CN110878379A - 一种类nadc30 prrsv减毒活疫苗配套鉴别检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套鉴别RT‑PCR方法与应用，属于农业兽用生物技术领域。通过对类NADC30 PRRSV减毒活疫苗基因组对比分析，建立了配套鉴别RT‑PCR方法，采用3条特异性引物进行鉴别，可根据扩増目的片段大小，快速鉴别疫苗毒与野毒感染，同时也可以对不同亚型野毒进行区分诊断，实现蓝耳病快速诊断与净化。

Description

一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套鉴别检测方法及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套鉴别RT-PCR方法与应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍、生长猪呼吸道疾病为主要特征的猪传染病，对全世界的养猪业造成了巨大经济损失。特别是2006年暴发高致病性HP-PRRSV，其临床发病率与死亡率高，给我国养猪业带来前所未有经济损失。自2012年开始，国内陆续分离到与美国NADC30基因同源性较高的毒株，由于与NADC30毒株遗传进化关系较近，国内现将该类病毒统称为类NADC30毒株（NADC30-like毒株），发病猪场临床症状主要表现为：母猪流产等繁殖障碍，保育及生长育肥猪的严重呼吸道症状。2014年以来，类NADC30毒株在我国流行呈现出加剧趋势，目前有大量研究报道，该类毒株与HP-PRRSV已成为猪场两大优势流行毒株，增加了毒株复杂性，给我国生猪养殖带来了新的挑战。

目前，市场上的商品化PRRSV疫苗主要有两大类：灭活疫苗和弱毒疫苗。疫苗免疫是防控PRRSV感染常用手段之一，但两类疫苗存在优缺点。灭活疫苗具有较高安全性，不存在毒力返强的风险，但其免疫效力与弱毒疫苗相比，诱导中和抗体水平低，产生的免疫效果不确实，且免疫剂量大，副反应作用大，也不能有效激发机体的细胞免疫，从而难以有效控制PRRSV的发生及流行；弱毒疫苗在PRRSV防控中发挥重要作用，但是弱毒苗对异源毒株提供部分交叉保护效力，特别是NADC30-like毒株的出现，由于它易于重组的特性产生了大量的重组毒株，NADC30-like 毒株基因组间同源性较低，即使是同一谱系中的不同毒株间仍有较大差异，现有疫苗难以对其产生充分的交叉保护。同时，弱毒疫苗不宜常温保存运输，因此，开发一种更加安全、高效、耐热保护、特别是对现在流行NADC30-1ike和HP-PRRSV两大优势毒株提供理想保护效果的疫苗迫在眉睫。

发明内容

PRRSV类NADC30毒株的基因组特征主要表现为非结构蛋白区Nsp2存在“111+1+19”的氨基酸缺失分子特征，具有高度变异性和更高的重组频率，重组模式复杂多样，但重组的位置主要集中于非结构蛋白区，基于上述特点，前期发明了一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗，该疫苗毒株为自然重组PRRSV，骨架为HP-PRRSV MLV，同时具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征，重组位置位于非结构蛋白编码区（Nsp2）的1737nt-3506nt。

具有SEQ ID NO:4序列:

PSLLPLECVQGCCEHKGGLSSPSAVEVSGFDPACLDWLAKVMHLPSSAIPAALAEMSGNFGHSAPPVPVVWTVSQFFARHSGGEDPDQVCLKKIVSLCQLLESCCCSQNKANPVTPEEVRRKIDQYLRGAVSLEECLARLEKARPPSILDTSFDWDVVLPGVGVVAQAAKLPLTNQCHAPVAVVAQRPPPEFQSRKAESVRSLPENRPLPAPRRKIRSECGSLASLGGNFPDSWEDLAGGPFHSPVLPESVARSNGPVPVPAPRRTVSQLKPSPITSTPVPAPRCGLQHVGGMNLAVGTLACQDELLDLPASSQTEYEALSLPQSEDALVVRGGEVEEALSEASGMPNDIRLTPVSSSSSLSSVEITRPKYSAQAIIDTGGPCCGHLQEVKEKYLSVMREACDATKLDDPATQEWLSRMWDRVDMLTWRSTSMFQAPFILADKFKFLPKMILETPPPYPCGFVMMPRTPAPSVGAESDLTVGSVATEDVPRILGKIGDTDELLDRGPSAPSKGEPVCDQPAKDPRMSPRDSDESIIVPPADTGGVGSFTDLPSSDGVDVDGGGPLRTVKTKAERLLDQLSCQVFSLVSH

本发明同时公开了一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套鉴别RT-PCR方法，其特征在于采用3条特异性引物进行鉴别，具体引物如下：

