CN110904106B - 春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种春兰miR159b基因及其在增强植物冷敏感性中的应用。本发明从春兰栽培品种“宋梅”中获得miR159b的前体序列片段编码基因MIR159b，并在春兰中进行表达分析，随后将其构建至过表达载体导入目的植物中验证其功能，经筛选培养获得T3代植株，发现其幼苗期根系生长速度较野生型显著加快；将移入土壤60天的野生型和35S：MIR159b转基因植株经4℃低温胁迫后，发现转基因植株出现主花序下垂，不复直立，茎生叶下垂卷曲，基生叶变黄等表型，可见该基因在兰花及其它园艺植物生产中将有广泛的用途。

Description

春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种春兰非编码RNA（核糖核酸）miR159b在增强植物冷敏感性中的应用。

背景技术

兰科（Orchidaceae）是开花植物中最大科之一，全世界有25000多种，约占所有开花植物的10%。春兰（Cymbidium goeringii）属于兰科兰属中的小花型地生兰种类，其花型奇特、花色淡雅，花香清幽，叶姿优美，观赏价值和经济价值极高。春兰对生长环境要求较高，在生长过程中极易受到高温、低温、干旱等恶劣环境影响，严重时，会导致园艺观赏品质下降，甚至植株死亡。因此，研究植物应对非生物胁迫的分子机制以及鉴定具有逆境应答功能的基因对春兰育种、生产及应用具有重要意义。而miR159在植物抗逆响应中扮演重要角色，可为植物的遗传改良提供重要依据。

MicroRNA159s（miR159s）是植物microRNAs中较为保守的古老家族之一，可参与植物生长发育、植物次生代谢、植物响应生物与非生物胁迫等多种生命活动过程。目前，对miR159的研究多集中于生长发育方面，逆境胁迫响应等所受关注相对较少。miR159可调控植物响应热胁迫，如，过表达miR159可增加小麦的热敏感性。而棉花中的miR159则在作物应对病原菌侵害的过程中起着重要作用。甘薯的miR159则可调控其应对盐胁迫。miR159同样是玉米、水稻、番茄等作物响应干旱胁迫的关键因子，但在水稻中的具体调控途径与品种相关，不同品种miR159的调控方式不同。目前，miR159在植物响应冷胁迫方面的作用尚未经过报道，因此，利用基因工程技术，将从春兰中克隆获得miR159b前体基因转入其它植物中，对于研究其功能具有重要意义，同时极具应用前景。

发明内容

本发明提供了一种春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用。

一种春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用，所述植物miR159b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述植物为春兰。

具体方法为：将包含所述春兰miR159b的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

由于miRNA本身很短，只有20bp左右，而前体基因相比较稍长一些，将其连接到载体上有利于拟南芥转化的实现，优选的，所述前体基因的序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示。

本发明通过将春兰miR159b转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，经筛选培养获得T3代植株，发现其幼苗期根系生长速度较野生型显著加快；将移入土壤60天的野生型和35S： MIR159b转基因植株经4℃低温胁迫后，发现转基因植株出现主花序下垂，不复直立，茎生叶下垂卷曲，基生叶变黄等表型，可见该基因在兰花及其它园艺植物生产中将有广泛的用途。

附图说明

图1是miR159b在春兰中的表达情况。A. miR159b在春兰营养生长和生殖生长期不同组织中的表达情况；B. 春兰miR159b在4℃低温胁迫下不同时刻的表达情况。

图2 是pBI121和春兰miR159b基因前体片段编码基因（MIR159b）重组载体示意图；

图3 是miR159b过表达载体构建过程的凝胶图谱。A. miR159b前体PCR扩增凝胶图谱；B. pBI121-MIR159b（miR159b前体）重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；C. pBI121-MIR159b（miR159b前体）重组质粒酶切验证图；

图4是T1代阳性转基因拟南芥植株鉴定结果。A. 9个株系的miR159b前体PCR扩增凝胶图谱（M：DL2000 Marker；M1：阳性对照；M2：阴性对照；M3：空白对照）；B. 9个株系的miR159b荧光定量分析结果；

图5是miR159b过表达拟南芥的根系表型对比图（WT：野生型对照；35S:MIR159b转基因植株）；

图6是miR159b过表达拟南芥与野生型4℃胁迫处理前后表型对比图（WT：野生型对照；35S:MIR159b转基因植株）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 基因的功能预测

