。
在序列表中进行不同的编号，其中SEQ ID NO:1的第一个氨基酸残基(Gly)被指定为第1号，并且最后一个(Glu)被指定为第40号。这同样适用于序列表中的其它序列，即所指定的N-末端氨基酸为第1号，而不考虑其相对于293Gly或参照LDL-R(293-332)置换氨基酸残基的293如何定位。然而，如上所说明的，本文中氨基酸位置的编号是参照LDL-R(293-332)的。
与SEQ ID NO.:1的同一性水平可以通过确定相对于SEQ ID NO 1没有改变的氨基酸的数目来计算。SEQ ID NO:1由40个氨基酸残基组成，并且如果引入三个氨基酸置换，则同一性水平为37/40％＝92.5％。如果5个氨基酸残基发生改变，则同一性水平为87.5％。如果所述肽在N-末端或C-末端延长，则该部分通常不包括在该比较中，而一个或多个氨基酸的缺失缩短了该比较物。例如，在上述实例中，如果N-末端氨基酸缺失，则同一性水平分别略微降低至36/39×100％和34/39×100％。当讨论衍生物的骨架序列的同一性时，取代基的氨基酸残基(例如该取代基所连接的残基，也称为该取代基的氨基酸残基)可以是野生型(wt)或置换的氨基酸。如果该取代基的氨基酸残基为野生型残基，如N-末端Gly或312K，则该残基包括于同一性水平的计算中，而从293至332的任何其它位置处的Lys将是氨基酸置换，且不包括在与SEQ ID NO.:1的氨基酸同一性的计算中。
本发明的每种EGF(A)类似物可参照以下两方面来描述：i)天然EGF(A)(LDL-R(293-332))中与改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的相应位置)，和ii)实际改变。
换言之，可参照天然LDL-R(293-332)EGF(A)肽来描述EGF(A)类似物，也就是当与天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO:1)相比时其中许多氨基酸残基已经改变的其变体。这些变化可独立地代表一个或多个氨基酸置换。
以下是合适的类似物命名法的非限制性实例：
并入本文包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的衍生物的实施例化合物#1中的EGF(A)类似物可被称为以下LDL-R(293-332)EGF(A)类似物：(301Leu,309Arg,312Glu,321Glu)LDL-R(293-332)EGF(A)或(Leu301,Arg309,Glu312,Glu321)-LDL-R(293-332)EGF(A)或(301L,309R,312E,321E)LDL-R(293-332)或(L301,R309,E312,E321)LDL-R(293-332)。这意味着当这种类似物与天然LDL-R(293-332)比对时，其i)在该类似物中根据该比对与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置301相对应的位置处具有Leu，ii)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置309相对应的位置处具有Arg，iii)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置312相对应的位置处具有Glu，iv)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置321相对应的位置处具有Glu。
通过参考参比序列天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO:1)，表述“与…等同的位置”或“相应位置”可用来表征变异LDL-R(293-332)EGF(A)序列中发生变化的位点。
等同或相应位置，以及改变的编号，例如通过简单的计算来容易地推断，以及/或者可使用标准蛋白质或肽比对程序，如基于Needleman-Wunsch算法的“align”。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比具有1-15个氨基酸置换。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比具有1-10个氨基酸置换。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比具有1-8个氨基酸置换，例如与SEQ ID NO.:1相比具有1-7、1-6、1-5个氨基酸置换。在特定的实施方案中，在所述EGF(A)类似物中可以存在多达7个氨基酸置换，例如可以存在多达6、5、4、3、2或1个氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1具有至少75％的同一性，如80％，如85％，如90或甚至95％的同一性。在其中不存在缺失/截短的一个实施方案中，这分别对应于相对于SEQ ID NO 1的多达10、8、6、4和2个氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1具有至少90％的同一性，如92％，如94％，如96％或甚至98％的同一性。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含至少35个，如36、37、38、39或至少40个氨基酸。在特定的实施方案中，所述EGF(A)类似物由36个，如38或40个氨基酸组成。在另一个特定的实施方案中，所述EGF(A)类似物由35、36、37、38、39或40个氨基酸组成。
在存在氨基酸添加(在本文中称为N-末端和C-末端延伸)的情况下，所述EGF(A)类似物可包含多达60个氨基酸。在特定的实施方案中，所述EGF(A)类似物包含35-60、38-55、40-50、40-45、40-42或40-41个氨基酸。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物由40或41个氨基酸残基组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含氨基酸残基301从Asn至Leu的氨基酸置换，还被描述为Asn301Leu或简单地描述为301Leu。在特定的实施方案中，所述EGF(A)类似物包含置换301Leu。
另外或备选地，所述EGF(A)类似物包含氨基酸残基297Cys、304Cys、308Cys、317Cys、319Cys和331Cys。这些Cys残基是可参与二硫桥的野生型残基，如297Cys与308Cys之间、304Cys与317Cys之间以及319Cys与331Cys之间的二硫桥。
在一个实施方案中，如下所述，所述EGF(A)类似物包含301Leu和多个其它氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含301Leu、310Asp，以及312Lys的氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含301Leu和310Asp，并且其中该类似物不具有299Asp至Glu、Val或His的置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含301Leu、309Arg和312Glu。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含301Leu、309Arg、312Glu和321Glu。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含301Leu和309Arg，条件是该类似物不具有310Asp至310Lys的置换，或者
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含301Leu和309Arg，条件是该类似物不具有299Asp至Glu、Val或His的置换。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物不具有置换D310K、D310N、D310Q、D310Q、D310R和D310A中的任何置换或甚至不具有310Asp的任何置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含一个、两个、三个或全部四个野生型残基：295Asn、296Glu、298Leu和302Gly。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含一个、两个、三个、四个或全部五个野生型残基：295Asn、296Glu、298Leu、302Gly和310Asp。
在一个实施方案中，所述肽具有295Asn。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物具有296Glu。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物具有298Leu。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物具有302Gly。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物具有310Asp。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物具有310Asp、295Asn和296Glu中的两个或更多个。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物具有310Asp、295Asn和296Glu中的全部3个。
如本文所述，所述EGF(A)类似物可包含其它氨基酸置换。在一个实施方案中，该类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330和332。
在一个实施方案中，所述类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、331和332。
在一个实施方案中，所述类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：294、299、300、303、309、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330和332。
在一个实施方案中，所述类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：299、300、309、313、316、318、321、322、323、324、326、328、329、330和332。
在一个实施方案中，所述类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个进一步的氨基酸置换：309、312、313、321、324、328和332。
在进一步的实施方案中，除上文指定的氨基酸残基之外，所述EGF(A)类似物还在某些特定位置处包含野生型氨基酸残基或者不同的残基，即氨基酸置换。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置293处包含氨基酸残基Gly(G)或Asn(N)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置294处包含氨基酸残基Trp(W)、Thr(T)或Gly(G)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Ser(S)、Arg(R)、Leu(L)、Ala(A)、Lys(K)或Tyr(Y)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)或Ala(A)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置300处包含氨基酸残基His(H)或Asn(N)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置307处包含氨基酸残基Val(V)、Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置307处包含氨基酸残基Val(V)或Ile(I)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置307处包含Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置307处包含Ile(I)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Glu(E)、His(H)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Arg(R)或Ser(S)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)或Arg(R)。
在一个这样的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置309处包含氨基酸残基Lys(K)或Arg(R)。
所述EGF(A)类似物可包含若干如本文所述的氨基酸置换，如选自299Ala、307Ile和321Glu的一个或多个氨基酸置换。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置321处包含氨基酸残基Asp(D)、Lys(K)或Glu(E)。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置321处包含氨基酸残基Asp(D)或Glu(E)。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置321处包含氨基酸残基Glu(E)。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置324处包含氨基酸残基Gln(Q)或Gly(G)。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物在位置329处包含氨基酸残基Arg(R)或His(H)。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物不具有300Asn(N)至Pro(P)的置换。
LDL-R的EGF(A)结构域在位置312处包含赖氨酸，该赖氨酸可用于如本文所述的置换。在不希望将该取代基连接至312的实施方案中，312Lys可被本文所述的另一种氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物不包含Lys残基。
在一个实施方案中，位置312处的Lys被选自Gly、Pro、Asp、Glu、Arg、His、Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe和Tyr的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，位置312处的Lys被选自Gly、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Ile、Leu、Phe和Tyr的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，位置312处的Lys被选自Asp、Glu、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe和Tyr的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，312Lys被312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile或312Phe置换。在一个实施方案中，312Lys被312Glu、312Asp、312Gln或312Arg置换。
在一个实施方案中，312Lys被312Glu、312Thr、312Asn、312Ile、312Phe或312Tyr置换。在一个实施方案中，312Lys被312Glu、312Asn或312Ile置换。
在一个实施方案中，312Lys被312Glu或312Arg置换。在一个实施方案中，312Lys被312Arg置换。在一个实施方案中，312Lys被312Glu置换。
为了包括将取代基在各个位置连接的选项(进一步参见下文)，可以通过SEQ IDNO.:1的野生型残基的氨基酸置换或通过SEQ ID NO.:1的肽延长如292Lys或333Lys来引入Lys。
在需要多于一个取代基的情况下，一个可以经由312Lys，而第二个是经由通过肽延长或SEQ ID NO.:1中的置换所引入的Lys。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
另外或备选地，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、301Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物肽包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。
在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。在一个实施方案中，本发明的EGF(A)类似物不包含以下任何置换：296K、298K、301K、302K和307K。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含以下任何置换：296K、298K、301K、302K、307K和310K。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含以下任何置换：296K、298K、301K、302K、307K和295K。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含以下任何置换：296K、298K、301K、302K、307K和295D。
在特定的实施方案中，所述EGF(A)类似物包含1或2个这样的Lys置换。
另外或备选地，所述EGF(A)类似物可以包含312Lys。
在一个实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含两个Lys残基。在一个实施方案中，本发明的EGF(A)类似物包含两个Lys残基，这两个Lys残基选自由以下组成的对：
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示I-XXIV组中的任一个所确定的氨基酸置换。
在更进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物由如下所示I-XXIV组中的任一个所确定的氨基酸置换组成。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示I-XVI组中的任一个所确定的氨基酸置换。
在更进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物由如下所示I-XVI组中的任一个所确定的氨基酸置换组成：
I.301Leu和309Arg
II.301Leu、309Arg、312Glu
III.301Leu、307Ile和309Arg
IV.301Leu、307Ile、309Arg和312Glu
V.301Leu、309Arg和321Glu
VI.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu
VII.301Leu、307Ile、309Arg和299Ala
VIII.301Leu、307Ile、309Arg、299Ala和312Glu
IX.301Leu和309Arg和至少一个Lys置换
X.301Leu、309Arg、312Glu和至少一个Lys置换
XI.301Leu、307Ile和309Arg和至少一个Lys置换
XII.301Leu、307Ile、309Arg和312Glu和至少一个Lys置换
XIII.301Leu、309Arg和321Glu和至少一个Lys置换
XIV.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu和至少一个Lys置换
XV.301Leu、307Ile、309Arg和299Ala和至少一个Lys置换，或者
XVI.301Leu、307Ile、309Arg、299Ala和312Glu和至少一个Lys置换。
在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含由以下任一项所确定的氨基酸置换或由其组成：
V.301Leu、309Arg和321Glu
VI.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu
XIII.301Leu、309Arg、312Glu和至少一个Lys置换，或者
XIV.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu和至少一个Lys置换。
在进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示XVII-XX组中的任一个所确定的氨基酸置换。
在更进一步的实施方案中，所述EGF(A)类似物由与SEQ ID NO.:1相比如下所示XVII-XX组中的任一个所确定的氨基酸置换组成。
XVII.301Leu和309Lys
XVIII.301Leu、309Lys和312Glu
XIX.301Leu和309Lys和至少一个其它Lys置换
XX.301Leu、309Lys和312Glu和至少一个其它Lys置换。
在进一步的实施方案中，根据本发明的EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示XXI-XXIV组中的任一个所确定的氨基酸置换。
在更进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)类似物由与SEQ ID NO.:1相比如下所示XXI-XXIV组中的任一个所确定的氨基酸置换组成。
XXI.301Leu和307Ile，
XXII.301Leu、307Ile和312Glu
XXIII.301Leu和307Ile和至少一个其它Lys置换，以及
XXIV.301Leu、307Ile和312Glu和至少一个其它Lys置换。
在进一步的具体实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID 1至114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID 1至114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:2-114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:2-47和49-114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-47和49-114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:2-44、46、47和49-114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-44、46、47和49-114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:2-44、46、47、49-53、55、58-114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-44、46、47、49-53、55、58-114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:19、21、73、107、108、109、110、111、112、113、114所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:19、21、73、107、108、109、110、111、112、113、114所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，如上所述的EGF(A)类似物不包含Lys残基，因此所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:5、6、23、26、49、50、107-111所确定的任一个氨基酸序列或由SEQID NO.:5、6、23、26、49、50、107-111所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:5、6、23、26、49、50或107所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:5、6、23、26、49、50或107所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个优选实施方案中，所述EGF(A)类似物包含312K残基的突变、321D残基且不包含Lys残基，例如其中所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:108、109、110或111所确定的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:108、109、110或111所确定的任一个氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物包含由SEQ ID NO.:108所确定的氨基酸序列或由SEQ ID NO.:108所确定的氨基酸序列组成。
