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CN110831968A - 用于治疗egfr阳性癌症的t细胞重定向双特异性抗体 - Google Patents

用于治疗egfr阳性癌症的t细胞重定向双特异性抗体 Download PDF

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CN110831968A
CN110831968A CN201880027187.0A CN201880027187A CN110831968A CN 110831968 A CN110831968 A CN 110831968A CN 201880027187 A CN201880027187 A CN 201880027187A CN 110831968 A CN110831968 A CN 110831968A
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Abstract

本发明涉及同时结合CD3和EGFR的双特异性抗体。发明人已经证明这类抗体可用于治疗EGFR肿瘤，其通过重定向T细胞并在活化的T细胞和表达EGFR的肿瘤细胞之间形成免疫突触，从而导致表达EGFR的肿瘤细胞的杀伤水平提高。特别地，本发明涉及选自以下的CD3xEGFR双特异性抗体：CD3xEGFR_SF1(SEQ ID NO：4、5和6)、CD3xEGFR_SF3(SEQ ID NO：7、2和8)、CD3xEGFR_SF4(SEQ ID NO：4、5和9)、CD3xEGFR_SD1(SEQ ID NO：1、2和10)和CD3xEGFR_SD2(SEQ ID NO：11、10和2)。

Description

用于治疗EGFR阳性癌症的T细胞重定向双特异性抗体
技术领域
本发明涉及同时结合CD3和EGFR的双特异性抗体。发明人已经证明这类抗体可用于通过重定向T细胞并在活化的T细胞和表达EGFR的肿瘤细胞之间形成免疫突触，导致表达EGFR的肿瘤细胞的杀伤水平提高，从而用于治疗EGFR肿瘤。
背景技术
已经证明，使用抗EGFR单克隆抗体(mAb)靶向由许多上皮来源的癌细胞过度表达的表皮生长因子受体(EGFR)已被证实可用于抑制该肿瘤细胞的生长，从而带来积极的临床结果。
癌症免疫疗法或免疫肿瘤学是第四种抗肿瘤方法，在经历了一些令人鼓舞的研究和其他有关其临床疗效的引人注目的数据之后，经历了一段时期的发展。
然而，用抗EGFR mAb治疗的患者的临床反应是可变的，并且可能反映EGFR表达的可变性、肿瘤细胞中的信号传导、癌细胞用于逃避治疗的适应性机制或所有这些因素的某种组合。
癌细胞对抗EGFR mAb治疗产生耐药的一种已被很好阐明的机制是通过突变来自哺乳动物ras基因家族的Kirsten ras(KRAS)癌基因同源物。在白血病、大肠癌、胰腺癌和肺癌中发现了体细胞KRAS突变。KRAS突变预示着已批准的抗EGFR mAb治疗剂帕尼单抗
Figure BDA0002245924160000011
和西妥昔单抗
Figure BDA0002245924160000012
在结肠直肠癌中的反应非常差。研究表明，肿瘤表达KRAS基因突变形式的患者对西妥昔单抗或帕尼单抗无反应。KRAS突变的出现是结直肠癌和其他癌症对抗EGFR mAb治疗剂的获得性耐药的常见驱动因素。
发明内容
为了解决与EGFR癌症治疗有关的问题，发明人已经产生了一套新的抗肿瘤药物，其适合于治疗EGFR过表达的癌症并克服了现有治疗的问题。
本发明涉及与CD3ε和EGFR上的表位结合的双特异性抗体。
其中CD3ε结合剂优选是SP34或OKT3或由其衍生。
其中EGFR结合剂优选是帕尼单抗和西妥昔单抗。
根据本发明，CD3xEGFR双特异性抗体包含至少一个FAB和一个scFv结合部分。
特别地，本发明涉及来自基于蛋白质的靶标特异性结合分子的结合部分，所述靶标特异性结合分子例如是抗体、DARPins、Fynomers、Affimers、可变淋巴细胞受体、anticalin、nanofitin、可变新抗原受体(VNAR)，但不限于这些。
具体而言，结合部分取自或衍生自抗体，例如Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab′)2、scFv、Fcabs、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三抗体。在优选的实施方案中，激动剂包含取自或衍生自Fab、ScFv和dAb的结合部分。
根据本发明，CD3xEGFR双特异性抗体包含彼此连接的至少一个FAB和一个scFv部分。
特别地，可以将结合部分遗传融合至包含相同或不同抗体Fc或其部分的支架。根据本发明的这个方面，第一全长抗体例如IgG可以形成根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体的基础，并且第二组结合部分可以根据本发明移植到起始抗体上。
优选地，将两个结合部分连接，使得第二结合部分位于免疫球蛋白重链的可变部分的远端。
或者，将两个结合部分连接，使得第二结合部分位于免疫球蛋白重链的可变部分的近端。
优选地，将两个结合部分连接，使得第二结合部分位于免疫球蛋白轻链的可变部分的远端。
或者，将两个结合部分连接，使得第二结合部分位于免疫球蛋白轻链的可变部分的近端。
根据本发明，两个连接的结合部分可以通过肽接头分开。
根据本发明，CD3xEGFR双特异性抗体选自包括CD3xEGFR_SF1(SEQ ID NO：4、5和6)、CD3xEGFR_SF3(SEQ ID NO：7、2和8)、CD3xEGFR_SF4(SEQ ID NO：4、5和9)、CD3xEGFR_SD1(SEQ ID NO：1、2和10)和CD3xEGFR_SD2(SEQ ID NO：11、10和2)的组。
根据本发明的另一方面，涉及与人EGFR的结构域4结合的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自以下的重可变序列和轻可变序列：SEQ ID NO：23和24、SEQ ID NO：25和26、SEQ ID NO：31和33、SEQ ID NO：32和34、SEQ ID NO：36和38、SEQ ID NO：37和39或由其衍生。
本发明还涉及根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体作为药物的用途。
本发明还涉及根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体作为用于治疗以EGFR的过表达为特征或恶化的癌症或其他疾病的药物的用途。
本发明还涉及一种治疗患有癌症的患者的方法，包括向该患者施用有效量的CD3xEGFR双特异性抗体。
本发明还涉及一种治疗患有癌症的患者的方法，包括向该患者施用有效量的CD3xEGFR双特异性抗体和一种或多种其他药剂，例如小分子或生物药物，以进一步调节该患者的免疫系统。这种药剂的实例包括抗PD-1抗体和抗肿瘤小分子，例如多激酶抑制剂。
此外，本发明涉及根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体和另一种药物对患者的共同给药，其中所述另一种药物具有协同或累加作用。
根据本发明的另一方面，提供了一种通过向需要的患者施用治疗量的根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体来治疗表达EGFR的癌症的方法。
根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体用作药物。
根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的CD3xEGFR双特异性抗体，用于表达EGFR的癌症的治疗。
根据本发明的另一方面，表达EGFR的癌症进一步包含提供的一个或多个KRAS或B-Raf突变。
除非另有定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。通常，本文描述的与细胞和组织培养，分子生物学以及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学以及杂交相关的术语和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔，脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述进行。前述技术和过程通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如本说明书通篇所引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、输送和患者治疗。
已知基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义一个恒定区，主要负责效应子(effector)功能。通常，从人获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任何一种，它们之间的重链性质彼此不同。某些类也具有子类(也称为同种型)，例如lgG1、lgG2等。此外，在人类中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用，术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体组合物”是指仅包含由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的一种分子种类的抗体分子群。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中是相同的。MAb包含能够与抗原的特定表位进行免疫反应的抗原结合位点，其特征在于对其具有独特的结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区域内的三个高度差异的延伸片段(称为“高变区”)插在被称为“框架区域”或“FR”的更为保守的侧翼片段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且每条重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。对每个结构域的氨基酸的分配是根据具有免疫学意义的蛋白质的Kabat序列所定义((National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，Chothia等，Nature 342：878-883(1989)。
本公开的融合蛋白的单结构域抗体(sdAb)片段部分在本文中可互换地称为本文的靶向多肽。
如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或其片段或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异结合的任何蛋白质决定簇。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当解离常数≤1mM，例如，在某些实施方案中≤1μM(诸如≤100nM，≤10nM或≤1nM)时，可以说抗体特异性结合抗原。
如本文所用，术语“免疫结合”和“免疫结合特性”是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价相互作用类型。可以根据相互作用的解离常数(KD)来表达免疫结合相互作用的强度或亲和力，其中越小的KD表示越大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域众所周知的方法进行定量。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中该速率取决于复合伴侣的浓度，相互作用的亲和力以及在两个方向上均等地影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)都可以通过计算浓度和缔合和解离的实际速率来确定(参见Nature 361：186-87(1993))。koff/kon的比率可以消除与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数KD(通常参见Davies等，(1990)Annual Rev Biochem 59：439-473)。当平衡结合常数(KD)为≤1mM，在一些实施方案中为≤1μM、≤100nM、≤10nM或≤100pM至约1pM，本发明的抗体被认为与抗原特异性结合。通过诸如放射性配体结合测定、表面等离振子共振(SPR)、流式细胞仪结合测定或本领域技术人员已知的类似测定来测量。
本文所用的术语“分离的蛋白质”是指cDNA、重组RNA或合成来源或其某种组合的蛋白质，由于其优点或来源，或其衍生的来源，“分离的蛋白质”(1)与在自然界中发现的蛋白质无关，(2)没有来自同一来源的其他蛋白质，例如，没有海洋蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。
术语“多肽”在本文中用作通用术语，是指多肽序列的天然蛋白质、片段或类似物。因此，天然蛋白质片段和类似物是多肽属的种类。
如本文所用，术语“天然存在的”应用于物体是指可以在自然界中发现物体的事实。例如，存在于有机体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，该多肽或多核苷酸序列可以从自然界中分离出并且未被人在实验室中有意修饰。
术语“序列同一性”是指在比较窗口中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即，基于核苷酸-核苷酸或残基-残基)。术语“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如A，T，C，G，U或I)或两个序列中均出现残基，以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比。本文所用的术语“实质同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中该多核苷酸或氨基酸包含具有至少85％的序列同一性，例如至少90％至95％的序列同一性的序列，与参考序列相比，通常在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口中，通常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口中，与参考序列相比具有至少99％的序列同一性，其中序列同一性的百分比是通过将参考序列与可能包括在整个比较窗口中占参考序列的20％或更少的缺失或添加的序列进行比较来计算的。参考序列可以是较大序列的子集。
如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren编著，Sinauer Associates，Sunderland7Mass.(1991))。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸(例如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸)的立体异构体(例如D-氨基酸)也可能是本公开的多肽。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
类似地，除非另有说明，否则单链多核苷酸序列的左端是5′端，双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录本的5′至3′添加方向被称为DNA链上的转录方向序列区域，该区域具有与RNA相同的序列，并且位于RNA转录本的5′至5′末端作为“上游序列”，在DNA链上具有与RNA相同的序列并且在RNA转录物的3′至3′端的序列区域被称为“下游序列”。
应用于多肽时，术语“实质同一性”是指两个肽序列在最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT使用默认缺口权重，具有至少80％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性或至少99％的序列同一性。
在一些实施方案中，不相同的残基位置通过保守氨基酸取代而不同。
保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸。具有酰胺基侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸基团是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸。并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。合适的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的微小变化被考虑为被本公开所涵盖，条件是氨基酸序列中的变化保持至少75％，例如至少80％、90％、95％或99％。特别地，可以考虑保守氨基酸的替代。保守置换是发生在侧链相关的氨基酸家族中的置换。遗传编码的氨基酸通常分为以下几类：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、以及(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其他氨基酸家族包括：(i)丝氨酸和苏氨酸、其属于脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其属于含酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其属于脂族家族；(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其属于芳香族。例如，可以合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸单独替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用丝氨酸替代苏氨酸，或用结构相关氨基酸替代氨基酸的类似替代，将不会对所得分子的结合或性质有重大影响，尤其是如果替换不涉及框架位点内的氨基酸时。氨基酸改变是否导致功能性肽可以通过测定多肽衍生物的比活性容易地确定。测定在本文中详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物的合适的氨基和羧基末端出现在功能域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构域和功能域。在一些实施方案中，计算机化的比较方法用于鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等，Science 253：164(1991)。因此，前述实例证明，本领域技术人员可以识别可用于定义根据本发明的结构和功能域的序列基序和结构构象。
如下的氨基酸取代是合适的：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变对形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，(4)赋予或修饰其他此类类似物的物理化学或功能特性。类似物可以包括不同于天然存在的肽序列的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然存在的序列中(例如，在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)进行单个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应实质上改变亲本序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应倾向于破坏亲本序列中出现的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。在Proteins，Structures and MolecularPrinciples(Creighton编著，W.H.Freeman and Company，New York(1984))、Introductionto Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编著，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))以及Thornton等，Nature 354：105(1991)中描述了本领域公认的多肽二级和三级结构的实例。
本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列与衍生其的天然序列(例如从全长cDNA序列)在相应位置是相同的。片段通常至少5、6、8或10个氨基酸长，例如至少14个氨基酸长、至少20个氨基酸长、至少50个氨基酸长或至少70个氨基酸长。如本文所用，术语“类似物”是指由至少25个氨基酸的片段组成的多肽，所述片段与衍生其的氨基酸序列的一部分具有实质同一性并且在合适的结合条件下与CD47具有特异性结合。通常，多肽类似物相对于天然序列包含保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常长至少20个氨基酸，例如长至少50个氨基酸或更长，并且经常可以与全长天然存在的多肽一样长。
