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CN110794074A - 当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法 - Google Patents

当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法 Download PDF

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CN110794074A
CN110794074A CN201911128114.3A CN201911128114A CN110794074A CN 110794074 A CN110794074 A CN 110794074A CN 201911128114 A CN201911128114 A CN 201911128114A CN 110794074 A CN110794074 A CN 110794074A
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urine
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苏志恒
黄慧敏
吴金霞
郑华
程邦
宋慧
郭宏伟
梁永红
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Guangxi Medical University
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Guangxi Medical University
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Abstract

本发明公开了当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，包括：采用超高效液相色谱串联质谱检测分析冰水浴加肾上腺素诱导雌性大鼠形成寒凝血瘀证及当归四逆汤干预后的不同时间点变化的内源性代谢产物，获得指纹图谱；利用多元变量统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出21个显著发生变化的代谢物；通过metaboanalyst开源在线代谢组学分析网站，富集出与寒凝血瘀证不同发展时期相关的八条代谢通路。本发明利用动态分析的方法研究寒凝血瘀证发生发展过程及当归四逆汤治疗过程中相关的代谢变化，有助于揭示在不同时间点的疾病发生发展机制，以及阐明治疗过程中药物所调控的异常代谢网络。

Description

当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法
技术领域
本发明涉及医药分析技术领域。更具体地说，本发明涉及当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法。
背景技术
代谢组学(metabonomics)有着“整体-动态-综合”的特点，这与复杂疾病的发病过程和中药的起效特点是具有一致性的。代谢组学是近年来发展起来的对生物系统动态代谢物变化进行定性和定量分析的新技术，常用于研究内源性小分子代谢物对外界刺激(包括环境、生理和病理刺激)的所产生的变化。代谢组学研究流程通常包括生物样本采集、预处理、样品分析、数据处理、标志物的鉴定及生物学意义阐释等过程。其技术主要包括核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱(GS/MS)联用技术、液相色谱-质谱(LC/MS)联用技术等。近年来，高通量代谢组学分析常被用于描述生物样本的代谢轮廓。由于超高效液相-四极杆飞行质谱(UPLC-Q-TOF/MS)可以快速的采集大量精确质量数信息，且有着高分辨率，高灵敏度的特点，该技术已广泛用于生物体内代谢变化的动态分析和药物治疗的机制研究。结合多元统计分析，可以将治疗组、疾病模型组和空白组的代谢轮廓可视化，分析代谢轮廓的变化以及辨识组间显著差异的内源性代谢物。
