CN110903404A - 一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种蜂毒素‑死亡素重组多肽，所述蜂毒素‑死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签。所述所述蜂毒素‑死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签，所述MBP标签能够促进蜂毒素‑死亡素重组多肽的表达，提高蜂毒素‑死亡素重组多肽的表达量，且能够提高蜂毒素‑死亡素重组多肽的纯度。

Description

一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用。

背景技术

蜂毒是公蜂用螫针刺向敌害时排出的毒汁，蜂毒素(Melittin)是其主要活性成分，由26个氨基酸组成，具有抗菌、消炎、抗辐射、抗关节炎、抗肿瘤、抗艾滋病以及治疗心血管疾病等作用。蜂毒素能够抑制20～30种革兰氏阴性病原微生物的发育。蜂毒素是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍。由于许多疼痛是炎症导致的，因此蜂毒素在治疗关节炎、痛风等炎性疼痛方面，具有显著的成效。

死亡素(thanatin)，又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺-益蝽(Podisusmaculiventris)中发现的由21个氨基酸残基组成的抗菌肽，抑菌谱非常广，但是对哺乳动物细胞不表现出溶血性。

将蜂毒素N端5-12位氨基酸与死亡素4-21位氨基酸氨基酸融合表达成杂合肽(MT)。新型抗菌肽由26个氨基酸组成，有效提高了抗菌肽的杀菌活性，尤其是针对耐药性革兰氏阴性致病菌，抑菌效价提高大大提高。但是在制备蜂毒素-死亡素杂合肽时，蜂毒素-死亡素杂合肽的表达量非常低，且纯度不高。

发明内容

本公开的目的是提供种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用，以达到提高蜂毒素-死亡素杂合肽的表达量的目的。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种蜂毒素-死亡素重组多肽(MBP-MT重组蛋白)，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP(meltosebinding protein，麦芽糖结合蛋白)标签。

N端融合了MBP标签的蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示

所述蜂毒素-死亡素重组多肽中蜂毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述蜂毒素-死亡素重组多肽中死亡素的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述MBP标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种蜂毒素-死亡素重组多肽在生产蜂毒素-死亡素重组多肽上的应用。

本公开的有益效果是：提供了一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用，所述所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签，所述MBP标签能够促进蜂毒素-死亡素重组多肽的表达，提高蜂毒素-死亡素重组多肽的表达量，且能够提高蜂毒素-死亡素重组多肽的纯度。

附图说明

图1为实施例1MBP标签扩增凝胶电泳图。

图2为实施例1MBP-MT重组蛋白基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图3为实施例2MBP-MT重组蛋白-pGAPZαA重组载体菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图4为实施例3MBP-MT重组蛋白-毕赤酵母酵母单菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图5为实施例4中MBP-MT重组蛋白在毕赤酵母中表达的Weston blot检测图。

图6为为实施例4中MBP-MT重组蛋白纯化SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1 MBP-MT重组蛋白的基因构建

1.目的基因片段和引物的设计

根据蜂毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示和死亡素的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的基因片段、pMAL-c5x载体结构特点以及两个酶切位点EcoR1和Xbal设计如下：

Gene1：GTGCTGAAAGTGCTGACCACGGGCAAACCGGTGCCGATTATCTA(SEQ ID NO.6)；

Gene2：CATACGCTGGCACTTGCCGGTACGACGATTGCAGTAGATAATCGGCACCGGTTTG(SEQ IDNO.7)；

MBP-MT-FP：GGCCGAATTCATGAAAATCGAAG(SEQ ID NO.8)；

MBP-MT-RP：CAGCACTTTCAGCACCCTTCCCTCGATCCC(SEQ ID NO.9)；

MBP-MT-geneRP：GGCCTCTAGAAACATACGCTGGCACTTGC(SEQ ID NO.10)。

2.MT目的基因的拼接重组

2.1编码MT目的蛋白基因的拼接

拼接PCR的反应体系如表1。

表1拼接PCR反应体系

2×PfuMax HiFi PCR ProMix	10μL
		Gene1和Gene2	各0.4μL
ddH<sub>2</sub>O	Add to 20μL

拼接PCR的反应条件如表2。

表2拼接PCR反应条件

拼接后得到的MT目的蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.2 MBP基因的获取

MBP基因扩增体系如表3。

表3 MBP基因扩增体系

MBP基因反应条件为(降落PCR)如表4所示。

表4 MBP基因反应条件

PCR反应结束后，取PCR产物进行1.0％琼脂糖电泳分析，结果如图1(泳道M：DNAMarker从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1，2为MBP标签扩增产物)所示，扩增产物大小与理论分子量相符，约为1.1kb。