肽类似物在制药工业中通常用作非肽药物，其性质类似于模板肽的性质。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物”或“拟肽模拟物”(peptide mimetics或peptidomimetics)。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)，Veber和Freidinger TINSp.392(1985)；以及Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)。这类化合物通常借助计算机分子模型来开发。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可以用于产生等效的治疗或预防作用。通常，肽模拟物在结构上类似于范例多肽(即具有生化特性或药理活性的多肽)，例如人抗体，但具有一个或多个肽键通过本领域众所周知的方法可选地被选自以下的键取代：--CH2NH--、--CH2S-、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、CH(OH)CH2--和--CH2SO--。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸取代L-赖氨酸)的系统取代可用于产生更稳定的肽。另外，可以通过本领域已知的方法产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的受约束的肽(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61：387(1992))，例如，通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。
术语“试剂”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子和/或由生物材料制成的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“被标记的”是指掺入可检测的标记，例如通过掺入放射性标记的氨基酸或附着于生物素部分的多肽，其可以被标记的亲和素(例如含有荧光标记或酶活性的链霉亲和素，所述荧光标记或酶活性可以通过光学或量热法检测)。在某些情况下，标记或标签也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。多肽标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如FITC、若丹明、镧系磷光体)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基、被次级报告分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂附着以减少潜在的空间位阻。如本文所用，术语“药剂或药物”是指当适当地施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。
本文所用的术语“抗肿瘤药”是指具有抑制人的肿瘤，特别是恶性(癌)病变例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的发展或进程的功能特性的药剂。转移抑制通常是抗肿瘤药的一种特性。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗的”、“治疗方案”等是指减轻和/或改善与其相关的病症和/或症状。“减轻”和/或“减轻的”是指减少、抑制、减弱、减少、阻止和/或稳定疾病例如癌症的发展或进程。应当理解，尽管没有排除，但是治疗疾病或病症并不需要完全消除与其相关的疾病、病症或症状。
本文中的其他化学术语是根据本领域的常规用法使用的，例如由The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker，S.编著，McGraw-Hill，San Francisco(1985))举例说明。
如本文所用，“基本上纯的”是指目标物种是存在的主要物种(即，以摩尔为基础，它比组合物中的任何其他单个物种更丰富)，并且在一些实施方案中，基本上纯化的级分是在组合物中目标物质占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。
通常，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物质的约80％以上，例如，约85％、90％、95％和99％以上。在一些实施方案中，将目标物质纯化至基本均质(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物)，其中组合物基本上由单个大分子物质组成。
在本公开中，“包含”、“包括”、“包含有”、“具有”等可以具有美国和/或欧洲专利法赋予它们的含义，并且可以表示“包括”、“包含”和“包含有”等类似含义；术语“基本上由...组成”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且这些术语是开放式的，允许存在比所列举的内容更多的内容，只要该内容没有因为超出所列举的内容的存在而导致基本或新颖的特征发生改变即可，但排除了现有技术的实施例。
“有效量”是指相对于未经治疗的患者而改善疾病症状所需的量。用于实施本发明以治疗疾病的活性化合物的有效量取决于给药方式、年龄、体重和受试者的总体健康状况。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。该量被称为“有效量”。
“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、啮齿动物、绵羊、灵长类、骆驼科动物或猫科动物。
如本文所用，术语“施用”是指将治疗剂转移、递送、引入或运输到需要用这种剂治疗的受试者的任何模式。这样的模式包括但不限于口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮内、鼻内和皮下施用。
附图说明
以下是对附图的简要概述。
图1：帕尼单抗抗EGFR结合剂(黑色)和人源化SP34抗CD3结合剂(灰色)，组装成各种不同的BEAT结构。
图2：表达膜结合EGFR的BAF细胞上3A6和10E6杂交瘤候选物的流式细胞仪分析。该图显示了亲本3A6和10E6杂交瘤上清液对BAF细胞上表达的膜结合EGFR的FACS谱。从两个杂交瘤克隆中收获的100μl与以106细胞/ml稀释的100ul的EGFR转染的BAF细胞一起温育。作为阴性对照，使用以10μg/ml稀释的纯化的小鼠IgG同种型。用山羊抗小鼠IgG-PE检测抗体结合。
图3：3A6A12B5和10E6F5与EGFR受体的胞外域IV特异性结合。该图显示了ELISA结果，其中针对固定化的重组可溶性EGFR(A)或EGFR-Her3嵌合分子(B和C)或单个检测了几种浓度(10至0.01μg/ml)的纯化3A6A12F5和10E6F5杂交瘤细胞亚克隆EGFR的IV域(D)。
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也在分析中进行了测试。
图4：CD3-EGFR_5和CD3-EGFR_8显示出对EGFR+A549靶细胞的杀伤活性。在48小时内，以10∶1的E∶T比率，使用来自3位健康供体的PBMC作为效应细胞(E)，对EGFR+A549细胞(靶细胞，T)进行CD3重定向的杀伤测定。直方图显示了从3个个体供体中计算出的特异性杀伤的平均百分比。在测定中以10nM使用了两个BEAT分子。
图5：(A)嵌合3A6抗体的KD测量。(B)嵌合10E6抗体的KD测量。
图6：(A)10E6最适抗体的KD测量。(B)10E6稳定抗体的KD测量。
图7：(A)与3A6嵌合抗体结合测试的传感图，(B)与10E6嵌合抗体结合测试的传感图。(C)使用多克隆山羊抗EGFR抗体的对照实验的传感图。
图8：(A)10E6最适抗体的热分析图。第一个峰对应于IgG1 CH2-CH3域，显示Tm为71.7℃，第二个峰对应于Fab。(B)10E6稳定抗体的热分析图。第一个峰对应于IgG1 CH2-CH3结构域，显示Tm为71.8℃，第二个峰对应于Fab。
图9：CD3xEGFR_1在A549肿瘤中没有效力。
图10：CD3xEGFR-SF1和CD3xEGFR-SF3在A549肿瘤中具有相同的功效。
图11：CD3xEGFR-SF3在SNU-216肿瘤中显示出比维克替比(Vectibix)更好的效力。
图12：地塞米松对异种移植模型中CD3xEGFR-SF3抗肿瘤活性的影响。(A)该图显示了平均肿瘤大小(mm3)±SEM。(B)该图显示了在第37天每只小鼠的肿瘤生长。
图13：EGFR(A)和CD3(B)的简单结合ELISA格式示意图。
图14：双重结合ELISA格式示意图。
图15：通过简单的EGFR结合ELISA检测小鼠血清中的CD3xEGFR-SF3。
图16：通过简单的CD3结合ELISA检测小鼠血清中的CD3xEGFR-SF3。
图17：通过双重CD3和EGFR结合ELISA检测小鼠血清中的CD3xEGFR-SF3。
图18：CD3xEGFR-SF3在Sprague-Dawley大鼠血清中的药代动力学特征。在以1mg/kg体重单次静脉内注射后，在雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝4)中评估了CD3xEGFR-SF3的药代动力学。在给药后42天的预定时间0.25、1、6、24、48、96、168、336、530、672、840和1008小时的预定时间点收集用于药代动力学(PK)评估的血样(六个星期)。使用合适的ELISA方法对这些血清样品中的CD3xEGFR-SF3浓度进行定量。代表测试的四只动物的数据(N＝1)。
图19：通过ELISA检测CD3xEGFR-SF3结合。将CD3xEGFR-SF3和对照抗体的剂量反应在包被的人CD3-Fc(huCD3-Fc，A)、人EGFR域I-IV组氨酸标签(huEGFR-His；B)或huEGFR-His(C)上孵育，然后用抗人IgG Fab与HRP(A和B)或huCD3-生物素偶联，然后与HRP偶联的抗生蛋白链菌素(C)一起检测。该图显示了每种处理的S形剂量反应结合曲线(在450nM处的吸光度)。每个数据点是来自三个独立重复的重复值的平均值±SEM。
图20：通过流式细胞术检测CD3xEGFR-SF3结合。将CD3xEGFR-SF3和对照抗体的剂量反应在PBMCS(A-C)或鳞状癌细胞系NCI-H1703(D)上孵育，并用PE标记的抗人IgG(Fc-γ)检测。对于PBMC，还用抗CD4或抗CD8抗体标记细胞。这些图显示了每种处理的平均荧光强度(MFI)的非线性S形回归结合曲线。每个数据点是来自三个独立重复的重复值的平均值±SEM。
图21：CD3xEGFR-SF3诱导表达EGFR的人类癌细胞系的定向裂解。在存在CD3xEGFR-SF3或对照抗体的剂量反应的情况下，以1∶10的E∶T比孵育目标癌细胞(T)和效应细胞(E；PBMC)，并确定癌细胞的重定向裂解通过细胞毒性试验(MTS)。从特异性杀伤的S形剂量反应曲线中提取EC50值。误差棒代表平均值±SEM。重定向裂解的细胞系在统计学上不同(单向方差分析；F＝5，6；p＜0.0001)。
图22：CD3xEGFR-SF3具有低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性潜力。CD3xEGFR的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在EGFR+癌细胞系A-431和A549(A)以及CD3+HPB-ALL细胞(B)中进行了评估，并用从特定杀伤的S形剂量反应曲线。误差棒表示来自两个独立实验的平均值±SEM。对于EGFR+癌细胞(最小二乘模型，F＝29，p＜0.0001)和CD3+HPB-ALL细胞(T检验，t＝3，p＜0.05)，治疗效果具有统计学意义。统计上的显著差异(p＜0.05)用星号(*)表示。
图23：CD3xEGFR-SF3没有补体依赖性细胞毒性。在EGFR+癌细胞A549(A)和CD3+HPB-ALL细胞(B)中评估了特定的补体依赖性细胞毒性(CDC)，并显示了特定CDC的S形剂量反应曲线。
图24：CD3xEGFR-SF3对PBMC增殖的影响。在增加剂量的CD3xEGFR或对照存在下，将PBMC孵育48小时。该图显示了来自六个独立实验的3H-胸苷掺入的结果。AE042、P1069和TRS代表CD3xEGFR-SF3的不同批次，浓度分别为0.0005、0.005、0.05、0.5和5(以ug/ml为单位)。对于不同的处理，“c”代表包衣，“s”代表可溶。误差线代表平均值±SEM。
图25：CD3xEGFR-SF3对PBMC增殖影响的统计分析。通过拟合最小二乘模型分析图24中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0，05)，以比较无mAb对照(A)和同型对照(B)的均值。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图26：响应CD3xEGFR-SF3的非特异性CD4+ T细胞活化。在增加剂量的CD3xEGFR或对照存在下，将PBMC孵育24h或48h。通过流式细胞术测量CD4+ T细胞的活化，作为活化标记CD69的表达。AE042、P1069和TRS代表CD3xEGFR-SF3的不同批次，浓度分别为0.0005、0.005、0.05、0.5和5ug/ml。对于不同的处理，“c”代表包衣，“s”代表可溶。误差棒代表来自六个独立实验的平均值±SEM。
图27：CD3xEGFR-SF3与无mAb条件之间非特异性CD4+ T细胞活化的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图26中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以将平均值与24小时(A)和48小时(B)的无mAb对照进行比较。均值的显著差异显示为超出决策限制的针杆(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图28：CD3xEGFR-SF3与同型对照之间非特异性CD4+ T细胞活化的统计比较。用拟合最小二乘模型分析图26中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较24h(A)和48h(B)的均值与同型对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图29：响应CD3xEGFR-SF3的非特异性CD8+ T细胞活化。在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照存在下，将PBMC孵育24h或48h。通过流式细胞术测量CD8+ T细胞的活化，作为活化标记CD69的表达。AE042、P1069和TRS代表CD3xEGFR-SF3的不同批次，浓度分别为0.0005、0.005、0.05、0.5和5ug/ml。对于不同的处理，“c”代表包衣，“s”代表可溶。误差棒代表来自六个独立实验的平均值±SEM。
图30：CD3xEGFR-SF3与无mAb条件之间非特异性CD8+ T细胞活化的统计比较。用最小二乘拟合模型分析图29中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0.05)，以比较24h(A)和48h(B)的均值与无mAb对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图31：CD3xEGFR-SF3与同型对照之间非特异性CD8+ T细胞活化的统计比较。用最小二乘拟合模型分析图29中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较24h(A)和48h(B)的均值与同型对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图32：24h对CD3xEGFR-SF3的非特异性T细胞细胞因子应答。在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照存在下，将PBMC孵育24小时，并通过Luminex在上清液中测量释放的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平。AE042和P1069代表不同批次的CD3xEGFR-SF3，浓度分别为0.0005、0.005、0.05、0.5和5ug/ml。对于不同的处理，“c”代表包衣，“s”代表可溶。误差棒代表来自六个独立实验的平均值±SEM。
图33：在24h，CD3xEGFR-SF3与无mAb条件之间的非特异性T细胞细胞因子应答的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图32中的数据，然后进行Dunnett比较(a＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-α(D)的无mAb对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图34：在24h，CD3xEGFR-SF3与同种型对照之间的非特异性T细胞细胞因子应答的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图32中的数据，然后进行Dunnett比较(a＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-α(D)的同型对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图35：在48h对CD3xEGFR-SF3的非特异性T细胞细胞因子应答。在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照存在下，将PBMC孵育48小时，并通过Luminex在上清液中测量释放的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平。AE042、P1069和TRS代表不同批次的CD3xEGFR-SF3，其浓度分别为0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5和10ug/ml。对于不同的处理，“c”代表包衣，“s”代表可溶。误差棒代表来自六个独立实验的平均值±SEM。
图36：在第48h，CD3xEGFR-SF3与无mAb条件之间的非特异性T细胞细胞因子反应的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图35中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-α(D)的无mAb对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图37：在48h，CD3xEGFR-SF3与同种型对照之间的非特异性T细胞细胞因子应答的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图35的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-α(D)的同型对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图38：在高密度PBMC分析中，CD3xEGFR-SF3不会诱导非特异性T细胞细胞因子应答。将PBMC以高密度(107细胞/m1)温育48小时。然后将细胞以正常密度(106细胞/ml)铺板，并在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照以及IL-2、IL-6、TNF-α水平的存在下培养24小时。并且，通过Luminex测量上清液中释放的IFN-γ。AE042和TRS代表CD3xEGFR-SF3的不同批次，其浓度分别0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10ug/ml。误差棒代表来自四个独立实验的平均值±SEM。
图39：在高密度PBMC分析中CD3xEGFR-SF3与无mAb条件之间的非特异性T细胞细胞因子应答的统计比较。用拟合最小二乘模型分析图38中的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-a(D)的无mAb对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图40：在高密度PBMC分析中，CD3xEGFR-SF3与同型对照之间的非特异性T细胞细胞因子应答的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图38的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-α(D)的同型对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图41：CD3xEGFR-SF3在全血测定中不会诱导细胞因子反应。在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照存在下，将健康志愿者的全血培养24小时，并通过Luminex在血清中测量IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平。AE042和TRS代表CD3xEGFR-SF3的不同批次，浓度分别为0.001、0.01、0.1和1ug/ml。误差棒代表来自四个独立实验的平均值±SEM。
图42：在全血测定中CD3xEGFR-SF3与无mAb条件之间的细胞因子反应的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图41中的数据，然后进行Dunnett比较(a＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)、IL-6(B)、IFN-γ(C)和TNF-α(D)的无mAb对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图43：在全血测定中CD3xEGFR-SF3与同种型对照之间的细胞因子应答的统计比较。通过拟合最小二乘模型分析图41的数据，然后进行Dunnett比较(α＝0,05)，以比较均值与IL-2(A)，IL-6(B)，IFN-γ(C)和TNF-α(D)的同型对照。均值的显著差异显示为超出决策限制的针线(每种处理的95％CI区间；灰色区域)。
图44：CD3xEGFR-SF3治疗性治疗在NOD SCID异种移植小鼠模型中的功效。图前通过sABC测定EGFR在A549细胞上的表达水平。皮下注射肿瘤细胞(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以2∶1的E∶T比例注入NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每PBMC供体每组n＝4至5)。静脉内施用CD3xEGFR-SF3。从第2天开始，每周一次2mg/kg，共3周。肿瘤生长通过外部卡尺测量来确定。这些图显示了平均肿瘤大小(mm3)±SEM。包括2个PBMC捐助者。研究名称：A549_15。
