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CN110801013B - 一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法及其产品。本发明基于漆酚过敏的机理，令漆酚在体外与蛋白质或肽或氨基酸其中的一种或几种组合形成漆酚络合物，在增强机体的对过敏反应的耐受性，同时使其失去与直接皮肤蛋白结合的机会，避免引起皮肤的过敏反应，得到非过敏生漆或漆酚。蛋白质或肽或氨基酸与漆酚可逆络合，并没有真正破坏漆酚的结构，使漆酚的抗氧化、抗肿瘤、抗菌等原有的生物活性没有改变或丧失，而且在体内极易被消化分解代谢；可用于生漆或漆酚食品、保健品和药品开发；本发明设计巧妙，制备过程中无有毒有害试剂的添加和残留，保证成品的安全。

Description

一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法及其产品
技术领域
本发明涉及食品、保健品和药品领域，具体是一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法及其产品。
背景技术
生漆为漆树科植物漆树Rhus vernicifera、Rhus succedanea和Melanorrhoeausitata韧皮部的分泌物，传统上主要应用于涂料行业，制作漆器、漆画等；干漆还有破瘀通经、消积杀虫和保护心血管等功效，广泛用于制药。
生漆的主要成分为漆酚(60-70％)、水分(20-30％)、植物胶(4-10％)、漆酶(1.5-2％)和水不溶性糖蛋白(3-5％)等。漆酚是侧链含有15个或17个碳原子、链上带有1个、2个或3个不饱和键的烯烃的邻苯二酚。
漆酚是一种半抗原，当半抗原漆酚与皮肤接触时，体内酶的催化反应将漆酚氧化形成亲电的邻醌类化合物，在邻苯二酚环的4，5，6位置与细胞膜上的角蛋白反应，形成一个完整的抗原；蛋白-漆酚复合物形成完全抗原以后，被朗格汉斯细胞(Langerhans cell)捕获，活化的朗格汉斯细胞在淋巴结聚集，并将抗原信息呈现给效应T细胞，效应细胞释放细胞因子，细胞因子和巨噬细胞、淋巴细胞及其他不同的类型靶标细胞结合，最后表现出接触性皮炎、红斑、丘疹、小泡和肿胀等病理性反应，轻者全身发痒，皮肤溃烂，重者可能引起双眼失明、手指干性坏疽、心律失常及多浆膜腔积液导致死亡等病症，严重制约了生漆或漆酚的利用和发展。
现代药理学研究发现漆酚具有很好的抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒和治疗脂肪肝等多种功效，所以消除漆酚过敏的障碍之后的生漆或漆酚在食品、保健品、药品领域有很大用途。
目前生漆脱敏的主要方法是对漆酚进行结构修饰和利用菌株对过敏原漆酚进行降解。
现有对漆酚进行结构修饰的技术方法存在的缺陷是改变了生漆中漆酚官能团的结构、而且对漆酚进行结构修饰时，一般使用或引入有毒有害试剂或基团，使生漆的食用、保健和药用价值受到威胁，而且脱敏效果不彻底；专利CN106075795B公开了利用灰色链霉菌锈色变种(Streptomyces griseus var.ferrugineus)对漆酚进行了降解，导致漆酚的价值丧失，造成了资源浪费。
目前还没有不破坏漆酚的基本结构、不改变漆酚生物活性而消除生漆或漆酚过敏的方法和产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法及其产品，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明是针对生漆过敏的机理，通过以下的方法实现的：是在特定条件下，按照一定工艺，给生漆或漆酚中配加免疫球蛋白，添加蛋白质、肽和氨基酸其中一种或几种组合，令漆酚在体外与蛋白质或肽或氨基酸其中的一种、或几种组合形成漆酚络合物。一方面免疫球蛋白是抗体，起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而使漆酚失去致敏作用；另一方面蛋白质、肽类和氨基酸是两性化合物，含有碱性基团-NH2，漆酚含有酸性酚羟基基团，酸碱基团结合使漆酚与蛋白质、肽和氨基酸在体外形成络合物，使漆酚失去了与皮肤角蛋白或细胞膜蛋白接触时的氧化反应，避免了体内漆酚-蛋白质抗原的形成。即使漆酚与皮肤接触，被氧化成亲电的邻苯二醌类化合物，但与漆酚络合的蛋白质、肽、氨基酸的酸性基团会立刻竞争性与邻苯二酚环的4，5，6位置结合形成体外蛋白质-漆酚络合物，避免了漆酚与皮肤角蛋白、细胞膜蛋白质的结合形成抗原。
本发明得到的非过敏的生漆或漆酚与蛋白质、肽或氨基酸其中的一种或几种形成的漆酚络合物，其中蛋白质或肽或氨基酸与漆酚属于可逆络合，并没有真正破坏漆酚的结构，使漆酚抗氧化、抗肿瘤、抗菌等原有的生物活性没有改变或丧失，而且在体内极易被消化分解代谢，可用于生漆或漆酚食品、保健品和药品开发。
具体的，一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，包括以下步骤：
S1、制备免疫球蛋白活化液：
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比，溶解配置免疫球蛋白活化基质，置于28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入免疫球蛋白，制成免疫球蛋白活化液；所述免疫球蛋白活化液中活化基质：免疫球蛋白的体积质量比为(100-150)L：(5-8)kg。
生漆来自漆树Rhus vernicifera、Rhus succedanea和Melanorrhoea usitata等天然漆和精制漆。
免疫球蛋白和可食蛋白、肽类和氨基酸可以是市售，也可以自制。
S2、非过敏生漆或漆酚的制备：