本实施例所采用的材料1是春兰“宋梅”营养生长时期与生殖生长时期的根、茎、叶，材料2是春兰“宋梅”4℃低温处理0h、2h、6h、12h、24h的叶片，两类材料采后均速冻于液氮中，超低温冰箱（-80℃）保存。

1）春兰各组织Total Small RNA的提取

按照TaKaRa植物总RNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将超低温冻存的春兰各组织迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至分别研磨成粉末状；将研磨成粉状的样品分别加入到含有450 μlBuffer PE 的1.5 mL灭菌 tube中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀；将裂解液12,000 rpm，4℃离心5分钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌tube 中。加入上清液 1/10体积的Buffer NB，Vortex 振荡混匀，12,000 rpm，4℃离心5 钟；将上清液小心吸取到新的1.5 mL灭菌 tube 中，加入450μL的 Buffer RL，使用移液枪将溶液混合均匀；加入混合液1.5倍体积的无水乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀后，立即将混合液全部转入到RNASpin Column中； 12,000 rpm，离心1分钟，弃滤液，将RNA Spin Column 放回到2 mlCollection Tube 中；将600μL的80%乙醇加入至RNA Spin Column 中，12,000 rpm 离心30秒钟，弃滤液；向RNA Spin Column膜中央加入50μL DNase I 反应液，室温静置15分钟；向RNA Spin Column膜中央加入350μL的Buffer RWB，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液；将600μL的80%乙醇加入至RNA Spin Column 中，12,000 rpm 离心30秒钟，弃滤液；将 RNA SpinColumn 重新安置于2mL Collection Tube 上，12,000 rpm 离心2分钟；将 RNA SpinColumn 安置于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央处加入30μL的 RNase Free dH₂O室温静置5分钟，12,000 rpm 离心2分钟洗脱RNA。所得RNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL RNA利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S和18S条带较为清晰，28S条带亮度约为18S的两倍，RNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测RNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用于反转录。

2）反转录与荧光定量分析

根据春兰microRNA组学测序结果，利用Primer 5设计春兰miR159b基因茎环引物，参考序列为：5’- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACTAGAGC-3’。同时，以18S作为内参基因，引物序列为：5’-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3’。以上述所提取的春兰各组织的Total Small RNA分别为模板，按照Vazyme公司的HiScript III 1^st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒的说明书混合好体系，进行cDNA反转录，反转录程序为：37℃ 15min，85℃ 5s。

将反转录产物稀释10倍，取1μL作模板，所用荧光定量引物如下：

miR159b-F：5’- CGCGTCTGGATGTCAGGGA -3’

miR159b-R：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’

18S-F：5’-GGTCCTATTGTGTTGGCT-3’

18S-R：5’-TCGCAGTGGTTCGTCTTT-3’

利用ChamQ™ Universal SYBR Qpcr Master Mix试剂盒（Vazyme公司）的说明书进行反应溶液的配制，在Applied Biosystems型实时荧光定量分析仪上运行PCR程序：95℃5min；95℃ 10s，60℃ 30s，循环40次；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。待反应结束，获得扩增曲线，通过StepOne Software v2.3导出数据，利用Excel进行数据分析，根据CT值用2^-ΔΔCq相对定量法计算相对表达量，数据分析结果如图1所示。

本实施例根据对荧光定量结果的分析，发现春兰miR159b在4℃低温处理6h快速响应，随后其相对表达量下降直至接近起始值，说明miR159b可以调控植物应答低温胁迫。而春兰组织表达分析结果表明，miR159b在春兰营养生长时期和生殖生长时期中，根中的表达量均高于叶和假鳞茎，故推测miR159b可能通过调控根的某些活动来令植物响应低温。

实施例2 基因的克隆与转化

本实施例所用的植物材料为春兰“宋梅”的新鲜叶片，拟南芥(Arabidopsis thaliana)为“哥伦比亚（Columbia）”型。所用的大肠杆菌菌株为Trans5α，用于基因克隆与过表达载体构建，载体构建如图2所示；农杆菌菌株为GV3101，用于转化拟南芥；试验中所用植物表达载体为pBI121。所用菌株分别购自擎科生物科技有限公司和普利斯生物公司。