图45：第41天，治疗组和对照组CD3xEGFR-SF3的A549肿瘤体积比较。数据显示每组在第41天每只动物的肿瘤体积。从图44中提取数据。研究名称：A549J_5。
具体实施方式
下面提供了一组与本发明有关的非详尽示例。
实施例1：以不同形式改造CD3xEGFR双特异性抗体。
Hombach等(2007)证明了目标表位在目标分子中的位置对T细胞活化的功效有重大影响，并且缩短T细胞与目标细胞膜之间的距离可以增加双特异性抗体的细胞毒性潜力。我们的假设是，重新排列CD3xEGFR BEAT双特异性抗体中的结合结构域可以改变重定向的T细胞与表达EGFR的癌细胞之间的距离，从而调节我们的分子的细胞毒性潜力。
如下所述，将帕尼单抗抗EGFR结合剂和人源化SP34抗CD3结合剂工程化为多种不同的BEAT形式。
构建替代的BEAT架构
通过改变帕尼单抗抗EGFR结合物和人源化SP34抗CD3结合物的位置来设计替代的BEAT结构(图1)。根据架构的不同，将结合物格式化为单链片段(scFv)或Fab。scFv格式的结合物通过Gly4Ser或G1y4Thr接头(SEQ ID NO：13和14)融合以赋予柔韧性。当Fab与scFv融合时，在两者之间添加了Gly4Ser接头。部分或全部编码不同多肽链的编码DNA(cDNA)为由GENEART AG(Regensburg，德国)合成的第一基因，并使用标准分子生物学技术进行修饰。用适当的DNA限制酶消化PCR产物，纯化并连接到修饰的pcDNA3.1质粒(InvitrogenAG，Zug，瑞士)中，该质粒带有CMV启动子和预先用相同的DNA限制酶消化的牛激素聚腺苷酸化(poly(A))。所有多肽链独立地连接到该表达载体中，其中鼠VJ2C前导肽驱动分泌。多肽链A(见图1)除了可变域外，通常还包含lgG1铰链，其后是具有L234A和L235A取代(EU编号)的lgG3CH2域，以及包含BEAT(A)取代的lgG3 CH3域。为了防止由于人源化SP34抗CD3结合物的VH3型框架而引起的蛋白A结合，当将SP34置于链A上时，添加了蛋白A结合废除突变N82aS和/或G65S。多肽链B通常包含lgG1铰链，随后是一个具有L234A和L235A取代的IgG1 CH2域，以及一个包含BEAT(B)取代的IgG1 CH3域。当结合剂以Fab形式存在时，IgG1 CH1结构域也是多肽链的一部分。构建了以下分子：CD3xEGFR_1(SEQ ID NO：1、2和3)，CD3xEGFR_SF1(SEQ IDNO：4、5和6)，CD3xEGFR_SF3(SEQ ID NO：7、2和8)，CD3xEGFR_SF4(SEQ ID NO：4、5和9)，CD3xEGFR_SD1(SEQ ID NO：1、2和10)，CD3xEGFR_SD2(SEQ ID NO：11、10和2)和CD3xEGFR_9(SEQ ID NO：1、2和12)。
在替代的BEAT结构中产生CD3Xegfr
对于瞬时表达，将等量的每种工程链载体共转染到适应悬浮液的HEK293-EBNA细胞中(ATCC-LGL标准，Teddington，英国；Cat.No.：CRL-10852)，使用聚乙烯亚胺(PEI；Sigma，Buchs，瑞士)。通常，用DNA-PEI混合物转染100ml悬浮于细胞中的细胞，其密度为每ml0.8-1.2百万细胞。将编码各条链的重组表达载体导入宿主细胞后，可通过进一步培养细胞4至5天以分泌到培养基(EX-CELL 293，HEK293-无血清培养基(Sigma))中来产生免疫球蛋白构建体，补充有0.1％的普鲁糖酸和4mM的谷氨酰胺。通过离心然后无菌过滤来制备含有分泌蛋白的无细胞培养上清液。然后使用蛋白A亲和树脂(Repligen)从无细胞上清液中纯化BEAT。将澄清的上清液用0.2M的NaH2PO4调节至pH 6.0，并通过重力流将其上样至蛋白A。用20CV的0.2M柠檬酸磷酸盐缓冲液pH 6.0洗涤柱。用16CV的20mM乙酸钠在pH 4.1洗脱蛋白质，并用0.1体积的1M Tris pH 8.0(Sigma)中和。使用Illustra NAP-10色谱柱(GEHealthcare)将样品缓冲液交换到PBS pH 7.4中。例外地，将无CD3xEGFR_SF3细胞的上清液加到1ml在0.2M柠檬酸磷酸盐缓冲液pH 6.0中预先平衡的HiTrapTMMabSelectSuReTMprotein A色谱柱上，并在
Figure BDA0002245924160000181
色谱系统上操作(均来自GEHealthcare Europe GmbH；柱CatNo：11-0034-93)的流速为1ml/min。运行缓冲液是0.2M柠檬酸磷酸盐缓冲液pH 6.0。洗涤缓冲液是0.2M pH 5.0的柠檬酸磷酸盐缓冲液。使用20mM乙酸钠缓冲液pH 4.1进行洗脱。洗脱后，在280nm下读取OD；合并含有CD3xEGFR抗体的部分，并用0.1％体积的1M Tris pH 8.0中和。使用Illustra NAP-10色谱柱(GE HealthcareEurope GmbH，Glattbrugg，瑞士)将样品缓冲液交换成PBS pH 7.4。
实施例2：对EGFR的结构域IV具有特异性的抗EGFR抗体的产生和表征。
免疫接种
使用7周大的雌性BALB/c小鼠(Harlan)生成针对EGFR细胞外结构域4的抗体。通过腹膜内(i.p)和皮下(s.c.)途径用50g人EGFR His标记蛋白(SEQ ID NO：15)或50g细胞外域IV EGFR His标记蛋白的混合物免疫小鼠三遍(SEQ ID NO：16)与100μl佐剂组合。通过直接ELISA，使用包被有重组人EGFR His或IV结构域His蛋白的板，通过直接ELISA来评估免疫的小鼠血清中对IV结构域具有特异性的循环抗EGFR抗体的存在。将小鼠血清连续稀释(从1∶100至1∶109)，并添加至96孔ELISA板，并使用山羊抗小鼠分子-HRP(JacksonImmunoresearch)检测结合的抗体。在处死前三天，在表现出最佳抗EGFR域IV IgG血清滴度的动物中，用10g不含佐剂的抗原进行了最终静脉内加强免疫。对动物实施安乐死并收获脾脏进行融合。
融合方案
在旋转的同时，在1分钟内将1ml温的PEG1500缓慢添加到细胞浆中。将细胞再轻轻混合2分钟。然后在4分钟内添加4ml温的SFM。缓慢加入10ml温的SFM，并将细胞在37℃水浴中温育5分钟。将细胞以1000rpm离心5分钟，然后重悬于200ml完全培养基中。为了融合，将细胞以200μl/孔铺板在十个96平底孔板中。
流式细胞仪筛选膜结合EGFR杂交瘤上清液
通过ELISA分析了来自两个融合体的大约1900个孔以获得它们在重组人EGFR特异的鼠IgG中的含量。进一步针对固定在96孔ELISA板上的人EGFR重组域IV筛选阳性杂交瘤上清液。在所有测试的克隆中，鉴定了两个亲本候选物3A6和10E6，并通过流式细胞仪对转染了膜结合EGFR的BAF细胞进行了测试。在该测定中，将105细胞/孔与100ul上清液在4℃下孵育1小时。初次温育后，将细胞以1300rpm离心2分钟，然后将沉淀以100ul在FACS缓冲液中以1/100稀释的PE标记的山羊抗小鼠二抗重悬。然后将细胞在4℃温育30分钟并洗涤两次，除去上清液，并将细胞重悬于150μl的FACS缓冲液中。通过流式细胞仪分析样品。如图2所示，流式细胞术实验的结果表明，与10ug/ml的同种型对照相比，3A6和10E6杂交瘤候选物都能识别BAF细胞上表达的膜结合人EGFR受体。将这两种杂交瘤候选物扩增并亚克隆。
ELISA法筛选可溶性EGFR杂交瘤上清液
亚克隆3A6A12B5和10E6F5分别来自3A6和10E6亲本克隆。根据制造商的说明，使用LC-kappa小鼠亲和基质(Life Technologies)收获并纯化来自两个亚克隆的上清液。这些纯化的抗体通过ELISA在涂有可溶性人EGFR或重组EGFR-Her3嵌合构建体的96孔板上进行测试。将这些分子在PBS中以2ug/ml的浓度稀释，并在高结合力的96孔板上于4℃固定过夜。用PBS 2％牛血清白蛋白(BSA)封闭板，并用3A6A12B5或10E6F5的系列稀释液孵育1小时。作为对照，使用相同浓度的帕尼单抗
Figure BDA0002245924160000201
然后将板用0.01％吐温的PBS洗涤，并与100ul的山羊抗小鼠IgG(以检测3A6A12B5和10E6F5)(Jackson ImmunoResearch EuropeLtd，Newmarket，英国)或山羊抗人IgG，F(ab′)2片段特异性HRP(用于检测Panitumumab)孵育1小时。孵育后，将板洗涤并与100ulTMB底物一起孵育。通过添加100μl的H2SO42N来终止反应，并在Synergy HT2分光光度计(Biotek，美国；分销商：WITTECAG，Littau，瑞士)上在450nm读取吸光度。图3的结果表明，纯化的3A6A12B5和10E6F5抗体以剂量依赖性方式识别可溶性EGFR分子(A)，并且还结合嵌合的Her31-EGFR-IV(C)和EGFRIV(D)分子。相反，这两个候选物均未识别嵌合的EGFRI-IIIHer3 IV分子(B)。这些结果表明3A6A12B5和10E6F5抗体都结合EGFR，并且特异性结合域IV。
重定向裂解测定(RDL)
按照实施例中描述的程序进行该测定。图4显示，BEAT CD3-EGFR_5和CD3-EGFR_8分子均显示出对EGFR+A549靶细胞的杀伤潜力。
实施例3：抗EGFR域IV抗体3A6和10E6的人源化
3.1人类EGFR和嵌合人类EGFR-ErbB3蛋白用于小鼠免疫接种和抗体表征
编码具有C末端多组氨酸标签的人EGFR可溶性细胞外区域(UniProt登录号：P00533残基25-638，在本文中称为hEGFR，SEQ ID NO：15)的多肽链的编码DNA(cDNA)，通过GENEARTAG(雷根斯堡，德国)，并使用标准分子生物学技术进行了改良。用适当的DNA限制酶消化PCR产物，纯化并连接到修饰的pcDNA3.1质粒中，该质粒带有CMV启动子和预先用相同的DNA限制酶消化的牛激素多腺苷酸化(poly(A))信号。
从上述hEGFR构建体中扩增了以下仅EGFR域IV的构建体，并将限制性酶切连接到上述表达质粒中：hEGFR-IV_505-638(505-638表示残基范围，该构建体还携带突变W516A以增加溶解度，通过使用包括适当突变的引物的标准重叠PCR(hEGFR-IV_556-638和hEGFR-IV_580-638)(SEQ ID NO：16、17和18)添加突变。食蟹猴EGFR-IV_556-638和580-638(在本文中称为cEGFR-IV_556-638和580-638)是通过向人类添加突变A566V(仅针对包含残基556-638的构建体)，P637A和T638R产生的通过重叠PCR构建(SEQ ID NO：19和20)构建体。
设计以下嵌合的人EGFR-ErbB3构建体(人ErbB3，UniProt登录号：P21860)，并通过Eurofins基因组学合成编码其多肽链的cDNA：hEGFR-I-II-III_hErbB3-IV和hErbB3-I-II-III_hEGFR-IV(SEQ ID NO：21和22)。
为了瞬时表达上述EGFR构建体，使用聚乙烯亚胺(PEI)将合适的表达载体转染入悬浮液适应的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)。通常，用含有100μg表达载体的DNA-PEI混合物转染100ml悬浮于细胞中的细胞，其密度为每ml 0.8-1.2百万细胞。将重组表达载体导入宿主细胞后，通过进一步培养细胞4至5天以分泌到培养基中(EX-CELL 293，HEK293-无血清培养基；Sigma，Buchs，瑞士)，补充有0.1％的草酸，4mM谷氨酰胺。然后，使用Ni琼脂糖Excel(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)从无细胞上清液中纯化EGFR，并用于进一步分析。
3.2嵌合3A6和10E6
使用标准分子生物学技术，将从杂交瘤细胞的抗体中提取的VH和VL序列重新格式化为小鼠-人嵌合IgG1抗体。小鼠3A6和10E6VH结构域与人IgG1Fc(CH1-铰链-CH2-CH3)融合，并且相应的VL结构域与IgG1恒定κ融合。将得到的构建体连接到上述修饰的pcDNA3.1质粒中(3A6嵌合抗体SEQ ID NO：23和24，10E6嵌合抗体SEQ ID NO：25和26)。
为了瞬时表达嵌合抗体，使用PEI以1∶1的摩尔比将重链和轻链的重组载体转染到悬浮液适应的HEK-EBNA细胞中。然后使用蛋白A亲和树脂(Repligen，Waltham MA，美国)从无细胞上清液中纯化抗体。通过重力流将澄清的上清液加载到蛋白A上。用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱蛋白质。使用Illustra NAP-10柱(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)将样品缓冲液交换进入PBS pH 7.4。
3.3小鼠单克隆3A6的人源化
本文描述了抗人EGFR小鼠抗体3A6的人源化，包括选择基本上保留人CDR移植受体框架的结合特性的人受体框架。准备了两个移植物，一个使用最适合的框架，另一个使用了稳定的框架。
同源匹配被用来选择人类最适合的受体框架来移植3A6 CDR。数据库例如来自人和小鼠的免疫球蛋白基因座的种系可变基因数据库(IMGT数据库，同上)或VBASE2(RetterI等，(2005)Nucleic Acids Res.33，Database issue D671-D674)或Kabat数据库(JohnsonG等，(2000)Nucleic Acids Res.28：214-218)或出版物(例如Kabat EA等，同上)来鉴定人类亚科。鼠重链和轻链V区所属的区域，并确定最适合用作受体分子的人种系框架。在这些亚家族中用作受体的重链和轻链可变序列(VH和VL)的选择可以基于序列同源性和/或CDR1和CDR2区结构的匹配，以帮助保留六个序列的适当相对表达移植后的CDR。
例如，使用IMGT数据库表明3A6重链可变域框架与人类重链可变域亚家族4的成员之间具有良好的同源性。对于种系序列IGHV4-4*08(SEQ ID NO：27)，观察到CDR和构架序列两者的最高同源性和同一性，其对于直至CDR3的整个序列具有59.4％的序列同一性。
使用相同的方法，3A6轻链可变域序列与人轻链可变域κ亚家族6的成员表现出良好的同源性。对于种系序列IGKV6-21*02(SEQ ID NO：28)，观察到CDR和构架序列的最高同源性和同一性，序列同一性为69.5％。
用作受体的人重链和轻链可变序列(VH和VL)的选择可以基于具有良好生物物理特性的种系(如在Ewert S等，(2003)J.Mol.Biol，325，531-553)和/或在天然抗体库中发现的配对(如在Glanville J等，(1999)Proc Natl Acad Sci U S A，106(48)：20216-21；DeKosky BJ等，(2015)Nat Med，21(1)：86-91中所记载)。本领域已知的用于良好配对和/或稳定性的框架序列是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：29)和IGKV1-39*01(SEQ ID NO：30)框架，它们被用作3A6稳定移植物人源化的受体框架。
制备了两种人γ一同种型的人源化抗体。抗体包括人-小鼠杂合重链可变域和人-小鼠杂合轻链可变域。第一杂合重链可变域基于人重链可变域IGHV4-4*08，其中种系CDRH1和H2分别替换为3A6 CDRH1和CDRH2。使用同源搜索从IMGT数据库中确定了与人受体框架最匹配的JH片段序列。为了将CDR容纳在人受体框架上，通过将人残基替换为小鼠残基来修饰关键位置。该过程称为回复突变，是单克隆抗体人源化中最不可预测的过程。它需要从小鼠抗体中鉴定和选择需要保留的关键构架残基，以保留亲和力，同时将人源化抗体的潜在免疫原性降至最低。所得的人-小鼠杂交重链可变序列具有人IGHV4-4*08框架区，3A6小鼠CDR，人至小鼠框架的关键反向突变并且与人受体最佳匹配的JH在本文中称为具有SEQ IDNO：31的重链可变域3A6-最适VH。第二杂合重链可变域基于人重链可变域IGHV3-23*04，其中种系CDRH1和H2分别替换为3A6 CDRH1和CDRH2。使用同源搜索从IMGT数据库中确定了与人受体框架最匹配的JH片段序列。所得的人-小鼠杂交重链可变序列具有人IGHV3-23*04构架区，3A6小鼠CDR，人至小鼠框架的关键反向突变并且与人受体最佳匹配的JH在本文中称为具有SEQ ID NO：32的重链可变域3A6-稳定-VH。
类似地，用于该第一人源化抗体候选物的第一人-鼠杂交轻链可变域具有人IGKV6-21*02框架区，3A6小鼠CDR和与人受体最匹配的JK，在本文中称为轻链可变体。具有SEQ ID NO：33的结构域3A6-最适-VL(在这种情况下，不需要框架中的反向突变，因为在小鼠和人框架中所有关键位置都相同)。涵盖3A6-最适-VH和3A6-最适-VL的第一人源化抗体在本文中缩写为3A6-最适抗体。用于第二种人源化抗体候选物的第二种人-小鼠杂交轻链可变域具有人IGKV1-39*01构架区，3A6小鼠CDR，人与小鼠构架的关键反向突变以及与人受体最佳匹配的JK，并且在本文中称为具有SEQ ID NO：34的轻链可变结构域3A6-稳定-VL。包含3A6-稳定-VH和3A6-稳定-VL的第二种人源化抗体在本文中简称为3A6-稳定-抗体。
3.4小鼠单克隆10E6的人源化
本文描述了抗人EGFR小鼠抗体10E6的人源化，包括选择基本上保留人CDR移植受体框架的结合特性的人受体框架。准备了两个移植物，一个使用最适合的框架，另一个使用最稳定的框架。
如上所述使用同源性匹配来选择人类最适合的受体框架以移植10E6 CDR。IMGT数据库表明10E6重链可变域框架与人类重链可变域亚家族4成员之间具有良好的同源性。对于种系序列IGHV4-30-4*01(SEQ ID NO：35)，其具有相对于直至CDR3的整个序列具有73.2％的序列同一性，观察到CDR和框架序列两者的最高同源性和同一性。
使用相同的方法，10E6轻链可变域序列与人轻链可变域κ亚家族6的成员表现出良好的同源性。对于种系序列IGKV6-21*02(SEQ ID NO：14)，其序列同一性为69.5％，观察到CDR和构架序列的最高同源性和同一性。
如上所述选择稳定的框架。使用人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：29)和IGKV1-39*01(SEQ ID NO：30)作为稳定移植物人源化的受体框架。
制备了两种人γ一同种型的人源化抗体。抗体包括人-小鼠杂合重链可变域和人-小鼠杂合轻链可变域。第一杂合重链可变结构域基于人重链可变结构域IGHV4-30-4*01，其中种系CDRH1和H2分别替换为10E6CDRH1和CDRH2。使用同源搜索从IMGT数据库中确定了与人受体框架最匹配的JH片段序列。所得的人-小鼠杂交重链可变序列具有人IGHV4-30-4*01框架区，10E6小鼠CDR，关键的人至小鼠框架反向突变，以及与人受体最佳匹配的JH在本文中称为具有SEQ ID NO：36的重链可变区10E6-最适-VH。第二杂合重链可变结构域基于人重链可变结构域IGHV3-23*04，其中种系CDRH1和H2分别替换为10E6 CDRH1和CDRH2。使用同源搜索从IMGT数据库中确定了与人受体框架最匹配的JH片段序列。所得的人-小鼠杂交重链可变序列具有人IGHV3-23*04构架区，10E6小鼠CDR，人至小鼠构架的关键反向突变以及与人受体最佳匹配的JH在本文中称为具有SEQ ID NO：37的重链可变域10E6-稳定-VH。
类似地，用于该第一人源化抗体候选物的第一人-鼠杂交轻链可变域具有人IGKV6-21*02框架区，10E6小鼠CDR，人与小鼠框架的关键反向突变以及与人受体最佳匹配的JK，并且在本文中被称为具有SEQ ID NO：38的轻链可变结构域10E6-最适-VL。包含10E6-最适-VH和10E6-最适-VL的第一人源化抗体在本文中缩写为10E6-最适的抗体。用于第二种人源化抗体候选物的第二种人-鼠杂合轻链可变域具有人IGKV1-39*01构架区，10E6小鼠CDR，人与小鼠构架的关键反向突变以及与人受体最佳匹配的JK，并且在本文中称为具有SEQ ID NO：39的轻链可变结构域10E6-稳定-VL。包含10E6-稳定-VH和10E6-稳定-VL的第二人源化抗体在本文中简称为10E6-稳定抗体。
3.5人源化3A6和10E6抗体的产生
通过Eurofins Genomics(Ebersberg，德国)合成了最适VH和VL以及稳定VH和VL的编码DNA序列(cDNA)，并使用标准分子生物学技术对其进行了修饰。将VH结构域融合至人IgG1 CH1-铰链-CH2-CH3部分，并将限制性酶切连接到上述表达载体中。类似地，将VL结构域的基因与人恒定κ结构域融合，并连接到单独的表达载体中。所得抗体为3A6-最适(SEQID NO：40和41)、3A6-稳定(SEQ ID NO：42和43)、10E6最适(SEQ ID NO：44和45)和10E6稳定(SEQ ID NO：46和47)。
为了瞬时表达抗体，使用PEL将重链和轻链的重组载体以1∶1摩尔比转染到悬浮液适应的HEK-EBNA细胞中，然后使用Protein A亲和树脂从无细胞上清液中纯化。通过重力流将澄清的上清液加载到蛋白A上。用0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱蛋白质。使用Illustra NAP-10色谱柱将样品缓冲液交换至PBS pH 7.4。
3.6通过表面等离振子共振(SPR)测定人EGFR的嵌合抗体和人源化抗体的动力学结合亲和常数
测量动力学结合亲和常数(KD)。在室温下在BIAcore T200(GE Healthcare-BIAcore，Uppsala，瑞典)上进行测量，并使用Biacore T200评估软件进行分析。将Series SCM5传感器芯片与Protein G共价偶联，并捕获100RUs感兴趣的抗体。在HBS-EP+缓冲液中以30μl/min的流速将hEGFR注射到浓度为19.53-2500nM的3A6和2.4-312.5nM或1-250nM的10E6基抗体中(流速为5μl/min)(图5和6，表示数据)响应单位数(缩写为RU；Y轴)与时间(X轴)的关系。在每次结合事件之后，用10μl pH 1.5的甘氨酸缓冲液再生表面。解离时间为4分钟。使用具有整体Rmax的1∶1Langmuir模型处理实验数据。
3.7结合SP34产生3A6和10E6双特异性抗体