寒凝血瘀证(BSS)定义是指不良的血液循环、流向身体的血液减少或血液粘稠，是中医中一种常见的慢性、综合性疾病，它是许多重症及不可愈疾病的病理基础，例如冠心病、不孕症和癌症。因此，寻找能够找到BSS发生发展过程中的标记性代谢物及阐明有着确切疗效的药物的作用机制对BSS的早期诊断及治疗有着重要意义，同时，对于提高我国人民健康水平具有非常重要的意义和紧迫性。长久以来，医药研究者一直致力于寒凝血瘀证发病机制及治疗药物的研究。BSS的发病机制复杂，是一个涉及多环节、多因素、多网络的动态过程。若疾病不能及时干预，则会发展到更严重的疾病。因此对BSS的发病机制的研究会有利于疾病的早期干预。然而，BSS在整个发生发展的过程中的发病机制目前还未得到阐明。
在中医药研究中，中药对BSS的治疗引起了广泛关注。在治疗复杂疾病方面，中药具有独特的优势。近年来，中医以其独特的理论体系和悠久历史的临床实践，在世界范围内得到广泛应用。当归四逆汤(DSD)是经典的中药方剂，广泛用于治疗寒凝血瘀证等疾病。研究表明，它具有显著促进血液循环的作用。它主要由以下七个中药组成:当归，桂枝，白芍，细辛，通草，甘草和大枣。由于BSS的发展是一个缓慢而动态过程，目前对DSD在BSS发展过程中的干预机制还未被研究。
发明内容
本发明的目的是提供当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，利用动态分析的方法研究BSS发生发展过程及DSD治疗过程中相关的代谢变化，有助于揭示在不同时间点的疾病的发生发展机制，以及阐明治疗过程中药物所调控的异常代谢网络。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，包括：
采用超高效液相色谱串联质谱检测分析冰水浴加肾上腺素诱导雌性大鼠形成寒凝血瘀证及当归四逆汤干预后的不同时间点变化的内源性代谢产物，获得指纹图谱；
利用多元变量统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出二十一个显著发生变化的代谢物，作为与寒凝血瘀证发生发展潜在相关差异代谢物；
通过metaboanalyst开源在线代谢组学分析网站，富集出与寒凝血瘀证不同发展时期相关的八条代谢通路。
优选的是，所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法中，获得当归四逆汤抗寒凝血瘀证的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)当归四逆汤的制备
将当归12g、桂枝9g、白芍9g、细辛3g、通草6g、炙甘草6g、大枣12g置于1000mL圆底烧瓶中，先用重量为上述组分重量8倍的蒸馏水浸泡1h，接着在常压、100℃下进行加热回流提取2h，收集第一次提取液，保留滤渣；
向1000mL圆底烧瓶中加入重量为上述组分重量6倍的水，将滤渣继续加热回流提取2h，收集第二次提取液；
合并第一次提取液和第二次提取液，并用200目纱布过滤；
将过滤后的滤液置于真空旋转蒸发仪中，于60℃条件下进行浓缩至最终浓缩液浓度为2.0g/mL，即得当归四逆汤；
(2)动物模型的确定
将24只雌性大鼠适应性喂养一周后，按照随机数字法随机分为空白组、模型组、DSD治疗组，每组8只，将模型组和DSD治疗组的大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳，当大鼠出现反应迟钝、呼吸微弱、腿部僵直欲溺水时取出，每天刺激一次，持续刺激14天；根据平行对照原则，空白组大鼠则被置于35-37℃水浴中游泳5-10min，每日游泳1次，连续游泳14天；当实验进行至第10天时，在模型组和DSD治疗组的大鼠皮下注射盐酸肾上腺素两次，间隔为4小时，剂量为0.8mg/kg；在第一次注射结束后2h，将模型组和DSD治疗组大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳5min，空白组大鼠则被置于35-37℃水浴中游泳5min；
本研究的给药方法为：在建模期间DSD治疗组每天灌胃当归四逆汤，剂量为1.8mg/g，空白组和模型组则平行给与等剂量的蒸馏水灌胃，每天一次，持续14天；
(3)大鼠尿液的采集、保存和前处理
在动物造模期间的第0，5，10，14天，收集每组大鼠晚上20：00到早晨8：00这一时间段的尿液样本，并分别用5mL离心管采集尿液样本后，将各根离心管埋于冰盒中，使各个尿液样本均处于0-4℃；