1）春兰叶片gDNA的提取

按照TaKaRa植物Genomic DNA提取试剂盒的说明书进行，具体操作为：

将新鲜的春兰“宋梅”叶片转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；迅速将研磨成粉状的样品加入到含有500 μl Buffer HS I和10μl 50x DTT Buffer混合液的1.5 mL灭菌 tube中混匀，向其中加入10 μl RNase A，涡旋振荡混匀，于56℃金属浴温育10min。将62.5 μl 的Buffer KAC加入裂解好的样品中，用移液枪反复吹打混匀，将其在冰上放置5min，12,000rpm离心5分钟；小心吸取上清液，并转移至新的新的1.5ml 灭菌 tube中，加入与上清液等体积的Buffer GB并将二者混合均匀；将上述所得混合液分次移入安置在Collection tube的Spin Column中，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；将500 μl Buffer WA加至Spin Column中，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；将700 μl Buffer WB沿Spin Column 管壁四周加入，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；再次将700 μl Buffer WB沿Spin Column 管壁四周加入，12,000rpm 离心1分钟，弃滤液；12,000rpm离心2分钟，以确保无剩余液体残留在Spin Column中。将Spin Column安置于新的1.5ml 灭菌 tube中，向Spin Column膜的中央处加入30 μl 在65℃金属浴上温育过的无菌水，室温静置5min；12,000rpm离心2分钟以洗脱gDNA。所得gDNA经浓度和纯度检测后存于-80℃冰箱保存备用。

吸取2μL gDNA利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示仅有一条清晰的大分子条带，全基因组DNA质量较好。通过微量核算蛋白测定仪检测gDNA纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀均在1.8~2.1之间，完整性较好，可用于PCR。

2）目的基因引物的设计及克隆

根据现有的春兰miRNA组测序数据，利用其它物种的MIR159相关基因序列进行Blast同源比对，得到含春兰miR159b的前体序列。利用Oligo6.0，Prime5.0在春兰miR159b前体序列发卡结构两端设计相应引物，并在上加入所选酶切位点（XbaI、SmaI）及pBI121上两酶切位点所在的同源臂，其引物序列为：

MIR159b-XbaI-F：5'- GAGAACACGGGGGACTCTAGATAGAGCTCCCTGACATCCAGA AG -3'（下划线部分为XbaI酶切位点），

MIR159b-SmaI-R：5'- ATAAGGGACTGACCACCCGGGTGGAGCTCCCTTC AATCCAA -3'（下划线部分为SmaI酶切位点）。

以gDNA为模板，利用PrimerStar Max高保真酶进行春兰MIR159b基因的克隆。PCR扩增体系（50μL）为：25μlL PrimerStar Max，2μL Forward Primer，2μL Reverse Primer，2μL Template DNA，19μL ddH₂O。PCR程序为：反应条件为94℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环，72℃总延伸5min，16℃保温。

PCR反应完成后，取全部PCR产物通过1.8%琼脂糖凝胶电泳检测（PCR扩增结果如图3A）并切割目的片段，凝胶回收纯化PCR目的扩增产物。采用TransGen公司的DNA凝胶回收试剂盒，进行目的片段纯化回收，具体操作为：将单一目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量；向胶块中加入3倍体积溶液GSB（如果凝胶为0.1g，其体积可视为100μL，则加入300μL GSB溶液），55℃水浴放置，其间不断温和上下翻转离心管，直至胶块完全溶解；将融化的凝胶溶液降至室温，加入1倍体积异丙醇（如果凝胶为0.1g，则加入100μL异丙醇），轻柔混匀；将混合液加入离心柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min，弃流出液，后将离心柱放回收集管中；向离心柱内加入650μL溶液WB，12000rpm离心1min，弃流出液；12000rpm离心2min，尽量除尽残留的WB，将吸附柱置于室温开盖放置5min，彻底晾干；将离心柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL ddH₂O（ddH₂O需提前置于60~70℃水浴预热），室温静置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。取2μL回收纯化后的产物，使用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，其余放置在-20℃冰箱，后续将用于与pBI121载体连接，构建过表达载体。