为了产生结合3A6和10E6结合物与人源化SP34的双特异性BEAT抗体，将上述VH片段与人IgG1 CH1铰链融合，然后与IgG1 CH2和lgG1 CH3融合。包含BEAT(A)替换的域。CH2域包含L234A和L235A替换(EU编号)。将内部scFv格式的人源化SP34，然后是短的五个氨基酸接头(Gly4Thr)与人IgG3CH2融合，然后是包含BEAT(B)取代的IgG3CH3域。CH2结构域同时包含L234A和L235A取代。如上所述将构建体连接到表达载体中。所得分子是CD3xEGFR_5(SEQID NO：48、24和49)，CD3xEGFR_6(SEQ ID NO：50、26和49)，CD3xEGFR_7(SEQ ID NO：48、35和49)和CD3xEGFR_8(SEQ ID NO：52、36和47)。
为了瞬时表达BEAT抗体，如上所述，使用PEI以1∶1∶1的摩尔比将重链和轻链以及scFv-Fc链的重组载体转染入悬浮液适应的HEK-EBNA细胞。将无细胞的上清液加载到在0.2M柠檬酸磷酸盐缓冲液pH 6.0中预先平衡的1ml HiTrapTMMabSelect SuReTM蛋白A色谱柱上，并在
Figure BDA0002245924160000261
色谱系统上操作(均购自GE Healthcare Europe GmbH；柱Cat.No：11-0034-93)的流速为1ml/min。运行缓冲液是0.2M柠檬酸磷酸盐缓冲液pH 6.0。洗涤缓冲液是0.2M pH 5.0的柠檬酸磷酸盐缓冲液。使用20mM乙酸钠缓冲液pH 4.1进行洗脱。洗脱后，在280nm下读取OD；合并含有CD3xEGFR抗体的部分，并用0.1％体积的1M Tris pH8.0中和。
3.8食蟹猴的抗原决定簇定位和交叉反应
表面等离子体激元共振用于评估3A6和10E6抗体与各种人和猕猴EGFR结构域IV构建体的结合，目的是缩小EGFR结构域IV中的表位，并证明与猕猴EGFR的交叉反应性。
在Biacore 2000仪器(GE)上进行测量。将CM5传感器芯片与Protein G共价偶联，并捕获100RUs的3A6或10E6嵌合抗体。在HBS-EP缓冲液中以200nM的浓度以30μl/min的流速将各种人类和食蟹猴EGFR构建体作为分析物注入。解离时间为4分钟。在每次结合事件之后，用10μl pH 1.5的甘氨酸缓冲液再生表面。为了验证EGFR结构域IV构建体的完整性，如上所述固定了我们已知包含至少一种抗EGFR结构域IV结合剂(AF231，Bio-Techne AG，Zug，瑞士)的多克隆山羊抗EGFR，并且如上所述注射食蟹猴EGFR构建体。结果如图7所示。3A6和10E6抗体均能够结合人和猕猴EGFR-IV_556-638。EGFR-IV_580-638不受任何一种抗体的结合。因此，我们得出结论，3A6和10E6抗体的结合表位在EGFR结构域IV内，更确切地说在556-638位残基内。此外，残基556-580含有表位的所需部分。此外，我们证明3A6和10E6抗体均与食蟹猴EGFR发生交叉反应。
3.9 10E6-最适和10E6-稳定抗体的热稳定性
通过差示扫描量热法(DSC)研究了10E6-最适和10E6-稳定抗体在PBS缓冲液中的热稳定性。在VP-DSC毛细管差示扫描量热仪(Malvern Instruments Ltd，Malvern，英国)上进行量热法测量。池体积为0.128ml，加热速率为1℃/min，过压保持在64p.s.i。所有样品在PBS(pH 7.4)中的浓度为1mg/ml。通过与包含相同缓冲液的重复样品(不含蛋白质)进行比较，估算了每种蛋白质的摩尔热容。使用标准程序分析部分摩尔热容和熔融曲线。使用Origin v7.0软件(由Malvern Instruments Ltd.提供)，使用非二态模型对温谱图进行基线校正，浓度归一化并进一步分析。结果如图8所示。最适-10E6的Fab和10E6-稳定的Fab的熔解温度(Tm)分别确定为82.8℃和84.9℃。
实施例4：CD3-EGFR_1在皮下异种移植的A549肿瘤中的功效
材料与方法
4.1.细胞系培养条件
将细胞在标准培养基中于5％CO2的湿润气氛中于37℃培养。每周将细胞传代2至3次，以使其保持最佳融合状态，并使用MycoAlert检测试剂盒(LT07-318，Lonza)常规检测支原体污染。这些细胞始终检测为支原体无污染。
4.2.效应细胞：人外周血单个核细胞(PBMC)
从La Chaux-de-Fonds输血中心获得的血液过滤器中收集外周血单核细胞(PMBC)。对于血液过滤器处理，将40ml PBS(补充1％的
Figure BDA0002245924160000271
(Drossapharm))注入血液过滤器中，并将包含PBMC的溶液收集在50ml预先装有聚蔗糖(GE Healthcare，17-1440-03)的血液分离管中(Chemie Brunschwig，PAA535710)。将聚蔗糖管在室温下(RT)在800g的离心力下离心20分钟，不带制动器，并收集PBMC“血沉棕黄层”环并将其转移到包含30ml PBS的50ml的falcon管中。在处理之前，将PBMC在PBS中洗涤3次。
4.3.动物饲养
在雌性7周大的免疫缺陷NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠中进行了体内实验，这些小鼠的特征是T细胞、B细胞和自然杀伤细胞缺陷(Harlan，Guana，法国)。将小鼠保持在啮齿动物微隔离笼中的标准环境条件下(室温20±1℃，相对湿度50±10％，黑暗周期12小时)。小鼠接受辐照的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法进行，并获得州和联邦兽医部门的事先授权。根据动物保护法，当皮下(s.c.)异种移植物诱导的肿瘤达到2000mm3时使小鼠安乐死。
4.4.异种移植实验
皮下注射肿瘤细胞(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以2∶1的E∶T比例注入NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每组PBMC供体每组n＝5)。
方案是预防性的，在细胞植入后3小时静脉内(i.v.)进行治疗。
静脉内施用CD3xEGFR_1。每周一次，持续3周。
通过卡尺测量进行肿瘤大小定量。使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度×宽度2
总结与结果
参考图9，通过sABC确定EGFR在A549细胞上的表达水平。皮下注射A549肿瘤细胞和从健康人类供体获得的PBMC进入雌性NOD/SCID小鼠的右侧腹。每个PBMC供体总共移植了5只小鼠。静脉内施用CD3xEGFR_1。从第0天开始，每周一次，持续3周。如第4.4节所述，通过外部卡尺测量确定肿瘤的生长。对照小鼠用PBS治疗。进行统计分析：单向方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnett事后分析以进行多重比较。对于每种情况(对照或CD3xEGFR_1)，包括2个PBMC供体(每种情况n＝10只动物)。
总而言之，CD3xEGFR_1对A549肿瘤无疗效。
实施例5CD3-EGFR-SF1和CD3-EGFR-SF3在皮下异种移植A549肿瘤中的疗效比较
材料与方法
5.1.细胞系培养条件
将细胞在标准培养基中于5％CO2的湿润气氛中于37℃培养。每周将细胞传代2至3次，以使其保持最佳融合状态，并使用MycoAlert检测试剂盒(LT07-318，Lonza)常规检测支原体污染。这些细胞始终检测为支原体无污染。
5.2.效应细胞：人外周血单个核细胞(PBMC)
从得自La Chaux-de-Fonds输血中心的血液过滤器中收集外周血单核细胞(PMBC)。对于血液过滤器处理，将40mlPBS(补充1％的
Figure BDA0002245924160000281
(Drossapharm))注入血液过滤器中，并将包含PBMC的溶液收集在50ml预先装有聚蔗糖(GE Healthcare，17-1440-03)的血液分离管中(Chemie Brunschwig，PAA535710)。将聚蔗糖管在室温下(RT)在800g的离心力下离心20分钟，不带制动器，并收集PBMC“血沉棕黄层”环并将其转移到包含30ml PBS的50ml的falcon管中。在处理之前，将PBMC在PBS中洗涤3次。
5.3.动物饲养
用7周大的免疫缺陷雌性NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠进行体内实验，其特征在于T细胞、B细胞和自然杀伤细胞缺陷(Harlan，Guana，法国)。将小鼠保持在啮齿动物微隔离笼中的标准环境条件下(室温20±1℃，相对湿度50±10％，黑暗周期12小时)。小鼠接受辐照的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法进行，并获得瑞士州和联邦兽医当局的事先授权。根据动物保护法，当皮下(s.c.)异种移植物诱导的肿瘤达到2000mm3时使小鼠安乐死。
5.4.异种移植实验
皮下注射肿瘤细胞(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以1∶1∶1的E∶T比例注入NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每组PBMC供体每组n＝5)。
方案是预防性的，在细胞植入后3小时静脉(i.v.)给药。
·CD3xEGFR-SF1静脉注射。每周一次，持续3周。
·CD3xEGFR-SF3静脉给药。每周一次，持续3周。
通过卡尺测量进行肿瘤大小定量。使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长×宽2
5.5。统计处理
使用Graphpad Prism 5软件分析数据。数据表示为平均值±SEM。统计分析是通过单向方差分析(ANOVA)进行的，然后是Dunnett的事后分析进行多次比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。
总结与结果
参考图10，CD3xEGFR-SF1和CD3xEGFR-SF3在A549肿瘤中具有相同的功效。通过sABC确定EGFR在A549细胞上的表达水平。皮下注射等量(10×106)的A549肿瘤细胞和从健康人类供体获得的PBMC进入雌性NOD/SCID小鼠的右侧腹。每个PBMC供体总共移植了5只小鼠。静脉内施用CD3xEGFR-SF1和CD3xEGFR-SF3。从第0天开始，每周一次，持续3周。如第5.4节所述，通过外部卡尺测量确定肿瘤的生长。对照小鼠用PBS治疗。进行统计分析：单因素方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnett事后分析以进行多重比较。对于每种条件(对照，CD3xEGFR-SF1或CD3xEGFR-SF3)，包括3个PBMC供体(每个条件n＝15只动物)。
总之，CD3xEGFR-SF1和CD3xEGFR-SF3在异种A549肿瘤中具有相同的功效。
表1图10的统计分析。执行的统计分析：单方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnett事后分析(post hoc)以进行多重比较。
Dunnett多重比较测试 显著性 总结 调整的P值
CD3xEGFR-SF1-0.2mg/kg vs.对照 是 *** ＜0.001
CD3xEGFR-SF1-0.04mg/kg vs.对照 是 *** ＜0.001
CD3xEGFR-SF3-0.2mg/kg vs.对照 是 *** ＜0.001
CD3xEGFR-SF3-0.04mg/kg vs.对照 是 *** ＜0.001
实施例6：CD3xEGFR-SF3显示出比其他EGFR靶向疗法(i)更好的体内抗癌效力。
材料与方法
6.1.细胞系培养条件
将细胞在标准培养基中于5％CO2的湿润气氛中于37℃培养。每周将细胞传代2至3次，以使其保持最佳融合状态，并使用MycoAlert检测试剂盒(LT07-318，Lonza)常规检测支原体污染。这些细胞对支原体污染的检测结果均为阴性。
6.2.效应细胞：人外周血单个核细胞(PBMC)
从得自La Chaux-de-Fonds输血中心的血液过滤器中收集外周血单核细胞(PMBC)。对于血液过滤器处理，将40ml PBS(补充1％的
Figure BDA0002245924160000301
(Drossapharm))注入血液过滤器中，并将包含PBMC的溶液收集在50ml预先装有聚蔗糖(GE Healthcare，17-1440-03)的血液分离管中(Chemie Brunschwig，PAA535710)。将聚蔗糖管在室温下(RT)在800g的离心力下离心20分钟，不带制动器，并收集PBMC“血沉棕黄层”环并将其转移到包含30ml PBS的50ml的falcon管中。在处理之前，将PBMC在PBS中洗涤3次。
6.3.动物饲养
在雌性7周大的免疫缺陷NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠中进行了体内实验，这些小鼠的特征是T细胞、B细胞和自然杀伤细胞缺陷(Harlan，Guana，法国)。将小鼠保持在啮齿动物微隔离笼中的标准环境条件下(室温20±1℃，相对湿度50±10％，黑暗周期12小时)。小鼠接受辐照的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法进行，并得到州和联邦兽医部门的事先授权。根据动物保护法，当皮下(s.c.)异种移植物诱导的肿瘤达到2000mm3时，对小鼠实施安乐死。
6.4.异种移植实验
皮下注射肿瘤细胞(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以1∶1∶1的E∶T比例注入NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每组PBMC供体每组n＝5)。
方案是预防性的，在细胞植入后3小时静脉内(i.v.)进行治疗。
·静脉注射CD3xEGFR-SF3。每周一次，持续3周。
·维克替比静脉注射每周两次，共6周。
通过卡尺测量进行肿瘤大小定量。使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长×宽2
6.5.统计处理
使用Graphpad Prism 5软件分析数据。数据表示为平均值±SEM。统计分析是通过单向方差分析(ANOVA)进行的，然后是Dunnett的事后分析进行多次比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。
总结与结果
参考图11，通过sABC确定EGFR在SNU-216细胞上的表达水平。皮下注射等量(10x106)的SNU-216肿瘤细胞和从健康人类供体获得的PBMC进入雌性NOD/SCID小鼠的右侧腹。每个PBMC供体总共移植了5只小鼠。静脉内施用CD3xEGFR-SF3。从第0天开始，每周一次，持续3周。维克替比静脉注射从第0天开始，每周两次，共6周。如第1.4节所述，通过外部卡尺测量来确定肿瘤的生长。这些图显示了平均肿瘤大小(mm3)±SEM。对照小鼠用PBS治疗。包括1个PBMC供体(每种情况n＝5只动物)。研究名称：SNU_2
总而言之，CD3xEGFR-SF3在SNU-216肿瘤中显示出比维克替比更好的效力。
实施例7CD3XEGFR-SF3相比于其他EGFR靶向疗法表现出更好的体内抗癌能力(ii)。
材料与方法
7.1.细胞系培养条件
在37℃，5％CO2的潮湿气氛下，将细胞在培养基中培养。每周将细胞传代2至3次，以使其保持最佳融合状态，并使用MycoAlert检测试剂盒(LT07-318，Lonza)常规检测支原体污染。这些细胞持续测试阴性支原体无污染。
7.2.效应细胞：人外周血单个核细胞(PBMC)
从得自La Chaux-de-Fonds输血中心的血液过滤器中收集外周血单核细胞(PMBC)。对于血液过滤器处理，将40ml PBS(补充1％的
Figure BDA0002245924160000321
(Drossapharm))注入血液过滤器中，并将包含PBMC的溶液收集在50ml预先装有聚蔗糖(GE Healthcare，17-1440-03)的血液分离管中(Chemie Brunschwig，PAA535710)。将聚蔗糖管在室温下(RT)在800g的离心力下离心20分钟，不带制动器，并收集PBMC“血沉棕黄层”环并将其转移到包含30ml PBS的50ml的falcon管中。在处理之前，将PBMC在PBS中洗涤3次。
7.3.动物饲养
在雌性7周大的免疫缺陷NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠中进行了体内实验，这些小鼠的特征是T细胞，B细胞和自然杀伤细胞缺陷(Harlan，Guana，法国)。将小鼠保持在啮齿动物微隔离笼中的标准环境条件下(室温20±1℃，相对湿度50±10％，黑暗周期12小时)。小鼠接受辐照的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法进行，并获得州和联邦兽医部门的事先授权。根据动物保护法，当皮下(s.c.)异种移植物诱导的肿瘤达到2000mm3时，对小鼠实施安乐死。
7.4.异种移植实验
皮下注射肿瘤细胞(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以1∶1∶1的E∶T比例注入NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每组PBMC供体每组n＝5)。
方案是预防性的，在细胞植入后3小时静脉内(i.v.)进行治疗。
·静脉注射CD3xEGFR-SF3。每周1次，持续3周。
·地塞米松经腹膜内给药。每周3次，共3周。
通过卡尺测量进行肿瘤大小定量。使用以下公式计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度×宽度2
7.5.统计处理
使用Graphpad Prism 5软件分析数据。数据表示为平均值±SEM。统计分析是通过单向方差分析(ANOVA)进行的，然后是Dunnett的事后分析进行多次比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。
总结与结果
参考图12。地塞米松对异种移植模型中CD3xEGFR-SF3抗肿瘤活性的影响。通过sABC确定EGFR在A549细胞上的表达水平。皮下注射等量(10×106)的A549肿瘤细胞和从健康人类供体获得PBMC进入雌性NOD/SCID小鼠的右侧腹。每个PBMC供体总共移植了5只小鼠。静脉内施用CD3xEGFR-SF3。从第0天开始，每周一次，持续3周。地塞米松经腹膜内给药。从第0天开始，每周3次，共3周。如第7.4节所述，通过外部卡尺测量确定肿瘤的生长。对照小鼠用PBS治疗。进行统计分析：单向方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnett事后分析以进行多重比较。对于每种情况(对照，CD3xEGFR-SF3，地塞米松或组合)，包括1个PBMC供体(每种情况n＝5只动物)。(A)该图显示了平均肿瘤大小(mm3)±SEM。(B)该图显示了在第37天每只小鼠的肿瘤生长。研究名称：A549_10。
表2：统计分析图12。执行的统计分析：单向方差分析(ANOVA)，然后进行Dunnett的事后比较。
Figure BDA0002245924160000331
总之，在A549细胞异种移植模型中，地塞米松的施用降低了CD3XEGFR-SF3的抗肿瘤活性。
实施例8：CD3xEGFR-SF3在小鼠血清中的体内稳定性
材料和方法
8.1.细胞系培养条件
在37℃，5％CO2的潮湿气氛下，将细胞在培养基中培养。每周将细胞传代2至3次，以使其保持最佳融合状态，并使用MycoAlert检测试剂盒(LT07-318，Lonza)常规检测支原体污染。这些细胞对支原体污染的检测结果均为阴性。
8.2.效应细胞：人外周血单个核细胞(PBMC)
从得自La Chaux-de-Fonds输血中心的血液过滤器中收获外周血单个核细胞(PMBC)。对于血液过滤器处理，将40ml PBS(补充1％的(Drossapharm))注入血液过滤器中，并将包含PBMC的溶液收集在50ml预先装有聚蔗糖(GE Healthcare，17-1440-03)的血液分离管中(Chemie Brunschwig，PAA535710)。将聚蔗糖管在室温下(RT)在800g的离心力下离心20分钟，不带制动器，并收集PBMC“血沉棕黄层”环并将其转移到包含30ml PBS的50ml的falcon管中。在处理之前，将PBMC在PBS中洗涤3次。
8.3.动物饲养
在7周龄免疫缺陷的雌性NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠中进行了体内实验，这些小鼠的特征是T细胞、B细胞和自然杀伤细胞缺陷(Harlan，Guana，法国)。将小鼠保持在啮齿动物微隔离笼中的标准环境条件下(室温20±1℃，相对湿度50±10％，黑暗周期12小时)。小鼠接受辐照的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法进行，并获得州和联邦兽医部门的事先授权。根据动物保护法，当皮下(s.c.)异种移植物诱导的肿瘤达到2000mm3时，对小鼠实施安乐死。
8.4.异种移植实验
-在名为IVS_3的实验中(简单的ELISA结合-EGFR臂)注入了批次P1027
将未异种移植的肿瘤的15只NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠静脉注射2mg/kg CD3XEGFR-SF3分子。
注射CD3XEGFR-SF3后，血液样本的几个时间点为：t＝0h(注射前一周)、t＝6h、t＝24h、t＝48h、t＝96h、t＝148h。对于每个时间点，将3只小鼠放血。
将血样在14000RPM下离心10分钟，收集小鼠血清并将其冷冻在-20℃下。
-在名为IVS_3之二的实验中(简单ELISA结合-CD3臂和双重ELISA结合-CD3和EGFR臂)注入了批次P1069
IVS_3研究后3周，重复使用了用于IVS_3研究的小鼠。注射前进行CD3xEGFR-SF3检测，以确认动物血液中不再残留CD3xEGFR-SF3。将未异种移植的肿瘤的NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠静脉注射2mg/kg CD3xEGFR-SF3分子。
在注射CD3xEGFR-SF3后执行血液样本的几个时间点：t＝0h(注射前一周)、t＝6h、t＝24h、t＝48h、t＝96h、t＝148h。对于每个时间点，将3只小鼠放血。