室温条件下，取免疫球蛋白活化液，按照生漆或漆酚:免疫球蛋白活化液＝100L:(10-17)L体积比，边搅拌边缓慢将免疫球蛋白活化液加入到生漆或漆酚中，搅拌均匀之后，再按照生漆或漆酚:可食蛋白质/肽类/氨基酸/可食蛋白质+肽类+氨基酸＝100L:(20-30)kg/(5-10)kg/(10-20)kg/(5-30)kg体积质量比，分别加入可食蛋白质、肽类、氨基酸、或可食蛋白质、肽类和氨基酸其中一种或几种混合物(当加入的为可食蛋白质、肽类和氨基酸中几种混合物时，生漆或漆酚：可食蛋白质+肽类+氨基酸的体积质量比为100L：(5-30)kg)，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
进一步的，所述步骤S1中免疫球蛋白可以是免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)其中一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤S1中蛋白质可以是蛋清、奶类、豆类、谷物类、畜蛋白等其中一种或几种的组合。
进一步的，所述的肽类化合物可以是如乳肽、豆类肽、谷物肽、卵白肽、畜产肽、水产肽、丝蛋白肽、复合肽、谷胱甘肽等其中一种或几种的组合。
进一步的，所述的氨基酸可以是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)等其中一种或几种的任意组合。
上述制备非过敏生漆或漆酚方法制备的产品。
本发明制备的产品还通过了豚鼠脱敏检验：
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、生漆原液对照组、将第三步中改造生漆或漆酚高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只；给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑、红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
本发明制备的产品通过了人体脱敏检验：
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将第三步改造生漆或漆酚2.5-4.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)；12-24h去除受试物；间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察；注意，胶带反应不计；通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0.5％，脱敏率达99.5％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本技术发明的技术优势之一，在对生漆或漆酚脱敏的同时，保留了漆酚基本结构，使漆酚的生物活性没有改变或丧失，非过敏生漆依然具备抗氧化、抗肿瘤、抗菌等漆酚原有的生物活性，可用于生漆食品、保健品、和药品开发；
本技术发明的非过敏生漆技术优势之二，制备过程中无有毒有害试剂的添加和残留，保证成品的安全性；
本技术发明的非过敏生漆技术优势之三，经过豚鼠试验与人体斑贴试验双重验证，确保了脱敏率在99.5％以上，可以消除生漆对人体的伤害，减轻生漆从业者的身心创伤。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1、免疫球蛋白G+苏氨酸非过敏生漆的制备
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比配置100mL免疫球蛋白活化基质，28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入8g免疫球蛋白G，制成免疫球蛋白G活化液。
在温度为22℃-35℃的环境下，按照生漆:免疫球蛋白活化液:苏氨酸＝100L:(10-17)L:(10-20)kg比例，取免疫球蛋白活化液530mL，边搅拌边逐渐加入生漆3600mL，搅拌均匀之后，加入苏氨酸450g，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、生漆原液对照组、将改造生漆高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只。给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑，红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将改造生漆2.5-4.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)。12-24h去除受试物。间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察。注意，胶带反应不计。通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0.48％，脱敏率达99.52％。
将脱敏的生漆与原液作对比，采用预加菌液倾注平板法，往已冷却至50-60℃左右的平板培养基中注入一定量的菌液，混合均匀，倾注平板(约20-25mL/平板)，水平静置凝固后制成含菌平板。将平板用彩笔平均划分为3个区域，在每个区域用已灭菌的钢管在试验平板上打直径为5.5mm的圆形孔，小心挑去培养基小块以做成圆孔，往一个孔中注入120-200μL的生漆原液，另一个孔中注入120-200μL的非过敏生漆，最后一个孔做为对照，4-6℃预扩散1-2h，35-37℃培养12-24h，霉菌于培养箱中25-28℃下培养24-48h。取出培养好的试验平板，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小，每种菌做3个平行，选取抑菌圈比较明显的平板测定抑菌圈直径，结果取3次重复实验的平均值。通过验证非过敏生漆与生漆原液的抑菌圈大小最大差异不超过1.0-1.5％，证明在对生漆的消除过敏的同时，保留了生漆的抑菌活性。
