CN110907546B

CN110907546B - 一种补肾健骨中药的hplc指纹图谱检测方法

Info

Publication number: CN110907546B
Application number: CN201911139919.8A
Authority: CN
Inventors: 陈鹏; 李霞; 陈骞; 明凯利; 熊丽; 向阳
Original assignee: Jianmin Pharmaceutical Groups Corp ltd
Current assignee: Jianmin Pharmaceutical Groups Corp ltd
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: CN110907546A

Abstract

本发明一种补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法，所述补肾健骨中药由熟地黄、山茱萸、狗脊、淫羊藿、山药、当归、牡丹皮、牡蛎等中药材制成，该检测方法包括将样品提取后上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为220‑250nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.05‑0.3％磷酸二氢钾和0.01‑0.1％辛烷磺酸钠的水溶液，采用梯度洗脱。本发明所建立的指纹图谱标出了9个共有峰，6号峰为淫羊藿苷的峰，经过方法学考察，这9个共有峰具有很高的稳定性、重复性和精密度，完全可用于指导生产和控制产品质量。

Description

一种补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明属于中药检测领域，涉及一种补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

CN 1493325A公开了种主治肝肾不足证之原发性骨质疏松症的中药及其制备方法，该中药由熟地黄、山茱萸、狗脊、淫羊藿、山药、当归、牡丹皮、煅牡蛎八味中药材组成，商品名“补肾健骨胶囊”，是健民药业集团股份有限公司独家品种，目前针对该中药的质量控制普遍采用的是对单一成分进行定性或定量检测，然而这种质量控制存在很大的局限性，首先，它不能全面表征药物的质量，导致中药掺假、伪劣现象严重，使中药不仅无法保证疗效，还严重威胁用药安全，其次，这种方法还存在检测次数多，仪器多，检测耗时耗力，效率低下等缺点。因此，有必要建立中药更全面、效率更高的质量检测方法。

指纹图谱是一种可量化的检测中药材及中药制剂的方法，主要用于鉴别真伪和评价原药材、半成品及制剂质量的均一性和稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的最有效手段。中药指纹图谱的检测方法有色谱法、光谱法、波谱法等。色谱法主要包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱，其中高效液相色谱法具有高效、快速、灵敏、重现性好的特点，现已成为中药指纹图谱研究的主流方法。

发明内容

本发明的目的是为了全面、有效地控制产品质量，建立一种补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法，所述补肾健骨中药由以下重量份数的原料制成：熟地黄3-8份、山茱萸1-5份、狗脊1-5份、淫羊藿1-5份、山药1-5份、当归1-5份、牡丹皮1-4份、牡蛎2-6，该检测方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将待测中药研细，30-70％甲醇超声提取，过滤，得供试品溶液；

(2)精密吸取供试品溶液，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为220-250nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.05-0.3％磷酸二氢钾和0.01-0.1％辛烷磺酸钠的水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25～40℃；

(3)记录供试品溶液0～50min的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，即得指纹图谱并进行相似度分析。

优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为235nm。

优选地，所述流动相B为含有0.1％磷酸二氢钾和0.05％辛烷磺酸钠的水溶液。

优选地，所述梯度洗脱的程序如下：

表1梯度洗脱程序

洗脱时间	流动相A	流动相B
			0～10min	10％	90％
10～25min	10→28％	90→72％
			25～35min	28％	72％
35～50min	28→100％	72→0％

优选地，所述指纹图谱具有9个共有峰，其中6号峰为参比峰即淫羊藿苷峰，各峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、相对峰面积如下：

表2 9个共有峰的保留时间和峰面积

本发明的有益效果是：

与现有的补肾健骨中药含量测定和鉴别方法相比，本发明所建立的指纹图谱能更加全面的反映中药所包含的化学信息，能更有效地指导投料、严格规范生产操作，从根本上避免中药掺假、伪劣现象，从而确保临床用药的安全、有效、可靠。

与其它质量控制方法如HPLC含量测定、薄层扫描、薄层鉴别等方法相比，本发明通过一次检测即可实现全面质量控制，具有操作方便、快捷、使用仪器少等优点。

本发明所建立的指纹图谱标出了9个共有峰，鉴定6号峰为淫羊藿苷的峰，经过方法学考察，这9个共有峰具有很高的稳定性、重复性和精密度，完全可用于指导生产和控制产品质量。