3）质粒的提取：

按照天根质粒小提中量试剂盒说明书提取质粒，具体步骤如下：

取过夜培养的10mL菌液，12000 rpm离心1min，去掉上清液；取500μL P1溶液（含RNase A）加至留有菌体沉淀的离心管中，使用涡旋仪彻底悬浮菌体沉淀；取500μL P2溶液加至离心管中，温和上下翻转时菌体裂解充分，取700μL P3溶液加至离心管中，立即温和上下翻转，充分混匀，当出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心10min；取500μL平衡液BL加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管，将收集的上清液分批加入过滤柱CS中，12000rpm离心2min，小心将收集管中收集的溶液分批加入吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管；取500μL去蛋白液PD加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱CP4重新放回收集管；取600μl 漂洗液PW（含无水乙醇）加至吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放回收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液；将吸附柱CP4移至新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间加入60μL ddH₂O；室温静置2min，12000rpm离心1min，离心管中收集的溶液即为质粒。最后测定质粒浓度，为下一步实验做准备。

4）双酶切反应

将提取的pBI121质粒用XbaI和SmaI在37℃条件下酶切30min，电泳回收线性载体，-20℃保存备用。双酶切反应体系为50μL：pBI121质粒 20μL，5×buffer 5μL，XbaI 1μL，SmaI 1μL，ddH₂O 23μL。

5）重组反应

琼脂糖凝胶电泳检测酶切后所回收到的目的基因和载体pBI121，根据所检测出的纯度和浓度，按连接体系加入各试剂。其中，目的片段分子数：载体分子数=3:1~5:1，连接反应体系为：线性化pBI121载体7μL，插入片段3μL，5×CE II buffer 4μl，Exnase II 2μl，ddH₂O Up to 20μL。在37℃下反应30min，常温放置（勿立即置于冷却），10min后转化至大肠杆菌感受态。

6）连接产物转入大肠杆菌

从超低温冰箱中取出感受态细胞Trans5α菌株，置于冰上融化。吸取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴10 min；42℃水浴锅中水浴，热激90 s，期间不要摇动；后立即置于冰上冰浴2 min；在超净台中加入500μL无抗生素的液体培养基，37℃、200 rpm摇25min复苏；6000 rpm 离心1 min，吸去350μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂布于LB平板（Kana的浓度为50 mg/L），37℃培养过夜。

7）重组子的鉴定

挑取平板上的单菌落接种到含有抗生素（Kana）的LB液体培养基中，37℃、200 rpm震荡培养过夜。使用目的基因全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，菌检结果如图3B所示。筛选后的阳性克隆送南京思普金公司测序。测序结果正确的阳性克隆，扩大培养后，使用天根质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切验证，判断酶切后片段大小是否一致，酶切结果如图3C所示，其中，M：DL2000 Marker；1：miR159b前体与pBI121连接后用XbaI和SmaI双酶切。

8）农杆菌感受态细胞的制备与转化

本实施例利用农杆菌GV3101来制备农杆菌感受态，进行拟南芥的侵染实验；农杆菌感受态制备过程为：挑取已经活化好的农杆菌单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，28℃、250 rpm摇菌培养20-24 h；吸取2mL菌液，接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中，28℃、250 rpm摇菌至OD₆₀₀值为0.8左右；将扩大繁殖后的菌液置于冰上冰浴30 min，4℃、5000rpm离心5 min，弃上清；加入10mL经预冷的0.1 mo1/L CaCl₂溶液，充分悬浮沉淀的菌体；4℃，5000 rpm离心5 min，弃去上清；加入1mL预冷的20 mmo1/L CaCl₂溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的GV3101感受态细胞，用离心管将其分装成100µL/管，迅速加入20%的无菌甘油，-80℃放置保存。

重组子的农杆菌转化：冰浴，使农杆菌感受态细胞融化，将600ng经回收纯化后的质粒加入到100 μl的农杆菌感受态中，轻轻混匀，冰浴5 min；使用液氮速冻5min，37℃金属浴中热激5 min，迅速置于冰上冰浴5min；加入800 μl不含任何抗生素的LB培养基，28℃，200 rpm复苏2 h； 4000 rpm离心3 min，吸掉部分液体培养基；使用移液枪充分混匀剩余的菌液，后涂布于添加 50 mg/L卡那霉素和100 mg/L的庆大霉素（GV3101）的固体 LB 培养基上；28℃倒置培养30~48 h。

农杆菌重组子的鉴定：从平板培养基上挑取长出的单菌落，接种于含有相应抗生素的液体培养基中；28℃，200 rpm培养过夜；使用35S-F分别搭配如下引物进行菌液PCR，引物序列为：

35S-F：5'-GATAGTGGAAAAGGAAGGTG-3'，

35S:MIR159b-R：5'- ATAAGGGACTGACCACCCGGGTGGAGCTCCCTTCA ATCCAA -3'。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否含有目的片段，鉴定后的阳性克隆加入适量无菌50%甘油，于-80℃保存备用。