从每个样本中取出等量的600μL尿液样本后，向每个尿液样本中加入质量浓度为0.1％的叠氮化钠，之后将各根离心管在-80℃下冻存；
在室温解冻各个尿液样本，并将各个尿液样本用600μL的去离子水进行稀释，接着将各个尿液样本离心去沉淀，再将各个尿液样本通过0.22微米聚偏二氟乙烯滤膜过滤后，分别装入进样小瓶，之后从每个样本中取10μL尿液样本混合在1个新的离心管中制成质量控制QC样本；
(4)尿液样本的超高效液相色谱串联质谱检测分析
(5)数据预处理
采用Masslynx软件对采集到的超高效液相色谱和质谱检测数据进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化处理，得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间；
(6)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异和动态变化
将预处理后的数据导入SIMCA-P14.1软件，将数据采用Par缩放方法进行预处理，之后对空白组、模型组、QC样本进行主成分分析，对不同时间点收集的空白组，模型组和DSD治疗组尿液样本进行PCA轨迹分析，对空白组，模型组以及DSD治疗组进行偏最小二乘法判别分析；
(7)筛选潜在生物标志物
以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析模型，对两组间的差异代谢物进行筛选，采用SPSS 16.0软件进行统计学处理；差异代谢物的筛选条件为：选择变量重要性投影值>1，且差异在两组间具有统计学意义；
(8)潜在生物标志物的鉴定
根据变量所对应的精确质量数和二级特征碎片，通过检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN对潜在生物标志物进行鉴定，并与有描述代谢物鉴定质谱信息的文献进行比较，最终共鉴定二十一个与BSS发生发展相关的差异代谢产物：1-甲基烟酰胺、肌酐、N-甲基组氨酸、酪胺葡萄糖醛酸、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、3-羟氨苯甲酸、亮氨酸-脯氨酸、2-苯乙酰胺、吲哚啉、2-甲基-1,2,3,4-四氢-6,7-异喹啉二醇、黄尿酸、3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸酯、马尿酸、核黄素、苯乙酰甘氨酸、5-甲氧吲哚乙酸酯、皮质酮、别胆酸、四氢皮质酮；
(9)代谢通路富集分析
将鉴定出的二十一个差异代谢产物上传到metaboanalyst开源在线代谢组学分析网站，录入不同天数尿液代谢物名称，将代谢产物名字标准化后，选择大鼠物种的KEGG数据库，进行相关通路的富集；对BSS大鼠不同时期尿液中显著受影响的代谢通路进行富集分析和拓扑分析，共富集得到八条代谢通路：烟酸和烟酰胺代谢通路、淀粉和蔗糖代谢通路、组氨酸代谢通路、戊糖和葡萄糖醛酸代谢通路、色氨酸代谢通路、苯丙氨酸代谢通路、核黄素代谢通路和类固醇激素生物合成代谢通路。
优选的是，所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法中，超高效液相色谱检测采用Waters公司超高效液相系统进行检测，HSS T3色谱柱，规格为100mm×2.1mm，固定相粒径1.8μm，实验柱温设置为25℃，流动相A水，B为含色谱甲酸的乙腈，其中，色谱甲酸的体积分数为0.1％，流动相流速0.4mL·min-1，梯度洗脱程序为：1％B,0-0.5min；1-10％B,0.5-7min；10-50％B,7-15min；50-100％B,15-17min,100％B,17-19min；100-1％B,19-20min；自动进样室温度设为4℃，进样量为10μL。