PCR产物回收：按照凝胶纯化试剂盒说明书回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测定浓度，并根据A260/A280分析纯度。结果如表5，可以看出PCR回收DNA的浓度和纯度较高。经测序MBP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4。

表5检测结果

2.3蜂毒素-死亡素重组多肽的合成

PCR反应体系如表6。

表6 PCR反应体系

反应条件(降落PCR)如表7。

表7反应条件

PCR反应结束后，取PCR产物进行1.0％琼脂糖电泳分析，结果如图2(泳道M：DNAMarker从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1～10为MBP-MT重组蛋白基因产物)所示，扩增产物大小与理论分子量相符，约为1.2kb；经测序MBP-MT重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

PCR产物回收，按照凝胶纯化试剂盒说明书回收PCR产物，超微量紫外分光光度计测定浓度，并根据A260/A280分析纯度。结果如表8。

表8 PCR产物回收的浓度及纯度

实施例2 MBP-MT重组蛋白-pGAPZαA重组载体构建

1.双酶切

MBP-MT重组蛋白基因及载体双酶切，用EcoRI和XbaI对MBP-MT重组蛋白基因和pGAPZa A载体分别进行双酶切，反应温度为37℃，反应时间为2小时。酶切反应体系如表9。

表9酶切反应体系

组分	体积
		10×FD buffer	5μL
pGAPZa A载体	3μg
		MBP-MT重组蛋白DNA片段	3μg
EcoRI和XbaI两种限制性内切酶	各1μL
		灭菌去离子水	补充至50μL

酶切后产物回收，酶切结束后，纯化回收酶切产物。按照DNA纯化试剂盒说明书纯化回收酶切产物。超微量紫外分光光度计测定浓度，并根据A260/A280分析纯度，结果如表10。

表10 MBP-MT重组蛋白基因和pGAPZa A载体酶切后产物的浓度与纯度

样品(双酶切后)	浓度(ng/uL)	A260/A280
			MBP-MT重组蛋白基因	42.0	1.790
pGAPZa A载体	20.4	1.747

连接反应，反应体系如表11：

表11连接反应体系

组分	体积
		T4 Quick Ligation Mix	5μL
插入DNA片段	50ng
		pGAPZαA载体	50ng
灭菌去离子水	补充至10μL

将上述材料混合后，22℃连接2h。

2.转化

(1)取5μL连接产物加到50μL DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30min；

(2)将上述转化液置于42℃水浴90s，取出后立即置于冰浴中放置5min；

(3)向其中加入500μlL37℃预热的Low Salt LB(不含抗生素LLB)培养液，180rpm、37℃振荡培养45min；

(4)2500rpm离心5min，将上清液吸走，留200μL混匀菌液，加到含Low Salt LB固体琼脂培养基上(Zeocin浓度25μg/mL)，用无菌的玻璃珠轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

3.菌落PCR鉴定

挑取上述平板上的单菌落个，分别溶到20μL的Lysis Buffer for Microorganismto Direct PCR中，于80℃加热30min，后离心每管取1μl菌液做模板，利用载体通用上游引物：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA -3’(SEQ ID NO.11)和载体通用下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.12)进行PCR。反应体系设计为10μL总体系如表12。

表12菌落PCR鉴定反应体系

2×SsoRubost Taq PCR ProMix	5μl
		上述转化后菌液	1μl
载体通用上游引物(10μM)	0.25μl
		载体通用上游引物(10μM)	0.25μl
H<sub>2</sub>O	3.5μl

反应条件如表13。

表13菌落PCR鉴定反应条件

挑取上述平板上的单菌落10个，分别溶到500μl含25μg/mL Zeocin的Low Salt LB培养液，37℃、180rpm/min震荡培养4h。每管取1μL菌液做模板，用载体的通用上游和下游引物进行PCR扩增，后进行琼脂琼脂糖凝胶检测条带理论大小为1.7kb左右，结果如图3(泳道M：DNA Marker从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、5000bp；泳道1、2、3、4、5均为单菌落菌落PCR产物)所示，可看出所挑取的单菌落均为阳性克隆，与理论大小相同。

实施例3毕赤酵母电转化

1.重组质粒的大量提取

1)从-80℃冰箱取出上述实施例2中鉴定正确的、含有重组质粒的EcoliDH5α，用枪头戳取菌液接种于含25μg/mL Zeocin的Low Salt LB培养液中，接种于37℃、200r/min的摇床中过夜培养(12～16h)，至少培养20mL；