9）农杆菌介导的拟南芥的转化

采用花序侵染法将目的基因转入拟南芥中，具体操作方法为：拟南芥(col野生型)保持健康生长状态至开花；活化携带有目的基因的农杆菌GV3101菌株。挑取单菌落，接种于5mL含有卡那霉素和庆大霉素的LB培养基上，28℃、200 rpm摇菌至菌液刚刚变浑浊，约8-10h；吸取1mL菌液，接种到三角瓶中(50mL )摇菌24 h，至OD值约为0.8左右；将菌液6000 rpm在室温下离心5 min，去除上清后收集菌体，用PH5.8的3%蔗糖溶液悬浮；浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.03%(300 μl/L)，晃出泡沫；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡1min，期间轻轻晃动；将浸过的拟南芥平躺在托盘中，用保鲜膜覆盖，锡箔纸密封避光，放置24 h；揭开锡箔纸，正长条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

3%蔗糖溶液重悬液各成分如下：MS培养基，添加蔗糖30g/L，Silwet-77 300µl/L。（注意：配制后pH调制5.8，菌液离心重悬后再加入SilwetL-77；重悬液和菌液的换算关系为：重悬液用量：菌液OD*菌液体积=0.8*重悬液）。

10）转基因植株的筛选

收集的T1代转基因拟南芥的种子，用酒精和次氯酸钠进行灭菌，步骤为：取适量获得的转基因种子放置于1.5mL离心管中，用0.8 %NaClO与乙醇混合液（现配，比例为体积比1:1）浸泡5min；75%酒精灭菌5~6次，每次2 min，；无菌水冲洗3~4次；用0.1%琼脂糖溶液悬浮。

将灭菌后的转基因拟南芥种子播种于含有抗生素（卡那霉素50 mg/L和头孢霉素100 mg/L）的MS固体培养基上，锡纸包裹放入4℃冰箱中春化。2天后从冰箱中取出，将培养基置于22℃，光照培养。大约一周后将培养基上可以正常生长的拟南芥移植与土中，继续生长。

11）转基因植株的DNA检测

取适量T1代拟南芥和转基因植株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤为：将适量叶片置于灭菌处理后的2mL离心管中，加入700 µl的CTAB溶液，用球磨仪彻底研磨，65℃静置10 min；加入等体积的氯仿：异戊醇，数次颠倒使其混合均匀，14000 rpm离心10 min；将上清移至新的无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀数次，室温静置2min，14000 rpm离心10 min，倒掉上清；加入70%的无水乙醇，使用移液枪吹打洗涤两次，14000 rpm离心1min，弃去上清；吹干表面液体，加入20 µL ddH₂O溶解。取上述提取的转基因和野生型拟南芥的DNA，用miR159b基因的特异性引物进行PCR检测。

春兰miR159b基因转化拟南芥后，共获得9个过表达miR159b基因拟南芥株系。以重组质粒为阳性对照，以野生型为阴性对照，以水为空白对照，PCR结果如图4A所示。

12）转基因植株的荧光定量PCR检测

从上述9个过表达春兰miR159b基因拟南芥株系的幼嫩茎生叶（同一高度）中提取总Small RNA，反转录及荧光定量引物、方法及程序同实施例1。以U6作为内参基因，其荧光定量引物如下，其反转录引物为以下U6-R。

U6-F：5’-GGTGCTAAGAAGAGGAAGAAT-3’

U6-R：5’-CTCCTTCTTTCTGGTAAACGT-3’

反应结束后，数据分析方式同实施例1，根据CT值用2^-ΔΔCq相对定量法计算相对表达量，最终数据分析结果如图4B所示。

本实施例克隆得到1个春兰miR159b前体基因，命名为MIR159b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，MIR159b基因核苷酸序列长度为214bp，含有1个茎环结构，并在其臂上存在一对miR159b正/反义互补序列，该miR159b成熟体核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO. 2所示。随后，将已连有春兰miR159b前体基因的35S:MIR159b过表达重组载体转入模式植物拟南芥中，结果表明，所得T1代植株均为春兰miR159b过表达植株，且不同株系的miR159b在幼嫩叶片中的过表达程度不同。

