CN110904169B - 氨基酸的高效绿色制造工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸生产技术领域,公开了氨基酸的高效绿色制造工艺,其包括如下步骤:步骤1)制备优化发酵培养基,步骤2)发酵工艺,步骤3)提取分离工艺。本发明发酵效率高,并且对分离提取工艺进行改进,提高了产品回收率和纯度,降低能耗和污水排放量,符合绿色制造的要求。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域,具体涉及氨基酸的高效绿色制造工艺。
背景技术
氨基酸在食品工业、医药、农业、畜牧业、以及人类健康、保健、化妆品行业等方面,发挥了越来越广泛的作用。据统计,氨基酸及其衍生物的种类已由20世纪60年代的50种左右发展到现在的1000余种。目前世界氨基酸已达600多万吨,生产向发展中国家扩展转移。国际氨基酸科学协会公布的调查报告显示,亚太地区已成为全球最大的氨基酸市场。我国是氨基酸生产和消费大国,无论是在工业总产量还是在年产值方面,都居于世界前列,在我国国民经济发展中扮演着重要角色。但与其他行业或国外氨基酸行业相比,我国氨基酸行业存在创新产品少、产品结构不合理、主要生产技术指标落后、能源消耗大、环境污染严重、生产成本较高等问题,特别是在生产装备等硬件方面,无法满足国际标准的要求。因此,我国虽然是氨基酸生产和消费大国,却难以称为真正的氨基酸强国。
氨基酸生产方法有提取法、化学合成法、酶法以及微生物发酵法。发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点。目前我国除L-组氨酸,部分L-亮氨酸和L-半胱氨酸用提取法生产,L-丝氨酸和部分L-半胱氨酸由酶法生产外,其他的氨基酸产品都是由发酵法来生产。与国外氨基酸产业相比,我国氨基酸发酵产业主要生产技术指标还比较落后,离真正意义上的发酵强国尚有不小的距离。
虽然我国氨基酸发酵技术已经取得了显著进展。但科技创新能力依然较弱,技术水平有待提高。虽然近年来研究开发比例明显增加,但仍相对不足。技术是氨基酸产业落后于其他产业发展的重要制约因素。我国仅是依靠能源及较低的生产成本优势很难与氨基酸生产大国竞争。因此,必须突破关键技术,加强自主创新能力,建立有效的技术支撑体系和质量保证体系。
谷氨酸是氨基酸中产量最大的氨基酸,主要以微生物发酵制备而得,通过优化发酵培养基,使得菌体增殖速率提高,可以提高氨基酸的产量。现有技术对谷氨酸发酵培养基优化进行了大量的研究,例如文献1“基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CNl021发酵培养基优化,中国酿造2014年”,通过最陡爬坡试验和响应面分析法对发酵培养基组成进行优化,得到谷氨酸棒杆菌最适发酵培养基组,较未优化培养基的发酵培养基产酸量提高了22.75%。文献2“混合硝酸稀土对谷氨酸产生菌的影响,氨基酸杂志”发现,在发酵培养基中添加一定量的稀土元素,能够提高谷氨酸的产量。申请人之前的专利技术“一种谷氨酸发酵培养基制备方法”,在常规培养基的基础上进行了改进,通过添加菌体蛋白浸膏来替代酵母膏氮源,不但节约了成本,还能提高氨基酸发酵产率,一举两得。
谷氨酸提取工艺主要存在以下弊端:1、国内现有的氨基酸生产仍采用板框、离交、脱色、干燥等传统技术手段,产品纯度低、酸碱用量大、环境污染严重,成为制约生物发酵行业绿色发展的关键因素。2、传统的絮凝剂造成废液的波美度和粘度高,造成废水处理难度大的技术问题。3、在干燥过程中料液易产生焦化的现象,影响产品的品质,产生不良的气味。
发明内容
申请人之前的专利技术“一种发酵生产α型谷氨酸的方法”通过对发酵工艺的优化,提高了发酵产酸效率,在此基础上,申请人继续对分离提取工艺进行改进,以达到提高产量、降低能耗和污水排放量的技术目的,据此,本发明提供了氨基酸的高效绿色制造工艺。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
氨基酸的高效绿色制造工艺,其包括如下步骤:
步骤1)制备优化发酵培养基,步骤2)发酵工艺,步骤3)提取分离工艺。
进一步地,所述优化发酵培养基包括分开使用的发酵培养基A和发酵培养基B;