实施例2、免疫球蛋白A+酪蛋白质制备非过敏生漆
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比配置300mL免疫球蛋白活化基质，28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入24g免疫球蛋白A，制成免疫球蛋白活化液。
在温度为22℃-35℃的环境下，按照生漆:免疫球蛋白活化液:可食蛋白质＝100L:(10-17)L:(20-30)kg比例，取免疫球蛋白A活化液725mL，边搅拌边逐渐加入生漆4500mL，搅拌均匀之后，加入酪蛋白1050g，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、生漆原液对照组、将改造生漆高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只。给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑、红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将改造生漆1.5-2.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)。12-24h去除受试物。间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察。注意，胶带反应不计。通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0.4，脱敏率达99.52％。
非过敏生漆4mL用2％的DMSO溶液配成6mL的溶液作为供试品溶液A；生漆原液4mL用2％的DMSO溶液配成6mL的溶液作为供试品溶液B；利巴韦林50mg用2％的DMSO溶液配成50mg/mL的溶液作为阳性对照药供试品溶液。
将供试品溶液用4％维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长好细胞的96孔板中，并设4个复孔、细胞对照孔和空白对照孔，置32℃、5％CO2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察，细胞出现90％病变时终止培养，按照CCK-8试剂盒的操作(每孔加10μLCCK-8染色，置35℃、5％CO2病毒培养箱中培养3h，用酶标仪在520nm波长测定吸光度OD值)，测定吸光度OD值。应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度TC50，并确定最大无毒浓度TC0。经验证非过敏生漆对Hep-2(人喉癌细胞)的TC50为1.687，TC0为0.896。非过敏生漆对RD(人横纹肌肉瘤细胞)的TC50为1.789，TC0为1.023。细胞毒性远大于利巴韦林，但比生漆原液对细胞的毒性大0.1％。证明在对生漆的消除过敏的同时，保留了生漆的抗病毒活性。
实施例3、免疫球蛋白M+酪蛋白磷酸肽+苯丙氨酸制备非过敏生漆
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比配置500mL免疫球蛋白活化基质，28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入48g免疫球蛋白M，制成免疫球蛋白活化液。
在温度为22℃-35℃的环境下，取免疫球蛋白M活化液555mL，按照生漆:免疫球蛋白活化液:可食蛋白质+肽类+氨基酸＝100L:(10-17)L:(5-30)kg比例，边搅拌边逐渐加入生漆3450mL，酪蛋白磷酸肽290g,苯丙氨酸220g,搅拌均匀之后，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、生漆原液对照组、将改造生漆高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只。给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑、红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将改造生漆2.5-4.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)。12-24h去除受试物。间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察。注意，胶带反应不计。通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0.4，脱敏率达99.52％。
FRAP常被用作检测样品的还原力。以Trolox作为标准品，测定浓度分别为15、30、60、120、240、480μmol/L的FRAP值，计算线性回归方程，得到的方程为y＝0.0017x－0.001(决定系数R2为0.9946，校正后决定系数R2Adj为0.9937)。而非过敏生漆的FRAP为(2.22±0.41)μmolTrolox/mg，与生漆原液的FRAP相差在±0.03内。