2)按照质粒提取试剂盒提取质粒，用微量分光光度计进行质粒浓度测定，浓度为，A260/A280为，-20℃保存备用。

2.重组质粒的线性化及纯化

根据质粒pGAPZa A中可选择的线性化位点以及插入基因的碱基序列，最终选取限制性内切酶AvrⅡ进行重组质粒的线性化处理。线性化体系如表14所示。

表14线性化反应体系

成分	添加量
		10×Cutsmart Buffer	20μL
重组质粒	20μg
		AvrⅡ内切酶	4μL
补充无菌水至	200μL

可分为两管反应，每管100μL，将线性化溶液混匀后置于恒温水浴槽中，37℃酶切2h后，取2μL酶切后的产物用1.5％(v/v)的琼脂糖凝胶检测重组质粒是否线性化完全。剩余线性化产物用琼脂糖电泳DNA回收试剂盒回收，分别50μL预热的水洗脱两遍，汇总至一根管子中，进行过夜冻干。

3.毕赤酵母GS115的电转化

3.1 GS115感受态细胞的制备

(1)将毕赤酵母GS115菌液用无菌接种环划线接种至YPD固体培养基上，用封口膜将平板封口后，于30℃恒温培养箱中倒置平板培养至有单菌落长出；

(2)挑取纯化后的GS115单菌落接种至5mL YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下过夜培养；

(3)按1：1000的比例将上述酵母菌液接种至100mL YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下培养至OD值达1.3-1.5；

(4)将上述菌液分装至两个50mL无菌离心管中，4℃条件下1500g/min离心5min后，去除培养基；

(5)加入40mL新配(2h内)的LDST溶液(100mM LiAc，10mM dithiothreitol,0.6Msorbitol and 10mM Tris-Hcl pH 7.5，现用现配不能保存)，30℃孵育30min；

(6)室温6000rpm离心5min；弃上清，用1mL冰浴1M山梨醇重悬菌体，转至1.5mLEP管；

(7)用1mL冰浴1M山梨醇洗涤菌体3次(应快速，菌脆弱)最后用400μL冰浴1M山梨醇重悬菌体，分装80μL/管(现配现用)。

3.2重组质粒电转入GS115感受态细胞

(1)打开电转化仪，预热30min；

(2)设置电穿孔转化电击条件：电压1500V，电阻200Ω，电容2.5mF，5ms；

(3)将5-10μg纯化后的线性化质粒加入到新鲜制备的GS115感受态细胞中，轻轻旋转离心管，使质粒和感受态细胞完全混匀后，将其全部转移至冰预冷处理的0.2cm无菌电转杯中；

(4)将电转杯继续冰浴5min后，放入电击槽，开始电击；

(5)电击结束后，立即向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇，用移液枪轻轻吹打混匀后，将其全部转移至无菌的1.5mL离心管中；

(6)将上述离心管置于30℃恒温培养箱中静置孵育1-2h；

(7)分别吸取10、25、50、100、200μL菌液涂布在含100μg/ml Zeocin的YPDS固体培养基上；

(8)30℃恒温倒置平板2-3天，至长出单菌落。

3.3重组毕赤酵母基因组PCR鉴定

(1)将筛选出的5个耐Zeocin的转化子接种于10mL YPD液体培养基中，于30℃、250r/min条件下培养12-16h；

(2)取酵母裂解液50ul加入1μL的过夜培养的酵母菌液，85℃孵育30min，12000r/min离心2min，取1μL上清进行PCR扩增；

(3)采用载体通用引物分别对酵母基因组DNA进行PCR扩增：pGAP Forword：5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’(SEQ ID NO.11)；3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.12)；

反应体系如表15所示：

表15反应体系

2×Hotstart Taq PCR ProMix	5μL
		酵母细胞裂解液上清	1μL
pGAP Forword	0.25μL
		3’AOX1	0.25μL
H<sub>2</sub>O	3.5μL

反应条件如表16所示：

表16反应条件

PCR反应完取5μl PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳分析，得到如下电泳图，条带理论大小为1.7kb，从图4中可看出实际与理论相符合，5个单克隆菌株均为阳性单克隆。

实施例4 MBP-MT重组蛋白在毕赤酵母中的表达

1.MBP-MT重组蛋白表达

挑取上述实施例3中的阳性单克隆于10mLYPD过夜培养，后取100μL接种到5瓶10mL(250mL摇瓶)的YPD培养基中，于30℃、250r/min条件下摇瓶表达。