本文的实例提供了下表中包括的各种EGF(A)类似物，包括关于氨基酸置换、Lys残基和SEQ ID NO的信息。
融合多肽
在一方面，本发明涉及融合多肽，其包含GLP-1类似物的氨基酸序列和EGF(A)类似物的氨基酸序列。如本文先前所述，GLP-1的类似物是指(7-37)(SEQ ID No:137)的变体，而EGF(A)的类似物是指LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域(SEQ ID NO:1)的变体。
所述融合多肽可以被进一步考虑在如下文所述的衍生物制备中作为中间体。当涉及本发明的衍生物时，融合多肽可以被称为骨架或肽骨架。
融合蛋白或融合多肽的制备是本领域公知的。可以制备用于在合适的宿主中表达融合多肽的重组载体，并根据公知常识(Sambrook等人,Molecular Cloning:a laboratorymanual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)通过异源表达用其产生融合蛋白。或者，通常通过固相肽合成来产生更短的多肽，甚至可以合成产生长度延伸的肽。也可以单独产生肽元件，随后对其进行天然化学连接以产生完整的融合多肽。
当欲融合两个肽区段时，顺序可能会影响所得融合多肽以及包含它的化合物的功能性。
在根据本发明的一个实施方案中，从N-末端开始的GLP-1类似物和EGF(A)类似物的顺序是GLP-1类似物，随后是EGF(A)类似物，任选地由间隔肽隔开(见下文)。可以说GLP-1类似物通过GLP-1类似物的C-末端与EGF(A)类似物融合。
在另一个实施方案中，GLP-1类似物通过EGF(A)类似物的C-末端与EGF(A)类似物融合，从而将EGF(A)类似物置于N-端。所得的融合多肽可以用术语“骨架”或“肽骨架”来指代，该术语定义了包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物以及可选的如下文所述的间隔肽的多肽链。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含如上文定义的GLP-1类似物，包括由SEQ ID NO.:138-187定义的任何类似物。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含如上文定义的EGF(A)类似物，包括由SEQ ID NO.:2-114定义的任何类似物。
间隔体
通常，融合多肽包括间隔体，以确保两个肽末端存在的任何功能都不会被其它肽的邻近性所干扰。在一个实施方案中，该间隔体是肽，其在本文中被称为间隔肽或肽间隔体。各种间隔肽是本领域已知的，并且可以放置在GLP-1类似物与EGF(A)类似物之间以获得融合多肽。如上所述，所得的融合多肽(包含间隔体)可以合成产生或通过异源表达产生。
间隔肽是4-80个氨基酸的通常的肽区段。
以下列出了如本文所用的此类肽的实例。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含肽间隔体，其中该肽间隔体包含选自由SEQ ID NO 115-136所确定的肽的序列。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含选自由SEQ ID NO115-136所确定的肽间隔体的肽间隔体。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含肽间隔体，该肽间隔体包含一个或多个GQAP区段，如1-20，如1-10，如1-6，如1，2、3、4或5个GQAP区段。
在一个实施方案中，所述肽间隔体包含选自由SEQ ID NO.:115-128所确定的肽的肽间隔体。
在一个实施方案中，所述肽间隔体选自由SEQ ID NO.:115-128所确定的序列。
在一个实施方案中，所述肽间隔体不包含Lys残基。
在一个实施方案中，所述肽间隔体包含Lys残基。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含肽间隔体，该肽间隔体包含一个或多个GQAP区段，其中通过氨基酸置换引入Lys残基。在进一步的此类实施方案中，所述间隔体可以选自由SEQ ID NO.:121-128所确定的序列。
在一个实施方案中，本发明的化合物、融合多肽及其衍生物包含富含甘氨酸的肽间隔体，例如其中至少一半氨基酸残基为Gly的肽间隔体，例如至少3/4的氨基酸为甘氨酸的肽间隔体。在这样的实施方案中，所述肽间隔体可以选自由SEQ ID NO.:130-136所确定的肽。
在进一步的实施方案中，所述肽间隔体选自由SEQ ID NO:115-117和121-136所确定的肽。
在进一步的实施方案中，所述肽间隔体选自由SEQ ID NO:115-117和121-128所确定的肽。
在一个实施方案中，所述肽间隔体选自由SEQ ID NO.:115-128所确定的序列。
在进一步的实施方案中，所述肽间隔体选自由SEQ ID NO:115-117所确定的肽。在进一步的实施方案中，所述肽间隔体由SEQ ID NO:116所确定。
在显示所有元件即GLP-1类似物、EGF(A)类似物和肽间隔体的变异性的实例中提供了根据本发明的融合多肽(肽骨架)的多个例子。
在一个实施方案中，本发明的衍生物的融合多肽或骨架序列由本文定义的GLP-1类似物、EGF(A)类似物和肽间隔体组成。
本申请的实例包括多种这样的融合多肽和衍生物，包括这样的融合多肽作为肽骨架。融合多肽的身份可以从单独元件的序列推导出来，单独元件即一起构成该融合多肽的GLP-1类似物、EGF(A)类似物和肽间隔体，它们根据下表分别分配SEQ ID。
GLP-1类似物位于EGF(A)类似物的C-端的实例
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:188-384、386-387所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:188-384所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:193、226-233和381-384所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:379-380所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:193、219和220所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:189、193、200-203和212-218所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:222-225所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:224-225所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:192-196所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:221、236、250、264、276、279、291、294、306、307、310、324、336、339、351、352、353、356、368和369所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:221、250、276、279、291、294、306、307、310、324、336、351、353、356、368和369所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:217、218、219、220、221、310和386所定义的融合多肽。在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:217、218、221、310和386所定义的融合多肽。在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:217、218、310和386所定义的融合多肽。在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:221、310和386所定义的融合多肽。在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:310和386所定义的融合多肽。在一个实施方案中，本发明涉及由SEQ ID NO.:310所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO:188和370-378所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:190、191、197、198和199所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:204-211所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:240-247、254-261、268-275、283-290、298-305、314-321、328-335、343-350和360-367所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种融合多肽，其选自由SEQ ID NO.:234-235、237-239、248-249、251-253、262-263、265-267、277-278、280-282、292-293、295-297、308-309、311-313、322-323、325-327、337-338、340-342、354-355和357-359所定义的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及包含恰好一个Lys残基的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及包含多达两个Lys残基的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及包含两个Lys残基的融合多肽。
在一个实施方案中，本发明涉及一种衍生物，其包含由SEQ ID NO.:188-384所定义的融合多肽或肽骨架，或以上定义的任何融合多肽，如下文进一步所描述的。
GLP-1功能
受体激动剂可被定义为与受体结合并引发天然配体典型的响应的类似物。完全激动剂可被定义为引发与天然配体相同量级的响应的激动剂(参见例如，“Principles ofBiochemistry”,AL Lehninger,DL Nelson,MM Cox,第二版,Worth Publishers,1993,第763页)。
因此，例如，“GLP-1受体激动剂”可被定义为能够与GLP-1受体结合并能够激活该GLP-1受体的化合物。
而“完全”GLP-1受体激动剂可被定义为能够引发与天然GLP-1相似量级的GLP-1受体响应的GLP-1受体激动剂。
在一个实施方案中，本发明的GLP-1类似物是GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的GLP-1类似物是完全GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的双功能化合物是GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的双功能化合物是完全GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的衍生物是GLP-1受体激动剂。在一些实施方案中，本发明的衍生物是完全GLP-1受体激动剂。
因此，GLP-1受体激动剂应表现出“GLP-1活性”，这是指化合物(即GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物)与GLP-1受体结合并启动信号转导途径，从而导致促胰岛素作用或其它本领域已知的生理效应的能力。例如，可以使用本文方法部分C中描述的GLP-1效力试验测试GLP-1类似物、双功能化合物及其衍生物的GLP-1活性。在一个实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物，即GLP-1/EGF(A)融合多肽及其衍生物，具有GLP-1活性。
术语半数最大有效浓度(EC50)通常是指通过参考剂量响应曲线，诱导基线与最大值之间一半的响应的浓度。EC50用作化合物效力的量度，并表示观察到其最大作用的50％时的浓度。
可以如上所述确定GLP-1类似物和包含GLP-1类似物的化合物的体外效力，并确定EC50。EC50值越低，效力越好。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中具有高达50pM、50-100pM、100-250pM或250-1000pM的EC50。在一个实施方案中，EC50为至多500pM，如至多300pM，如至多200pM。在一个实施方案中，EC50与人GLP-1(7-37)相当，如至多50pM。在进一步的实施方案中，EC50为至多40pM，如至多30pM，如至多20pM，如至多10pM。EC50约为10pM的化合物的高效力等同于索马鲁肽分子的效力。
如本文其它地方所述，GLP-1效力必须与EGF(A)类似物的效力进行平衡，因此在一些实施方案中，可能优选包括提供小于索马鲁肽效力的GLP-1效力的GLP-1类似物，使得该GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的效力与索马鲁肽相比降低至少2倍，如至少5倍，如至少10倍，如至少25倍，如至少50倍，如至少100倍。可能更优选与野生型GLP-1相比效力降低。
在一个实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在没有HSA的情况下测量的)为至少25pM，如至少50pM，如至少75pM，如至少100pM，如至少250pM，或如至少500pM。
在这样的实施方案中，如C1中所述在没有HSA的情况下测量的GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50为至多500pM，如至多400pM，如至多300pM，如至多200pM，如至多100pM，如至多50pM。
在进一步的实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在没有HSA的情况下测量的)为20-1000pM，如50-500pM，如100-250pM，如75-100pM。
在进一步的实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在没有HSA的情况下测量的)为20-800pM，如20-600pM，如20-400pM，如20-200pM或如20-100pM。
或者，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在没有HSA的情况下测量的)为200-1000pM，如300-800pM或如400-600pM或250-750pM或300-500pM。
当在HSA的存在下评价效力时，上述效力考虑因素也是有意义的。
在一个实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在存在1％HSA的情况下测量的)为至少500pM，如至少750pM，如至少1000pM，如至少1500pM，或如至少2000pM。
在这样的实施方案中，如C1中所述在存在1％HSA的情况下测量的GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50为至多2500pM，如至多2000pM，如至多1500pM，如至多1250pM，或如至多1000pM。
在进一步的实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在存在1％HSA的情况下测量的)为500-2500pM，如500-2000pM，如500-1500pM，如500-1000pM。
在进一步的实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在存在1％HSA的情况下测量的)为750-2500pM，如1000-2500pM，如1500-2500pM，如2000-2500pM或如1800-2500pM。
或者，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的EC50(如C1中所述在存在1％HSA的情况下测量的)为500-2500pM，如750-2000pM或如1000-2000pM或1500-2000pM。可以降低GLP-1的效力，以使其与PCSK9完全结合，同时减少与GLP-1相关的副作用，例如但不限于恶心。
或者，可以在C2中描述的体外结合试验中测试GLP-1类似物和包含GLP-1类似物的化合物的体外结合亲和力，并且当在低HSA的存在下进行测试时，对具有等同于野生型GLP-1或索马鲁肽的功能的化合物的亲和力约为1nM。
在一个实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物在体外结合试验中具有至多200nM的IC50，在进一步的实施方案中，IC50为至多100nM，如至多75nM，如至多50nM，如至多25nM，如至多10nM，如至多5nM。在一些实施方案中，可能优选具有小于索马鲁肽结合的结合，使得GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的结合与索马鲁肽相比降低至少5倍，如至少10倍，如至少25倍，如至少50倍，如至少100倍。可能更优选与野生型GLP-1相比，结合亲和力降低。
在一个实施方案中，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的IC50(如C2中所述在没有HSA的情况下测量的)为至少1nM，如至少5nM，如至少10nM，如至少25nM，如至少50nM，如至少100nM。
在这样的实施方案中，如C2中所述在没有HSA的情况下测量的GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的IC50为至多200nM，如至多100nM，如至多75nM，如至多50nM，如至多25nM，如至多15nM，如至多10nM，如至多5nM。
在进一步的实施方案中，如C2中所述在没有HSA的情况下测量的GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物的IC50为0.1-200nM，如1-100nM，如5-75nM，如5-50nM。
当在不存在HSA的情况下评价结合时，以上考虑因素是有意义的。可以减少GLP-1的结合，以允许与PCSK9完全结合，同时减少与GLP-1相关的副作用，例如但不限于恶心。
备选地或另外地，可以通过测量GLP-1类似物和包含GLP-1类似物的化合物对血糖和/或体重的影响，在体内测量GLP-1的作用。可以在合适的模型中，如在C7中所述的db/db小鼠中和在C8中所述的DIO大鼠中，测量血糖和/或体重的降低。
在一个实施方案中，如本文C7所述，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物在db/db小鼠中具有降低血糖的能力。可以根据从0到24小时的血糖变化曲线下面积(AUC ΔBG24h)估算作用，并针对AUC ΔBG24h计算有效剂量50％(ED50，得到基线与最大作用之间一半的响应的GLP-1衍生物剂量)。
在一个实施方案中，优选GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物具有小于15nmol/kg的EC50 AUC ΔBG24h。在一个实施方案中，EC50 AUC ΔBG24h为1-15，如2-12或如5-10nmol/kg。
减轻体重的能力同样可以使用C8中所述的DIO大鼠进行评价。
在一个实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物能够将体重降低至基线体重的至少95％。
在一个实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，GLP-1类似物或包含GLP-1类似物的化合物能够将体重降低至基线体重的至少90％。
EGF(A)功能-(PCSK9i)
如本文所述，所述EGF(A)类似物是由SEQ ID NO:1所定义的LDL-R(293-332)EGF(A)肽的变体。该EGF(A)类似物在本文中被定义为包含作为SEQ ID NO:1的类似物的氨基酸序列的肽。
这样的EGF(A)类似物优选地具有结合PCSK9的能力。在具体的实施方案中，例如，与天然LDL-R(293-332)(天然EGF(A))或与其它PCSK9结合化合物相比，该EGF(A)类似物具有改善的与PCSK9结合的能力。
EGF(A)类似物可进一步具有抑制PCSK9与LDL-R结合的能力。在一个实施方案中，该EGF(A)类似物是PCSK9抑制剂。在一个实施方案中，该EGF(A)类似物抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。
可以使用本文C3部分所述的试验评估这种结合，该试验测量测试化合物竞争性抑制PCSK9与人LDLR结合的能力。由于其抑制PCSK9与LDL-R相互作用的能力，此类化合物被称为PCSK9抑制剂。
在一个实施方案中，本发明的EGF(A)类似物和包含EGF(A)类似物的化合物(融合多肽或衍生物)是PCSK9抑制剂化合物或简称为PCSK9抑制剂。在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO.:1的EGF(A)类似物的化合物，其中该类似物能够抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。
在一个实施方案中，与EGF(A)LDL-R(293-332)(SEQ ID 1)相比，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物具有改善的结合PCSK9的能力。由于野生型序列具有相对较弱的抑制功能，因此也可以与EGF(A)类似物进行比较。在一个实施方案中，与SEQ ID NO.:2所定义的[299A,301L,307I,309R,310K]EGF(A)相比，所述EGF(A)类似物(和包含所述类似物的化合物)具有改善的结合PCSK9的能力。在ELISA测定中测得的效力提供了EGF(A)类似物或包含EGF(A)类似物的化合物以Ki报告的表观亲和力，并且如C3中所述，低Ki是具有强抑制功能的化合物的特征。
在一个实施方案中，如在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定(C3部分)中所测量的，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物的Ki低于50nM，如低于25nM或如低于10nM。在进一步的实施方案中，如在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定(C3部分)中所测量的，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物的Ki低于8.0nM，如低于5.0nM，如低于2.5nM，乃至低于2.0nM。在一个实施方案中，如在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定(C3部分)中所测量的，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物的Ki为0.1-10.0nM，如0.1-8.0nM或0.1-5.0nM。