P1：5- ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3；SEQ ID NO:1

P2：5- ACTCTGCGGCAACGACAAAG-3；SEQ ID NO:2

P3：5- CTTGACAGGGAGCTGCTTGA；SEQ ID NO:3

疫苗毒株扩增片段740bp，野毒经典PRRSV扩增片段1021bp，野毒HP-PRRSV扩增片段931bp，野毒NADC30扩增片段628bp。

本发明进一步公开了在鉴别疫苗毒与野毒方面的应用，同时可以对不同亚型野毒进行区分诊断，实现蓝耳病快速诊断与净化。本发明主要解决了疫苗毒株与野毒在临床生产中感染而无法鉴别区分问题，重点考察了检测方法特异性及敏感性，主要难点在于引物序列设计与优化。

本发明更加详细的描述如下：

一、材料与方法

1、主要试剂

MARC-145细胞购自南京科佰生物细胞库；PRRSV N蛋白单克隆抗体、异硫氯酸荧光素（FITC）-山羊抗小鼠IgG，购自天津联星生物公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；DEPC、PMD-18T载体、dNTP、RNase Inhibitor、M-MLV、Taq酶、随机引物等为大连宝生物工程有限公司产品。

2、鉴别RT-PCR引物设计

参考PRRSV NADC30（JN654459.1）、CH-1a（AY032626.1）和JXA1（EF112445.1）基因序列，应用Primer 5.0软件，针对Nsp2基因缺失持性，设计3条特异性引物：

P1：5- ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3；SEQ ID NO:1

P2：5- ACTCTGCGGCAACGACAAAG-3；SEQ ID NO:2

P3：5- CTTGACAGGGAGCTGCTTGA；SEQ ID NO:3

根据扩増目的片段大小，可快速鉴别疫苗毒与野毒感染，同时也可以对不同亚型野毒进行区分诊断，实现蓝耳病快速诊断与净化。

3、反应体系建立及条件优化

反应体系如下（20μl）：10×PCR Buffer（with Mg2+）2μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/Leach）2 μL，Primer各0.5，1，1.5 μL（梯度稀释），rTaq（5 U/μL）0.5 μL，cDNA模板 5 μL，加去离子水至20 μL。

PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 40s，54，55，56，57，58℃（温度梯度） 45s，72℃1.5 min，35个cycles；72 ℃延伸10min。待反应结束后，取5μL PCR产物，用0.85%琼脂糖凝胶电泳检测。根据电泳条带的清晰情况，适当调整Primer浓度及退火温度，确定最佳反应体系。

4、鉴别方法特异性试验

分别以PRRSV 类NADC30疫苗毒株及野毒分离株、Ch-1R株（哈维科公司产品）、JXA1-R株（武汉中博公司产品）及CSFV（CVCC AV1535）、PEDV（HVRIPEDV0001）、TGEV（HVRITGEV0001）、RV（CVCC AV55）、SIV（CVCC AV1522）的cDNA以及PRV（CVCC AV1211）、PCV2（CAU0034）的DNA为模板进行PCR扩增，来验证引物特异性。

5、鉴别检测方法敏感性试验

将提取的PRRSV的类NADC30疫苗及野毒、JXA1-R株、Ch-1R株的cDNA用核酸蛋白分析仪测定其浓度，然后进行10倍系列稀释，检测其敏感性。

二、结果与分析

1、鉴别检测方法的反应体系优化结果

反应的最佳体系为（20μL）：10×PCR Buffer（with Mg2+）2 μL，dNTP Mixture（2.5mmol/L each）2 μL，Primer各1 μL，rTaq（5 U/μL）0.5 μL，cDNA模板 5 μL，PCR水8.0μL。反应条件：95℃5min；94℃40s，56℃45s，72℃1.5 min，35个cycles；72 ℃延伸10min。

2、鉴别检测方法的特异性试验结果

用该检测方法对PRRSV类NADC30疫苗毒及野毒、JXA1-R株、Ch-1R株、JEV、CSFV、PEDV、TGEV、RV、SIV、PRV、PCV2进行特异性检测，结果显示NADC30-like PRRSV疫苗毒株能扩增出740bp的特异条带，NADC30-like 野毒株能够扩增出628bp的条带，HP-PRRSV（JXA1-R株）能扩增出931bp的条带，经典PRRSV（Ch-1R株）能扩增出1021bp的条带，其余均未扩增出条带（图1），说明建立的鉴别检测方法具有良好的特异性。

1、鉴别检测方法的敏感性试验结果

在优化的最佳RT-PCR反应条件下，对PRRSV类NADC30疫苗毒株及野毒、JXA1-R株及Ch-1R株的最小检出量分别为0.39，0.54，5.17，9.25pg，相比经典PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株，NADC30疫苗毒株检出敏感性更高。