分别在培养0h、24h、36h、48h、60h后取样，于8000r/min离心5min，将上清转至干净的50mL离心管，后将上清和菌沉淀，并放入-80℃保存，直至检测蛋白表达时取出。

2.重组蛋白在毕赤酵母中的表达检测

将表达时间为0h、6h、12h、24h、48h的培养液上清经超滤浓缩、硫酸铵沉淀并复溶后进行Weston blot检测，并用已表达目的蛋白进行纯化，结果如图5(泳道M为蛋白Marker，泳道1～5为别为0h、6h、12h、24h、48h培养液上清)所示，从图5结果可以确定，带MBP融合标签的MT蛋白获得可溶表达，并且在24h培养后目的蛋白的表达量趋于饱和，因此确定表达培养时间为24h较好。

3.重组蛋白纯化

3.1酸氨沉淀

称取硫酸铵：按照每升上清加361g硫酸氨的比例称取硫酸氨粉末；

硫酸的添加：在0℃的条件下，并边搅拌边将硫酸粉末慢慢敲入发酵液上清；

静置沉淀：4℃冰箱静置4h，12000r/min离心30min，弃上清；

蛋白复溶：按1L发酵液上清加入20mL组氨酸标签-亲和层析柱结合缓冲液(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)的比例加入加入缓冲液，并涡旋直至所有蛋白复溶；

过膜转移：将复溶后所得溶液过0.22μm过滤头，转移到新的无菌瓶中。

3.2亲和层析

选用1mlMBP标签-亲和层析柱，纯化系统GE Healthcare AKTA pure；

洗泵:用蒸馏水洗A1、B1泵后，再分别用结合缓冲液Buffer A(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)、洗脱缓冲液Buffer B(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、500mM咪唑、5％甘油)分别洗A1、B1泵，流速75ml/min；

平衡柱子：将A1泵放入Buffer A(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)中，平衡10个柱体积结合缓冲液Buffer A(50mM三甲醇氨基甲烷pH 8.0、50mM氯化钠、5％甘油)，流速1ml/min；

上样：用A1泵上样，流速为0.5ml/min；

洗脱：按0％Buffer B、10％Buffer B、40％Buffer B、60％Buffer B、100％BufferB进行梯度洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积；

收集：按梯度收集，并超滤浓缩；

电泳检测：将收集到的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测。

SDS-PAGE电泳检测的结果如图6(泳道1为穿透液蛋白条带；泳道2为0％buffer B洗脱蛋白条带；泳道3为10％buffer B洗脱蛋白条带；泳道4与40％buffer B洗脱蛋白条带；泳道5为60％bufferB洗脱蛋白条带；泳道6为100％bufferB洗脱蛋白条带；泳道M为ThermoScientific Pierce^TMUnstained Protein MW Marker)所示，可以看出40％Buffer B洗脱的效果最好，且可以看出蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签后能够提高蜂毒素-死亡素重组多肽蛋白质的浓度及纯度。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种蜂毒素-死亡素重组多肽及其应用

<130> 2019.12.27

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgccgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag ggtgctgaaa gtgctgacca cgggcaaacc ggtgccgatt 1200

atctactgca atcgtcgtac cggcaagtgc cagcgtatg 1239

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtgctgaaag tgctgaccac gggc 24

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaaccggtgc cgattatcta ctgcaatcgt cgtaccggca agtgccagcg tatg 54

<210> 4

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgccgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag g 1161

<210> 5

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtgctgaaag tgctgaccac gggcaaaccg gtgccgatta tctactgcaa tcgtcgtacc 60

ggcaagtgcc agcgtatg 78

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gtgctgaaag tgctgaccac gggcaaaccg gtgccgatta tcta 44

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

catacgctgg cacttgccgg tacgacgatt gcagtagata atcggcaccg gtttg 55

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggccgaattc atgaaaatcg aag 23

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cagcactttc agcacccttc cctcgatccc 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ggcctctaga aacatacgct ggcacttgc 29

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtccctattt caatcaattg aa 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

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Claims (7)

1.一种蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的N端融合了MBP标签。

2.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，N端融合了MBP标签的蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽中蜂毒素的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述蜂毒素-死亡素重组多肽中死亡素的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求书1中所述的蜂毒素-死亡素重组多肽，其特征在于，所述MBP标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求书1-6任意一项所述蜂毒素-死亡素重组多肽在生产蜂毒素-死亡素重组多肽上的应用。

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