将血样在14000RPM下离心10分钟，收集小鼠血清并将其冷冻在-20℃下。
-在名为IVS_4的实验中(简单的ELISA结合-EGFR臂)注入了批次P1027
皮下注射肿瘤细胞HT29(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以2∶1的E∶T比例注入20只NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每组PBMC供体每组n＝10)。
通过卡尺测量进行肿瘤大小定量。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度×宽度2
当肿瘤达到150-200mm3时，经静脉施用CD3xEGFR-SF3，2mg/kg，一次。
在注射CD3xEGFR-SF3后执行血液样本的几个时间点：t＝6h、t＝24h、t＝48h、t＝96h、t＝148h。对于每个时间点，对4只小鼠(对照组2只小鼠，CD3xEGFR-SF3治疗组2只小鼠)采血。
将血样以14000RPM离心10分钟，收集小鼠血清并将其冷冻在-20℃下。
8.5.简单ELISA结合
图13显示了测定形式。
将人EGFR-1-IV-C-His标记或Hs CD3 1-26N端肽-Fc标记的蛋白在1x PBS中稀释至2g/ml，并将100μl加入96孔板的每个孔中并在4℃下孵育过夜。
第二天，除去上清液，并将板用200μl PBS 2％BSA在室温(RT)下充分封闭1小时。除去上清液。将CD3xEGFR-SF3在PBS 2％BSA或具有1/100+1/200+1/400+1/800+1/1600+1/3200的小鼠血清的PBS 2％BSA加标的中稀释至一定浓度范围，并根据板布局将100μl抗体稀释液添加至每个孔。对于样品(小鼠处理的血清-IVS3-IVS4)，以1/100+1/200+1/400+1/800+1/1600+1/3200稀释，并根据平板布局向每个孔中添加100μl血清稀释液并在室温下孵育1小时。用PBS 0.01％吐温洗涤板5次。将100μl山羊抗人Fc HRP(1/1000在PBS 2％BSA中)或100μl山羊抗人Fab HRP(1/1000在PBS 2％BSA中)添加到每个孔中，并将板在室温温育1小时。将板用PBS 0.01％吐温洗涤x5次，并将100μl的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液加入到每个孔中。5分钟后，通过加入100μl H2SO42N/孔来终止反应。在450nm读取吸光度。
然后使用Prism(GraphPad)软件绘制数据并进行分析。要获得STD曲线：使用GraphPad Prism 5，使用X＝Log(X)变换X值，分析非线性回归，公式：S型剂量响应。为获得样品中抗体浓度的微克/毫升浓度：使用X＝Log(X)，从转换X值中使用以下方法，再次使用分析非线性回归方程：S型剂量响应，并使用STD曲线。
8.6.CD3和EGFR双重结合ELISA
已开发出一种双重结合酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，用于定量CD3XEGFR-SF3与其靶标CD3和EGFR的结合，以确认CD3XEGFR-SF3的生物学活性。图14显示了测定形式。
用抗帕尼单抗以2pg/ml的浓度将高结合力的96孔平底平板包被，并将平板在4℃孵育过夜。然后将板在室温下用PBS-2％BSA封闭1小时。将CD3xEGFR-SF3在PBS 2％BSA或具有1/100+1/200+1/400+1/800+1/1600+1/3200的小鼠血清的PBS 2％BSA加标物中稀释至一定浓度范围，然后根据板布局将100μl抗体稀释液添加至每个孔。对于样品(小鼠处理的血清-IVS3-IVS4)，以1/100+1/200+1/400+1/800+1/1600+1/3200稀释，并根据以下方法向每个孔中添加100μl血清稀释度平板布局并在室温下孵育1小时。然后将板用PBS 0.01％Tween洗涤5次。以0.1μg/ml添加100μl生物素化的抗Id SP34，并将板在RT下温育1小时。
加入在PBS-2％BSA中以1/4000稀释的链霉亲和素-HRP溶液，并将板在RT下温育1小时。然后将板用PBS 0.01％吐温洗涤5次。最后，将100μl的SuperSignal West Femto最大灵敏度底物溶液添加到每个孔中。用Synergy HT2-分光光度计测量发光度(增益为100，光学位置为顶部，发射孔，积分时间为1秒，读取高度为1.00mm)。
然后使用Prism(GraphPad)软件绘制数据并进行分析。要获得STD曲线：使用GraphPad Prism 5，使用X＝Log(X)变换X值，分析非线性回归，公式：S型剂量响应。要获得样品中抗体浓度的ug/ml浓度：使用X＝Log(X)从Transform X值中使用以下方法，再次使用非线性回归分析，等式：S型剂量响应，并使用STD曲线。
总结与结果
参考图15、16和17，通过简单和双重结合ELISA进行小鼠血清中CD3XEGFR-SF3的检测，并且在注射后直至一周内检测到CD3xEGFR-SF3。
实施例9CD3XEGFR-SF3在Sprague-Dawley大鼠血清中的药代动力学分布。
在以1mg/kg体重单次静脉内注射后，在雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝4)中评估了CD3xEGFR-SF3的药代动力学。在给药后42天的时间内在0.25、1、6、24、48、96、168、336、530、672、840和1008小时的预定时间点收集用于药代动力学(PK)评估的血样(六个星期)。
使用ELISA方法定量这些血清样品中CD3xEGFR-SF3的浓度。在这种方法中，人α-帕尼妥单抗抗体被用作捕获抗体，而生物素化的抗-id生物素SP34被用作检测抗体。在未稀释的SD大鼠血清中，该测定的LLOQ为6.25ng/ml。使用Phoneix
Figure BDA0002245924160000372
7.0版对血清浓度与时间的关系进行非房室分析(NCA)，以评估PK参数。
静脉推注后，除动物#M2在1小时外，在给药后0.25小时的初始时间点观察到最大浓度(Cmax)。注射后35天，除#M3外，所有动物的血清浓度均高于LLOQ(6.25ng/mL)。在动物#M3中，血清浓度最多只能定量到672小时。在1008小时(第42天)，所有动物的血清浓度均低于LLOQ。
在所有四只大鼠中，静脉药代动力学曲线具有可比性(图18)。血清浓度分布似乎遵循双指数分布，具有初始分布阶段，随后是更长的末端消除阶段。CD3xEGFR-SF3显示清除缓慢，分布体积有限。CD3xEGFR-SF3在Sprague-Dawley大鼠中的末端消除半衰期(t1/2)估计约为4天。
表3CD3XEGFR-SF3在Sprague-Dawley大鼠血清中的平均药代动力学参数。Cmax：给药后药物的峰值血浆浓度。AUC：曲线下的面积，浓度-时间曲线的积分。Tmax：达到Cmax的时间。T1/2：药物浓度达到其原始值一半所需的时间。Vz：静脉内给药后末期的分布体积。Vss：静脉内给药后测定的平衡时的表观分布体积。CL：清除率，单位时间清除的血浆量。MRTINF：平均停留时间无穷大。
Figure BDA0002245924160000371
*：中位数(范围)
实施例10：体外药理学的进一步研究
材料和方法
10.1简单ELISA结合
将高结合力的96孔平底平板(Corning)在4℃下用人EGFR-I-IV-his或人CD31-26N-末端肽(在0.01M PBS中为2ug/ml)包被过夜。在室温(RT)下用PBS+2％BSA封闭板1小时。在PBS+2％BSA中制备CD3xEGFR-SF3的系列稀释液(从10ug/ml开始，稀释度为1/3)和对照抗体(10ug/ml)，并将100ul转移到测定板上并在室温下孵育1小时。然后将板用PBS+0.01％吐温20洗涤5次，并在室温下加入抗人IgG(Fab)HRP(1/2000)1小时。将板用PBS+0.01％吐温20洗涤5次，将100ul TMB底物溶液(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)加入到每个孔中，并通过添加100ul的H2SO4(2N)在1至10分钟之间终止反应。用Synergy HT2-分光光度计在450nm下测量光密度。
10.2CD3和EGFR双重结合ELISA
已开发出一种双重结合酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，用于定量CD3xEGFR-SF3与其靶标CD3和EGFR的结合，以确认CD3xEGFR-SF3的生物学活性。为此，将高结合力的96孔平底平板(Corning)在4℃用人重组EGFR-Fc(2ug/ml，0.01M PBS)包被过夜。将板用PBS+0.01％Tween 20洗涤5次，并在室温(RT)下用PBS+2％BSA封闭1小时。在PBS+2％BSA中进行CD3xEGFR-SF3的连续稀释(从4ug/ml开始，稀释度为1/4)和对照抗体，然后将100ul转移到测定板上并在室温下孵育1小时。然后将板用PBS+0.01％吐温20洗涤5次，并在室温下加入生物素化的抗人CD3E(0.5ug/ml)1小时，然后在室温下用链霉亲和素-HRP(1/1000)孵育1h。然后将板用PBS+0.01％吐温20洗涤5次，向每个孔中加入100ul TMB底物溶液(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)，并通过添加100ul的H2SO4(2N)在1至10分钟之间终止反应。用Synergy HT2-分光光度计在450nm下测量光密度。
10.3简单FACS结合
使用PBMC(评估与CD3的结合)或NCI-HI 703鳞状癌细胞(评估与EGFR的结合)进行FACS简单结合。将细胞以106细胞/ml重悬于FACS缓冲液(1X PBS+10％乙二胺四乙酸+2％FBS)中，并将100ul加入U型底96孔板中，然后以350g离心3分钟。将CD3xEGFR-SF3的系列稀释液(10ug/ml，1/3稀释)和对照抗体添加到细胞中，并在4℃下孵育30分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤并用以下抗体(ThermoFisher)染色：抗人CD4PE-eF610(1/100)，抗人CD8aAPC(1/100)和抗人IgG(Fc-γ特异性)PE(1/200)20分钟4℃。用FACS缓冲液洗涤细胞，并重悬于含有Sytox绿色活力染料(1/200)的FACS缓冲液中，在4℃下20分钟，并在CytoFlex(Beckman Coulter)上采集。
10.4抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)分析
对于效应细胞，使用聚蔗糖梯度纯化从全血滤器中收获PBMC。简而言之，将含有肝素(Drossapharm)的PBS注入过滤器，收集到装有聚蔗糖的50ml血液分离管(SepMate-50；Stemcell)中，并在1200g下离心10分钟。收获PBMCS并用PBS洗涤3次，然后根据制造商的方案使用NK Cell Isolation Kit(eBiosciences)分离NK细胞。将分离的NK以106细胞/mL重悬，并在37℃与IL-2(100U/ml Peprotech)一起孵育过夜。对于靶细胞，将HPB-ALL、A-431和A549在ADDC培养基(RPMI+2％FCS+1％谷氨酸+1％NEAA+1％NaPyr+1％P/S)中洗涤并按0.2×106个细胞/ml重悬于CDC培养基中。将CD3xEGFR-SF3的系列稀释液(80nM，按1/10稀释)和对照抗体(1∶1比例)添加到靶细胞中，并在37℃下孵育15-20分钟。使用未经处理的靶细胞可自发杀伤力(下基线)。使用热休克细胞(细胞在-80℃冷冻，融化3倍)可获得最大杀伤力(上基线)。然后加入NK细胞(50000细胞)(E∶T比为5∶1)，并将样品在37℃下孵育4.5小时。对于A549和A-413，将样品以350g离心3分钟，收集上清液，并根据制造商的规程使用非放射性细胞毒性测定法(Promega)分析细胞毒性(LDH释放)。简而言之，将上清液与LDH底物溶液孵育20-60分钟，然后用50ul终止液终止，并用Synergy HT2-分光光度计在490nM读数。对于HPB-ALL细胞，将细胞重悬于1X PBS+10％乙二胺四乙酸+2％含7-AAD(1/100)的FBS中，以便在CytoFlex(Beckman Coulter)上进行分析。
10.5补体依赖性细胞毒性(CDC)分析
靶细胞(A549或HPB-ALL)在CDC培养基(RPMI+2％FCS+1％谷氨酸+1％NEAA+1％NaPyr+1％P/S)中洗涤，并以106个细胞/mL重悬于CDC培养基。将CD3xEGFR-SF3的系列稀释液(100nM，以1/5稀释)和对照抗体(比例为1：1)添加到靶细胞中，并在37℃下孵育15分钟，然后添加15％的幼兔补体。使用未经处理的靶细胞可自发杀死(下基线)。通过热激细胞获得最大杀伤力(上基线)(细胞在-80℃下冷冻，并解冻3次)。将样品在37℃孵育4.5h，然后在350g离心3分钟。对于A549细胞，收集上清液，并根据制造商的规程使用
Figure BDA0002245924160000401
非放射性细胞毒性测定法(Promega)分析细胞毒性(LDH释放)。简而言之，将上清液与LDH底物溶液孵育20-60分钟，然后用50ul终止液终止，并用Synergy HT2-分光光度计在490nM读数。对于HPB-ALL细胞，将细胞重悬于1X PBS+10％乙二胺四乙酸+2％含7-AAD(1/100)的FBS中，以在CytoFlex(Beckman Coulter)上采集。使用FlowJo(BD)分析数据。
10.6正常密度PBMC测定
使用聚蔗糖梯度纯化从全血滤器中收集PBMC。简而言之，将含有肝素(Drossapharm)的PBS注入过滤器，收集到装有聚蔗糖的50ml血液分离管(SepMate-50；Stemcell)中，并在1200g下离心10分钟。收获PBMCS，用PBS洗涤3次，以106细胞/ml重悬，接种在96孔板中，并在连续稀释的CD3xEGFR-SF3(10ug/ml，以1/3稀释)和对照抗体存在下于37℃孵育24h或48h。
通过流式细胞术在24小时和48小时评估激活标记。将细胞在4℃下用以下抗体(ThermoFischer)染色20分钟：抗人CD4PE-eF610、CD8AF700、CD25PE和CD69PeCy7，然后洗涤1X PBS+10％乙二胺四乙酸+2％FBS，在350g的条件下离心3分钟，然后在IX PBS+10％乙二胺四乙酸+2％含有Sytox绿色活力染料的FBS(1/2000)中重悬，在4℃放置20分钟，然后在CytoFlex(Beckman Coulter)上获得。使用FlowJo(BD)分析数据。
为了在24小时和48小时释放细胞因子，将板在350g离心5分钟，收集上清液，并根据制造商的方案通过Luminex对细胞因子进行定量。
为了评估增殖，在孵育30小时后添加3H-胸苷(0.5uCu/孔)，并在48小时时间点用户滤过器过滤器中收获，并向其中添加了闪烁液，然后使用β闪烁读取百万分率(cpm)计数器。
10.7高密度PBMC分析中的非特异性T细胞活化
使用聚蔗糖梯度纯化从全血过滤器中收集PBMC。简而言之，将含有肝素(Drossapharm)的PBS注入过滤器中，收集到装有聚蔗糖的50ml血液分离管(SepMate-50；Stemcell)中，并在1200g下离心10分钟。收获PBMCS，并用PBS洗涤3次，并以107细胞/ml接种在24孔板中，以在37℃下孵育48小时。然后将细胞以350g离心5分钟，以106细胞/ml的正常密度重悬于96孔板中，并在连续稀释的CD3xEGFR-SF3(10ug/ml，以1/3稀释)和对照抗体的存在下在37℃下孵育24小时。为了测量释放的细胞因子，将板以350g离心5分钟，收集上清液，并根据制造商的方案通过Luminex对细胞因子进行定量。
10.8全血分析(WBA)
从健康志愿者那里采集新鲜的全血，并按照0.5ml/孔接种在48孔板中。将血液在CD3xEGFR-SF3连续稀释液(10ug/ml，以1/10稀释)和对照抗体存在下于37℃孵育24h。将样品以3000g离心5分钟，收集上清液，稀释1/2，并根据制造商的方案通过Luminex对释放的细胞因子进行定量。
10.9重定向裂解测定(RDL)
从ATCC获得了一系列用作靶细胞的细胞系，并每周两次用胰蛋白酶传代2至3次，以使其在供应商推荐的培养基中保持最佳融合状态。使用Mycoalert检测试剂盒(LT07-318，Lonza)对细胞常规进行支原体污染测试，结果均为阴性。在每次测定之前，评估细胞的特异性抗体结合能力(sABC；
Figure BDA0002245924160000412
)以验证表面EGFR表达。
使用聚蔗糖梯度纯化从全血滤器中收获PBMC(效应细胞)。简而言之，将含有肝素(Drossapharm)的PBS注入过滤器中，收集到装有聚蔗糖的50ml血液分离管(SepMate-50；Stemcell)中，并在1200g下离心10分钟。收获PBMCS，用PBS洗涤3次，并以2×106细胞/ml重悬。对于重定向裂解，将靶细胞(T；1×104细胞/孔)和效应细胞(E；1×105细胞/孔)(E∶T比10∶1)铺在96孔平板中在连续稀释的CD3xEGFR-SF3(10nM，1/10稀释)和对照抗体存在下，于37℃下孵育48小时。使用
Figure BDA0002245924160000411
AQueousOne溶液细胞增殖测定法(Promega)根据制造商的方案，通过MTS测定法在48小时时评估靶细胞的生存力。简要地，将板洗涤3次，然后将MTS溶液加入孔中。在Synergy HT2-分光光度计上于490nm读取板。当观察到最大杀伤力(仅使用裂解溶液杀死的靶标)和自发杀伤力(仅使用靶标的孔)之间有足够的差异时，认为该板有效。
10.10数据和统计分析
剂量反应分析：使用Prism(GraphPad)绘制数据并进行分析。首先使用X＝Log(X)转换数据。使用转换后的数据，应用4参数logistic回归(4PL)拟合，得出S形剂量反应曲线(Hillslope固定为1)。根据曲线拟合获得与被测样品的最大功效百分比F相对应的ECF值(F＝20、50和80)。
流式细胞仪数据：使用FlowJo(BD)分析数据，并提取平均荧光强度(MFI)，特定细胞群百分比或ul事件。然后为每个实验处理数据。
Luminex数据：使用ProcartaPlex Analyst(eBioscience)分析Luminex数据。将细胞因子浓度标准化至定量的上限和下限。
特异性ADCC杀伤公式的百分比：
Figure BDA0002245924160000421
其中样品对应于在样品中测量的杀伤，RS对应于自发杀伤，而RM对应于最大杀伤。然后使用剂量反应分析方法分析特异性杀伤的百分比。
特异性CDC杀伤分子的百分比：
％特异性CDC样品＝％特异性杀伤样品-％特异性杀伤无抗体
其中％特异性CDC样品对应于针对样品测量的特异性杀伤，％特异性杀伤无抗体对应于未处理靶标的特异性杀伤。然后使用剂量反应分析方法分析特异性杀伤的百分比。
RDL中特定的杀伤形式的百分比：
其中吸光度490nm(样品)对应于样品的OD值，吸光度490nm(自发杀伤)对应于仅靶标孔的平均值获得的OD，而吸光度490nm(最大杀伤)对应于仅裂解靶细胞的平均OD。使用上述剂量响应分析方法进一步分析以这种方式获得的百分比。
供体排斥：供体排斥是使用JMP软件进行的。
RDL供体排除：当剂量反应曲线的拟合度R2＜0.7或无mAb样品的特异性杀死率高于40％时，将供体排除。
安全实验供体排除：分别针对每个供体的治疗拟合出读出数据(激活百分比，增殖或细胞因子浓度)。然后使用无mAb条件作为对照进行Dunnett的比较测试。当无mAb条件与该供体的至少一种阳性对照之间无统计学差异时，将供体排除在外。
统计分析：使用JMP进行统计比较。进行拟合最小二乘嵌套模型以比较治疗效果，治疗浓度和治疗批次。模型拟合后，使用无mAb条件和IgG同种型条件作为对照进行Dunnett比较。这些比较是在排除供体后并分别针对每个时间点(如果适用)进行的。
总结和结果
为证实CD3xEGFR-SF3的生物学活性并定量CD3xEGFR-SF3与其靶标CD3和EGFR的结合，已进行了ELISA分析。
特别是，将CD3xEGFR-SF3和对照抗体的剂量反应在包被标签的人CD3-Fc或带有组氨酸标签的人EGFR上孵育，然后用结合HRP的抗人IgG Fab(单EGFR或CD3；分别见图19A和B)或huCD3-生物素，然后进行HRP偶联的抗生蛋白链菌素(双重结合；图19C)。表4表示从三个独立复制的S形剂量反应结合曲线中提取的EC20、50和80值(图19)。
表4.CD3xEGFR-SF3结合ELISA的EC值。该值代表平均值±SEM。
ELISA结合 EC<sub>20</sub>(ug/ml) EC<sub>50</sub>(ug/ml) EC<sub>80</sub>(ug/ml)
单EGFR(A) 0.0132±0.004 0.053±0.016 0.212±0.063
单CD3(B) 0.023±0.001 0.091±0.005 0.363±0.022
双结合(C) 0.043±0.01 0.171±0.04 0.685±0.18
为了进一步评估CD3xEGFR-SF3与CD3和EGFR的结合，分别使用PBMC或NCI-H1703鳞状癌细胞进行FACS简单结合。特别是将CD3xEGFR-SF3和对照抗体的剂量反应在PBMCS(图20A-C)或鳞状癌细胞系NCI-H1703(图20D)上孵育，并用PE标记的抗人IgG(Fc-γ)检测。对于PBMC，还用抗CD4或抗CD8抗体标记细胞。表5表示从三个独立复制的非线性S形回归结合曲线中提取的EC20、50和80值(图20)。
表5.CD3xEGFR-SF3结合ELISA的EC值。该值代表平均值±SEM。
Figure BDA0002245924160000431
为了评估CD3xEGFR-SF3诱导各种表达EGFR的人类癌细胞系重定向裂解的能力，在CD3xEGFR-SF3或对照抗体的剂量反应的存在下将目标癌细胞(T)和效应细胞(E；PBMC)以1∶10的E∶T比例孵育。通过细胞毒性测定法(MTS)确定癌细胞的重定向裂解。EC50值是从特定杀伤的S形剂量反应曲线中得到的(图21)。重定向裂解的细胞系具有统计学差异(单向方差分析；F＝5、6；p＜0.0001)。总之，CD3xEGFR-SF3诱导了所有测试的表达EGFR的人类癌细胞系的重定向裂解。