优选的是，所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法中，质谱检测采用Waters公司四极杆-飞行时间质谱仪进行检测，采集质谱质量数范围为100-1000Da，所有数据在电喷雾离子ESI源正离子模式下进行采集，其中，毛细管电压4.0kV，椎孔电压35kV，提取电压4.0kV；离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量40L·h-1，脱溶剂流量800L·h-1，Centriod模式进行数据采集，采用Waters公司的LockSprayTM系统进行实时校正，以亮氨酸-脑啡肽为质量参比成分，参比液的流速为20μL/min，在序列中每分析8个尿液样本，进样一次QC样本。
优选的是，所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法中，数据预处理的主要的处理参数如下：保留时间范围0-20min；质量数范围100-1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6，数据经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。
优选的是，所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法中，将各个尿液样本离心去沉淀时先以3500转/min的转速低速离心10分钟，接着以12000转/min的转速高速离心10分钟。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对各组大鼠不同时间点尿液样品内代谢产物进行动态分析，发现了BSS发生发展相关的差异代谢物。
本发明通过动态尿液分析技术发现BSS的生物标志物的含量变化，对差异尿液代谢物进行代谢通路分析，得到了BSS发生发展中所扰动的代谢通路。
本发明通过分析发现DSD干预BSS的标志物的含量变化，确定了DSD能够在不同时期起效时所调控的代谢物。
本发明通过ROC分析，发现了有较高诊断价值的BSS差异代谢物。
本发明从整体水平高效、快速、全面综合地揭示了BSS发生发展机制及DSD的作用机制，为传统中药方剂有效成分的尿液代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1是基于超高效液相色谱-串联质谱正离子模式下采集的模型组大鼠在第0天的尿液代谢指纹图谱；
图2是基于超高效液相色谱-串联质谱正离子模式下采集的模型组大鼠在第5天的尿液代谢指纹图谱；
图3是基于超高效液相色谱-串联质谱正离子模式下采集的模型组大鼠在第10天的尿液代谢指纹图谱；
图4是基于超高效液相色谱-串联质谱正离子模式下采集的模型组大鼠在第14天的尿液代谢指纹图谱；
图5为第0天(图5中用(A)表示)，5天(图5中用(B)表示)，10天(图5中用(C)表示)，14天(图5中用(D)表示)的三维PCA图；图5中C为空白组，M为模型组，QC为质量控制样本；
图6为不同天数大鼠尿液的PCA轨迹分析图；图6中C为空白组，M为模型组，DSD为DSD治疗组；
图7为第5，10，14天的大鼠尿液PLS-DA图；图7中C为空白组，M为模型组，Q为DSD治疗组；
图8为第5，10，14天大鼠尿液OPLS-DA模型的S-plot图；
图9为metaboanalyst平台在线构建的代谢通路富集图；
图10是代谢通路总结图；图10中虚线加粗圆框中的代谢物为下差异代谢物；图10中箭头向上表示代谢物在模型组相对于正常组是上调趋势；向下则反之；与正常组相比，P*<0.05，P**<0.01。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
一种基于动态尿液代谢组学的当归四逆汤治疗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，采用基于超高效液相色谱-串联质谱技术检测分析冰水浴+肾上腺素诱导雌性大鼠形成寒凝血瘀证及当归四逆汤干预后的不同时间点变化的内源性代谢产物，获得指纹图谱。
利用多元统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出21个显著发生变化的代谢物，作为与寒凝血瘀证发生发展潜在相关差异代谢物。
通过metaboanalyst开源在线代谢组学分析网站，富集出与寒凝血瘀证不同发展时期相关的8条代谢通路。
本研究初步探讨了差异代谢物对寒凝血瘀证的诊断价值。经过受试者特征曲线(ROC)分析，有10个代谢物的曲线下面积(AUC)>0.9,其作为寒凝血瘀证的诊断指标具有较高的诊断价值。