EGF(A)类似物和包含它们的化合物的功能性可以进一步以其改善LDL摄取的能力来表征，例如在本文C4部分所述。
在一个实施方案中，在PCSK9的存在下，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物增加LDL摄取。在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物能够逆转或降低PCSK9介导的LDL摄取减少。
在一个实施方案中，所述EGF(A)类似物和包含所述类似物的化合物具有如在LDL摄取试验中所测量的低于1500nM，如低于1000nM或如低于500nM的EC50。
可以在合适的模型中，例如通过如本文C8部分所述的在DIO大鼠中的研究，评价EGF(A)类似物和包含类似物的化合物对血液胆固醇的影响。该研究包括测试化合物的数次给药，因此效果取决于给药的剂量和频率。在本研究中，在21天后评价低剂量、高剂量和非常高剂量的效果。
在一个实施方案中，当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述EGF(A)类似物或包含EGF(A)类似物的化合物能够将胆固醇降低至少0.5mmol/L。在进一步的实施方案中，当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，胆固醇水平降低至少0.6或如0.8mmol/L。
在一个实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述EGF(A)类似物或包含EGF(A)类似物的化合物能够将胆固醇降低至少0.8mmol/L。在进一步的实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，胆固醇水平降低至少1.0或如1.2mmol/L。
双功能性
如上文所述，不同的功能性与GLP-1类似物和EGF(A)类似物这两种类似物相关。当将两者组合时，在本发明的化合物中，优选维持每种类似物的功能，即GLP-1类似物具有刺激GLP-1受体的能力，并且EGF(A)类似物竞争性结合PCSK9，此外，包含这两种类似物的化合物具有这两种功能性。可以在本文所述用于测试GLP-1和EGF(A)功能性的试验中测试此类化合物的功能性。
在一个实施方案中，所述化合物被称为双功能分子。
为了获得适合治疗用途的化合物，必须平衡功能性以获得PCSK9抑制剂和GLP-1受体激动剂的所需活性水平。在一个实施方案中，该化合物是如上文所述的GLP-1受体激动剂。在一个实施方案中，该化合物是如上文所述的PCSK9抑制剂。在C1部分中描述了GLP-1受体效力的测量，在C2部分中描述了GLP-1类似物的结合亲和力，并且这些功能性要求对包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物同样相关。
同样，EGF(A)类似物的功能性已在本文C3、C4和C6部分中关于EGF(A)功能和试验的部分中描述。
就每种类似物而言，包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的本发明化合物是单价的，即所述化合物包含一个EGF(A)类似物和一个GLP-1类似物。为了平衡GLP-1受体激动剂功能和PCSK9抑制剂功能，可以单独选择类似物以获得这两种活性的适当水平。众所周知，高剂量的GLP-1受体激动剂可能会产生诸如恶心的副作用，因此优选在确保良好的PCSK9抑制功能的同时降低GLP-1的效力，以在相同的血浆浓度下获得这两种活性的适当平衡。
在一个实施方案中，如上文所述，与GLP-1(3-37)或索马鲁肽相比，GLP-1的效力降低。在这样的实施方案中，通过体外cre荧光素酶试验(C1部分，无HSA)测得的EC50为至少10pM。
在一个实施方案中，通过竞争性ELISA(C3部分)测得的表观Ki低于50nM。
在一个实施方案中，表观EGF(A)Ki(C3)与GLP-1效力(C1，无HSA)之比为至多5000，如至多4000，如至多3000，如至多2000或如至多1000。
在一个实施方案中，表观EGF(A)Ki(C3)与GLP-1效力(C1，无HSA)之比为至多1000，如至多800，如至多600，如至多400或如至多200。
在一个实施方案中，表观EGF(A)Ki(C3)与GLP-1效力(C1，无HSA)之比为至多200，如至多150，如至多100，如至多50。
为了确认所述化合物确实是双功能的，优选评价如本文所述可在如本文C8部分所述的DIO大鼠中完成的功能性，其中可测量对体重和胆固醇的影响。
在一个实施方案中，在如本文C8部分所述的体内大鼠研究中，所述化合物能够至少与GLP-1/EGF(A)化合物#41相等地降低胆固醇和体重。
在一个实施方案中，当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述化合物能够将胆固醇降低至少0.5mmol/L。
在进一步的实施方案中，当以30nmol/kg/天的剂量给药并在21天后测量时，胆固醇水平降低至少0.6或如0.8mmol/L。
在一个实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述化合物能够将胆固醇降低至少0.8mmol/L。
在进一步的实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，胆固醇水平降低至少1.0或如1.2mmol/L。
在一个实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述化合物能够将体重降低至基线体重的至少95％。
在一个实施方案中，当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述化合物能够将体重降低至基线体重的至少90％。
衍生物
如本文在双功能化合物的语境中所使用的，术语“衍生物”是指化学修饰的双功能化合物，其中一个或多个取代基已经共价连接至该化合物。
如上文所述，取代基共价连接至化合物上。将取代基连接至多肽的多种方式是已知的，例如通过经由N-末端、C-末端或内部氨基酸残基连接取代基。
在一个实施方案中，所述化合物可包含一个或多个取代基。在一个实施方案中，该化合物包含一个或两个取代基。在一个实施方案中，该化合物具有一个或两个取代基。在一个实施方案中，该化合物具有一个取代基。在一个实施方案中，该化合物具有两个取代基。
在化合物具有两个取代基的实施方案中，优选这两个取代基是相同的。
在一个实施方案中，所述一个或两个取代基连接至肽骨架的氮原子上。在一个实施方案中，所述一个或两个取代基连接至肽骨架的氨基上。在一个实施方案中，所述一个或两个取代基连接至一个或两个Lys残基的ε氮上。
在一个实施方案中，所述两个取代基连接至肽骨架的不同Lys残基上。在一个实施方案中，所述两个取代基连接至肽骨架中不同Lys残基的ε-氮上。
如上文所述，包含GLP-1类似物、肽间隔体和EGF(A)类似物或由它们组成的衍生物的融合多肽或肽骨架可以具有一个或多个Lys残基。上文已经描述了具有不同数目的Lys残基的GLP-1类似物、肽间隔体和EGF(A)类似物的各个实例，并且可以将这些序列组合以获得具有恰好一个或两个Lys残基的融合多肽或肽骨架。
在一个实施方案中，所述肽骨架具有一个或两个Lys残基。在一个实施方案中，所述肽骨架仅包含一个Lys残基。在一个实施方案中，所述肽骨架包含恰好两个Lys残基。
在一个实施方案中，所述肽骨架包含含有一个或两个Lys残基的GLP-1类似物。在一个实施方案中，所述肽骨架包含仅含有一个Lys残基的GLP-1类似物。在一个实施方案中，所述肽骨架包含含有恰好两个残基的GLP-1类似物。
在一个实施方案中，所述肽骨架包含含有一个或两个Lys残基的EGF(A)类似物。在一个实施方案中，所述肽骨架包含仅含有一个Lys残基的EGF(A)类似物。在一个实施方案中，所述肽骨架包含含有恰好两个Lys残基的EGF(A)类似物。
在一个实施方案中，所述肽骨架包含含有一个或两个Lys残基的肽间隔体。在一个实施方案中，所述肽骨架包含仅含有一个Lys残基的肽间隔体。在一个实施方案中，所述肽骨架包含含有恰好两个残基的肽间隔体。
在一个实施方案中，取代基旨在改善肽的功能性。
在一个实施方案中，取代基延长化合物的半衰期，使得与本文所示的肽骨架的半衰期相比，包含肽骨架和取代基的衍生物的血浆半衰期具有延长的半衰期(C5部分，表5)。
确定在不同物种中的半衰期的方法是本领域公知的，并且在本文中以小型猪进行了例示(C5部分)。
在一个实施方案中，根据本发明的衍生物具有超过12小时的半衰期。
在一个实施方案中，根据本发明的衍生物在皮下或静脉内给药后测得的在小型猪中的半衰期在24小时以上，例如在36小时以上，或者例如在48小时以上。
取代基
术语“取代基”是指通过取代通常存在于相同位置的原子，经由氨基酸残基连接至多肽的部分。通常，取代基替代氢原子，如氨基(-NH2)的氢。因此，取代基是共价连接至肽或多肽的部分。根据本发明，优选的是该部分，例如取代基，对肽的功能性没有影响或具有最小的影响，同时增加其它有益性质，如增加稳定性或延长半衰期。
在一个实施方案中，半衰期延长取代基是蛋白质部分。在进一步的这类实施方案中，该蛋白质部分可包括人白蛋白、Fc结构域或非结构化的蛋白质延伸。在进一步的实施方案中，该蛋白质部分可以与类似物之一融合。在进一步的实施方案中，该蛋白质部分是Fc结构域并且该Fc结构域与GLP-1类似物或EGF(A)类似物融合。当制备Fc融合体时，所得化合物通常是二价的，因为两个Fc多肽将形成一个Fc结构域。
在一个实施方案中，所述取代基不是蛋白质部分。
在一个实施方案中，所述取代基不是与肽骨架融合的蛋白质部分。
在另一个实施方案中，所述取代基是非蛋白质部分。
在特定的实施方案中，所述取代基能够与白蛋白形成非共价复合物，从而促进衍生物在血流内的循环，并且还具有延长衍生物的作用时间的效果。在特定的实施方案中，该取代基能够延长衍生物的作用时间，而基本上不降低其与PCSK9和/或GLP-1受体的结合能力。
在一个实施方案中，所述衍生物包含半衰期延长取代基。多种半衰期延长取代基在本领域中是公知的，并具体包括如下文进一步描述的包含脂肪酸基团的白蛋白结合物，并且这类白蛋白结合物是非蛋白质取代基。
所述取代基包含至少一个脂肪酸基团。
在特定的实施方案中，所述脂肪酸基团包含含有至少8个连续-CH2-基团的碳链。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含至少10个连续的-CH2-基团，如至少12个连续的-CH2-基团、至少14个连续的-CH2-基团、至少16个连续的-CH2-基团、至少18个连续的-CH2-基团。
在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含8-20个连续的-CH2-基团。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含10-18个连续的-CH2-基团。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含12-18个连续的-CH2-基团。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含14-18个连续的-CH2-基团。
在衍生物包含两个取代基的情况下，用较短的脂肪酸基团可以获得延长的半衰期，因此在衍生物包含两个取代基的实施方案中，该脂肪酸基团可包含至少8个连续的-CH2-基团，如至少10个连续的-CH2-基团，如至少12个连续的-CH2-基团，至少14个连续的-CH2-基团，至少16个连续的-CH2-基团、至少18个连续的-CH2-基团。
在衍生物包含两个取代基的进一步的实施方案中，每个取代基包含含有8-18个连续-CH2-基团的脂肪酸基团。在进一步的这类实施方案中，该脂肪酸基团包含10-18个连续的-CH2-基团，如12-18个连续的-CH2-基团，如14-18个连续的-CH2-基团。
如本文使用的术语“脂肪酸基团”可被称为包含至少一个官能团的化学基团，该官能团为pKa<7的酸。
在一个实施方案中，所述取代基包含至少8个连续的-CH2-基团和至少一个官能团(FG)，pKa<7。作为酸的这类官能团的非限制性实例包括羧酸(还包括羧基苯氧基)。
在一个实施方案中，脂肪酸基团在该官能团(酸)的相反端包含羰基，这样的脂肪酸基团也可以称为二酸。
在一个实施方案中，术语“延长体”可用来描述脂肪酸基团，该脂肪酸基团是负责延长化合物半衰期的取代基的末端部分。
在一个实施方案中，延长体可以被定义为：
化学式1：HOOC-(CH2)n-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为C(n+2)二酸或者表示为：
化学式1b：其中n为8-20范围内的整数。
在一个实施方案中，延长体可以被定义为：
化学式2：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*其中m为8-11范围内的整数或被定义为
化学式2b：其中羧基在化学式3的(C6H4)基团的位置2、3或4处，并且其中m为8-11范围内的整数。
在一个实施方案中，所述延长体可用如上定义的化学式1、化学式1b、化学式2或化学式2b来定义。
在一个实施方案中，根据本发明的取代基包含一个或多个连接体元件。连接体元件可以通过酰胺键彼此连接并且与延长体连接，并被称为“Z”(参见下文)。
如下文进一步定义的，连接元件的数目可以是至多6个，表示为-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-，其中Z1与延长体(Pro-)连接，并且最后一个Z元件与肽连接，在这种情况下，该取代基可以被表示为Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-。因此，上面的符号*表示与Z1的连接点，当通过酰胺键结合时，其为氮。在一个实施方案中，其中Z1是键(参见下文)，并且符号*表示与相邻Z元件的氮的连接点。
在一个实施方案中，取代基被定义为：Pro-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-，其中Pro-选自化学式1、化学式1b、化学式2和化学式2b，并且其中n为8-20范围内的整数，m为8-11范围内的整数。
在特定的实施方案中，在化学式1或1b中，n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，且m为8、9、10或11。
本文使用的术语“键”意为共价键。当Z1-Z6的连接体元件被定义为键时，其相当于其中不存在所述组分的情况。下文中的表述Z1-Z6中的任一个为键也可以被解读为Z1-Z6中的任一个不存在。在逻辑上“键”不能跟随“键”。因此本文的表述“键”意指在前的Z元件共价连接至不是“键”(或不存在)的下一个Z元件。
连接体元件Z1-Z6各自选自能够形成酰胺键的化学部分，包括氨基酸样部分，如Glu、γGlu(也被称为gammal Glu或gGlu，并由*-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*定义)、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep和Aeeep，和如下所述的其它部分。
在一个实施方案中，Z1元件是可选的，在一个这样的实施例中，Z1选自
化学式3：*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*或
化学式3b：和键。
化学式3也可被称为氨甲环酸反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸的Trx，其中化学式3涵盖邻-(1,2)、间-(1,3)和对-(1,4)形式，而化学式3b指定对-(1,4)形式。
在一个实施方案中，Z2选自γGlu、Glu或键。在一个实施方案中Z2为γGlu。
在一个实施方案中，Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep和Aeeep和键。
Glu、Gly、Ser、Ala、Thr是本领域公知的氨基酸残基。
γGlu由化学式4定义：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*，其等同于化学式4b：
并且也可被称为γGlu。
Ado由化学式5定义：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*，其也可被称为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其等同于
化学式5b：
Aeep由化学式6定义：*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*，其也可被表示为
化学式6b:
Aeeep由化学式7定义：*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*，其也可被表示为
化学式7b：
在一个实施方案中，Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自Glu、γGlu、Gly、Ala、Ado、Aeep和Aeeep和键。
在一个实施方案中，Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自Glu、γGlu、Gly、Ala、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自Glu、γGlu、Gly、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自γGlu、Gly、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自γGlu、Ado和键。
在实施方案中，所述取代基选自由以下#1至#14定义的取代基。
取代基#1由化学式6定义：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado-*，其等同于
化学式6b：
取代基#2由化学式7定义：
HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado-Ado-Ado-*，其等同于
化学式7b：
取代基#3由化学式8定义：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado*，其等同于
化学式8b：
取代基#4由化学式9定义：HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-*，其等同于
化学式9b：
取代基#5由化学式10定义：HOOC-(CH2)18-CO-γGlu-Ado-Ado-*，其等同于
化学式10b：
取代基#6由化学式11定义：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-*，其被指定为
化学式11b：
取代基#7由化学式12定义：
HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-*，其被指定为
化学式12b：
取代基#8由化学式13定义：
HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-Ado-*，其被指定为
化学式13b：
取代基#9由化学式14定义：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-γGlu-*，其被指定为
化学式14b：
取代基#10由化学式15定义：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-*，其被指定为
化学式15b：
取代基#11由化学式16定义：
HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado-Ado-Ado-*，其被指定为
化学式16b：
取代基#12由化学式17定义：HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-*，其被指定为
化学式17b：
取代基#13由化学式18定义：4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado-*，其被指定为
化学式18b：
取代基#14由化学式19定义：HOOC-(CH2)14-CO-γGlu-Ado-Ado-*，其被指定为
化学式19b：
双功能化合物
本文描述了多种融合化合物，并且如别处所述，挑战在于确保两种功能性得到维持并平衡。公开的化合物包括EGF(A)类似物、间隔体和GLP-1类似物的变化以及元件的顺序。
在一个实施方案中，所述融合多肽在N-端包含GLP-1类似物，并且在C-端包含EGF(A)类似物，发现这对于维持GLP-1功能性至关重要。
在进一步的实施方案中，EGF(A)类似物的序列应至少包含301L突变，并且优选包含309R和309I中的一个或多个，如本文中详细描述的，并以由SEQ ID NO.:107和108所确定的EGF(A)类似物的序列进行例示，其还可以包含312E突变以去除野生型赖氨酸。
在一个实施方案中，所述GLP-1类似物包含如上所述的突变，如残基8至例如8Aib、8G或8W的突变，以及残基34至例如34R的突变，这允许取代基连接到K26上。进一步的突变如30G可能有利于降低GLP-1类似物的效力。
在这样的实施方案中，所述化合物包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物，其中
i)所述GLP-1类似物由SEQ ID No.:139、140、141、142或164所确定，并且
ii)所述EGF(A)类似物由SEQ ID No.:107、108、109所确定。
在一个实施方案中，所述化合物包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物，其中
i)所述GLP-1类似物由SEQ ID No.:139或164所确定，并且
ii)所述EGF(A)类似物由SEQ ID No.:107或108所确定。
在一个实施方案中，所述化合物包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物，其中
i)所述GLP-1类似物由SEQ ID No.:164所确定，并且
ii)所述EGF(A)类似物由SEQ ID No.:108所确定。
在一个实施方案中，所述化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#1-74和76-314中的任一种。
在一个实施方案中，所述化合物选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#1-74、76-314的化合物。
在一个实施方案中，所述化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#69和/或#306。在一个实施方案中，该化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#69。在一个实施方案中，该化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#306。
在一个实施方案中，所述化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#41和/或#48。在一个实施方案中，该化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#41。在一个实施方案中，该化合物是GLP-1/EGF(A)化合物#48。
制备方法
本文所述的化合物可以使用公知常识来制备。骨架或融合多肽可以通过化学合成(如方法部分A1中所述)或通过异源表达来提供。可以通过常规分子生物学制备编码融合多肽的表达载体，并且可以选择合适的宿主。也可以组合使用多种方法，其中一部分骨架经合成制备，而另一部分骨架通过重组技术制备。取代基可以在化学合成过程中或在随后与骨架或其部分的反应中连接至肽骨架。与制备方法无关，所述化合物按其元件例如融合多肽(肽骨架)和一个或多个取代基来定义。
本发明的一个方面涉及制备如本文所述的包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的融合多肽的方法。