在1.25-60μmol/L范围内，Trolox的ABTS+·清除能力与其浓度呈线性相关(决定系数R2为0.9972,校正后决定系数R2Adj为0.9952)，标准曲线为y＝1.588x－0.558。由此计算出非过敏生漆的ABTS+·清除能力为(0.68±0.06)μmol Trolox/mg，与生漆原液的ABTS+·清除能力相差在±0.01之内，证明在对生漆的消除过敏的同时，保留了生漆的抗氧化活性。
实施例4、免疫球蛋白G+丝氨酸制备非过敏漆酚
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比配置200mL免疫球蛋白活化基质，28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入16g免疫球蛋白G，制成免疫球蛋白活化液。
在温度为22℃-35℃的环境下，按照漆酚:免疫球蛋白活化液:氨基酸＝100L:(10-17)L:(10-20)kg，取免疫球蛋白G活化液170mL，边搅拌边逐渐加入漆酚1330mL，搅拌均匀之后，加入丝氨酸150g,搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、漆酚原液对照组、将改造漆酚高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只。给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑、红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将非过敏漆酚2.5-4.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)。12-24h去除受试物。间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察。注意，胶带反应不计。通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0.4，脱敏率达99.52％。
将脱敏的漆酚与原液作对比，采用预加菌液倾注平板法，往已冷却至50-60℃左右的平板培养基中注入一定量的菌液，混合均匀，倾注平板(约20-25mL/平板)，水平静置凝固后制成含菌平板。将平板用彩笔平均划分为3个区域，在每个区域用已灭菌的钢管在试验平板上打直径为5.5mm的圆形孔，小心挑去培养基小块以做成圆孔，往一个孔中注入120-200μL的漆酚，另一个孔中注入120-200μL的非过敏生漆，最后一个孔做为对照，4-6℃预扩散1-2h，35-37℃培养12-24h，霉菌于培养箱中25-28℃下培养24-48h。取出培养好的试验平板，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小，每种菌做3个平行，选取抑菌圈比较明显的平板测定抑菌圈直径，结果取3次重复实验的平均值。通过验证非过敏漆酚与漆酚原液的抑菌圈大小最大差异不超过0.5-0.3％，证明在对漆酚的消除过敏的同时，保留了漆酚的抑菌活性。
实施例5、免疫球蛋白D+缬氨酸制备非过敏漆酚
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量比配置900mL免疫球蛋白活化基质，28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入72g免疫球蛋白，制成免疫球蛋白D活化液。
在温度为22℃-35℃的环境下，按照漆酚:免疫球蛋白活化液:氨基酸＝100L:(10-17)L:(10-20)kg取免疫球蛋白活化液580mL，边搅拌边逐渐加入漆酚5300mL，搅拌均匀之后，再加入缬蛋白630g，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、漆酚原液对照组、将改造漆酚高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只。给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑、红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将改造漆酚2.5-4.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)。12-24h去除受试物。间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察。注意，胶带反应不计。通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0％，脱敏率达100％。
选择非过敏漆酚4mL用2％的DMSO溶液配成6mL的溶液作为供试品溶液A；漆酚原液4mL用2％的DMSO溶液配成6mL的溶液作为供试品溶液B；利巴韦林50mg用2％的DMSO溶液配成50mg/mL的溶液作为阳性对照药供试品溶液。
将供试品溶液用4％维持液按二倍比稀释10个浓度梯度，依次接种于己经长好细胞的96孔板中，并设4个复孔、细胞对照孔和空白对照孔，置32℃、5％CO2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下观察，细胞出现90％病变时终止培养，按照CCK-8试剂盒的操作(每孔加10μLCCK-8染色，置35℃、5％CO2病毒培养箱中培养3h，用酶标仪在600nm波长测定吸光度OD值)，测定吸光度OD值。应用Reed-Muench公式计算药物半数中毒浓度为，并确定最大无毒浓度TC0。经验证非过敏漆酚对Hep-2(人喉癌细胞)TC50为1.578，TC0为0.824。脱敏对RD(人横纹肌肉瘤细胞)的TC50为0.452，TC0为0.221。细胞毒性远大于利巴韦林，甚至漆酚原液对细胞的毒性小7％，证明在对生漆的消除过敏的同时，保留了漆酚的抗病毒活性。