获得当归四逆汤抗寒凝血瘀证的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)当归四逆汤的制备
将当归12g、桂枝9g、白芍9g、细辛3g、通草6g、炙甘草6g、大枣12g置于1000mL圆底烧瓶中，先用重量为上述组分重量8倍的蒸馏水浸泡1h，接着在常压、100℃下进行加热回流提取2h，收集第一次提取液，保留滤渣；
向1000mL圆底烧瓶中加入重量为上述组分重量6倍的水，将滤渣继续加热回流提取2h，收集第二次提取液；
合并第一次提取液和第二次提取液，并用200目纱布过滤；
将过滤后的滤液置于真空旋转蒸发仪中，于60℃条件下进行浓缩至最终浓缩液浓度为2.0g/mL，即得当归四逆汤；
(2)动物模型的确定
为了研究寒凝血瘀证对大鼠代谢的影响，本研究设置了空白对照组和寒凝血瘀证模型组，即空白组和模型组。同时，为了研究当归四逆汤对寒凝血瘀证的干预作用，本研究中给寒凝血瘀证大鼠灌胃当归四逆汤，设置了当归四逆汤组，即DSD治疗组；
将24只雌性大鼠适应性喂养一周后，按照随机数字法随机分为空白组、模型组、DSD治疗组，每组8只，将模型组和DSD治疗组的大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳，当大鼠出现反应迟钝、呼吸微弱、腿部僵直欲溺水时取出，每天刺激一次，持续刺激14天；根据平行对照原则，空白组大鼠则被置于35-37℃水浴中游泳5-10min，每日游泳1次，连续游泳14天；当实验进行至第10天时，在模型组和DSD治疗组的大鼠皮下注射盐酸肾上腺素两次，间隔为4小时，剂量为0.8mg/kg；在第一次注射结束后2h，将模型组和DSD治疗组大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳5min，空白组大鼠则被置于35-37℃水浴中游泳5min；本研究的给药方法为：在建模期间DSD治疗组每天灌胃当归四逆汤，剂量为1.8mg/g，空白组和模型组则平行给与等剂量的蒸馏水灌胃，每天一次，持续14天；
(3)大鼠尿液的采集、保存和前处理
所需尿液样品的采集：在动物造模期间的第0，5，10，14天，收集大鼠晚上20：00到早晨8：00这一时间段的尿液样本。并分别用5mL离心管采集尿液样本。将离心管埋于冰盒中，各个尿液样本均处于低温条件下(0-4℃)。
尿液样品的预处理和保存：从每个样本中取出等量的600μL尿液样本，向每个尿液样本中加入质量浓度为0.1％的叠氮化钠作为防腐剂。将各根离心管冻存于-80℃冰箱中。
在液质联用分析前对尿液进行前处理：在室温解冻各个尿液样本，并将各个尿液样本用等体积(600μL)的去离子水进行稀释。接着将各个尿液样本离心去沉淀，先低速离心(转速3500转/min，离心10分钟)，接着高速离心(转速12000转/min，离心10分钟)。再将各个尿液样本通过0.22微米聚偏二氟乙烯滤膜过滤，装入进样小瓶即可。从每个尿液样本中取10μL尿液样本混合在1个新的离心管中制成质量控制(QC)样本，用于后续液质联用分析中检验方法的稳健性和重复性。
(4)尿液样本的液质联用分析
对不同时间采集的各组大鼠尿液样品进行方法考察，建立超高效液相色谱-串联质谱技术检测分析大鼠动态尿液样品指纹图谱分析方法，对尿液样本依次进行超高效液相色谱-质谱分析；
超高效液相色谱分析条件：采用Waters公司超高效液相(ACQUITY UPLC)系统进行检测，HSS T3色谱柱(规格为100mm×2.1mm，固定相粒径1.8μm)，实验柱温设置为25℃，流动相A水，B为乙腈(含体积分数为0.1％的色谱甲酸)，流动相流速0.4mL·min-1，梯度洗脱程序为：1％B,0-0.5min；1-10％B,0.5-7min；10-50％B,7-15min；50-100％B,15-17min,100％B,17-19min；100-1％B,19-20min。自动进样室温度设为4℃，进样量为10μL；