附图说明

图1是补肾健骨胶囊的HPLC标准指纹图谱。

图2是淫羊藿苷对照品的HPLC图谱。

图3是待测样品50％乙醇超声提取后的HPLC图谱。

图4是205nm检测波长得到的HPLC图谱。

图5是215nm检测波长得到的HPLC图谱。

图6是250nm检测波长得到的HPLC图谱。

图7是300nm检测波长得到的HPLC图谱。

图8是流动相为乙腈-水系统的HPLC标准指纹图谱。

图9是流动相为乙腈-磷酸系统的HPLC标准指纹图谱。

图10是流动相为乙腈-三乙胺系统的HPLC标准指纹图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。

以下实施例中所用到的补肾健骨胶囊由健民药业集团股份有限公司提供。

处方：熟地黄508g、山茱萸(制)254g、狗脊254g、淫羊藿254g、山药254g、当归254g、牡丹皮190g、牡蛎(煅)381g

制法：以上十味，山茱萸(制)、当归、淫羊藿用70％乙醇回流提取二次，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，牡丹皮用水蒸气蒸馏提取丹皮酚，以上药渣与其余药材(煅牡蛎取3/4量)加水煎煮三次，合并煎液，滤过，静置，取上清液浓缩至相对密度为1.20～1.28，与醇提浸膏合并，浓缩至相对密度为1.20～1.30的浸膏，取剩余的1/4煅牡蛎粉作为底料，喷入浸膏和丹皮酚制粒，填充制成1000粒，即得。

实施例1

1.仪器与试药

DIONEX P680高效液相色谱仪，四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，紫外检测器；AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

10个批次的补肾健骨胶囊(190201-03、190404-05，190706-10共10批)；淫羊藿苷对照品(供含测用，中国食品药品检定研究院购买，批号：110737-200415)；乙腈为色谱级，水为纯化水，其余为化学级。

2.方法步骤

(1)供试品溶液的制备：将待测补肾健骨胶囊的内容物研细，取1.5g，精密称定，精密加入50％甲醇30ml，称定重量，超声30分钟(功率250W，频率40kHz)，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)精密吸取供试品溶液10ul，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为235nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％磷酸二氢钾和0.05％辛烷磺酸钠的水溶液，采用梯度洗脱，流速为1ml/min，柱温为30℃，理论板数不低于4000。

洗脱程序见表1，即完成1个样品分析程序，记录时间为0～50min。

(3)方法学考察：按照指纹图谱的要求进行精密度试验，稳定性试验，重复性试验；

(4)指纹图谱的建立：分别取数批次补肾健骨胶囊样品，按步骤(1)项下制备供试品溶液，按步骤(2)的色谱条件进行测定并记录50min色谱图，结果所有色谱峰集中在50min内，比较样品批次之间的色谱图，确定了9个共有峰，经过与对照品图谱对比，确认6号为淫羊藿苷。

(5)样品相似度计算：将所得的10批次补肾健骨胶囊色谱图导入国家药典委员颁布的2004版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，选取“时间窗”宽度为0.1min，经过多点矫正和数据匹配生成色谱指纹图谱共有模式，对10批样品的指纹图谱进行相似度分析。

实施例2检测条件优化

1.供试品溶液的制备

根据补肾健骨胶囊的处方和制剂特点，分别考察了50％甲醇、50％乙醇作为提取溶剂，制备供试品溶液，具体方法参照实施例1。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈，4.6×250mm，5um；检测波长：235nm；进样量10ul；柱温：30℃；流速：1ml/min；流动相A：乙腈，流动相B：含有0.1％磷酸二氢钾和0.05％辛烷磺酸钠的水溶液，梯度洗脱程序见表1。

从图1和图3的比较可以看出，50％甲醇提取所得供试品溶液的色谱峰面积更大，40-45分钟的三个峰分离效果更好，所以确定50％甲醇作为提取溶剂。

最终确定供试品制备方法为：将待测补肾健骨胶囊研细，取1.5g，精密称定，精密加入50％甲醇30ml，称定重量，超声30分钟(功率250W，频率40kHz)，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.测定波长的确定

分别选择205nm、215nm、235nm、250nm、300nm作为检测波长，其它条件与实施例1相同，得到的HPLC图谱。

从图1、4、5、6、7的比较可以看出，图4的基线波动较大，且图4、图5中1号和2号色谱峰面积都较小，图6中6号色谱峰面积较小，且7、8、9号色谱峰峰形太小，几可忽略，图7中缺少1、2、3号峰，综合来看，以235nm为检测波长的指纹图谱最能全面反映制剂的成分，而且峰形最好，其它峰分离度和色谱峰的数目、基线及信号响应都比较弱。所以，确定235nm为最佳检测波长。