所述发酵培养基A按照如下方法制得:取各原料:葡萄糖,酵母浸膏,K2HPO4,MgSO4·7H2O,2-羟基乙胺,CeCl3,MnSO4·H2O,FeSO4·7H2O,VB1,生物素;将各原料搅拌均匀后,调节pH,灭菌,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B按照如下方法制得:
取各原料:琥珀酸,尿素,壳聚糖;将各原料搅拌均匀后,调节pH,灭菌,制得发酵培养基B。
进一步地,所述步骤2)发酵工艺,具体包括:将产谷氨酸的黄色短杆菌按8-10%接种量将种子液接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养24h,然后添加10L发酵培养基B,继续发酵培养24h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度30-36℃,通风比1∶0.7-0.9,搅拌转速200-400r/min,溶氧维持在20-30%,流加葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0%,流加消泡剂消泡。
进一步地,所述步骤3)提取分离工艺,具体包括:取发酵液,采用高速碟片离心机离心,收集滤液和菌体蛋白沉淀;往滤液中添加0.5-2%的絮凝剂,静置6-12h,板框过滤,收集液体;然后经过陶瓷膜进行过滤,收集滤液;将滤液引入脱色罐,活性炭的添加量为0.5-1%,脱色时间为30-120min,过滤收集脱色液;将脱色液经过脱色膜进行二次脱色,收集脱色清液;将脱色清液通过顺序式模拟移动床进行色谱分离得到提取液;将提取液经四效浓缩、离心、流化床喷雾干燥,即得。
优选地,所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖50-100g/L,酵母浸膏10-30g/L,K2HPO4 1-5g/L,MgSO4·7H2O 20-200mg/L,2-羟基乙胺10-50mg/L,CeCl31-20mg/L,MnSO4·H2O 1-10mg/L,FeSO4·7H2O 1-10mg/L,VB1 5-50mg/L,生物素1-10μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6-7,121℃灭菌,自然冷却,制得发酵培养基A。
优选地,所述发酵培养基A的制备方法为:
取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl310mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB110mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A。
优选地,所述发酵培养基B的制备方法为:
取各原料:琥珀酸1-10g/L,尿素1-5g/L,壳聚糖20-100mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH,灭菌,制得发酵培养基B;
优选地,所述发酵培养基B的制备方法为:
取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。
优选地,所述絮凝剂由壳聚糖和海藻酸钠按照2:1的质量比混合制得。
与现有技术相比,本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面:
本发明发酵培养基采用两部分组成,发酵培养基A侧重于菌株增殖的提升,发酵培养基B侧重于谷氨酸的合成和分泌;
前期细胞增殖时,2-羟基乙胺可以促进磷脂酰乙醇胺细胞壁组分的合成,从而提高菌株增殖速率,后期菌株增殖放缓,以产酸为主,2-羟基乙胺还能够作为阳离子表面活性剂,使得细胞壁疏松,提高细胞通透性,促进谷氨酸释放到胞外;
CeCl3稀土盐能够促进菌株增殖,提高谷氨酸相关合成酶的活力,提高谷氨酸的产量;但是过高的浓度会造成菌株增殖放缓和死亡,谷氨酸产量相应下降;
发酵中后期,菌株增殖速度放缓,以产酸为主,壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合,并螯合金属阳离子,从而改变细胞壁的通透性,促进谷氨酸分泌到胞外。
发酵培养基中添加了琥珀酸,三羧酸循环有一定促进作用,而对乙醛酸循环途径具有抑制作用,从而导致中间代谢物更多地流向三羧酸循环途径,进而促进谷氨酸产量的增加。