质谱条件：采用Waters公司四极杆-飞行时间质谱仪(Xevo G2-S Q-TOF)进行检测，采集质谱质量数范围为100-1000Da。所有数据在电喷雾离子(ESI)源正离子模式下进行采集，其中，毛细管电压4.0kV，椎孔电压35kV，提取电压4.0kV；离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量40L·h-1，脱溶剂流量800L·h-1。Centriod模式进行数据采集，采用Waters公司的LockSprayTM系统进行实时校正，以亮氨酸-脑啡肽为质量参比成分(m/z556.2771[M+H]+),参比液的流速为20μL/min。质量控制样本贯穿于整个测试序列中。在序列中每分析8个尿液样本，进样一次QC样本。
结果如图1-4所示，图中展示了模型组大鼠在第0，5，10，14天的超高效液相色谱图，可以从图中看到大鼠尿液中的代谢物在不同天数下色谱行为发生了变化。
(5)数据预处理
采用Waters公司的Masslynx软件对采集到的超高效液相色谱和质谱检测数据进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化等处理，得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间等数据；主要的处理参数如下：保留时间范围0-20min；质量数范围100-1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6。数据经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。归一化方式采用总离子强度归一化的方法。
(6)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异和动态变化
将预处理后的数据导入SIMCA-P14.1软件。首先对空白组、模型组、QC样本进行主成分分析。进行分析前，将数据采用Par缩放方法进行预处理。主成分分析作为一种无监督式学习方法，可以真实反映样本的聚类情况。如图5所示，模型组与空白组分离良好，无交叉和重叠，说明两组代谢模式存在明显的差异，且QC样本聚集较紧密，说明在数据采集过程中的仪器状态是良好的，保证了数据的可靠性。
为了进行疾病下尿液代谢轮廓的动态分析及DSD疗效的初步探究，将不同时间点(第0，5，10，14天)的空白组，模型组和DSD治疗组尿液样本进行PCA轨迹分析。如图6所示，在PCA轨迹图中，空白组，模型组和DSD治疗组在第0天时的代谢轮廓是重叠的，说明在实验的起始点，各组的代谢轮廓无明显的差异。随着疾病的发生发展，轮廓图中显示空白组与模型组第5，10，14天的代谢轮廓是逐渐远离的，说明了疾病对大鼠尿液的代谢轮廓有着显著影响。在此过程中，DSD对模型组大鼠的干预作用也逐渐显著：从第0至第10天，DSD还没有显著的影响到BSS大鼠的代谢轮廓，但是当DSD干预持续到第14天时，DSD治疗组与模型组大鼠的代谢轮廓发生了显著的区分，说明此时DSD对BSS产生了显著的干预作用，使模型组大鼠的代谢轮廓发生了变化。主成分分析PCA得分图中的每一个点代表每只实验大鼠的尿液代谢轮廓。
为了进一步的确证DSD对BSS大鼠的干预效果，将空白组，模型组以及DSD治疗组进行偏最小二乘法判别分析，如图7所示，所建立的PLS-DA模型拟合能力指数分别为:第5天,R2X＝0.568,R2Y＝0.907,Q2＝0.73；第10天,R2X＝0.588,R2Y＝0.984,Q2＝0.96；第14天,R2X＝0.522,R2Y＝0.96,Q2＝0.751；R2X和R2Y分别表示PLS-DA分类模型所能够解释X和Y矩阵信息的百分比,Q2则为通过交叉验证计算得出，用以评价PLS-DA模型的预测能力，Q2越大代表模型预测效果较好；结果表明，在第5，10，14天的时间点，空白组和模型组均分离良好，且DSD治疗组介于与空白组和模型组之间，提示DSD干预后BSS大鼠尿液代谢模式发生改变，表明DSD对BSS大鼠尿液代谢紊乱有一定的干预作用。PLS-DA得分图中的每一个点代表每只实验大鼠的尿液代谢轮廓。
(7)筛选潜在生物标志物
如图8所示，为了筛选在BSS发生发展过程中有显著变化的差异代谢物，以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)模型，对两组间的差异代谢物进行筛选。采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。差异代谢物的筛选条件为：选择变量重要性投影(VIP)值>1，且差异在两组间具有统计学意义(T-test P value<0.05)。符合以上条件的变量将作为BSS的潜在生物标志物。变量对分类的重要程度由VIP值的大小来权衡，本研究中依据其对变量进行筛选。