本发明的一个方面涉及制备包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的融合多肽的衍生物的方法，其进一步包含一个或多个与所述融合多肽共价连接的取代基。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的化合物(或其药学上可接受的盐、酰胺或酯)，以及药学上可接受的辅料。这类组合物可如本领域所知的那样制备。
术语“辅料”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非医药活性物质。辅料可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。辅料的非限制性实例是：溶剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。药学活性成分与各种辅料的配制是本领域已知的，参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何后续版本)。
本发明的组合物可以是液体制剂的形式，即包含水的水性制剂。液体制剂可以是溶液或悬浮液。或者，它可以是固体制剂，例如冷冻干燥的或喷雾干燥的组合物。
本发明的组合物可以用于肠胃外给药，例如借助于注射器，任选地笔式注射器，或借助于输注泵，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行给药。
本发明的药物组合物可进一步包含第二活性成分，如治疗剂，其可在联合治疗的情况下简化给药。
制剂的实例包括液体制剂，即包含水的水性制剂。液体制剂可以是溶液或悬浮液。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％、70％、80％或甚至至少90％w/w的水。
或者，药物组合物可以是固体制剂，例如，冻干或喷雾干燥的组合物，其可以原样使用，或由医师或患者在使用前向其添加溶剂和/或稀释剂。
水性制剂的pH可以是pH 3至pH 10之间的任何值，例如约7.0至约9.5；或约3.0至约7.0，如7.0至9.5，或3.0至7.0。
药物组合物可包含缓冲液。该缓冲液例如可选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸，及其混合物。
药物组合物可包含防腐剂。该防腐剂例如可选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯丁醇、和硫柳汞(thiomerosal)、溴硝醇、苯甲酸、咪唑啉基脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(chlorphenesine)(3-对-氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)，及其混合物。防腐剂可以以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。
药物组合物可包含等张剂。该等张剂例如可选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛醇(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。可以使用任何糖，如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、支链淀粉、糊精、环糊精、α和βHPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。糖醇被定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿糖醇。在一个实施方案中，该糖醇添加剂为甘露醇。
药物组合物可包含螯合剂。该螯合剂例如可选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐，及其混合物。
药物组合物可包含稳定剂。该稳定剂可以是例如一种或多种氧化抑制剂、聚集抑制剂、表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。这些不同种类的稳定剂的非限制性实例在下面公开。药物组合物可包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。该稳定剂例如可选自聚乙二醇(例如，PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，以及不同的盐(例如氯化钠)。
药物组合物可包含另外的稳定剂，诸如但不限于，保护多肽免受甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保护多肽免受与冷冻-解冻或机械剪切有关的聚集的非离子型表面活性剂。
药物组合物可包含一种或多种表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水性)部分与脂溶性(亲脂性)部分组成的任何分子或离子。该表面活性剂例如可选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。
药物组合物可包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如，EDTA(乙二胺四乙酸)和/或苄脒盐酸盐。
药物组合物的其它可选的成分包括例如润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、金属离子、油性载体、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶)和/或两性离子(例如，氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
所述衍生物或类似物可以以药物组合物的形式来施用。其可以通过本领域已知的各种途径施用于有需要的患者。给药途径可以是，例如，肠胃外、表皮；真皮；经皮；结膜；输尿管；阴道；直肠；和/或眼部，舌；舌下；颊；口中；口服；胃中；小肠中；鼻；肺，如通过细支气管、肺泡或其组合。
组合物可以以若干种剂型施用，例如作为溶液；悬浮液；乳液；微乳液；多重乳液；泡沫；药膏；糊剂；石膏；软膏；片剂；包衣片剂；口香糖；冲洗剂(rinse)；胶囊如硬或软的明胶胶囊；栓剂；直肠胶囊；滴剂；凝胶；喷雾剂；粉末；气雾剂；吸入剂；滴眼剂；眼用软膏；眼用冲洗剂；阴道子宫托；阴道环；阴道软膏；注射溶液；原位转化溶液如原位胶凝、凝固(setting)、沉淀以及原位结晶；输注溶液；或作为植入物。
例如，为了改善稳定性、生物利用度和/或溶解性，可将组合物在药物载体或药物递送系统中进一步复合。组合物还可用于控制释放、持续释放、延长释放、阻滞释放和/或缓慢释放药物递送系统的制剂。
医药用途
在一个方面，本发明涉及本发明的化合物用于制备药物的用途。
本发明还涉及用作药物或用于制备药物的本发明化合物或其药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的化合物或其组合物可用于治疗或预防心血管疾病和/或心血管风险。
在一个实施方案中，本发明的化合物或其组合物可用于
i.改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；降低LDL-C，增加HDL；降低小而密的LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；
ii.预防和/或治疗心血管疾病，如心脏综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；治疗心血管疾病。
本发明还涉及用于治疗或预防心血管疾病和/或心血管风险的方法。
本发明进一步涉及用于以下目的的方法：(i)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；增加HDL-C；降低LDL-C，降低小而密的LDL-C；降低VLDL-C；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；(ii)预防和/或治疗心血管疾病，如心脏综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；治疗心血管疾病；其中施用药物活性量的根据本发明的化合物。
在一些实施方案中，本发明的化合物可用于以下医药治疗：
i.预防和/或治疗所有形式的糖尿病，如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、MODY(青年成熟发作型糖尿病)、妊娠糖尿病，和/或用于减少HbA1C；
ii.延缓或预防糖尿病进展，如2型糖尿病的进展，延缓糖耐量减低(IGT)进展成需要胰岛素的2型糖尿病，延缓或预防胰岛素抵抗，和/或延缓无需胰岛素的2型糖尿病进展成需要胰岛素的2型糖尿病；
iii.改善β-细胞功能，如减少β-细胞凋亡、提高β-细胞功能和/或β-细胞质量，和/或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性；
iv.预防和/或治疗认知障碍和/或神经退行性病症，如阿尔茨海默病、帕金森病和/或多发性硬化；
v.例如通过减少食物摄取、降低体重、抑制食欲、诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症；治疗或预防暴食症、神经性贪食症和/或由抗精神病药或类固醇给药诱发的肥胖症；减少胃运动；延缓胃排空；增加身体活动；和/或预防和/或治疗肥胖症的共病，如骨关节炎和/或尿失禁；
vi.预防和/或治疗糖尿病并发症，如血管病；神经病，包括周围神经病变；肾病；和/或视网膜病；
vii.改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常、降低总血清脂质；增加HDL；降低小而密的LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低人的脂蛋白a(Lp(a))血浆水平；在体外和/或体内抑制载脂蛋白a(apo(a))的生成；
viii.预防和/或治疗心血管疾病，如综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；
ix.预防和/或治疗胃肠疾病，如炎性肠病、短肠综合征或克罗恩病或结肠炎；消化不良；和/或胃溃疡；和/或炎症，如银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎和/或系统性红斑狼疮；
x.预防和/或治疗危重病，如治疗危重患者、危重病多发性肾病(CIPNP)患者和/或潜在的CIPNP患者；预防危重病或CIPNP的进展；预防、治疗和/或治愈患者的全身性炎症反应综合征(SIRS)；预防或降低患者在住院期间罹患菌血症、败血症和/或脓毒性休克的可能性；和/或稳定具有急性病的重症监护室患者的血糖、胰岛素平衡和可选的代谢；
xi.预防和/或治疗多囊卵巢综合征(PCOS)；
xii.预防和/或治疗脑部疾病，如脑缺血、脑出血和/或创伤性脑损伤；
xiii.预防和/或治疗睡眠呼吸暂停；和/或
xiv.预防和/或治疗滥用，如酒精滥用和/或药物滥用。
在一些实施方案中，所述适应症选自(i)-(xiv)，如适应症(i)-(viii)、(x)-(xiii)和/或(xiv)，并且以一种方式或其它方式与糖尿病有关。
在一些实施方案中，所述适应症选自(i)-(iii)和(v)-(viii)，如适应症(i)、(ii)和/或(iii)；或适应症(v)、适应症(vi)、适应症(vii)和/或适应症(viii)。
在一些实施方案中，所述适应症为(i)。在进一步的特定实施方案中，该适应症为(v)。在又一个特定实施方案中，该适应症为(viii)。
在一些实施方案中，本发明的化合物可以用于治疗和/或预防所有形式的糖尿病(包括饮食失调)、心血管疾病、胃肠疾病、糖尿病并发症和/或多囊卵巢综合征，和/或用于改善脂质参数、改善β-细胞功能和/或用于延缓或预防糖尿病疾病进展。
特别优选以下适应症：2型糖尿病和/或肥胖症。在一些实施方案中，本发明涉及体重管理方法。在一些实施方案中，本发明涉及降低食欲的方法。在一些实施方案中，本发明涉及减少食物摄取的方法。
一般而言，罹患肥胖症的所有受试者也被认为是罹患超重的。在一些实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防肥胖症的方法。在一些实施方案中，本发明涉及本发明的衍生物或类似物用于治疗或预防肥胖症的用途。在一些实施方案中，罹患肥胖症的受试者是人，如成人或孩童(包括婴儿、儿童和青少年)。身体质量指数(BMI)是基于身高和体重的体脂肪的量度。计算公式为BMI＝以千克为单位的体重/(以米为单位的身高)2。罹患肥胖症的人类受试者的BMI可为≥30；该受试者也可被称为肥胖的。在一些实施方案中，罹患肥胖症的人类受试者的BMI可为≥35或BMI在≥30至<40的范围内。在一些实施方案中，该肥胖症为重度肥胖症或病态肥胖症，其中人类受试者的BMI可为≥40。
在一些实施方案中，本发明涉及一种任选地在至少一种体重相关的共病的存在下治疗或预防超重的方法。
在一些实施方案中，本发明涉及任选地在至少一种体重相关的共病的存在下，本发明化合物治疗或预防超重的用途。在一些实施方案中，罹患超重的受试者是人，如成人或孩童(包括婴儿、儿童和青少年)。在一些实施方案中，罹患超重的人类受试者的BMI可为≥25，诸如BMI≥27。在一些实施方案中，罹患超重的人类受试者的BMI在25至<30的范围内或在27至<30的范围内。在一些实施方案中，所述体重相关的共病选自高血压、糖尿病(诸如2型糖尿病)、血脂异常、高胆固醇和阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnoea)。
在一些实施方案中，本发明涉及一种减轻体重的方法。在一些实施方案中，本发明涉及本发明化合物用于减轻体重的用途。将要根据本发明经历体重减轻的人的BMI可为≥25，例如BMI为≥27或BMI为≥30。在一些实施方案中，将要根据本发明经历体重减轻的人的BMI可为≥35或BMI为≥40。术语“体重减轻”可包括肥胖症和/或超重的治疗或预防。
在进一步的实施方案中，本发明涉及根据本发明的化合物在治疗或预防如上所述的糖尿病和心血管疾病或心血管风险中的用途，其以一种药物解决两种疾病或病症的。
在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的治疗方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效剂量的根据本发明的化合物的步骤。
待施用的剂量可以单独确定，并且可以小于每周50mg，如每周10-15mg，或每月70-100mg，这取决于所选择的具体药物化合物和给药方案。
虽然本文已经阐明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附实施方案涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。
实施方案
1.包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物，其中
i.所述GLP-1类似物是由SEQ ID No:137所确定的GLP-1(7-37)的类似物，并且
ii.所述EGF(A)类似物是由SEQ ID No:1所确定的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域的类似物。
2.根据实施方案1的化合物，其中所述化合物具有至少一个Lys残基。
3.根据实施方案1的化合物，其中所述化合物具有至少两个Lys残基。
4.根据实施方案1的化合物，其中所述化合物具有恰好一个或两个Lys残基。
5.根据实施方案1的化合物，其中所述化合物具有恰好一个Lys残基。
6.根据实施方案1的化合物，其中所述化合物具有恰好两个Lys残基。
7.根据实施方案1的化合物，其中所述化合物包含融合多肽。
8.根据实施方案7的化合物，其中所述融合多肽包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物。
9.根据实施方案8的化合物，其中所述GLP-1类似物经由所述GLP-1类似物的C-末端氨基酸残基与所述EGF(A)类似物融合。
10.根据实施方案8的化合物，其中所述融合多肽在N-端包含所述GLP-1类似物，并且在C-端包含所述EGF(A)类似物。
11.根据实施方案8的化合物，其中所述EGF(A)类似物经由所述EGF(A)类似物的C-末端氨基酸残基与所述GLP-1类似物融合。
12.根据实施方案8的化合物，其中所述融合多肽在N-端包含所述EGF(A)类似物，并且在C-端包含所述GLP-1类似物。
13.根据实施方案7-12中任一项的化合物，其中所述融合多肽包含肽间隔体。
14.根据实施方案13的化合物，其中所述肽间隔体由4-80个氨基酸残基组成。
15.根据实施方案14的化合物，其中所述肽间隔体由4-20个氨基酸残基组成。
16.根据实施方案14的化合物，其中所述肽间隔体包含Lys残基。
17.根据实施方案14的化合物，其中所述肽间隔体不包含Lys残基。
18.根据实施方案14的化合物，其中所述肽间隔体选自由SEQ ID NO 115-126所确定的肽。
19.根据实施方案14的化合物，其中所述肽间隔体选自由SEQ ID NO 115-136所确定的肽。
20.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物是GLP-1受体激动剂。
21.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50为1-50pM、10-100pM、50-100pM、100-250pM或250-1000pM。
22.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物是完全GLP-1受体激动剂。
23.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50与野生型GLP-1相当。
24.根据实施方案23的化合物，其中所述GLP-1类似物具有至多50pM的EC50。
25.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50与索马鲁肽相当。
26.根据实施方案25的化合物，其中所述GLP-1类似物的EC50为5-15pM。
27.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(具有1％HSA)中的EC50至多为2500pM。
28.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(具有1％HSA)中的EC50至少为500pM。
29.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在如C7中所述的db/db小鼠中具有降低血糖的能力。
30.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在如C7中所述的db/db小鼠中具有降低血糖的能力，并且其中EC50 AUC ΔBG24h小于15nmol/kg。
31.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在如C8中所述的DIO大鼠中具有降低体重的能力。
32.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在如C8中所述的DIO大鼠中具有降低体重的能力，并且其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述GLP-1类似物能够将体重降低至基线体重的至少95％。
33.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在如C8中所述的DIO大鼠中具有降低体重的能力，并且其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述GLP-1类似物能够将体重降低至基线体重的至少90％。
34.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物与SEQ ID NO.:137至少80％，如85％，如90％，如95％相同。
35.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物与SEQ ID NO.:137相比包含至多6个氨基酸置换。
36.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含8A的氨基酸置换。
37.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含8A至G或W的氨基酸置换。
38.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在位置8处包含非蛋白型氨基酸残基。
39.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在位置8处包含非蛋白型氨基酸残基Aib。
40.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含8A至G、W或非蛋白型氨基酸残基Aib的氨基酸置换。
41.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含8Aib。
42.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含零个、一个或两个Lys残基。
43.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含一个或两个选自12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K和36K的Lys残基。
44.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含Lys残基26K和34K。
45.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含26K和34K之一或两者的置换或缺失。
46.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物不包含26K。
47.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含26K的缺失。
48.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含26K的氨基酸置换。
49.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含26R。
50.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含另外的Lys残基。
51.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含选自12K、21K、23K、24K、25K、27K、30K、31K、32K、33K和36K的另外的Lys。
52.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含恰好一个选自12K、21K、23K、24K、25K、26K、27K、30K、31K、32K、33K、34K和36K的Lys残基。
53.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含恰好两个选自以下对的Lys残基：
k)21K和26K
l)23K和26K
m)24K和26K
n)25K和26K
o)27K和26K
p)30K和26K
q)31K和26K
r)32K和26K
s)33K和26K
t)34K和26K
54.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物不包含34K。
55.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含34K的缺失。
56.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含34K的氨基酸置换。
57.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含34R或34Q。
58.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含氨基酸残基35-37、34-37或33-37的缺失。
59.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含33L。