三、结论

本发明可迅速诊断出是疫苗免疫还是野毒感染，有助于评价疫苗的免疫效果，同时也可以对不同亚型野毒进行区分诊断，实现蓝耳病快速诊断与净化。

附图说明

图1 为配套RT-PCR鉴别诊断技术结果：其中:

1.野毒NADC30毒株； 2. 野毒HP-PRRSV毒株；3. 野毒经典PRRSV毒株；

4.本发明疫苗毒株； 5. 野毒NADC30+HP-PRRSV； 6. 野毒经典PRRSV+NADC30；

7. 野毒经典PRRSV+HP-PRRSV； 8. 野毒NADC30+HP-PRRSV+经典PRRSV；

9.空白对照。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明所用原料及试剂均有市售。NADC30临床野毒株（参见-天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及遗传演化分析-硕士论文中第四章：病毒分离与鉴定），然后由本实验室分离和保存；也可以参见下面方法进行分离：

（1）取新鲜PRRS阳性（NADC30 RT-PCR 检测阳性）样品，剪碎、组织处理器拍打，4℃、6000rpm离心10 min；取少量上清液反复冻融3次，0.22μm 滤膜过滤除菌；

（2）接种单层的PAMs细胞，37℃吸附1h，弃上清，加入含血清的DMEM 培养液，放置37℃、5%CO2培养箱培养48h后；

（3）应用倒置显微镜定时观察细胞CPE，连续观察5d，收获培养物冻融，反复培养3代，观察细胞CPE；

（4）将收获的细胞培养物，按照试剂盒说明书步骤提取病毒总RNA，按常规RT-PCR检测方法进行检测并基因测序。

实施例2

一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗，该疫苗毒株为自然重组PRRSV，骨架为HP-PRRSVMLV，同时具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征，重组位置位于非结构蛋白编码区（Nsp2）的1737nt-3506nt；NADC30 PRRSV减毒活疫苗制备如下：

（1）将种子液接种MARC-145 细胞单层，37℃培养48h～60h，当70 %以上细胞出现CPE时收获病毒液。

（2）将收获的病毒液进行10×系列稀释，接种于96孔板，每个稀释度接种8个孔，0.1 mL/孔，同时设正常细胞对照，于37℃5% CO₂培养2 d～3 d，测定TCID₅₀。

（3）将收获的种子液调整浓度，用以明胶为主要成分的耐热冻干保护剂混合，定量分装后加盖，置于冻干机内进行冷冻真空冻干。

（4）每批次分别抽样进行病毒含量TCID₅₀测定和无菌检验。

实施例3

反应体系配制与反应条件1

反应体系配制（20μL）：10×PCR Buffer（with Mg2+）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/Leach）2 μL，Primer各1 μL，rTaq（5 U/μL）0.5 μL，cDNA模板 5 μL，PCR水8.0μL。反应条件：95℃5min；94℃40s，55℃45s，72℃1.5 min，35个cycles；72 ℃延伸10min

反应体系配制与反应条件2

反应的最佳体系为（20μL）：10×PCR Buffer（with Mg2+）2 μL，dNTP Mixture（2.5mmol/L each）2 μL，Primer各1 μL，rTaq（5 U/μL）0.5 μL，cDNA模板 5 μL，PCR水8.0μL。反应条件：95℃5min；94℃40s，57℃45s，72℃1.5 min，35个cycles；72 ℃延伸10min。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津农学院

<120> 一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套鉴别检测方法及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttgtgct tcctggggtt g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actctgcggc aacgacaaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttgacaggg agctgcttga 20