(8)潜在生物标志物的鉴定
根据变量所对映的精确质量数和二级特征碎片，通过检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN对潜在生物标志物进行鉴定，并与有描述代谢物鉴定质谱信息的文献进行比较，最终共鉴定出二十一个与BSS发生发展相关的差异代谢产物：1-甲基烟酰胺、肌酐、N-甲基组氨酸、酪胺葡萄糖醛酸、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、3-羟氨苯甲酸、亮氨酸-脯氨酸、2-苯乙酰胺、吲哚啉、2-甲基-1,2,3,4-四氢-6,7-异喹啉二醇、黄尿酸、3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸酯、马尿酸、核黄素、苯乙酰甘氨酸、5-甲氧吲哚乙酸酯、皮质酮、别胆酸、四氢皮质酮。
与空白组相比，模型组在第5天有8个代谢物1-甲基鸟嘌呤、3-羟氨苯甲酸(3-HAA)、吲哚啉、黄尿酸、苯乙酰甘氨酸、四氢皮质酮、2种未知代谢物(m/z值分别为182.1181和425.2169)含量下降；同时，马尿酸和5-甲氧基吲哚乙酸的含量增加。
模型组在第10天，代谢物的数量表现出显著降低的有12个，具体为：1-甲基烟酰胺、肌酐、N-甲基组氨酸、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、3-HAA、吲哚啉、黄尿酸、核黄素、皮质酮、四氢皮质酮、m/z值分别为182.1181和425.2169的两个未知代谢物)。与此相反，在第10天，酪胺葡萄糖醛酸、亮氨酸-脯氨酸、2-苯乙酰胺、2-甲基-1,2,3,4-四氢-6,7-异喹啉二醇、3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸和马尿酸含量增加。
模型组在第14天，2-甲基-1,2,3,4-四氢-6,7-异喹啉二醇，3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸酯，5-甲氧吲哚乙酸酯和别胆酸的含量降低。通过分析DSD治疗组中差异代谢物所对应的含量，发现4种代谢物相对于模型组来说能被DSD所显著回调，且作用在不同的时期，具体为：5-甲氧吲哚乙酸酯、吲哚啉在第5天被DSD所回调；3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸在第10被DSD所回调；2-甲基-1,2,3,4-四氢-6,7-异喹啉二醇在第10、14天被DSD所回调。不同时期空白组、模型组和DSD治疗组大鼠尿液差异代谢产物和含量变化趋势，如表1所示。
表1不同时期空白组、模型组和DSD治疗组大鼠尿液差异代谢产物和含量变化趋势
Figure BDA0002277491310000111
(M/C表示模型和正常组相比:#P<0.05,##P<0.01.Q/M表示DSD治疗组和模型组相比:*P<0.05,**P<0.01)
(9)代谢通路富集分析：将筛选鉴定出的差异代谢产物上传到metaboanalyst代谢组学在线分析网页，录入不同天数尿液代谢物名称，将代谢物名字标准化后，选择大鼠物种的KEGG数据库，进行相关通路的富集。如图9所示，对BSS大鼠不同时期尿液中显著受影响的代谢通路进行富集分析和拓扑分析，共富集得到8条代谢通路，基于此构建分析代谢通路图；通过代谢通路分析后所得影响值，即Impact值，当Impact>0.1时，该条代谢通路在代谢网络中具有重要影响。因此依据代谢通路的通路重要值确定烟酸和烟酰胺代谢(Impact值为0.125)和戊糖、葡萄糖醛酸转换的相互转化(Impact值为0.273)是BSS发生发展的最相关的两条重要代谢通路。如图10所示，将代谢物所涉及到的通路进行总结，绘制了代谢通路总结图。图中可以看出通路与代谢物之间的关系以及通路与通路之间的动态影响。