60.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含至少26个，如至少27个或至少28个氨基酸残基。
61.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物包含氨基酸残基21、23、24、25、27、29、30、31、32和33之一的氨基酸置换。
62.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物具有如下定义的序列：
H-X8-E-G-T-X12-T-S-D-V-S-S-Y-L-X21-G-X23-X24-X25-X26-X27-F-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37(SEQ ID NO 187)，其中
X8为A、G、W或Aib，
X12为F或K，
X21为E、G或K，
X23为Q、G或K，
X24为A、G、V或K，
X25为A、G、V或K，
X26为K或R，
X27为E、G或K，
X29为I、A或V，
X30为A、G或K，
X31为W、G或K，
X32为L、G、T、V、I或K，
X33为V、G、I、L、K或不存在，
X34为K、R、Q或不存在，
X35为G或不存在，
X36为R、K或不存在，且
X37为G或不存在。
63.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物选自由SEQ IDNO.:138至186，如SEQ ID NO.:139-146、155-162、164-173，如SEQ ID NO.:139-142、155-162、164-173，如SEQ ID NO.:139、142、155-162、164-173，如SEQ ID NO.:139、155-162、164-173，如SEQ ID NO.:155-162、164-173或如SEQ ID NO.:139和164所确定的GLP-1类似物。
64.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物是PCSK9抑制剂。
65.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中与由SEQ ID NO.:1所确定的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域相比，所述EGF(A)类似物具有增加的对人PCSK9的结合亲和力。
66.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当在C3部分中所述的PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，所述EGF(A)类似物以低于50nM，如低于25nM或如低于10nM的Ki结合PCSK9。
67.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当在C3部分中所述的PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，所述EGF(A)类似物以低于5nM的Ki结合PCSK9。
68.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物增加LDL摄取。
69.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物在人PCSK9的存在下增加LDL摄取。
70.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当在C4部分中所述的LDL摄取试验中测量时，所述EGF(A)类似物的EC50低于1000nM。
71.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当在C4部分中所述的LDL摄取试验中测量时，所述EGF(A)类似物的EC50低于500nM。
72.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物降低血液胆固醇。
73.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当如C8部分所述进行评价时，所述EGF(A)类似物降低DIO大鼠中的血液胆固醇。
74.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述EGF(A)类似物使血液胆固醇降低至少0.5mmol/L。
75.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述EGF(A)类似物使血液胆固醇降低至少0.8mmol/L。
76.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1至少80％、85％、90％或如95％相同。
77.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物与SEQ ID NO.:1相比包含1-15个氨基酸置换。
78.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含301L。
79.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含301L和309R。
80.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含(野生型)氨基酸残基295N(Asn)、296E(Glu)、298L(Leu)、302G(Gly)和310D(Asp)中的一个或多个。
81.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物不包含任何K残基。
82.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物不包含312K。
83.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含312E、312D、312Q或312R。
84.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含301L、309R，以及312K的氨基酸置换，如312E。
85.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含301L、310D，以及312K的氨基酸置换，如312E。
86.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含301L和310D，并且该肽没有299D至G、V或H的置换。
87.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含321D或321E。
88.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物包含301L、309R、312E和321E。
89.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中所述EGF(A)类似物序列由SEQ IDNO.:19、21、73、107、108、109、110、111、112、113和114，如107、108、109、110和111，如107和108中的任何一个定义。
90.根据前述实施方案7-89中任一项的化合物，其中所述融合多肽包含GLP-1类似物、间隔肽和EGF(A)类似物。
91.根据实施方案90的化合物，其中所述GLP-1类似物如实施方案20-63中任一项所定义。
92.根据实施方案90或实施方案91的化合物，其中所述EGF(A)类似物如实施方案64-89中任一项所定义。
93.根据实施方案90、91或92的化合物，其中间隔肽如实施方案14-19中任一项所定义。
94.根据实施方案90的化合物，其中所述融合多肽选自由SEQ IDNO.:188-384所确定的序列。
95.根据实施方案90-94中任一项的化合物，其中所述融合多肽包含多达两个赖氨酸残基。
96.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物包含多达两个取代基。
97.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物包含多达两个半衰期延长取代基。
98.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物是包含肽骨架和多达两个连接至其上的取代基的衍生物。
99.根据实施方案98的化合物，其中所述肽骨架是如实施方案7-94中任一项所定义的融合肽。
100.根据前述实施方案96-99中任一项的化合物，其中至少一个取代基连接至所述GLP-1类似物、EGF(A)类似物和/或间隔体。
101.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基连接至所述GLP-1类似物。
102.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基连接至所述EGF(A)类似物。
103.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基连接至所述间隔体。
104.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由Lys/K氨基酸残基连接。
105.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由Lys/K氨基酸残基连接至所述GLP-1类似物。
106.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由选自12K、21K、24K、25K、26K、27K、31K、32K和36K的Lys/K氨基酸残基连接至所述GLP-1类似物。
107.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由26K连接至所述GLP-1类似物。
108.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基连接至所述EGF(A)类似物。
109.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys连接至所述EGF(A)类似物。
110.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys连接至所述EGF(A)类似物。
111.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys连接至所述EGF(A)类似物。
112.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys,321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys或333Lys连接至所述EGF(A)类似物。
113.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由313Lys、321Lys、324Lys、328Lys或333Lys连接至所述EGF(A)类似物。
114.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基连接至所述肽间隔体。
115.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由Lys残基连接至所述肽间隔体。
116.根据实施方案100的化合物，其中至少一个取代基经由Lys残基连接至所述肽间隔体，其中所述间隔体是在位置1、2、3、4、5、6、7或8上具有Lys的SEQ ID 116的变体。
117.根据实施方案96-116中任一项的化合物，其中该化合物包含恰好两个连接至所述融合肽的取代基。
118.根据实施方案117的化合物，其中一个取代基经由实施方案105-107中定义的GLP-1类似物连接，并且一个取代基连接至如实施方案115-116中任一项所定义的间隔体上。
119.根据实施方案117的化合物，其中一个取代基经由实施方案109-113中任一项所定义的EGF(A)类似物连接，并且一个取代基连接至如实施方案115-116中任一项所定义的肽间隔体上。
120.根据实施方案117的化合物，其中一个取代基经由实施方案105-107中任一项所定义的GLP-1类似物连接，并且一个取代基连接至如实施方案109-113中任一项所定义的EGF(A)类似物上。
121.根据实施方案117的化合物，其中所述两个取代基经由实施方案105-108中任一项所定义的GLP-1类似物连接。
122.根据实施方案117的化合物，其中所述两个取代基经由实施方案109-113中任一项所定义的EGF(A)类似物连接。
123.根据前述实施方案96-122中任一项的化合物，其中所述取代基包含脂肪酸基团(AB)。
124.根据实施方案123的化合物，其中所述取代基包含选自以下化学式的脂肪酸基团：化学式1–C(＝O)-(CH2)n-COOH，其中n为8-20范围内的整数，以及化学式2–HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*，其中m为8-11范围内的整数。
125.根据实施方案123的化合物，其中所述取代基包含选自二酸–C(＝O)-(CH2)n-COOH的脂肪酸基团，其中n为14-20。
126.根据实施方案123的化合物，其中所述取代基包含选自二酸(–HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*)的脂肪酸基团，其中m为8-11范围内的整数。
127.根据实施方案123-126中任一项的化合物，其中所述至少一个取代基进一步包含至少一个连接体元件。
128.根据实施方案123-126中任一项的化合物，其中所述至少一个取代基进一步包含被表示为-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-的至多6个连接体元件。
129.根据实施方案123-126中任一项的化合物，其中所述至少一个取代基进一步包含被表示为-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-的至多6个连接体元件，其中Z1与脂肪酸基团相连，并且最后一个Z元件与肽骨架相连。
130.根据实施方案128和129中任一项的化合物，其中–Z1为*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*或键。
131.根据实施方案128和130中任一项的化合物，其中–Z2-为γGlu、Glu或键。
132.根据实施方案128和130中任一项的化合物，其中–Z2-为γGlu。
133.根据实施方案128和132中任一项的化合物，其中Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自Glu、γGlu和Ado和键。
134.根据实施方案128和132中任一项的化合物，其中Z3、Z4、Z5和Z6彼此独立地选自γGlu、Ado和键。
135.根据实施方案123-134中任一项的化合物，其中所述至少一个取代基包含含有-γGlu-Ado-Ado-的连接体。
136.根据实施方案123的化合物，其中所述至少一个取代基选自取代基#1-13，例如选自取代基#1-4、#5-12、#6-12或由下列基团组成的取代基组：取代基#1、#5和#6。
137.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物是双功能的。
138.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物是GLP-1受体激动剂。
139.根据实施方案137或实施方案138的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50为1-50pM、10-100pM、50-100pM、100-250pM或250-1000pM。
140.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物是完全GLP-1受体激动剂。
141.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50与野生型GLP-1相当。
142.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50至多为50pM。
143.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50与索马鲁肽相当。
144.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(无HSA)中的EC50为5-15pM。
145.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(具有1％HSA)中的EC50至多为2500pM。
146.根据前述实施方案137-139中任一项的化合物，其中该化合物在C1中描述的GLP-1体外效力试验(具有1％HSA)中的EC50至少为500pM。
147.根据前述实施方案137-46中任一项的化合物，其中该化合物在如C7中所述的db/db小鼠中具有降低血糖的能力。
148.根据前述实施方案137-46中任一项的化合物，其中该化合物在如C7中所述的db/db小鼠中具有降低血糖的能力，并且其中EC50 AUC ΔBG24h小于15nmol/kg。
149.根据前述实施方案137-46中任一项的化合物，其中所述GLP-1类似物在如C8中所述的DIO大鼠中具有降低体重的能力。
150.根据前述实施方案137-146中任一项的化合物，其中该化合物在如C8中所述的DIO大鼠中具有降低体重的能力，并且其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述GLP-1类似物能够将体重降低至基线体重的至少95％。
151.根据前述实施方案137-146中任一项的化合物，其中该化合物在如C8中所述的DIO大鼠中具有降低体重的能力，并且其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，所述GLP-1类似物能够将体重降低至基线体重的至少90％。
152.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物是PCSK9抑制剂。
153.根据前述实施方案137-145中任一项的化合物，其中与由SEQ ID NO.:1所确定的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域相比，该化合物具有增加的对人PCSK9的结合亲和力。
154.根据前述实施方案137-145中任一项的化合物，其中当在C3部分中所述的PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，该化合物以低于50nM，如低于25nM或如低于10nM的Ki结合PCSK9。
155.根据前述实施方案137-145中任一项的化合物，其中当在C3部分中所述的PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，该化合物以低于5nM的Ki结合PCSK9。
156.根据前述实施方案137-145中任一项的化合物，其中该化合物增加LDL摄取。
157.根据前述实施方案137-145中任一项的化合物，其中该化合物在人PCSK9的存在下增加LDL摄取。
158.根据前述实施方案137-152中任一项的化合物，其中当在C4部分中所述的LDL摄取试验中测量时，该化合物的EC50低于1000nM。
159.根据前述实施方案137-145中任一项的化合物，其中当在C4部分中所述的LDL摄取试验中测量时，该化合物的EC50低于500nM。
160.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中当如C8部分所述在DIO大鼠中评价时，该化合物降低血液胆固醇。
161.根据实施方案160的化合物，其中当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物使血液胆固醇降低至少0.5mmol/L。
162.根据实施方案160的化合物，其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物使血液胆固醇降低至少0.8mmol/L。
163.根据实施方案中任一项的化合物，其中该化合物是如前述实施方案139-144中任一项所定义的GLP-1受体激动剂和如前述实施方案153-159中任一项所定义的PCSK9抑制剂。
164.根据实施方案160的化合物，其中该化合物的表观EGF(A)Ki(C3)与GLP-1效力(C1，无HSA)之比为至多5000，如至多4000，如至多3000，如至多2000或如至多1000。
165.根据实施方案160的化合物，其中该化合物的表观EGF(A)Ki(C3)与GLP-1效力(C1，无HSA)之比为至多1000，如至多800，如至多600，如至多400或如至多200。
166.根据实施方案160的化合物，其中该化合物的表观EGF(A)Ki(C3)与GLP-1效力(C1，无HSA)之比为至多200，如至多150，如至多100个，如至多50、25和10。
167.根据前述实施方案137-166中任一项的化合物，其中在如本文C8部分所述的体内大鼠研究中，该化合物能够至少与GLP-1/EGF(A)化合物#41相等地降低胆固醇和体重。
168.根据实施方案167的化合物，其中当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物能够使胆固醇降低至少0.5mmol/L。
169.根据实施方案167的化合物，其中当以30nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物能够使胆固醇降低至少0.6，如0.7或如0.8mmol/L。
170.根据实施方案167的化合物，其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物能够使胆固醇降低至少0.8mmol/L。
171.根据实施方案167的化合物，其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物能够使胆固醇降低至少1.0或如1.2mmol/L。
172.根据实施方案167-171的化合物，其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物能够使体重降低至基线体重的至少95％。
173.根据实施方案167-171的化合物，其中当以300nmol/kg/天给药并在21天后测量时，该化合物能够使体重降低至基线体重的至少90％。
174.根据前述实施方案中任一项的化合物，其中该化合物选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#1至#314的化合物。
175.包含GLP-1受体激动剂和EGF(A)类似物的化合物，其中所述EGF(A)类似物是由SEQ ID No:1所确定的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域的类似物。
176.根据实施方案175的化合物，其中所述EGF(A)类似物如前述实施方案64-89中任一项所定义。
177.化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#1至#305的化合物。
178.化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#1至#314的化合物。
179.化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#1、2、21、22、23、25、26、27、29、32、41、48、51、52、53,54、69、82、86、221、230、287、298和306的化合物。
180.化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#1、2、21、22、23、25、26、27、29、32、48、52、53、54、69和306的化合物。