<210> 4

<211> 589

<212> PRT

<213> NADC30 PRRSV减毒活疫苗

<400> 4

Pro Ser Leu Leu Pro Leu Glu Cys Val Gln Gly Cys Cys Glu His Lys

1 5 10 15

Gly Gly Leu Ser Ser Pro Ser Ala Val Glu Val Ser Gly Phe Asp Pro

20 25 30

Ala Cys Leu Asp Trp Leu Ala Lys Val Met His Leu Pro Ser Ser Ala

35 40 45

Ile Pro Ala Ala Leu Ala Glu Met Ser Gly Asn Phe Gly His Ser Ala

50 55 60

Pro Pro Val Pro Val Val Trp Thr Val Ser Gln Phe Phe Ala Arg His

65 70 75 80

Ser Gly Gly Glu Asp Pro Asp Gln Val Cys Leu Lys Lys Ile Val Ser

85 90 95

Leu Cys Gln Leu Leu Glu Ser Cys Cys Cys Ser Gln Asn Lys Ala Asn

100 105 110

Pro Val Thr Pro Glu Glu Val Arg Arg Lys Ile Asp Gln Tyr Leu Arg

115 120 125

Gly Ala Val Ser Leu Glu Glu Cys Leu Ala Arg Leu Glu Lys Ala Arg

130 135 140

Pro Pro Ser Ile Leu Asp Thr Ser Phe Asp Trp Asp Val Val Leu Pro

145 150 155 160

Gly Val Gly Val Val Ala Gln Ala Ala Lys Leu Pro Leu Thr Asn Gln

165 170 175

Cys His Ala Pro Val Ala Val Val Ala Gln Arg Pro Pro Pro Glu Phe

180 185 190

Gln Ser Arg Lys Ala Glu Ser Val Arg Ser Leu Pro Glu Asn Arg Pro

195 200 205

Leu Pro Ala Pro Arg Arg Lys Ile Arg Ser Glu Cys Gly Ser Leu Ala

210 215 220

Ser Leu Gly Gly Asn Phe Pro Asp Ser Trp Glu Asp Leu Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Phe His Ser Pro Val Leu Pro Glu Ser Val Ala Arg Ser Asn Gly

245 250 255

Pro Val Pro Val Pro Ala Pro Arg Arg Thr Val Ser Gln Leu Lys Pro

260 265 270

Ser Pro Ile Thr Ser Thr Pro Val Pro Ala Pro Arg Cys Gly Leu Gln

275 280 285

His Val Gly Gly Met Asn Leu Ala Val Gly Thr Leu Ala Cys Gln Asp

290 295 300

Glu Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ser Ser Gln Thr Glu Tyr Glu Ala Leu

305 310 315 320

Ser Leu Pro Gln Ser Glu Asp Ala Leu Val Val Arg Gly Gly Glu Val

325 330 335

Glu Glu Ala Leu Ser Glu Ala Ser Gly Met Pro Asn Asp Ile Arg Leu

340 345 350

Thr Pro Val Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Val Glu Ile Thr Arg

355 360 365

Pro Lys Tyr Ser Ala Gln Ala Ile Ile Asp Thr Gly Gly Pro Cys Cys

370 375 380

Gly His Leu Gln Glu Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Val Met Arg Glu

385 390 395 400

Ala Cys Asp Ala Thr Lys Leu Asp Asp Pro Ala Thr Gln Glu Trp Leu

405 410 415

Ser Arg Met Trp Asp Arg Val Asp Met Leu Thr Trp Arg Ser Thr Ser

420 425 430

Met Phe Gln Ala Pro Phe Ile Leu Ala Asp Lys Phe Lys Phe Leu Pro

435 440 445

Lys Met Ile Leu Glu Thr Pro Pro Pro Tyr Pro Cys Gly Phe Val Met

450 455 460

Met Pro Arg Thr Pro Ala Pro Ser Val Gly Ala Glu Ser Asp Leu Thr

465 470 475 480

Val Gly Ser Val Ala Thr Glu Asp Val Pro Arg Ile Leu Gly Lys Ile

485 490 495

Gly Asp Thr Asp Glu Leu Leu Asp Arg Gly Pro Ser Ala Pro Ser Lys

500 505 510

Gly Glu Pro Val Cys Asp Gln Pro Ala Lys Asp Pro Arg Met Ser Pro

515 520 525

Arg Asp Ser Asp Glu Ser Ile Ile Val Pro Pro Ala Asp Thr Gly Gly

530 535 540

Val Gly Ser Phe Thr Asp Leu Pro Ser Ser Asp Gly Val Asp Val Asp

545 550 555 560

Gly Gly Gly Pro Leu Arg Thr Val Lys Thr Lys Ala Glu Arg Leu Leu

565 570 575

Asp Gln Leu Ser Cys Gln Val Phe Ser Leu Val Ser His

580 585

Claims (2)

1.一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套鉴别RT-PCR方法，其特征在于采用3条特异性引物进行鉴别，具体引物如下：

P1：5- ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3；SEQ ID NO:1

P2：5- ACTCTGCGGCAACGACAAAG-3；SEQ ID NO:2

P3：5- CTTGACAGGGAGCTGCTTGA；SEQ ID NO:3

疫苗毒株扩增片段740bp，野毒经典PRRSV扩增片段1021bp，野毒HP-PRRSV扩增片段931bp，野毒NADC30扩增片段628bp。

2.权利要求所述一种类NADC30 PRRSV减毒活疫苗配套RT-PCR方法在鉴别疫苗毒株与PRRSV野毒方面的应用。

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