本发明以获取高纯度高性价比的氨基酸产品、减少环境污染、提高绿色化水平为最终目标,采用“色谱+多级膜耦合分离纯化技术”为核心的综合化绿色分离提取技术,大幅度降低提取过程酸碱使用量和用水量,降低提取过程的能耗,降低提取过程的高氨氮废水的生成量;以“陶瓷膜+脱色膜”过滤技术实现氨基酸发酵液精细过滤,达到模拟移动床色谱的精度要求;绿色高效“甲壳素+海藻酸钠新型絮凝剂”替代传统聚丙烯酰胺,在显著提高蛋白收率的同时,降低了废液的波美度和粘度,实现了行业絮凝剂绿色化的突破。
说明书附图
图1:CeCl3稀土盐对菌体浓度的影响;
图2:CeCl3稀土盐对谷氨酸含量的影响;
图3:2-羟基乙胺对菌体浓度的影响;
图4:2-羟基乙胺对谷氨酸含量的影响;
图5:2-羟基乙胺对糖酸转化率的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合本申请具体实施例,对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
氨基酸的高效绿色制造工艺,其包括如下步骤:
1)优化的谷氨酸发酵培养基,其包括发酵培养基A和发酵培养基B;所述发酵培养基A首先添加,然后间隔24h添加发酵培养基B。
所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L, K2HPO42g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl310mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB110mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B;
2)发酵工艺:将黄色短杆菌GDK-9种子液(OD600nm为13.5)按8%接种量接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养24h,然后添加10L发酵培养基B,继续发酵培养24h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.7,搅拌转速300r/min,溶氧维持在20%,流加质量百分比浓度为20%的葡萄糖维持残糖不低于1.0%,流加消泡剂消泡;
3)提取分离工艺:
取发酵液,采用高速碟片离心机以4000rpm的速度离心5min,收集滤液和菌体蛋白沉淀;往滤液中添加1%(质量体积比,100ml滤液中添加1g絮凝剂)的絮凝剂(壳聚糖和海藻酸钠按照2:1的质量比混合制得),混匀,然后静置12h,板框过滤,收集液体;然后经过陶瓷膜进行过滤,收集滤液;将滤液引入脱色罐,活性炭的添加量为0.5%(质量体积比,100ml滤液中添加0.5g),脱色时间为60min,过滤收集脱色液;将脱色液经过脱色膜进行二次脱色,收集脱色清液;将脱色清液通过顺序式模拟移动床进行色谱分离得到提取液;将提取液经四效浓缩、离心、流化床喷雾干燥,即得。
本发明提取工艺较常规的离交工艺产品提取收率提高10%以上,产品纯度大于99%,提取过程酸碱使用量下降40%以上,用水量大幅度下降20%以上,提取过程高氨氮废水产生量下降50%以上;企业年减少氨基酸废水排放量25万m3,废水回用率达到70%以上,节能减排,降低了环境污染的压力。
实施例2
氨基酸的高效绿色制造工艺,其包括如下步骤:
1)优化的谷氨酸发酵培养基,其包括发酵培养基A和发酵培养基B;所述发酵培养基A首先添加,然后间隔24h添加发酵培养基B。
所述发酵培养基A的制备方法为:取各原料:葡萄糖100g/L,酵母浸膏25g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O 70mg/L,2-羟基乙胺20mg/L,CeCl35mg/L,MnSO4·H2O 2mg/L,FeSO4·7H2O 2mg/L,VB15mg/L,生物素5μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B的制备方法为:取各原料:琥珀酸7g/L,尿素2g/L,壳聚糖50mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B;