181.化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#41、#48、#69和#306，如#306和#69，或如#306或#69的化合物。
182.根据前述实施方案中任一项的化合物在制备药物中的用途。
183.根据前述实施方案1-181中任一项的化合物，其用于制备药物。
184.根据前述实施方案1-181中任一项的化合物，其用于治疗方法中。
185.根据前述实施方案1-181中任一项的化合物，其用于糖尿病和/或超重的治疗方法中。
186.根据前述实施方案1-181中任一项的化合物，其用于治疗或预防心血管疾病和/或心血管风险的方法中。
187.根据前述实施方案1-181中任一项的化合物，其用于改善脂质参数的治疗方法中。
188.根据前述实施方案1-181中任一项的化合物，其用于治疗糖尿病和心血管疾病的方法中。
189.治疗糖尿病和/或超重的方法，所述方法包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据前述实施方案1-181中任一项的化合物。
190.治疗或预防心血管疾病和/或心血管风险的方法，所述方法包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据前述实施方案1-181中任一项的化合物。
191.用于改善脂质参数的治疗方法，所述方法包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据前述实施方案1-181中任一项的化合物。
192.治疗糖尿病和心血管疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用药学上有效量的根据前述实施方案1-181中任一项的化合物。
方法与实施例
缩写列表
Aib：α-氨基异丁酸(2-氨基异丁酸)
AcOH：乙酸
Ado：8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
API：活性药物成分
AUC：曲线下面积
BG：血糖
BHK：幼仓鼠肾
BW：体重
Boc：叔丁氧羰基
BSA：牛血清白蛋白
Bzl：苄基
CAS：化学文摘服务
Clt：2-氯三苯甲基
可力丁(collidine)：2,4,6-三甲基吡啶
DCM：二氯甲烷
Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基
DesH：脱氨基组氨酸(咪唑丙酸或3-(咪唑-5-基)丙酸)，Imp)
DIC：二异丙基碳二亚胺
DIPEA：二异丙基乙胺
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)
DooaSuc：8-氨基-3,6-二氧杂辛基琥珀酰胺酸
DTT：二硫苏糖醇
EDTA：乙二胺四乙酸
EGF：表皮生长因子样
EGF(A)：表皮生长因子样结构域A
EGTA：乙二醇四乙酸
FCS：胎牛血清
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
HATU：(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)
HBTU：(2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)
HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
hPCSK9：人PCSK9
HPLC：高效液相色谱法
HSA：人血清白蛋白
IBMX：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
IC50：半数最大抑制浓度
Imp：咪唑丙酸或3-(咪唑-5-基)丙酸)(也称为脱氨基组氨酸，DesH)
Inp：异哌啶酸
i.v.：静脉内
ivDde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基
IVGTT：静脉内葡萄糖耐量试验
LCMS：液相色谱质谱法
LDL-R或LDLr：LDL受体
LDL：低密度脂蛋白
LDL-C：LDL胆固醇
LYD：Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS：参见MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法
MeOH：甲醇
Mmt：4-甲氧基三苯甲基
MRT：平均停留时间
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMP：N-甲基吡咯烷酮
ND：未确定
OBz：苯甲酰酯
OEG：8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(也称为Ado)
OPfp：五氟苯氧基
OPnp：对硝基苯氧基
OSu：O-琥珀酰亚胺酯(羟基琥珀酰亚胺酯)
OtBu：叔丁酯
Oxyma氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PD：药效学
Pen/Strep：青霉素/链霉素
PK：药代动力学
QC：质量控制
RP：反相
RP-HPLC：反相高效液相色谱法
RT：室温
Rt：停留时间
s.c.：皮下
SD：标准偏差
SEC-HPLC：大小排阻高效液相色谱法
SEM：平均值的标准误差
SPA：闪烁迫近测定
SPPS：固相肽合成
tBu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
TIS或TIPS：三异丙基硅烷
Tos：对甲苯磺酸酯(或对甲苯磺酰基)
TotaGlyc：13-氨基-4,7,10-三氧杂三癸基二甘酰胺酸
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇
Trt：三苯基甲基(三苯甲基)
Trx：氨甲环酸
TtdSuc：13-氨基-4,7,10-三氧杂三癸基琥珀酰胺酸
UPLC：超高效液相色谱法
具体材料
二十烷二酸单叔丁酯
二十二烷二酸单叔丁酯
4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸叔丁酯
Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
Fmoc-氨甲环酸
Fmoc-Lys(Mtt)-OH
Boc-His(Trt)-OH
Fmoc-Aib-OH
二十烷二酸单叔丁酯、二十二烷二酸单叔丁酯和4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸叔丁酯的制备在下面的第2节中描述，最后提到的五种材料是可商购获得的。
方法
该部分分为三块：部分A涉及制备本发明化合物的通用方法，部分B涉及本发明大量具体化合物的制备，部分C涉及本发明化合物的表征方法，还包括大量具体实施例化合物的结果。
A1.一般制备方法
该部分涉及固相肽合成方法(SPPS法，包括氨基酸脱保护方法，从树脂上切割肽的方法，以及其纯化方法)，以及检测和表征所得肽的方法(LCMS和UPLC方法)。
在一些情况下，可通过将在二肽酰胺键上受保护的二肽与可在酸性条件下被切割的基团(诸如但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苄基，或2,4,6-三甲氧基苄基)一起使用来改善肽的固相合成。在肽中存在丝氨酸或苏氨酸的情况下，可以使用假脯氨酸二肽(可从例如Novabiochem获得，也参见W.R.Sampson(1999),J.Pep.Sci.5,403)。所使用的Fmoc保护的氨基酸衍生物是推荐的标准品：例如由Anaspec、Bachem、Iris Biotech或Novabiochem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH或Fmoc-Val-OH等。在没有任何其它说明时，使用天然L型的氨基酸。N-末端氨基酸在α氨基处经Boc保护(例如，对于在N-末端处具有His的肽，为Boc-His(Boc)-OH或Boc-His(Trt)-OH)。在使用SPPS进行模块化白蛋白结合部分连接的情况下，以下适当保护的结构单元，诸如但不限于Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、Fmoc-氨甲环酸、Fmoc-异哌啶酸、Fmoc-Glu-OtBu和十六烷酸单叔丁酯，由例如Anaspec、Bachem、IrisBiotech或Novabiochem提供。二十烷二酸单叔丁酯、二十二烷二酸单叔丁酯和4-(10-羧酸癸氧基)苯甲酸叔丁酯可以如下所述制备。下述所有操作均以400-μmol或450-μmol的合成规模进行。
1.树脂结合的经保护的肽酰肼的合成
方法：SPPS_P
使用相对于树脂负载(例如0.49mmol/g Fmoc-亚肼基-丙酮基-氨基甲基聚苯乙烯树脂(PYV1000，来自Iris Biotech,95615 Marktredwitz,Germany))五倍过量的Fmoc-氨基酸(在含有300mM Oxyma的DMF中300mM)，以400-μmol或450-μmol的规模在来自Protein Technologies(Tucson,AZ 85714 U.S.A.)的Prelude或SymphonyX固相肽合成仪上进行SPPS_P。使用在DMF中的20％哌啶或在含有0.1M Oxyma的DMF中的20％哌啶进行Fmoc脱保护。使用在DMF中的5:5:5:5的氨基酸/Oxyma/DIC/可力丁进行偶联。在脱保护与偶联步骤之间进行DMF顶部清洗(6个循环9ml)。偶联时间通常为120分钟。对包括但不限于Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OH或Boc-His(Trt)-OH的一些氨基酸进行“双偶联”，其意思是在第一次偶联(例如，60min)后，将树脂排干并添加更多试剂(氨基酸、OxymaDIC和可力丁)，并使混合物再次反应(例如，60min)。
2.树脂结合的经保护的Cys-肽酸的合成
使用相同的偶联程序，使用低负荷Fmoc-Glu(OtBu)-Wang(0.32mmol/g)树脂如上所述进行SPPS_P。
3.白蛋白结合物的合成
二十烷二酸单叔丁酯可以如本领域已知的那样制备，例如，如WO2010102886 A1所述。
二十二烷二酸单叔丁基酯可以如本领域已知的那样制备，例如，如WO2015000942A1所述。
4-(10-羧基癸氧基)苯甲酸叔丁酯可以如本领域已知的那样制备，例如，如WO2006082204 A1所述。
4.侧链与树脂结合的经保护的肽骨架的连接
当赖氨酸侧链上存在酰化时，将待酰化的赖氨酸的ε氨基用Mtt保护。Mtt的去除使用六氟异丙醇/DCM(75:25，3x 10ml，分别为5min、25min和25min)进行，然后用DCM(4x10ml)、DMF(2x 9ml)、含有0.1M Oxyma的DMF中的20％哌啶(1x 9ml)、DMF(4x 9ml)洗涤树脂。可通过树脂结合的肽的酰化或通过在未保护的肽的溶液中的酰化(如WO2010029159 A1所述)，使延长部分和/或连接体连接至该肽。在延长部分和/或连接体与经保护的肽基树脂连接的情况下，通过使用SPPS和适当保护的结构单元，该连接可以是模块化的。
方法：SC_P
如上所述去除N-ε-赖氨酸保护基团，并使用如上所述的适当保护的结构单元，通过Prelude或SymphonyX肽合成仪上的一个或多个自动化步骤进行赖氨酸的化学修饰。如SPPS_P中所述进行双偶联，每个偶联1小时，或者进行单偶联，每个偶联2小时。
5.连接有或没有侧链的树脂结合肽的切割和纯化
方法：CP_M1
合成后，用DCM洗涤树脂，并通过用TFA/TIS/水/DTT(92.5/2.5/2.5/2.5或90/5/2.5/2.5)处理2-3小时从树脂上切下肽，随后用乙醚沉淀。将肽溶解于合适的溶剂(例如，水/乙腈)中，并使用乙腈/水/TFA，在C18,5μM柱上通过标准RP-HPLC进行纯化。通过UPLC和LCMS方法的组合分析级分，并将合适的级分合并，并冻干。
如果需要，可以使用本领域已知的方法将肽抗衡离子交换为钠。作为实例，将5克Sep-pak C18柱用50ml 2-丙醇、50ml乙腈和50ml水洗涤。将约70mg蛋白质在21ml 50mMHEPES缓冲液(pH 7.2)中的溶液上样至Sep-pak柱，用50ml水、50ml 0.1M氯化钠(水溶液)和50ml水洗涤。该蛋白质的钠盐用100ml水/乙腈(30:70)洗脱并冻干。
6.肽酰肼与Cys-肽的天然化学连接及纯化
方法：NCL_M1
将肽酰肼(1.0当量)溶解于0.2M磷酸二钠/6.0M盐酸胍(水溶液，pH 3.0)中至终浓度4.0mM，并冷却至-10℃。加入亚硝酸钠(在水中0.2M，5当量)，并将混合物在-10℃下搅拌20分钟。向该溶液中加入0.2M 4-巯基苯乙酸(50当量)在0.2M磷酸二钠/6.0M盐酸胍(pH调节至7.0)中的溶液，然后加入Cys-肽(1.1当量)。用氢氧化钠(1.0M，水溶液)将溶液的pH调节至6.7，并将混合物在25℃下搅拌16小时。将1,4-二硫苏糖醇(100当量)添加至反应混合物中并搅拌30分钟，然后用浓盐酸(水溶液)将pH调节至3.0。使用来自EMD Millipore(Billerica，MA 01821 U.S.A.)的具有Ultracel-3膜的Amicon Ultra-15离心过滤器装置通过超滤浓缩反应混合物。浓缩的溶液用0.05M磷酸二钠/6.0M盐酸胍(水溶液，pH 3.0)稀释，并再次通过超滤浓缩。重复该过程，直到4-巯基苯乙酸的浓度低于0.1mM(对应于>1000倍稀释)。将该浓缩溶液滴加到50mM三(羟甲基)氨基甲烷、5mM氯化钙、3mM半胱氨酸、0.3mM胱氨酸的搅拌的溶液(水溶液，pH 8.2)中，得到约0.1mg/ml的蛋白质浓度。将该溶液在25℃下搅拌16小时。用浓盐酸(水溶液)将折叠混合物的pH调节至约3，然后在C18，5μm柱上通过标准RP-HPLC使用乙腈/水/TFA进行纯化。通过UPLC和LCMS方法的组合来分析级分，并将适当的级分合并，并冻干。
7.融合蛋白的重组表达
使用合适的宿主，通过异源表达提供目标融合蛋白。使用已知技术构建表达质粒，并通过本领域技术人员已知的方法表达并纯化融合蛋白。简而言之，收集细胞并使用细胞破碎器在pH 7的1X PBS缓冲液中裂解。收集含有融合蛋白的不溶性级分，并在相同缓冲液中洗涤两次(6,000g/20min)。然后使用20mM乙醇胺，2M尿素，pH 10.5在室温(22-26℃)下将包涵体溶解至10mg/mL的浓度。一小时后，用脱矿物质水将溶液稀释3倍，并将pH调节至8.5。在相同温度下以1:1,000的比例进行肠激酶裂解20小时。之后，添加最终浓度为10mM的CaCl2和5mM半胱氨酸进行重折叠。将pH调节至3.0后，从SP快速流动琼脂糖中捕获蛋白质。将捕获的样品上样至pH7.5的反相FeF柱。选择Source 30Q柱(20mM Tris，5mM CaCl2，pH9.0)作为最终精制步骤。
8.非蛋白型氨基酸向重组蛋白中的掺入
可以通过在含有Fmoc-His-Aib-OH的溶液中酰化来引入N-端His-Aib二肽，然后去除Fmoc保护基团(如WO2013098191 A1所述)。
A2.用于检测和表征的一般方法
1.LC-MS方法
方法：LCMS01
在由Waters Acquity UPLC系统和来自Micromass的LCT Premier XE质谱仪组成的装置上进行LCMS01。洗脱液：A：0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸的乙腈溶液。通过将适当体积的样品(优选2-10μl)注射到柱上并用A和B的梯度洗脱，在室温下进行该分析。UPLC条件、检测器设置和质谱仪设置为：柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mm×50mm。梯度：在4.0min(备选8.0min)期间的线性5％-95％乙腈，0.4ml/min。检测：214nm(来自TUV(可调谐的UV检测器)的模拟输出)MS电离模式：API-ES。扫描：100-2000amu(备选500-2000amu)，步长0.1amu。
方法：LCMS34
在由Waters Acquity UPLC系统和Xevo G2-XS Qtof质谱仪组成的装置上进行LCMS34。洗脱液：A：0.1％甲酸水溶液；B：0.1％甲酸的乙腈溶液。通过将适当体积的样品(优选2-10μl)注射到柱上并用A和B的梯度洗脱，在室温下进行该分析。UPLC条件、检测器设置和质谱仪设置为：柱：Waters Acquity UPLC BEH，C-18，1.7μm，2.1mm×50mm。梯度：在4.0min(备选8.0min)期间的线性5％-95％乙腈，0.4ml/min。检测：214nm(来自TUV(可调谐的UV检测器)的模拟输出)MS电离模式：API-ES。扫描：100-2000amu(备选500-2000amu)，步长0.1amu。
方法：LCMS27
在由Agilent 1290 infinity系列和具有Agilent Jet Stream源电离的AgilentTechnologies LC/MSD TOF 6230(G6230A)检测器组成的装置上进行LCMS27。洗脱液：A：0.02％TFA水溶液；B：0.02％TFA的乙腈溶液。通过将适当体积的样品(优选2-10μl)注射到柱上并用A和B的梯度洗脱，在室温下进行该分析。UPLC条件、检测器设置和质谱仪设置为：柱：Aeris Widepore，C-18，3.6μm，2.1mm x 50mm。梯度：在4.0min期间的线性5％-95％乙腈，0.4ml/min。检测：214nm(来自TUV(可调谐的UV检测器)的模拟输出)。扫描：100-3200amu。
2.UPLC方法
方法：UPLC01
使用安装有双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP分析。使用ACQUITY UPLCBEH130，C18，1.7um，2.1mm×150mm柱(40℃)收集214nm和254nm处的UV检测。该UPLC系统与两个洗脱液储器连接，该储器含有：A：99.95％H2O，0.05％TFA；B：99.95％CH3CN，0.05％TFA。使用以下线性梯度：在0.40ml/min的流速下经16分钟从95％A，5％B至40％A，60％B。
方法：UPLC02
使用安装有双波段检测器的Waters UPLC系统进行RP分析。使用ACQUITY UPLCBEH130，C18，1.7um，2.1mm×150mm柱(40℃)收集214nm和254nm处的UV检测。该UPLC系统与两个洗脱液储器连接，该储器含有：A：99.95％H2O，0.05％TFA；B：99.95％CH3CN，0.05％TFA。使用以下线性梯度：在0.40ml/min的流速下经16分钟从95％A，5％B至5％A，95％B。
A3.所选中间体的表征
肽酰肼：
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L]EGF(A)(293-303)酰肼，具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
制备方法：SPPS_P；CP_M1
LCMS34：m/3＝1970.3，m/4＝1478.0，m/5＝1182.6
UPLC02：Rt＝9.3min
Cys-肽：
[309R,312E,321E]EGF(A)(304-332)
制备方法：SPPS_P；CP_M1
LCMS01：m/3＝1119.8，m/4＝840.1，m/5＝672.3
UPLC02：Rt＝8.4min
B1.具体化合物–EGF(A)类似物和衍生物
EGF(A)类似物和衍生物(EGF(A)化合物1-159)的汇总表
B2.具体化合物–GLP-1/EGF(A)化合物
化合物的制备如上所述进行。通过参考本文其它地方提供的每个元件的氨基酸序列、取代基和一个或两个取代基的特定连接点来提供化合物的身份。下面显示了一些示例，并且下面提供了汇总表。
GLP-1/EGF(A)化合物#1
其也可以被描述为：
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#1
或
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#1
(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
或
SEQ ID 193，其具有经由SEQ ID 193的位置20的赖氨酸(K)(等于[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K)(的ε氮)连接的取代基#1。
GLP-1/EGF(A)化合物#23
其也可以被描述为：
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#6
或
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#6
(HOOC-(CH2)18-CO-Trx-γGlu-Ado-Ado)。
或
SEQ ID 193，其具有经由SEQ ID 193位置20的赖氨酸(K)连接的取代基#6。
GLP-1/EGF(A)化合物#41
其也可以被描述为
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E]EGF(A)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1的26K(的ε氮)和[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)的333K(的ε氮)连接的取代基#1
或
[8Aib,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1的26K(的ε氮)和[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)的333K(的ε氮)连接的取代基#1
(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)
或
SEQ ID 190，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1的26K(的ε氮)和[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)的333K(的ε氮)连接的取代基#1
(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
或
SEQ ID 190，其具有经由位置20和80的Lys连接的取代基#1
(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
GLP-1/EGF(A)化合物#42
其也可以被描述为
[8Aib,26R,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)，其具有经由[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)的313K和321K(的ε氮)连接的取代基#13
或
[8Aib,26R,34R]GLP-1(7-37)-GQAPGQAP-[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)，其具有经由[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)的313K和321K(的ε氮)连接的取代基#13
(4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado)。
或
SEQ ID 380，其具有经由[301L,309R,312E,313K,321K]EGF(A)的313K和321K(的ε氮)连接的取代基#13(4-COOH-PhO-C11-γGlu-Ado-Ado)。
或
SEQ ID 380，其具有经由SEQ ID 380的位置60和68的Lys连接的取代基#13。
GLP-1/EGF(A)化合物#75
其也可以被描述为
[301L,309R,312E,321E]EGF(A)-GQAPGQAP-[8Aib,34R]GLP-1(7-37)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#1
或
[301L,309R,312E,321E]EGF(A)-GQAPGQAP-[8Aib,34R]GLP-1(7-37)，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#1
(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)
或
SEQ ID 386，其具有经由[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的26K(的ε氮)连接的取代基#1(HOOC-(CH2)16-CO-γGlu-Ado-Ado)。