在EGFR+癌细胞系A-431和A549(图22A)以及CD3+HPB-ALL细胞(图22B)中评估了CD3xEGFR-SF3的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，由从特定杀伤的S形剂量反应曲线中提取的EC50值。与A-431和A549中的Erbitux(爱必妥)相比，用CD3xEGFR-SF3处理降低了ADCC(图22A；最小二乘模型，F＝29，p＜0.0001)，并且与HPB-ALL细胞中的人抗SP34抗体相比(图22B；T检验，t＝3，p＜0.05。总之，在测试的表达EGFR或CD3的细胞系中，CD3xEGFR-SF3不诱导ADCC。
在EGFR+癌细胞A549(图23A)和CD3+HPB-ALL细胞(图23B)中评估了特定的补体依赖性细胞毒性(CDC)，并从特定CDC的S形剂量反应曲线中得到了EC50值。对于A549和HPB-ALL细胞，CD3xEGFR-SF3均不诱导任何特异性的补体依赖性细胞毒性。
为了评估CD3xEGFR-SF3对非特异性细胞增殖的影响，将健康供体(n＝19)的PBMC在剂量递增的CD3xEGFR-SF3或对照存在下孵育48小时。通过在48小时测量3H-胸苷的掺入来评估增殖(图24)。使用FitLeast Square模型进行增殖的统计分析，然后进行Dunnett比较，以比较针对无mAb对照(图25A)或同种型对照(图25B)的平均值。
与无mAb条件相比，CD3xEGFR-SF3在高浓度的CD3xEGFR-SF3AE042和P1069批次中引起轻微增殖，这在最新的TRS批次药物中未观察到。与同种型对照相比，CD3xEGFR-SF3仅在最高浓度(5ug/ml)的AE042批次中诱导统计学上显著的增殖。与同型对照相比，水或湿包衣形式的其他批次的CD3xEGFR-SF3均未诱导任何显著的增殖增加。总之，TRS批次的CD3xEGFR-SF3在PBMC分析中不会诱导任何增殖。
为了评估CD3xEGFR是否可以诱导CD4+ T细胞的非特异性活化，将来自健康供体(n＝23)的PBMC在剂量递增的CD3xEGFR-SF3或对照存在下孵育24h或48h。通过流式细胞术测量CD4+ T细胞的活化，作为T细胞活化标志物CD69的表达(图26)。使用Fit Least Square模型在每个时间点进行CD4+ T细胞活化的统计分析，然后进行Dunnett比较，以针对无mAb对照(图27A和B)或同种型对照(图28A和B)比较均值。
当与无mAb条件进行比较(即最严格的比较)时，诱导的高浓度(1-10ug/ml)CD3xEGFR-SF3包被的和水性TRS批次和5ug/ml的仅AE042水性CD3xEGFR-SF3批次CD4+ T细胞在24h和48h的非特异性活化，以及未包被的CD3xEGFR-SF3批次P1069(浓度从0.005ug/ml开始)在48h诱导CD4+ T细胞活化。当与同种型对照相比时，测试的所有CD3xEGFR-SF3批次均未在24h诱导非特异性CD4+ T细胞活化，并且在48h时，只有最高浓度(5ug/ml)的AE042和P1069批次含水形式但TRS批次的CD3xEGFR-SF3不会诱导CD4+ T细胞的活化。总之，与同种型抗体相比，TRS批次CD3xEGFR-SF3在非特异性PBMC中不会诱导统计学上显著的CD4+ T细胞活化。
为了评估CD3xEGFR是否可以诱导CD8+ T细胞的非特异性活化，将来自健康供体(n＝23)的PBMC在剂量递增的CD3xEGFR-SF3或对照存在下孵育24h或48h。通过流式细胞术测量CD8+ T细胞的激活作为激活标记CD69的表达(图29)。使用FitLeastSquare模型在每个时间点进行CD8+ T细胞活化的统计分析，然后进行Dunnett比较，以针对无mAb对照(图30A和B)或同型对照(图31A和B)比较均值。
当与无mAb条件进行比较时(即最严格的比较)，在PBMC分析中，不同批次的CDxEGFR-SF3水溶液或高浓度(1-10ug/ml)包被在24h和48h诱导CD8+ T细胞活化。与同种型对照相比，在24h时，只有包被的TR3批次的CD3xEGFR-SF3 CD1x/mL，而不是10ug/ml诱导CD8+ T细胞活化，而在48h时，只有最高浓度的不同批次才诱导CD8+ T细胞活化。总之，与同型抗体相比，在低剂量的非特异性PBMC分析中，CD3xEGFR-SF3不会诱导统计学上显著的CD8+T细胞活化。
为了预测在临床环境中任何潜在的细胞因子释放，PBMC通常用于细胞因子释放测定的临床前测试中(Stebbings等，J Immunol 179：3325-3331(2007))。为了评估CD3xEGFR-SF3是否可以诱导非特异性T细胞细胞因子反应，将来自健康供体(n＝23)的PBMC在剂量递增的CD3xEGFR-SF3或对照存在下孵育24h，通过Luminex测量上清液中释放的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平(图32)。使用Fit Least Square模型在每个时间点对释放的细胞因子进行统计分析，然后进行Dunnett比较，以比较针对无mAb对照(图33A-D)或同种型对照(图34A-D)的均值。
当与无mAb条件进行比较(即最严格的比较)时，所有批次的CD3xEGFR-SF3均未诱导IL-2的释放，只有AE042水溶液的CD3xEGFR-SF3批次均诱导了IL-6的释放，并且仅在非特异性T细胞测定中，包被的AE042和P1069批次的CD3xEGFR-SF3的较高剂量(0.5和5ug/ml)诱导IFN-γ和TNF-α释放。与同型对照相比，CD3xEGFR-SF3在24h时不会诱导IL-2或IFN-γ的释放，仅在AE042水溶液中存在最高浓度的CD3xEGFR-SF3时才诱导IL-6，并且仅以最高浓度的包被的P1069批次的CD3xEGFR-SF3时才诱导TNF-α。总之，在与PBMC孵育24小时后，CD3xEGFR-SF3仅以批次依赖的方式诱导了IL-6和TNF-α的释放，但不诱导IL-2或IFN-γ的释放。
在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照存在下，将来自健康供体(n＝23)的PBMC孵育48小时，并通过Luminex测量释放的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ在上清液中的水平(图35)。使用FitLeast Square模型在每个时间点对释放的细胞因子进行统计分析，然后进行Dunnett比较，以比较针对无mAb对照(图36A-D)或同种型对照(图37A-D)的均值。
当与无mAb条件进行比较(即最严格的比较)时，所有批次的CD3xEGFR-SF3均未诱导IL-2或IFN-γ的释放，只有高浓度的包被CD3xEGFR-SF3才诱导TNF-α的释放，并且IL-6的释放取决于CD3xEGFR-SF3的批次和浓度。当与同种型对照相比时，CD3xEGFR-SF3不会诱导任何IL-2或IFN-γ的释放，包被的CD3xEGFR-SF3仅诱导高浓度的TNF-α的释放，而IL-6的释放则被水相诱导但不被包被CD3xEGFR-SF3(0.05、0.5和5ug/ml)的AE042批次诱导，以及以0.01和0.1ug/ml包被的TRS但没有更高的浓度。总之，CD3xEGFR-SF3在与PBMC孵育48小时后，以批次依赖的方式仅以高浓度诱导IL-6和TNF-α的释放，而不诱导IL-2和IFN-γ的释放。
PBMC的高密度预培养，然后与可溶性mAb孵育用作细胞因子释放测定方法，以评估mAb的临床前安全性(
Figure BDA0002245924160000461
等，Blood 118：6772-6782(2011))。将来自健康供体(n＝16)的PBMC高密度(107细胞/ml)预孵育48小时。然后将细胞以正常密度(106细胞/ml)铺板，并在增加剂量的水性CD3xEGFR-SF3或对照的存在下培养24小时，并且释放的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平通过Luminex在上清液中测量(图38)。使用Fit Least Square模型进行释放细胞因子的统计分析，然后进行Dunnett比较，以比较针对无mAb对照(图39A-D)或同种型对照(图40A-D)。与未经治疗(无mAb)的情况或高密度PBMC分析中的同种型对照相比，CD3xEGFR-SF3不会引起IL-2、IL-6、TNF-α或IFN-γ水平的任何显著增加。
全血测定法被广泛用作一种风险评估方法，用以鉴定在输注单克隆抗体治疗剂后临床环境中可能释放的细胞因子(Vessillier et al.Immunol Methods 424：43-52(2015))。为了评估CD3xEGFR-SF3是否可以诱导细胞因子的产生，在增加剂量的CD3xEGFR-SF3或对照组的存在下将健康志愿者(n＝16)的全血培养24小时，并通过Luminex在上清液中测量IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ血浆水平(图41)。使用Fit Least Square模型进行释放细胞因子的统计分析，然后进行Dunnett比较，以比较针对无mAb对照(图42A-D)或同种型对照(图43A-D)的均值。在全血分析中，与未治疗(无mAb)的情况或同种型对照相比，CD3xEGFR-SF3不会引起IL-2、IL-6、TNF-α或IFN-γ水平的任何显著增加。
实施例11NOD SCID异种移植小鼠模型中CD3xEGFR_SF3的进一步体内表征
材料与方法
11.1细胞系培养条件
将A549细胞在37℃在5％CO2的潮湿气氛中在培养基中培养。每周将细胞传代2至3次，以使其保持最佳融合状态，并使用MycoAlert检测试剂盒常规测试其支原体污染情况。细胞持续测试阴性。
11.2效应细胞：人外周血单个核细胞(PBMC)
从得自La Chaux-de-Fonds输血中心的血液过滤器中收集外周血单核细胞(PMBC)。为了进行血液过滤器处理，将40ml PBS(补充1％的
Figure BDA0002245924160000471
(Drossapharm))注入血液过滤器中，并将包含PBMC的溶液收集在50ml预先装有聚蔗糖(GE Healthcare)的血液分离管(Chemie Brunschwig)中。将聚蔗糖管在室温下(RT)在800g的离心力下离心20分钟，不带制动器，并收集PBMC“血沉棕黄层”环并将其转移到包含30ml PBS的50ml的falcon管中。在处理之前，将PBMC在PBS中洗涤3次。
11.3动物饲养
在雌性6-7周龄免疫缺陷NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠中进行体内实验，其特征是T细胞，B细胞和自然杀伤细胞缺陷(Envigo)。将小鼠保持在啮齿动物微隔离笼中的标准环境条件下(室温20±1℃，相对湿度50±10％，黑暗周期12小时)。小鼠接受辐照的食物和垫料以及0.22μm过滤的饮用水。所有实验均根据瑞士动物保护法进行，并获得州和联邦兽医部门的事先授权。
11.4异种移植实验
皮下注射肿瘤细胞(靶细胞，T)和PBMC(效应细胞，E)的混合物。以2∶1的E∶T比例注入NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj(NOD/SCID)小鼠的右侧腹区域(每PBMC供体每组n＝4至5)。方案是治疗性的，治疗在细胞植入后第2天静脉内(i.v.)进行。静脉内施用CD3xEGFR-SF3(P1069)。每周一次，持续2周，剂量为2mg/kg。通过卡尺测量进行肿瘤大小定量。使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝0.5×长度×宽度2。
11.5统计分析
使用Graphpad Prism 5软件分析数据。数据表示为平均值±SEM。通过Mann-Whitney检验进行统计分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。
总结与结果
表6.图45的统计分析(Mann Whitney检验)。
Figure BDA0002245924160000481
在第41天，在CD3xEGFR-SF3治疗组中，平均肿瘤体积为488mm3，而对照组为1059mm3(见图44和45)。CD3xEGFR-SF3诱导了显著的A549肿瘤生长降低。
序列表
<110> 格兰马克药品股份有限公司
<120> 用于治疗EGFR阳性癌症的T细胞重定向双特异性抗体
<130> GBR 1372
<160> 52
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 001EGFR_BTA
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu Val
355 360 365
Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro Met Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu
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Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu Ser Asn Tyr Ala
165 170 175
Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly
180 185 190
Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Asn Thr Trp Val
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Thr Asp
245 250 255
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
260 265 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
275 280 285
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
290 295 300
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
305 310 315 320
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
325 330 335
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
355 360 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val Ala
370 375 380
Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Thr Leu
385 390 395 400
Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
405 410 415
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp Pro Pro Leu
420 425 430
Leu Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Asp
435 440 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Lys
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<220>
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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
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100 105 110
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
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Phe Asp His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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260 265 270
Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
275 280 285
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
290 295 300
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
340 345 350
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
355 360 365
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
370 375 380
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
405 410 415
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
420 425 430
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
435 440 445
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485 490 495
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
500 505 510
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
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Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
595 600 605
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610 615 620
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln
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Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 5
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu
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65 70 75 80
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Leu Leu Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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Pro Gly Lys
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
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Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Tyr Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu Ser Asn Tyr Ala
165 170 175
Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly
180 185 190
Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Asn Thr Trp Val
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Thr Gln
245 250 255
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Asp
275 280 285
Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
290 295 300
Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
305 310 315 320
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe Ser
325 330 335
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
340 345 350
Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
370 375 380
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
405 410 415
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
420 425 430
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
435 440 445
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
450 455 460
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
465 470 475 480
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
485 490 495
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
500 505 510