2)发酵工艺:将黄色短杆菌GDK-9按8%接种量将种子液(OD600nm为13.5)接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养,发酵培养24h,然后添加10L发酵培养基B,继续发酵培养24h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度35℃,通风比1∶0.7,搅拌转速300r/min,溶氧维持在20%,流加质量百分比浓度为20%的葡萄糖维持残糖不低于1.0%,流加消泡剂消泡;
3)提取分离工艺:
取发酵液,采用高速碟片离心机以5000rpm的速度离心4min,收集滤液和菌体蛋白沉淀;往滤液中添加1.5%(质量体积比,100ml滤液中添加1.5g絮凝剂)的絮凝剂(壳聚糖和海藻酸钠按照3:2的质量比混合制得),混匀,然后静置9h,板框过滤,收集液体;然后经过陶瓷膜进行过滤,收集滤液;将滤液引入脱色罐,活性炭的添加量为0.5%(质量体积比,100ml滤液中添加0.5g),脱色时间为90min,过滤收集脱色液;将脱色液经过脱色膜进行二次脱色,收集脱色清液;将脱色清液通过顺序式模拟移动床进行色谱分离得到提取液;将提取液经四效浓缩、离心、流化床喷雾干燥,即得。
实施例3
一、CeCl3稀土盐对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。
发酵培养基为:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L, K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,CeCl3 0-40mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB110mg/L,生物素7μg/L;
发酵工艺同实施例1,100L发酵罐中含有70L发酵培养基。
设置CeCl3的添加浓度为0,2.5,5,10,20,40mg/L,如图1-2所示,随着CeCl3添加量的增加,菌体浓度和谷氨酸含量均有所提升,当添加量为10mg/L时,菌体浓度和谷氨酸含量达到峰值,然后出现下降趋势,但是整个过程中,糖酸转化率没有明显改变(附图未显示);说明CeCl3稀土盐能够促进菌株增殖,提高谷氨酸相关合成酶的活力,提高谷氨酸的产量,但是过高的浓度会造成菌株增殖放缓和死亡,谷氨酸产量相应下降。
二、通过上述实验确定CeCl3添加量为10mg/L,在此基础上,研究2-羟基乙胺对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。设置2-羟基乙胺的浓度为2.5,5,10,20,40,80,160mg/L,如图3-4所示,随着2-羟基乙胺添加量的增加,菌体浓度随之增加,相应地,谷氨酸含量和糖酸转化率也有所提升,当添加量为40mg/L时,菌体浓度和谷氨酸含量达到峰值,继续增加2-羟基乙胺的浓度,产生明显的抑菌效果,菌株密度下降明显;原因是,2-羟基乙胺可能促进磷脂酰乙醇胺细胞壁组分的合成,从而提高菌株增殖速率,但是浓度过大会导致抑菌现象,后期菌株增殖放缓,以产酸为主,2-羟基乙胺还能够作为阳离子表面活性剂,使得细胞壁疏松,提高细胞通透性,促进谷氨酸释放到发酵液,从而提高了谷氨酸产量和糖酸转化率。
三、通过上述实验确定CeCl3添加量为10mg/L、2-羟基乙胺的添加量40mg/L,在此基础上,研究发酵培养基B对菌体浓度、谷氨酸含量以及糖酸转化率的影响。
对照组1采用发酵培养基A进行发酵,不采用发酵培养基B,100L发酵罐中含有70L发酵培养基A;发酵工艺参照实施例1。
对照组2:发酵培养基B中不添加琥珀酸,其余同实施例1。
对照组3:发酵培养基B中不添加壳聚糖,其余同实施例1。
对照组4:发酵培养基A中添加5g/L的琥珀酸,其余同对照组1。
实验组为实施例1。
具体结果见表1。
表1
组别 | 菌浓度OD<sub>600nm</sub> | 谷氨酸产量g/L | 糖酸转化率% |
对照组1 | 53.9 | 137.4 | 59.1 |
对照组2 | 54.2 | 141.2 | 61.8 |
对照组3 | 54.5 | 145.8 | 62.6 |
对照组4 | 53.8 | 137.9 | 59.2 |
实验组 | 55.3 | 150.7 | 64.1 |