实施例6、免疫球蛋白E+酪蛋白磷酸肽+蛋氨酸制备非过敏漆酚
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比配置800mL免疫球蛋白活化基质，28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入64g免疫球蛋白E，制成免疫球蛋白活化液。
在温度为22℃-35℃的环境下，按照漆酚:免疫球蛋白活化液:肽类+氨基酸＝100L:(10-17)L:(5-30)kg，取免疫球蛋白活化液850mL，边搅拌边逐渐加入漆酚5500mL，搅拌均匀之后，加入酪蛋白70g，酪蛋白磷酸肽190g,蛋氨酸100g，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
选择SD豚鼠，体重(300±20)g，脱毛面积30mm2脱毛后24h后，选择脱毛合格的豚鼠50只，雌雄各半随机分为白凡士林对照组(基质对照组)、漆酚原液对照组、将改造漆酚高、中、低剂量组给药涂抹剂量依次为0.2g/kg、0.1g/kg、0.05g/kg(分别相当于临床剂量的50倍、25倍和12.5倍)，每组动物10只。给药24h后，除受试物，连续观察12-15d，豚鼠毛发正常,高、中、低剂量组豚鼠皮肤光滑、红润，无瘙痒，无红肿、无溃烂等现象。
选用合格的斑试器，210名作为斑贴试验志愿者，以封闭式斑贴试验方法,将改造漆酚2.5-4.0g涂于斑器内,外用胶带贴敷于受试者背部(女性贴于小臂内侧)。12-24h去除受试物。间隔30分钟作首次观察，并于24、48、72、96、120、144、168小时分别作第2次与后续每天一次的观察。注意，胶带反应不计。通过检验证明在除去受试物0.5-168h之内志愿者的阳性率为0.4，脱敏率达99.52％。
在一定浓度范围内(0.31-10mmol/L)，超氧阴离子自由基清除率与VC浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝8.975x+5.677(决定系数R2为0.9943，校正后决定系数R2Adj为0.9948)。将测得的非过敏漆酚超氧阴离子自由基清除率代入上述线性方程，可得出非过敏漆酚超氧阴离子自由基清除能力为(18.92±2.42)μmol VC/mg，与漆酚原液超氧阴离子自由基清除能力相差±0.01之内，证明在对漆酚消除过敏的同时，保留了漆酚的抗氧化活性。
Trolox浓度在一定范围内(1.5～80μmol/L),与DPPH自由基清除率呈线性关系(决定系数R2为0.9892，校正后决定系数R2Adj为0.9817),回归方程为：y＝0.978x+5.823。根据该方程，非过敏漆酚样品的DPPH自由基清除能力为(0.69±0.08)μmolTrolox/mg，与漆酚原液的DPPH自由基清除能力相差±0.02之内，证明在对漆酚消除过敏的同时，保留了漆酚的抗氧化活性。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (6)

1.一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备免疫球蛋白活化液：
在无菌环境中，按照枸橼酸三钠:枸橼酸:葡萄糖:0.9％生理盐水＝(22.0-25.0)kg:(8.0-10.0)kg:(24.5-27.5)kg:1000L的质量体积比，溶解配置免疫球蛋白活化基质，置于28℃-32℃恒温培养箱活化2-4h，加入免疫球蛋白，制成免疫球蛋白活化液；所述步骤S1中的免疫球蛋白活化液中活化基质：免疫球蛋白的体积质量比为(100-150)L：(5-8)kg；
S2、非过敏生漆或漆酚的制备：
室温条件下，取免疫球蛋白活化液，按照生漆或漆酚:免疫球蛋白活化液＝100L:(10-17)L的体积比，边搅拌边缓慢将免疫球蛋白活化液加入到生漆或漆酚中，搅拌均匀之后，再按照生漆或漆酚：可食蛋白质/肽类/氨基酸/可食蛋白质+肽类+氨基酸＝100L:(20-30)kg/(5-10)kg/(10-20)kg/(5-30)kg体积质量比，分别加入可食蛋白质或肽类或氨基酸、或可食蛋白质、肽类和氨基酸的混合物，搅拌至溶液呈均匀凝胶状。
2.根据权利要求1所述的一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，其特征在于，所述步骤S1中的免疫球蛋白是免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)其中一种。
3.根据权利要求1所述的一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中的免疫球蛋白和可食蛋白、肽类和氨基酸是市售或自制的。
4.根据权利要求1所述的一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，其特征在于，所述步骤S2中的可食蛋白是蛋清、奶类、谷物类、畜蛋白其中一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，其特征在于，所述步骤S2中的肽类是乳肽、谷物肽、卵白肽、畜产肽、水产肽、丝蛋白肽、复合肽、谷胱甘肽中一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的一种生物化学法制备非过敏生漆或漆酚的方法，其特征在于，所述步骤S2中的氨基酸是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)中一种或几种的任意组合。
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