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
515 520 525
Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
530 535 540
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val
545 550 555 560
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
565 570 575
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
580 585 590
Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val Tyr Thr Leu
595 600 605
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu Val Cys
610 615 620
Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
625 630 635 640
Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp
645 650 655
Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val Asp Lys Ser
660 665 670
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
675 680 685
Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695 700
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<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 008BTB_Fc
<400> 8
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val
115 120 125
Ala Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Thr
130 135 140
Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp Pro Pro
165 170 175
Leu Leu Glu Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 009EGFRscFv_BTB_Fc401
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
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Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His
210 215 220
Phe Asp His Leu Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys Gly Gly Gly Gly Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
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305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
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385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
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Ser Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 10
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 010EGFR-hSP34scFv_BTB401
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
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Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
245 250 255
Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
260 265 270
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
290 295 300
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
325 330 335
Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
355 360 365
Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu
370 375 380
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu Ser
385 390 395 400
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
405 410 415
Leu Ile Gly Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
420 425 430
Ser Gly Ser Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
435 440 445
Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Asn
450 455 460
Thr Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
485 490 495
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
500 505 510
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
515 520 525
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
530 535 540
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
545 550 555 560
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
565 570 575
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
580 585 590
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
595 600 605
Glu Val Ala Thr Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
610 615 620
Val Thr Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
625 630 635 640
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp
645 650 655
Pro Pro Leu Leu Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu
660 665 670
Arg Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
675 680 685
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
690 695 700
Leu Ser Pro Gly Lys
705
<210> 11
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 011BTA_Fc
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys
130 135 140
Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 12
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 012EGFR_BTB401_CD3scFv
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val Ala Thr
340 345 350
Phe Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Thr Leu Val
355 360 365
Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Asp Pro Pro Leu Leu
385 390 395 400
Glu Ser Gln Gly Ser Phe Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
465 470 475 480
Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
485 490 495
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
500 505 510
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
515 520 525
Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
530 535 540
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
545 550 555 560
Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
595 600 605
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val
610 615 620
Thr Glu Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala
625 630 635 640
Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro
645 650 655
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile
660 665 670
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe
675 680 685
Tyr Ser Asn Thr Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
690 695 700
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 013 Gly4Ser接头
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 014 Gly4Thr接头
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Thr
1 5
<210> 15
<211> 624
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
20 25 30
Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg
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Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala
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Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val
130 135 140
Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp
165 170 175
Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala
180 185 190
Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
195 200 205
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210 215 220
Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn
245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
260 265 270
Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys
290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
305 310 315 320
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
325 330 335
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
385 390 395 400
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
405 410 415
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
450 455 460
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
485 490 495
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
500 505 510
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
515 520 525
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530 535 540
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
545 550 555 560
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
565 570 575
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
580 585 590
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
595 600 605
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
610 615 620
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<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 016hEGFR-IV_505-638
<400> 16
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Ala Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
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50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
85 90 95
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
100 105 110
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
130 135 140
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<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 017hEGFR-IV_556-638
<400> 17
Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
20 25 30
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
35 40 45
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
50 55 60
Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
65 70 75 80
Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
85 90
<210> 18
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 018hEGFR-IV_580-638
<400> 18
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
35 40 45
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His
50 55 60
His His His His His
65
<210> 19
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 019cEGFR-IV_556-638
<400> 19
Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Val Met Asn Ile Thr Cys
1 5 10 15
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
20 25 30
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
35 40 45
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
50 55 60
Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
65 70 75 80
Cys Ala Arg Ser Ala His His His His His His His His
85 90
<210> 20
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 020cEGFR-IV_580-638
<400> 20
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
20 25 30
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
35 40 45
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Ala Arg Ser Ala His His His
50 55 60
His His His His His
65
<210> 21
<211> 624
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 021hEGFR-I-II-III_hErbB3-IV
<400> 21
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln
1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
20 25 30
Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg
35 40 45
Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr
50 55 60
Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu
65 70 75 80
Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala
85 90 95
Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro
100 105 110
Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn
115 120 125
Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val