或
SEQ ID 386，其具有经由SEQ ID 386(7-37)位置68的Lys连接的取代基#1。
通过参考如本文其它地方提供的每个元件的氨基酸序列、取代基和一个或两个取代基的特定连接点，提供其它化合物的身份。
包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的衍生物(GLP-1/EGF(A)化合物)的汇总表
分别参考GLP-1和EGF(A)类似物表示取代基的连接。如上所述，26K等于GLP-1(7-37)序列中的位置20，而EGF(A)类似物的324K是LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域位置32处的氨基酸置换。可以类似的方式推导出其它连接位点的具体位置。取代基相对于肽骨架的具体位置将根据间隔体的长度以及GLP-1和EGF(A)类似物的可能截短而不同。
表10：在C-端具有EGF(A)类似物的化合物
在N-末端具有EGF(A)类似物的化合物
下表提供了用于选择化合物的分析数据。
包含GLP-1/EGF(A)化合物分析数据的表格
C.一般表征方法
为了表征化合物，可以在各种试验中测试功能性。
C1-GLP-1体外效力
本实施例的目的在于在体外测试化合物如包含GLP-1类似物的衍生物的GLP-1活性(或效力)。体外效力是在全细胞试验中人GLP-1受体激活的量度。
如下所述确定GLP-1/EGF(A)化合物的衍生物的效力，并包括GLP-1(7-37)和索马鲁肽的数据用于比较。
原理
通过在报告基因试验中测量人GLP-1受体的应答来确定体外效力。在表达人GLP-1受体并含有与启动子偶联的cAMP响应元件(CRE)DNA以及萤火虫萤光素酶(CRE萤光素酶)基因的稳定转染的BHK细胞系中进行该试验。当人GLP-1受体被激活时，其导致cAMP的产生，这进而导致萤光素酶蛋白质得到表达。当试验孵育完成时，添加萤光素酶底物(萤光素)，并且该酶将萤光素转化成氧化萤光素从而产生生物发光。测量该发光作为该试验的读出。
细胞培养和制备
该试验中使用的细胞(克隆FCW467-12A/KZ10-1)是以BHKTS13作为亲本细胞系的BHK细胞。该细胞来源于表达人GLP-1受体的克隆(FCW467-12A)，并且是通过用CRE萤光素酶进一步转染而建立的，从而获得本克隆。
将细胞在细胞培养基中在5％CO2下培养。将细胞等分并储存在液氮中。在每次测定前取出等份，并在PBS中洗涤两次，之后以所需浓度悬浮在测定特异性缓冲液中。对于96孔板，制备悬浮液以得到5×103个细胞/孔的终浓度。
材料
在该试验中使用了以下化学物质：Pluronic F-68(10％)(Gibco 2404)、人血清白蛋白(HSA)(Sigma A9511)、卵白蛋白(Sigma A5503)、不含酚红的DMEM(Gibco 11880-028)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax 100×(Gibco 35050)和steadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
缓冲液
细胞培养基为含有10％FBS(胎牛血清；Invitrogen 16140-071)、1mg/ml G418(Invitrogen 15140-122)、240nM MTX(氨甲蝶呤；Sigma M9929)和1％pen/strep(青霉素/链霉素；Invitrogen 15140-122)的DMEM培养基。
测定培养基为不含酚红的DMEM、10mM Hepes和1×Glutamax。测定缓冲液由在测定培养基中的2％卵白蛋白和0.2％Pluronic F-68组成。
程序
1)将细胞储备液在37℃水浴中解冻。
2)将细胞在PBS中洗涤三次。
3)对细胞进行计数并在测定培养基中调节至5×103个细胞/50μl(1×105个细胞/ml)。将50μl等份的细胞转移至测定板的每个孔中。
4)将测试化合物和参考化合物的储备液在测定缓冲液中稀释至0.2μM的浓度。将化合物稀释10倍以得到以下的浓度：2×10-7M、2×10-8M、2×10-9M、2×10-10M、2×10-11M、2×10-12M、2×10-13M和2×10-14M。
5)将50μl等份的化合物或空白从稀释板转移至测定板。在下列终浓度下测试化合物：1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M和1×10-14M。
6)将测定板在5％CO2培养箱中于37℃孵育3h。
7)将测定板从培养箱中取出并使其在室温下静置15min。
8)向测定板的每个孔中添加100μl等份的steadylite plus试剂(试剂是光敏的)。
9)将每个测定板用铝箔覆盖以避光，并在室温下振荡30min。
10)在Packard TopCount NXT仪器中读取每个测定板。
计算和结果
在包括和不包括HSA的情况下，对一系列化合物进行如上所述的体外效力试验。将来自TopCount仪器的数据传输至GraphPad Prism软件。该软件进行非线性回归(log(激动剂)相对于响应)。用该软件计算并以pM为单位报告的EC50值在以下表1中示出。
对每个样品最少测量两个重复品。所报告的值为重复品的平均值。
表1：GLP-I/EGF(A)化合物(即包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的衍生物)的体外效力。
大多数GLP-1/EGF(A)化合物显示出GLP-1活性。特定效力(在不存在和存在HSA的情况下)受类似物中的氨基酸变异以及间隔体和取代基的身份的影响。上面的数据表明，可以获得效力与GLP-1(7-37)和索马鲁肽相当或相对降低的化合物。
此外，当EGF(A)类似物连接到GLP-1类似物的N-末端(化合物75，SEQ ID 386)而不是GLP-1类似物的C-末端(化合物1，SEQ ID 193)时，观察到GLP-1效力的显著损失。
C2-GLP-1–体外受体结合
本实施例的目的在于在体外测试GLP-1衍生物的受体结合。受体结合是衍生物对人GLP-1受体的亲和力的量度。
原理
在竞争结合试验中测量与人GLP-1受体的受体结合。在这种类型的试验中，使标记的配体(在这种情况下为125I-GLP-1)与受体结合。将每种衍生物/化合物以一系列浓度添加至含有人GLP-1受体的隔离的膜中，并监测标记的配体的置换。该受体结合被报告为一半的标记配体从受体上被置换时的浓度——IC50值。包括GLP-1(7-37)和索马鲁肽作为比较化合物。
材料
在该试验中使用以下化学物质：人血清白蛋白(HSA)(Sigma A1653)、不含酚红的DMEM(Gibco 11880-028)、Pen/strep(Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、1M Hepes(Gibco 15630)、EDTA(Invitrogen 15575-038)、PBS(Invitrogen 14190-094)、胎牛血清(Invitrogen 16140-071)、EGTA、MgCl2(Merck 1.05832.1000)、吐温20(Amresco 0850C335)、SPA颗粒(麦胚凝集素(WGA)SPA珠子,Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(内部生产的)、OptiPlateTM-96(Packard 6005290)。
缓冲液1由20mM Na-HEPES外加10mM EDTA组成，并且pH被调节至7.4。缓冲液2由20mM Na-HEPES外加0.1mM EDTA组成，并且pH被调节至7.4。测定缓冲液由补充有5mM EGTA、5mM MgCl2、0.005％w/v吐温20的50mM HEPES组成，并且pH被调节至7.4。8％白蛋白储备液由以8％(w/v)溶解在测定缓冲液中的HSA组成。0.02％白蛋白储备液由以0.02％(w/v)溶解在测定缓冲液中的HSA组成。
细胞培养和膜制备
该试验中使用的细胞(克隆FCW467-12A)是以BHKTS13作为亲本细胞系的BHK细胞。该细胞表达人GLP-1受体。
使细胞在DMEM、10％胎牛血清、1％pen/strep(青霉素/链霉素)和1.0mg/ml选择标记G418中在5％CO2下生长。
为制备膜制品，使细胞生长至约80％汇合。将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次并收获。使用短暂的离心使细胞沉淀，并将细胞沉淀物保存在冰上。将细胞沉淀物用ULTRA-THURRAXTM分散仪器在适量的缓冲液1(例如，10ml)中均质化20-30秒。将匀浆离心15分钟。将沉淀物重悬(均质化)在10ml缓冲液2中并离心。再一次重复该步骤。将所得的沉淀物重悬于缓冲液2中，并测定蛋白质浓度。将膜等分并储存在-80℃下。
程序
1)对于存在低HSA(0.005)的受体结合试验，向测定板的每个孔中添加50μl的测定缓冲液。
2)对测试化合物进行系列稀释以得到以下浓度：8×10-7M、8×10-8M、8×10-9M、8×10-10M、8×10-11M、8×10-12M和8×10-13M。将25μl添加至测定板的适当孔中。
3)将细胞膜等份解冻并稀释至其工作浓度。向测定板的每个孔中添加50μl。
4)将WGA SPA珠子以20mg/ml悬浮于测定缓冲液中。在临添加至测定板之前，将该悬浮液在测定缓冲液中稀释至10mg/ml。向测定板的每个孔中添加50μl。
5)通过向测定板的每个孔中添加25μl的[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2的480pM溶液来开始孵育。保留25μl等份以用于测量总计数/孔。
6)将测定板在30℃下孵育2h。
7)将测定板离心10min。
8)在Packard TopCount NXT仪器中读取测定板。
计算
将来自TopCount仪器的数据传输到GraphPad Prism软件。该软件执行非线性回归。用该软件计算IC50值并以nM为单位报告。
结果
获得以下结果：
表2：GLP-1/EGF(A)化合物的GLP-1受体结合
上面的数据表明，GLP-1的结合取决于具体的序列和取代基，并且为了制备具有与GLP-1(7-37)或索马鲁肽相当或降低的受体结合的化合物，可以获得各种水平的GLP-1结合活性。再次，当EGF(A)类似物连接至GLP-1类似物的N-末端(化合物75，SEQ ID 386)而不是GLP-1类似物的C-末端(化合物1，SEQ ID 193)时，观察到GLP-1结合的显著损失。
C3-PCSK9-LDL-R结合-竞争性(ELISA)
该试验测量与LDL-R竞争时对PCSK9的表观结合亲和力。特别地，该试验用来评价EGF(A)类似物和包含EGF(A)类似物的化合物(如GLP-1/EGF(A)化合物)对PCSK9的表观结合亲和力。
该试验如下进行。实验前一天，将重组人低密度脂蛋白受体(rhLDL-R；NSO-衍生的；R&Dsystems#2148-LD)以1μg/ml溶解于50mM碳酸钠，pH 9.6中，然后向测定板(Maxisorp96，NUNC#439454)的每个孔中添加100μl的该溶液，并在4℃下包被过夜。在实验当天，一式两份制作含生物素化PCSK9(0.5ug/ml，BioSite/BPSBioscience目录号71304)的EGF(A)化合物的八点浓度曲线。制备测试化合物和生物素化PCSK9的混合物，并于室温下在含有25mMHepes，pH 7.2(15630-056，100ml，1M)、150mM NaCl(Emsure 1.06404.1000)、1％HSA(SigmaA1887-25G)、0.05％吐温20(Calbiochem 655205)、2mM CaCl2(Sigma 223506-500G)的测定缓冲液中孵育1小时。然后将包被的测定板用200μl测定缓冲液洗涤4次，然后将100μl的测试化合物和生物素化PCSK9的混合物添加至该板并在室温下孵育2小时。将平板用200μl的测定缓冲液洗涤4次，然后在室温下与链霉亲和素-HRP(25ng/ml；VWR#14-30-00)孵育1小时。通过添加50μl的TMB-on(KEM-EN-TEC)来检测该反应并在黑暗中孵育10分钟。然后通过向混合物中添加(通过电子多次移液添加)50μl的4M H3PO4终止该反应。然后在1小时内用Spectramax在450和620nm处读板。620nm读数用于背景减除。使用Graphpad Prism，通过非线性回归对数(抑制剂)对响应变量斜率(四个参数)计算IC50值，并使用以下公式转换成Ki值：Ki＝IC50/(1+(生物素-PCSK9)/(kd(生物素-PCSK9)))，其中生物素-PCSK9的Kd为1.096727714μg/ml，并且[生物素-PCSK9]＝0.5(μg/ml)。
结果在以下表3.1至3.6中示出。较高的Ki值反映较低的对PCSK9的表观结合亲和力，反之亦然。注意到，少数化合物表现出的Ki大大高于针对EGF66测量的值，如高于500nM的值，这表明观察到的结合不是特异性的。肽的氨基酸置换和/或一个或多个侧链衍生化均可导致与LDL-R的结合的丧失。通常，大量测试的EGF(A)化合物表现出抑制PCSK9与hLDL-R结合的能力。
PCSK9抑制剂
如上所述测试最初一组包含各种氨基酸置换的EGF(A)类似物，结果在表3.1中示出。
表3.1-所选EGF(A)类似物的表观结合亲和力(Ki)
在WO 2012177741中被确定为最有效的肽变体的EGF66(EGF(A)化合物#48)具有5个突变。发现这些突变中有几个对于在C3所述的试验中所确定的Ki值并不是特别重要。具体而言，发现在位置310处含有野生型残基Asp(D)的化合物比含有310K的化合物具有更高的效力。还可看出，关键氨基酸置换为301L，优选与309R组合。最后，307I和299A仅适度地有助于对EGF(A)类似物的亲和力。
取代基的N-末端连接
在随后的实验中，测试了半衰期延长体(例如取代基)与肽的连接是否会影响如通过C3所述试验所确定的Ki。如本文所述，可通过不同的技术连接取代基，并且取代基最初通过酰化或烷基化连接至肽的N-末端氨基酸的氮原子上。
如表3.2所示，所有经测试的化合物都具有低于3.0的Ki值，提示各种延长体和连接体元件被良好地容许。这是不寻常的，因为如先前对于诸如GLP-1的肽所观察到的，侧链的连接对效力通常有负面影响。
表3.2 -N-末端取代的EGF(A)类似物的表观Ki
取代基的Lys连接
为了评价取代基与PCSK9抑制剂肽连接的备选位置，制备了一系列化合物。除了在EGF(A)化合物#58、29和4中与各个位置上的Lys置换组合外，使用包含以下三个氨基酸置换的骨架肽：N301L、N309R和K312E。所有经测试的化合物在位置297、304、308、317、319、331处包含6个半胱氨酸氨基酸，它们通常参与半胱氨酸二硫桥。包括312E是为了确保位点特异性置换，EGF(A)化合物#4除外，其中获得与野生型312K的连接。还测试了肽延伸一个Lys(EGF(A)化合物#75和3)。包含C18二酸延长体和γGlu-2xAdo连接体的上述相同取代基在所有化合物中使用并通过酰化连接。结果包括在表3.3中。
表3.3–具有经由Lys残基连接的取代基的EGF(A)类似物的表观Ki
该分析显示，大多数PCSK9抑制剂肽保持了功能性。例外为位置298、301、302和307中任一个处的Lys置换和衍生化，其产生非功能性肽。还观察到位置296、299、315和320K处的Lys引入和置换降低了表观亲和力。
因此该数据也证实了表3.1的结果，表明Asn(N)301至Leu(L)的氨基酸置换对结合是必需的。
没有观察到在位置295和310处的Lys引入和置换的数据。如上所述，先前已经发现，在310处保持Asp优于310K置换。如下所见，还发现在位置295处引入Asp(D)消除了结合(EGF(A)示例化合物70)。
总之，得出以下结论：在位置295、298、302、307和310中任一个位置处不包含连接的取代基或在PCSK9肽的位置295、296、298、299、302、307、310、315和320中任一个位置处不包含连接的取代基的化合物通常是功能性的。进一步得出以下结论：位置295、298、302和310中任意位置处的氨基酸置换通常不具吸引力。从表3.1和3.2可以看出，V307I突变联合301Leu似乎不可接受，甚至没有吸引力。
进一步认为，在位置295、296、298、302、310之一的位置处含有氨基酸置换的肽可能具有较低的功能性，而位置299、315和320处的置换似乎只略微降低了功能性。另一方面，这也提示其余氨基酸残基可能存在高度灵活性，因为Lys置换以及侧链的连接像大多数其它氨基酸置换一样会对肽有影响。
具有两个取代基的PCSK9抑制剂
制备了一系列含有两个取代基的化合物。可通过在N-末端或Lys(K)残基处的酰化、烷基化或组合获得双置换。此外，N-末端可以是氨基酸293G或变异氨基酸残基，如292A、293G、293K和294T(在293G缺失的情况下)。这些化合物是用不同的取代基制备的，尽管在单个化合物上的两个取代基是相同的。本研究中使用的骨架还包括N301L氨基酸置换与N309R和各种N-末端和/或Lys置换的组合，这是获得特定酰化/烷基化所需要的。
表3.4-双取代的EGF(A)类似物的表观Ki
发明人还得出以下结论：这些取代基在各个位置和组合中被非常良好地容许。
其它EGF(A)衍生物
为进一步探索EGF(A)序列中各种氨基酸置换的作用，制备了其它化合物并如表3.5所示进行测试。所有化合物都包含一个取代基，该取代基经由通过氨基酸置换或333K延伸引入的Lys残基进行连接。全部骨架肽都包含N301L氨基酸置换，并且任选地包含N309R和I312E中的一个或多个。全部取代基都包含含有16-20个碳原子的脂肪二酸以及连接体，该连接体是单独的γGlu，或延伸出Ado-Ado和/或氨甲环酸(Trx)部分。
表3.5-具有经由Lys残基连接的取代基的其它EGF(A)类似物的表观Ki
以上表3.5中的结果显示，位置312处的内部野生型赖氨酸可以被Glu(E)以及Gln(Q)、Arg(R)或Asp(D)置换。基于这种变异，预期在位置312处将会容许宽范围的氨基酸残基，而不干扰肽的抑制功能。
几种其它氨基酸置换也被证明能被良好地容许，包括G293N、T294G、D299A、N300H、H306Y、H306D、N309S、Q324G和R329H，而如上所述，N295D和N300P都不是有吸引力的氨基酸置换。
包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的PCSK9结合
为了进一步探索PCSK9结合功能性是否可以与GLP-1受体激动剂活性组合，在同一试验中测试了包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物，结果包括在以下表3.6中。
表3.6-包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物的表观Ki
数据表明，包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物保持与该化合物的EGF(A)类似物相关的PCSK9结合活性。数据还表明，仅有非常适度的变化，并且GLP-1类似物和EGF(A)类似物的方向不影响PCSK9结合。
C4-在HepG2细胞中的LDL摄取试验
用来确定PCSK9肽及其衍生物的抑制效力的替代试验用于测量HepG2细胞中的LDL摄取。
试验原理：LDL摄取主要由内源表达的hLDLR介导，因此LDL摄取能力是LDLR表达的间接量度。与外源性PCSK9一起孵育可以以剂量依赖性方式下调hLDLR。因此，PCSK9孵育会降低细胞摄取LDL分子的能力。然后可以通过添加能中和或抑制PCSK9/LDLR结合的化合物来拮抗LDL摄取的下调。因此，可以基于PCSK9抑制剂在PCSK9的存在下增加LDL摄取以及例如抵消PCSK9介导的hLDLR下调的能力来表征PCSK9抑制剂。
使用在10％脂蛋白缺乏的胎牛血清(Sigma Aldrich#S5394)中生长的HepG2细胞(Sigma Aldrich ECACC：保藏号85011430)进行试验，并且测量细胞摄取BODIPY荧光标记的LDL颗粒(Life technologies Europe BV#L3483)的能力。
试验方案：将96孔板(Perkin Elmer，ViewPlate-96 Black#60005182)在37℃孵箱中用聚-D-赖氨酸(10mg/L，Sigma Aldrich#P6407，溶解于PBS Gibco#14190-094)包被1小时。然后用100μl的PBS(Gibco#14190-094)洗板2次。为获得EGF(A)化合物的8点浓度曲线制备测试组合物，它们全部含有在测定培养基(DMEM(Gibco#31966-021)、10％脂蛋白缺乏的胎牛血清(Sigma Aldrich#S5394)和1％的Pen Strep(Cambrex#DE17-602E))中稀释的PCSK9(10ug/ml)，并且以50ul/孔的体积添加至板上。
30-60分钟后以50ul/孔的体积添加在测定培养基中稀释的50,000个HepG2细胞(Sigma-Aldrich：ECACC：保藏号85011430，批号：13B023)，并将板在CO2可透性塑料袋(Antalis Team，LDPE袋120/35x 300x0.025mm#281604)中孵育20小时(在37℃、5％CO2下)。此后将板清空，之后立即向每个孔中添加50μl在测定培养基中浓度为10μg/ml的FL-LDL(Life technologies Europe BV#L3483)，并将板在CO2可透性塑料袋中孵育2小时(在37℃、5％CO2下)，用黑色盖子盖上以避光。将板清空并用100μl的PBS(Gibco#14190-094)洗涤2次。然后添加100μl的PBS(Gibco#14190-094)，并在此后的15分钟内在SpecktraMax M4(Molecular Probes,Invitrogen Detection Technologies)上使用以下滤波器Ex(515nm)/Em(520nm)读取平板(底部读取)。使用GraphPad Prism、非线性回归曲线拟合、S形剂量-响应(可变斜率)计算EC50值。
结果
HepG2细胞中的LDL摄取试验如上所述对一系列化合物进行。
结果在以下表4.1中示出。较低的EC50值反映了较高的逆转PCSK9介导的LDL摄取下调的能力，而相反，高EC50值表明化合物具有低的抑制PCSK9介导的LDL摄取下调的能力。
可以看出，大多数化合物在LDL摄取试验中表现出100-500nM的EC50，这表明化合物具有高的逆转PCSK9介导的LDL摄取下调即增加LDL摄取的能力。
表4.1：在HepG2细胞中的LDL摄取数据(EC50)-(EGF(A)类似物和衍生物)
对包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的GLP-1/EGF(A)化合物的LDL摄取进行了进一步评价，并再次证实与GLP-1类似物的连接不会干扰EGF(A)类似物的功能性(见表4.2)。
表4.2包含GLP-1类似物和EGF(A)类似物的化合物在HepG2细胞中的LDL摄取数据(EC50)
C5-在小型猪中的药代动力学(PK)
本研究的目的是确定GLP-1衍生物在向小型猪静脉内施用后的体内延长，即其在体内的时间的延长，从而延长其作用时间。这在确定所述衍生物的终末半衰期的药代动力学(PK)研究中完成。终末半衰期是指在终末消除阶段将特定血浆浓度减半所花的时间。
雌性小型猪从EllegaardMinipigs(Dalmose,Denmark)获得，在研究中使用的是大约8-12月龄，体重约20-30kg。将小型猪单独圈养(带有永久性导管的猪)在以稻草作为铺垫的围栏中，每天限制饲喂一次Altromin 9030小型猪饮食(Altromin Spezialfutter GmbH&Co.KG)。
适应三周后，将两根永久性中央静脉导管植入每只动物的尾腔静脉中。手术后让动物恢复1周，然后用其进行重复的药代动力学研究，在连续给药之间有适当的洗脱期。
将衍生物溶解在含有50mM磷酸盐、70nM氯化钠和0.05％聚山梨酯80(pH 7.4)的缓冲液中。
通过一根导管进行衍生物的静脉内注射(对应于0.05ml/kg的体积和2nmol/kg的剂量)，并在预定时间点采集血样直至给药后14天(优选从另一根导管进行采样)。
将血液样品(例如0.8ml)收集在EDTA(8mM)包被的管中，然后在4℃和1942g下离心10分钟。
将血浆吸移到干冰上的Micronic管中，并保持在-20℃下，直到使用LOCI分析衍生物的血浆浓度。通过Phoenix v.6.4(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)中的非房室药代动力学方法分析各个血浆的浓度-时间曲线，并确定所得的终末半衰期(调和平均值)。
结果
如上所述使用小型猪进行药代动力学研究。获得了关于终末半衰期的以下结果：
表5：在小型猪中的药代动力学研究(i.v.)