结论:对照组1采用单一发酵培养基发酵,谷氨酸产量和糖酸转化率明显低于实验组,菌体浓度差异并不大;对照组4在对照组1的基础上添加了琥珀酸,对菌体浓度并没有影响,谷氨酸产量和糖酸转化率也没有明显差异,可能原因是,发酵前期以菌体增殖为主,产酸较少,琥珀酸对菌体增殖并没有明显的刺激作用;实验组和对照组3选用发酵中期添加琥珀酸,此时,菌体增殖放缓,以产酸为主,琥珀酸对三羧酸循环有正向促进作用,而对乙醛酸循环途径起抑制作用,从而导致谷氨酸产量的增加;梯度试验发现,琥珀酸添加量过大(大于10g/L),并不会对谷氨酸产量带来进一步的提升,综合成本考虑,选择低于10g/L的添加量较为合适。对照组2和实验组在发酵中后期添加壳聚糖,能够改变细胞壁的通透性,促进谷氨酸分泌到胞外,从而提升谷氨酸产量和糖酸转化率;但是壳聚糖添加量(超过100mg/L)过大会导致抑菌现象发生,进而造成菌株死亡。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,或在实施案例之外的树种实施本方法,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改,改进或范围的扩大,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1. 谷氨酸的高效绿色制造方法,其包括如下步骤:
步骤1)制备优化发酵培养基
所述优化发酵培养基包括分开使用的发酵培养基A和发酵培养基B;
所述发酵培养基A按照如下方法制得:葡萄糖50-100g/L,酵母浸膏10-30g/L,K2HPO4 1-5g/L,MgSO4·7H2O 20-200mg/L,2-羟基乙胺10-50mg/L,CeCl31-20mg/L,MnSO4·H2O 1-10mg/L,FeSO4·7H2O 1-10mg/L,VB1 5-50mg/L,生物素1-10μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6-7,121℃灭菌,自然冷却,制得发酵培养基A;
所述发酵培养基B按照如下方法制得:
取琥珀酸1-10g/L,尿素1-5g/L,壳聚糖20-100mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH,灭菌,制得发酵培养基B;
步骤2)发酵工艺
将产谷氨酸的黄色短杆菌(brevibacterium flavum)按8-10%接种量将种子液接入装有60L发酵培养基A的100L发酵罐中进行发酵培养,所述种子液的OD600nm为13.5,发酵培养24h,然后添加10L发酵培养基B,继续发酵培养24h,收集发酵液;整个发酵培养过程中,控制发酵温度30-36℃,通风比1∶0.7-0.9,搅拌转速200-400r/min,溶氧维持在20-30%,流加葡萄糖溶液维持残糖不低于1.0%,流加消泡剂消泡;
步骤3)提取分离工艺
取发酵液,采用高速碟片离心机离心,收集滤液和菌体蛋白沉淀;往滤液中添加0.5-2%的絮凝剂,静置6-12h,板框过滤,收集液体;然后经过陶瓷膜进行过滤,收集滤液;将滤液引入脱色罐,活性炭的添加量为0.5-1%,脱色时间为30-120min,过滤收集脱色液;将脱色液经过脱色膜进行二次脱色,收集脱色清液;将脱色清液通过顺序式模拟移动床进行色谱分离得到提取液;将提取液经四效浓缩、离心、流化床喷雾干燥,即得。
2.根据权利要求1所述的制造方法,其特征在于,所述发酵培养基A的制备方法为:
取各原料:葡萄糖80g/L,酵母浸膏20g/L,K2HPO4 2g/L,MgSO4·7H2O 50mg/L,2-羟基乙胺40mg/L,CeCl310mg/L,MnSO4·H2O 3mg/L,FeSO4·7H2O 3mg/L,VB110mg/L,生物素7μg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基A。
3.根据权利要求1所述的制造方法,其特征在于,所述发酵培养基B的制备方法为:
取各原料:琥珀酸5g/L,尿素2g/L,壳聚糖80mg/L;将各原料搅拌均匀后,调节pH为6.5,121℃灭菌15min,自然冷却,制得发酵培养基B。
4.根据权利要求1所述的制造方法,其特征在于,所述絮凝剂由壳聚糖和海藻酸钠按照2:1的质量比混合制得。
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