130 135 140
Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu
145 150 155 160
Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp
165 170 175
Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala
180 185 190
Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
195 200 205
His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys
210 215 220
Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys
225 230 235 240
Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn
245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
260 265 270
Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys
290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
305 310 315 320
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
325 330 335
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
385 390 395 400
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
405 410 415
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
450 455 460
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
485 490 495
Arg Asp Cys Leu Ser Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val
500 505 510
Thr His Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu
515 520 525
Ala Glu Cys Phe Ser Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr
530 535 540
Ala Thr Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His
545 550 555 560
Phe Arg Asp Gly Pro His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu
565 570 575
Gly Ala Lys Gly Pro Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys
580 585 590
Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu
595 600 605
Gln Asp Cys Leu Gly Gln Ser Ala His His His His His His His His
610 615 620
<210> 22
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 022hErbB3-I-II-III_hEGFR-IV
<400> 22
Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu Ile Val Leu
35 40 45
Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile Arg Glu Val
50 55 60
Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr Leu Pro Leu
65 70 75 80
Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp Gly Lys Phe
85 90 95
Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser His Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser Gly Gly Val
115 120 125
Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr Ile Asp Trp
130 135 140
Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val Lys Asp Asn
145 150 155 160
Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly Arg Cys Trp
165 170 175
Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr Ile Cys Ala
180 185 190
Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn Gln Cys Cys
195 200 205
His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp Thr Asp Cys
210 215 220
Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu Glu Pro Asn
245 250 255
Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala Ser Cys Pro
260 265 270
His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala Cys Pro Pro
275 280 285
Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys Glu Pro Cys
290 295 300
Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser Gly Ser Arg
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Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val Asn Cys Thr
325 330 335
Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu Asn Gly Asp
340 345 350
Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu Asn Val Phe
355 360 365
Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln Ser Trp Pro
370 375 380
Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr Thr Ile Gly
385 390 395 400
Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile Met Lys Asn
405 410 415
Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Ala
420 425 430
Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr His His Ser
435 440 445
Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu Arg Leu Asp
450 455 460
Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu Gly Lys Val
465 470 475 480
Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly
485 490 495
Gln Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp
500 505 510
Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser
515 520 525
Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile
530 535 540
Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr
545 550 555 560
Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
565 570 575
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys
580 585 590
His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
595 600 605
Glu Gly Cys Pro Thr Ser Ala His His His His His His His His
610 615 620
<210> 23
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0233A6_VH_IGG1
<400> 23
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0243A6_VL_cK
<400> 24
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Ala Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala His Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 450
<212> PRT
<213> SEQ ID NO: 02510E6_VH_IGG1
<400> 25
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Arg Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Val Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 02610E6_VL_cK
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 027IGHV4-4*08
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 28
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 028IGKV6-21*02
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro
85 90 95
<210> 29
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 029IGHV3-23*04
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Tyr Asn Tyr Leu
100
<210> 30
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 030IGKV1-39*01
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 31
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0313A6-最适-VH
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0323A6-稳定-VH
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0333A6-最适-VL
<400> 33
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0343A6-稳定-VL
<400> 34
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 035IGHV4-30-4*01
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 03610E6-最适-VH
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Val Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 03710E6-稳定-VH
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Val Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 03810E6-最适-VL
<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 03910E6-稳定-VL
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0403A6-最适抗体重链
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 41
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0413A6-最适抗体轻链
<400> 41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 42
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 0423A6-稳定抗体重链
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<211> 214
<212> PRT
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<220>
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<400> 43
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Trp Pro Leu
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 04510E6-最适抗体轻链
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 04610E6-稳定抗体重链
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<220>
<223> SEQ ID NO: 04710E6-稳定抗体轻链
<400> 47
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
<220>
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Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
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Ser Arg Leu Ser Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
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Gly Asn Gln Gly Arg Thr Val Arg Pro Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys
355 360 365
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His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
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<400> 49
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Glu Ser Asn Tyr Ala
165 170 175
Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly
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Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Phe Tyr Ser Asn Thr Trp Val
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Thr Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
325 330 335
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340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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<220>
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val Tyr
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 051CD3xEGFR_7 链A
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys
355 360 365
Leu Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 52
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 052CD3xEGFR_8 链A
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Val Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Ser Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ala Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Lys Leu
355 360 365
Val Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ser Leu Val Ser Trp Leu Asn Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (8)

1.一种CD3xEGFR双特异性抗体，其与在CD3ε和EGFR上的表位结合。
2.根据权利要求1所述的CD3xEGFR双特异性抗体，其包含至少一个FAB和至少一个scFv部分。
3.根据权利要求2所述的CD3xEGFR双特异性抗体，其中，所述至少一个FAB和一个scFv部分彼此连接。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的CD3xEGFR双特异性抗体，其选自包括CD3xEGFR_SF1(SEQ ID NO：4、5和6)、CD3xEGFR_SF3(SEQ ID NO：7、2和8)、CD3xEGFR_SF4(SEQ ID NO：4、5和9)、CD3xEGFR_SD1(SEQ ID NO：1、2和10)和CD3xEGFR_SD2(SEQ ID NO：11、10和2)的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的CD3xEGFR双特异性抗体，其用作药物。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的CD3xEGFR双特异性抗体，用于治疗表达EGFR的癌症。
7.根据权利要求6所述的CD3xEGFR双特异性抗体，其中所述表达EGFR的癌症还包含一个或多个KRAS或B-Raf突变。
8.一种与人EGFR的结构域4结合的抗体或其片段，其包含选自或衍生自以下的重可变序列和轻可变序列：SEQ ID NO：23和24、SEQ ID Ns：25和26、SEQ ID NO：31和33、SEQ IDNO：32和34、SEQ ID NO：36和38、SEQ ID NO：37和39。
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