实施例3 春兰miR159b增强植物冷敏感性的表型鉴定

1）转基因纯合植株的获得与表型观察：收获的转基因T1代种子经灭菌，筛选培养后，再移植于营养土中，22℃，16 h光照/8h黑暗培养；经检测后保留初步确认的转基因植株，待成熟后收获T1代种子，进行编号，得到T2代；同T1代一样，将T2代种子经灭菌后涂布于含抗生素的筛选培养基上，置于22℃，连续光照；10天左右，对不同编号的T2代种子进行存活率统计，选取存活比例为75%的植株移植与营养土中按照22℃，16 h光照/8h黑暗培养，并取叶片进行阳性检测；阳性T2代植株继续进行编号，收集种子，得到T3代种子；将种子灭菌后，用筛选培养基筛选，置于光下连续光照培养；10天左右，观察不同编号的T3代植株，全部存活并且没有出现分离的为T3代纯合植株。

选取其中表型明显的转基因植株进行观察，结果如图5所示，相比于野生型，转基因拟南芥植株在幼苗期生长较快，在种子拨入筛选培养基第12天，其根系长度约有0.5cm，而野生型的根系则约为0.1cm。此外，幼苗期转基因植株的地上部分生长速度明显快于野生型，第12天时其真叶已达4片，而野生型真叶仅长出2片。

2）冷胁迫处理

取移入土内60日龄的野生型和T3代35S:MIR159b转基因拟南芥各3盆，放入4℃低温环境培养（培养前1~2天浇透水），其他条件为：第一时段，光照7000lx，温度4℃，湿度75%，时长16h/d；第二时段，光照0lx，温度4℃，湿度75%，时长8h/d。培养三天，照相、观察表型。

4℃低温胁迫处理结果如图5所示，4℃处理前，转基因拟南芥和野生型拟南芥无显著差异；4℃处理后，与野生型相比，转基因拟南芥的冷敏感性显著增强，具体表现为：转基因型的主花序下垂，不复直立，茎生叶下垂卷曲，基生叶变黄；而野生型的花序仅顶端微垂，茎生叶卷曲不明显，基生叶未发现变黄。

本实施例将转春兰35S:MIR159b拟南芥植株筛选、培养并获得T3代纯合植株，发现其幼苗期根系生长速度较野生型显著加快；将移入土壤60天的野生型和35S：MIR159b转基因植株经4℃低温胁迫后，从结果可以看出，相比于野生型，过表达35S:MIR159b的拟南芥具有更强的冷敏感性，说明MIR159b能帮助植物提高冷敏感性。

<120> 春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 春兰Cymbidium goeringii

<400> 1

uagagcuccc ugacauccag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 春兰Cymbidium goeringii

<400> 2

tagagctccc tgacatccag 20

<210> 3

<211> 214

<212> RNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

uagagcuccc ugacauccaa aguaaggccu uugagggcuu guuauugcug cuggguuagg 60

aauuccacaa uucuauuuca uuaaaauccc ucaaauuggc auaacacaau gguguaaaaa 120

uaauauauug gaaauauggg gcagacuugc ggguuucgug accaaggagc uauuggcaag 180

ucuuaagagc uuguuuggau ugaagggagc ucca 214

<210> 4

<211> 214

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

tagagctccc tgacatccaa agtaaggcct ttgagggctt gttattgctg ctgggttagg 60

aattccacaa ttctatttca ttaaaatccc tcaaattggc ataacacaat ggtgtaaaaa 120

taatatattg gaaatatggg gcagacttgc gggtttcgtg accaaggagc tattggcaag 180

tcttaagagc ttgtttggat tgaagggagc tcca 214

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

cgcgtctgga tgtcaggga 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 6

agtgcagggt ccgaggtatt 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 7

ggtcctattg tgttggct 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 8

tcgcagtggt tcgtcttt 18

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 9

gagaacacgg gggactctag atagagctcc ctgacatcca gaag 44

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 10

ataagggact gaccacccgg gtggagctcc cttcaatcca a 41

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 11

gatagtggaa aaggaaggtg 20

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 12

ataagggact gaccacccgg gtggagctcc cttcaatcca a 41

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 13

ggtgctaaga agaggaagaa t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 14

ctccttcttt ctggtaaacg t 21

Claims (4)

1.春兰miR159b在增强植物冷敏感性中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将包含所述春兰miR159b的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到野生型拟南芥“哥伦比亚”，筛选，培养，获得转基因植株。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述春兰miR159b前体基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

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