3.流动相的选择

我们共考察了多组流动相，其中，第一组流动相为乙腈-水，第二组流动相为乙腈-磷酸溶液，第三组流动相为乙腈-0.1％磷酸二氢钾(0.05％辛烷磺酸钠)系统，第四组流动相为乙腈-三乙胺系统，其它条件与实施例1相同。

从图1、图8、图9和图10的比较可以看出，图8只有4、5、6号峰，缺少1、2、3和7、8、9号峰，图9中4、5、6号峰分离效果不好，且在13min有一峰未能分离完全，图10在35-45min之间有大量峰无法分离，而图1乙腈-0.1％磷酸二氢钾(0.05％辛烷磺酸钠)系统所得液相色谱图基线较平稳、色谱峰峰形较对称、分离度更好。

实施例3方法学考察

1.稳定性试验

取供试品溶液按照上述色谱项下条件，在0、4、8、12h、24h测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间均小于2.0％，各色谱峰的相对峰面积均小于2.0％，符合指纹图谱技术要求。见表3-4。

表3补肾健骨胶囊稳定性考察相对保留时间

表4补肾健骨胶囊稳定性考察相对峰面积

2.重复性试验

取同一批号样品6份，按照1项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间均小于2.0％，各色谱峰的相对峰面积均小于5.0％，符合指纹图谱技术要求。见表5-6。

表5补肾健骨胶囊重复性考察相对保留时间

表6补肾健骨胶囊重复性考察相对峰面积

3.精密度试验

取供试品溶液按照上述色谱项下条件，连续进样6次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，各色谱峰的相对保留时间均小于1.0％，各色谱峰的相对峰面积均小于3.0％，符合指纹图谱技术要求。见表7-8。

表7补肾健骨胶囊精密度考察相对保留时间

表8补肾健骨胶囊精密度考察相对峰面积

实施例4.指纹图谱的建立

分别取10批补肾健骨胶囊样品，制备供试品溶液，测定并记录50min色谱图，比较了10批样品的色谱图，确定了9个共有峰。经过确认，6号为淫羊藿苷峰，作为参比峰。

1.样品相似度计算：将10批补肾健骨胶囊色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，选取“时间窗”宽度为0.1min，采用样品3生成对照谱，经过多点矫正和数据匹配生成色谱指纹图谱共有模式，10批样品指纹图谱相似度计算结果见表9。

表9十批样品相似度

批号	相似度
		190201	0.992
190202	0.993
		190203	0.999
190404	0.989
		190405	0.985
190706	0.976
		190707	0.992
190708	0.993
		190709	0.990
190710	0.989
		对照指纹图谱	1

2.补肾健骨胶囊标准指纹图谱的制定

取多批补肾健骨胶囊，分别按所述供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，根据检测所得的多批检测数据，建立补肾健骨胶囊的高效液相图谱，确立高效液相色谱峰保留时间和峰面积值，然后收集所有检测数据，计算各对应峰相对保留时间的平均值和相对峰面积的平均值以及标准差等，分别与参照峰的平均保留时间和平均峰面积相除，作为标准指纹图谱的相对峰保留时间和相对峰面积值，导出计算结果，制定标准指纹图谱数据，绘制标准指纹图谱(标准指纹图谱见图1)，并指认6号峰为淫羊藿苷峰(图谱见图2)，结果见表10。

表10标准指纹图谱数据

Claims

1.一种补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法，所述补肾健骨中药由以下重量份数的原料制成：熟地黄3-8份、山茱萸1-5份、狗脊1-5份、淫羊藿1-5份、山药1-5份、当归1-5份、牡丹皮1-4份、牡蛎2-6，其特征在于该检测方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将待测中药研细，50％甲醇超声提取，过滤，得供试品溶液；

(2)精密吸取供试品溶液，上高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为235nm，所述高效液相色谱仪的固定相为C₁₈色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％磷酸二氢钾和0.05％辛烷磺酸钠的水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.5-2ml/min，柱温为25～40℃；

(3)记录供试品溶液0～50min的色谱图，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液的色谱图分别经过数据导入、多点矫正和数据匹配，即得指纹图谱并进行相似度分析，

所述梯度洗脱的程序如下：

洗脱时间流动相A 流动相B 0～10min 10％ 90％ 10～25min 10→28％ 90→72％ 25～35min 28％ 72％ 35～50min 28→100％ 72→0％

。

2.如权利要求1所述补肾健骨中药的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：所述指纹图谱具有9个共有峰，其中6号峰为参比峰即淫羊藿苷峰，各峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、相对峰面积如下：