与人GLP-1(7-37)相比，所有测试化合物的终末半衰期均延长。
包含在位置8上具有G的GLP-1类似物的化合物21的终末半衰期为2小时，比其它具有非天然氨基酸(在位置8上为Aib)的化合物的半衰期短10-25倍。
C6-hPCSK9攻击模型
本研究的目的是显示响应于本文所述EGF(A)类似物或包含EGF(A)类似物的化合物对静脉内注射的hPCSK9的作用的抑制，小鼠肝脏中LDL受体表达水平的变化。
方法
向健康的雄性BalBC或NMRI小鼠(Charles River，德国)皮下或静脉内注射EGF(A)类似物(或包含EGF(A)类似物的化合物)，15-120分钟后以0.4mg/kg的剂量向其尾静脉经静脉内注射hPCSK9(Sino Biologicals，中国)。注射hPCSK9后60分钟，将动物用异氟烷麻醉并通过颈脱位法施以安乐死。然后迅速切下肝脏并在液氮中骤冻。将肝脏保持于-80℃直至分析。
LDL-R Western印迹法：
将肝组织样品(100mg)在含有磷酸酶抑制剂混合物、PhosStop(Roche，04 906 837001)和蛋白酶抑制剂混合物、compelate(Roche，04 693 159 001)的500μl裂解缓冲液(Life Technology，FNN0011)中均质化。添加1个钢珠后，将组织在30Hz下均质化2.5分钟。以5000×g离心5分钟后，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，23225)测定总蛋白质含量。将样品缓冲液(Life Technology，NP0007)中等量的蛋白质(60μg)煮沸10分钟并以14000rpm旋转2分钟，然后加载至Criterion XT 3-8％Tris-乙酸盐凝胶(BioRad#345-0131)上，并进行SDS-PAGE。根据制造商的说明书(Life Technology)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(iBlot 2NC Regular stacks，novex#IB23001)。通过膜的Ponceau S(Sigma，P7170)染色证实等量蛋白质转移，并将膜进一步在封闭缓冲液(TBS-T，2％吐温)中封闭。用第一兔抗LDLr抗体(Cayman Chemical Company#10012422)检测LDL-r蛋白质，而使用第一兔抗β-肌动蛋白抗体(abcam#ab6276)检测β-肌动蛋白。使用WesternBright Quantum Chemiluminscent(Advansta#K-12042-D10)，用过氧化物酶缀合的山羊抗兔第二抗体(Biorad#170-6516)将这两种蛋白质进一步可视化，并使用CCD相机(LAS3000,FujiFilm)成像。使用MultiGauge软件(Fujifilm)对来自Western印迹的化学发光信号进行定量分析。
结果
通过Western印迹法测量LDL-R表达水平，并比较表达水平。“媒介物-hPCSK9”降低表达，其代表单独注射hPCSK9的组。注射EGF(A)化合物-hPCSK9的组显示LDL-R的表达正常化，因为表达恢复到至少90％。
结果显示，hPCSK9降低了LDL-R的表达水平，并且所测试的EGF(A)化合物抑制了该效果。表6.1和6.2中总结的数据呈现为相对于健康对照动物基线水平(设定为100％)与单独hPCSK9下调后水平(设定为0％)之间的窗口的变化百分比。6种EGF(A)化合物能够抑制hPCSK9对LDL-R表达水平的作用，并且所观察到的抑制水平类似于使用对照分子阿利库单抗所观察到的抑制水平。
表6.1
表6.2
结论
几个化合物实施例已显示出在抑制LDL-R表达水平被hPCSK9下调方面的功效。
C7-在db/db小鼠中的药效学研究
该试验的目的在于在糖尿病情况下证实对血糖(BG)和体重(BW)的急性影响。
如下所述，在单剂量研究中在肥胖的糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中测试所述化合物。以0.3、1.0、3.0、10、30和100nmol/kg或1.0、3.0、10、30、100和300nmol/kg的不同剂量测试所述衍生物。从出生开始饲以饮食NIH31(NIH 31M Rodent Diet，从Taconic Farms,Inc.,US商购获得，见www.taconic.com)的小鼠(来自Taconic，Denmark)在大约10周龄时加入本研究。在到达动物单位后，使小鼠自由获取标准食物(例如Altromin 1324,Brogaarden,Gentofte,Denmark)和自来水，并保持在24℃。1-2周的适应后，在一天内评估基础血糖两次。仅包括基线血糖水平>15mM的小鼠。基于匹配血糖水平和体重将小鼠分配到治疗组(N＝5-7只/组)。
将动物分组以接受如下处理：媒介物，皮下，或GLP-1/PCSK9i衍生物(0.3、1.0、3.0、10、30或100nmol/kg或1.0、3.0、10、30、100和300nmol/kg)，皮下，其中媒介物为50mM磷酸钠、70mM氯化钠、0.05％聚山梨醇酯80，pH 7.4。
将所述GLP-1/EGF(A)化合物溶解在媒介物中至0.05、0.17、0.5、1.7、5.0或17nmol/ml或0.17、0.5、1.7、5.0、17或50nmol/ml的给药浓度。在实验开始时用6ml/kg(即300μl/50g小鼠)的剂量体积向动物皮下给药一次。
在给药当天，在早上时间-1/2h时评估血糖，此后对小鼠称重。在大约时间0时给予GLP-1/EGF(A)化合物。给药当天，在给药后1、2、4和8h评估血糖。
次日，在24h、48h、72h和96h时评估血糖。每天，在血糖采样后对小鼠称重。
小鼠在数字计重秤上单独称重。
用于测量血糖的样品从有意识的小鼠的尾尖毛细血管获得。将5μl血液收集到肝素化的毛细管中，并转移至250μl葡萄糖缓冲液(EKF系统溶液,Eppendorf,Germany)。使用葡萄糖氧化酶法(葡萄糖分析仪Biosen 5040,EKF Diagnostic,GmbH,Barleben,Germany)测定葡萄糖浓度。将样品在室温下保持最多1h或在4℃下保持最多24h直到分析。
在小鼠中计算基线减去血糖和基线减去体重。
结果
如上所述，在单剂量研究中测试了GLP-1/EGF(A)化合物1、2、21、22、23、25、26、27、29和32。以不同剂量测试衍生物，即0.3、1.0、3.0、10、30和100nmol/kg(化合物2、21、22、23、25和26)或1.0、3.0、10、30、100和300nmol/kg(化合物1、27、29和32)。
表7.1概述了给药后24小时最高剂量对血糖变化和体重变化的最大影响(Emax)。如果两个最高剂量水平没有产生相似的效果，因此可能尚未达到真实的Emax，则将这些值标记为星号(*)。
表7.1在db/db小鼠中对血糖和体重的影响的Emax值
为了说明GLP-1/PCSK9i衍生物对血糖和体重的影响，计算从0至24小时的Δ血糖的曲线下面积(AUC ΔBG24h)和在给药后24小时的Δ体重增加(ΔBW24h)。基于这些参数的剂量响应曲线，针对AUC ΔBG24h和ΔBW24h计算有效剂量50％(ED50，产生基线与最大效应之间的一半响应的GLP-1衍生物剂量)。ED50可以用作GLP-1/PCSK9i衍生物的效力的估计值。获得以下结果(所有单个测定的平均值)。
表7.2在db/db小鼠中对血糖和体重的影响的ED50值
所测试的化合物显示出剂量依赖性地降低血糖以及体重的体内效果。
虽然本文已经阐明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。
C8-在DIO大鼠中的药效学研究
本试验的目的是验证在肥胖环境下对体重(BW)和总胆固醇水平的亚慢性影响。如下所述，在饮食诱发的肥胖症(DIO)大鼠模型中，在亚慢性剂量研究中对化合物进行21天测试。衍生物以不同的剂量(即30和300nmol/kg)进行测试，并且在一些情况下，向300nmol/kg组给予900nmol/kg的更高剂量，持续指定的时间。
Sprague Dawley大鼠(来自Charles River,France)，从6周龄开始饲喂60％高脂饮食(D12492，可从Research Diets,Inc购得)，在22周龄时到达我们的动物单位。到达动物单位后，让大鼠自由获取45％高脂饮食(D12451，可从Research Diets,Inc购得)、自来水，并使大鼠处于受控照明(12h:12h光照/黑暗周期；在06:00-18:00光照)和温度(22±2℃)条件下。适应2-3周后，根据匹配的体重和脂肪百分比将大鼠分为治疗组(每组N＝10)。
将动物分组以接受如下治疗：媒介物，皮下，或GLP-1/EGF(A)化合物(30或300nmol/kg，在一些情况下，来自300nmol/kg组的大鼠接受900nmol/kg，持续指示的天数)，皮下，其中媒介物为50mM磷酸盐，70mM氯化钠，0.007％聚山梨酯20，pH 7.4。将GLP-1/EGF(A)化合物溶解在媒介物中，以达到15(用于向上滴定)、50(用于向上滴定)、150、500(用于向上滴定)或1500nmol/ml的给药浓度。
动物每天早晨皮下给药一次，持续22天，给药体积为0.2ml/kg。缓慢向上滴定剂量，以使大鼠在第一天接受3nmol/kg，第二天接受10nmol/kg，第三天接受30nmol/kg，并且如果适用，第四天接受100nmol/kg，并在第五天接受300nmol/kg。30nmol/kg组从第三天到实验结束时接受全剂量。300nmol/kg组从第5天到实验结束时接受全剂量。给予300nmol/kgGLP-1/EGF(A)化合物41的大鼠从第16天到实验结束时接受900nmol/kg。给予300nmol/kgGLP-1/EGF(A)化合物48的大鼠从第20天到实验结束时接受900nmol/kg。通过将1500nmol/ml溶液的给药体积增加到0.6ml/kg，可以达到900nmol/kg的剂量。
临给药前，每天用数字秤对大鼠进行称重。还要每天称量食物容器的重量，以计算食物消耗量。在给药开始前3至4天和第20或21天通过MR扫描评估身体组成(Echo MRI 700,Houston,TX USA)。在给药开始前5天和研究结束时，从清醒的大鼠中采集舌下血液样品。将血液样品收集在EDTA管中，并通过倒置充分混合。收集后立即将EDTA管置于冰上。EDTA血液样品在4℃下以6000G离心5分钟，并将血浆样品在-80℃下储存直至分析。在Cobas分析仪(Cobas6000,Roche Diagnistics,USA)上分析样品的总胆固醇水平。
计算每只大鼠的基线减去体重和基线减去总胆固醇水平，并对每组取平均值。
结果
如上所述，在亚慢性剂量研究中测试了GLP-1/EGF(A)化合物41、48和69。衍生物以不同的剂量进行测试，即30和300nmol/kg(GLP-1/EGF(A)化合物69)，或30和300nmol/kg，最后两天(GLP-1/EGF(A)化合物41)或最后7天(GLP-1/EGF(A)化合物48)剂量增加到900nmol/kg。
表8.1概述了每组作为与基线体重相比的百分比的平均体重(平均值±SEM)以及血浆总胆固醇水平与基线水平相比的变化平均值(平均值±SEM)。
表8.1：21天后，作为与基线体重相比的百分比的平均体重以及血浆总胆固醇水平与基线水平相比的变化平均值
C9-化学稳定性
制备GLP-1/EGF(A)化合物69和313的制剂，以研究321D被321E置换的EGF(A)类似物的潜在稳定作用(异构体形成的减少)。化合物浓度为在由20mM Tris(pH 7.4)、18.4mg/ml丙二醇，0.43mM CaCl2组成的制剂中2mg/mL。通过将冷冻干燥的物质以最终浓度溶解到含有Tris、丙二醇和CaCl2的MQ水中来制备制剂。使用0.1N HCl(水溶液)和0.1N NaOH(水溶液)调节pH。将每种制剂过滤除菌，并装在HPLC玻璃小瓶中，并静态保存在37℃的温度控制柜中。在选定的时间点(时间0、1周、2周、4周)，从HPLC小瓶中抽取样品并冷冻以供后续的UPLC-MS分析。
使用基于BEH C4柱(1.7um，1.0x150mm，Waters)和0.1％甲酸水溶液(洗脱液A)/0.1％甲酸的乙腈溶液(洗脱液B)溶剂体系的稳定性指示纯度方法来评价热应激的制剂的纯度损失。使用以下条件：柱温：50℃；流速：0.30mL/min；紫外线检测器的波长：215nm。梯度为在41分钟内从31％至39％B。LC流在线注入到配备有以正离子模式运行的电喷雾接口的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Fischer Scientific)。显示该纯度方法与上述制剂兼容，并且未观察到含量/类似物损失。异构体的形成量通过对各种样品(即时间0和在37℃下孵育2周和4周的样品)的总离子色谱图进行基于质量的提取来确定，每个样品中的异构体百分比由异构体峰面积相对于主峰(API)面积的积分来计算。
表9.1.通过基于质量的总离子色谱图提取确定的制剂样品中的异构体量
表9.1中的结果表明，在37℃下孵育4周后，用321E代替321D使异构体的形成量从20.2％显著降低至4.2％。
虽然本文已经阐明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。

Claims (7)

1.GLP-1/EGF(A)化合物，所述化合物选自GLP-1/EGF(A)化合物#1-74、77-87、91-92、95、99-100、103-120、123-124、128、221-226、229-230、281和283-314，所述化合物结构如表10中所示，
并且其中取代基的结构如下所示：
由化学式6b定义的取代基#1，
化学式6b
由化学式7b定义的取代基#2，
化学式7b
由化学式8b定义的取代基#3，
化学式8b
由化学式9b定义的取代基#4，
化学式9b
由化学式10b定义的取代基#5，
化学式10b
由化学式11b定义的取代基#6，化学式11b
由化学式13b定义的取代基#8，化学式13b
由化学式14b定义的取代基#9，化学式14b
由化学式15b定义的取代基#10，化学式15b
由化学式16b定义的取代基#11，化学式16b
由化学式17b定义的取代基#12，
化学式17b
由化学式18b定义的取代基#13，和
化学式18b
由化学式19b定义的取代基#14，
化学式19b
2.根据权利要求1所述的化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#41、#48、#69和#306的化合物，其中
化合物#41由由SEQ ID NO.:190定义的融合肽和两个由化学式6b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:139定义的GLP-1类似物[8Aib,34R]GLP-1(7-37)、SEQ ID NO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:19定义的EGF(A)类似物[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)组成
化学式6b
所述取代基连接至[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸残基26K和[301L,309R,312E,321E,333K]EGF(A)的333K，
化合物#48由由SEQ ID NO.:202定义的融合肽和一个由化学式11b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:139定义的GLP-1类似物[8Aib,34R]GLP-1(7-37)、SEQ ID NO.:119定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式11b
所述取代基连接至[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K，
化合物#69由由SEQ ID NO.:310定义的融合肽和一个由化学式11b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:164定义的GLP-1类似物[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)、SEQ IDNO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式11b
所述取代基连接至[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K，和
化合物#306由由SEQ ID NO.:310定义的融合肽和一个由化学式10b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:164定义的GLP-1类似物[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)、SEQ IDNO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式10b
所述取代基连接至[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K。
3.根据权利要求2所述的化合物，其选自被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#306和#69的化合物，其中
化合物#69由由SEQ ID NO.:310定义的融合肽和一个由化学式11b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:164定义的GLP-1类似物[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)、SEQ IDNO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式11b
所述取代基连接至[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K，和
化合物#306由由SEQ ID NO.:310定义的融合肽和一个由化学式10b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:164定义的GLP-1类似物[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)、SEQ IDNO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式10b
所述取代基连接至[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K。
4.根据权利要求3所述的化合物，其为被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#306的化合物，其中
化合物#306由由SEQ ID NO.:310定义的融合肽和一个由化学式10b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:164定义的GLP-1类似物[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)、SEQ IDNO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式10b
所述取代基连接至[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K。
5.根据权利要求3所述的化合物，其为被定义为GLP-1/EGF(A)化合物#69的化合物，其中
化合物#69由由SEQ ID NO.:310定义的融合肽和一个由化学式11b定义的取代基组成，该融合肽由SEQ ID NO.:164定义的GLP-1类似物[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)、SEQ IDNO.:116定义的间隔体和SEQ ID NO.:108定义的EGF(A)类似物组成
化学式11b
所述取代基连接至[8Aib,30G,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物由由SEQ ID NO.:193定义的融合肽和一个由化学式6b定义的取代基组成，
化学式6b
所述取代基经由SEQ ID 193的位置20的赖氨酸(K)(等于[8Aib,34R]GLP-1(7-37)的氨基酸26K)连接。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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