①尿液动态分析方法可以揭示疾病发展及药物调控的整个过程，有助于疾病和治疗机制的深入研究。在第5、10和14天，对比模型组和空白组之间代谢物的含量差异，最终共有21个代谢物被鉴定为生物标志物。它们参与烟酸和烟酰胺代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、核黄素代谢和类固醇激素生物合成。此外，BSS还会引起嘌呤类物质、吲哚类物质和二氢喹啉类物质的代谢功能障碍。
②色氨酸在哺乳动物蛋白质生物合成中起着不可或缺的作用，它主要由两种途径代谢。首先，色氨酸分解代谢的主要途径是犬尿氨酸代谢，它是许多重要生物活性代谢物(如拮抗剂犬尿酸、神经活性犬尿氨酸、锌结合化合物吡啶甲酸)产生的关键步骤。代谢物黄尿酸是甲基转移酶的底物，是具有光化学活性的一种代谢物。代谢产物3-HAA是色氨酸经过一系列酶促反应后产生的关键代谢中间体。在我们的研究中，与空白组大鼠相比，模型组大鼠在第5天和第10天中黄尿酸和3-HAA含量降低。3-HAA的减少直接影响3-HAA向羟基喹啉酮的转化，而羟基喹啉酮是连接色氨酸代谢和烟酸、烟酰胺代谢的关键枢纽。其次，色氨酸是合成血清素必不可少的前体。血清素是一种神经递质，在情绪、压力反应等方面起着重要作用。在尿样中，血清素的下游产物5-甲氧基吲哚乙酸在模型组中第5天升高，而在第14天降低。这表明，血清素的代谢可能会随着病情的进展而改变，5-甲氧吲哚乙酸可能受到短期刺激的影响，在第5天出现了明显的升高趋势，这可能是因为它参与了寒冷环境下正常生理调节过程中血管的收缩。然而，在第14天，血清素因疾病而减少，此时身体的调节功能受损，导致5-甲氧基吲哚乙酸减少。
③烟酸和烟酰胺代谢是生物体内重要的代谢途径。烟酰胺是烟酸的一种酰胺化形式，具有抗氧化应激和抗炎作用。参与细胞能量代谢，有效保护细胞膜免受自由基损伤，防止炎症细胞的活化。烟酰胺在烟酰胺N-甲基转移酶(EC:2.1.1.1)的作用下转化为1-甲基烟酰胺，在醛氧化酶(EC:1.2.3.1)的作用下代谢为1-甲基-4-吡啶-5-羧酰胺。结果显示，与空白组相比，模型组第10天的1-甲基烟酰胺明显减少。这可能导致BSS病理状态下体内烟酸和烟酰胺代谢异常。
④糖酵解或糖异生在人体中起着至关重要的作用，糖异生提供了葡萄糖分子的来源。葡萄糖醛酸与体内葡萄糖代谢密切相关。在葡萄糖醛酸转移酶(EC:2.4.1.17)的作用下，葡萄糖醛酸可转化为亲水性强的葡萄糖醛酸苷，更容易被机体排出。已有报道BSS的发病机制涉及淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、半乳糖代谢等葡萄糖代谢途径紊乱。在我们的研究中，当BSS发生时，模型组在第10天尿酪胺葡糖苷显著上调，提示可能发生糖代谢紊乱和异常凝血。DSD处理后，DSD治疗组的糖代谢与模型组有显著性差异，说明DSD对BSS大鼠的作用可能与调节糖代谢有关。
⑤苯丙氨酸可被作为一种氨基酸合成多种细胞蛋白。它主要转化为酪氨酸，用于合成某些激素和神经递质，如多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素。因此，稳定的苯丙氨酸代谢是维持正常生长发育和生理功能的关键因素。研究表明，苯乙酰甘氨酸不仅与异常的磷脂代谢密切相关，还与肠道微生物群代谢密切相关。酪氨酸羟化酶和多巴胺羟化酶的高表达增加了儿茶素胺的生成，而肾上腺素和去甲肾上腺素合成的增加导致血管收缩，血管收缩进一步增加血液粘度，从而导致血瘀的形成。本研究中，苯丙氨酸代谢通路在BSS大鼠中被破坏；苯乙酰甘氨酸在第5天下降，而2-苯乙酰胺在第10天异常升高。这表明苯丙氨酸水平在疾病开始时下降，然后随着疾病的不断进展而变成增加趋势。这一结果与之前的研究结果一致，即苯丙氨酸在BSS中有增加的趋势。
⑥类固醇生产的一般过程包括从胆固醇到黄体酮的一个途径。类固醇发生的急性调节蛋白(StAR)是一种与胆固醇结合的蛋白，可促进胆固醇从线粒体外膜向线粒体内膜外排。在细胞中，花生四烯酸是类固醇形成和星形表达所必需的。当花生四烯酸的合成被阻断时，类固醇的合成就会受到影响。根据既往研究表明，BSS发生时，血清花生四烯酸和皮质酮前体21-脱氧皮质醇降低，进而导致甾体合成途径相关代谢物减少。本研究中，与空白组相比，模型组第10天皮质酮下降。同样，在第5、10和14天，四氢皮质酮显著下降。模型组持续下降的类固醇水平提示BSS可能在整个疾病发展过程中持续影响类固醇代谢。
(10)受试者特征曲线(ROC)分析：将所鉴定到的21种代谢物的原始数据导入到SPSS16.0软件中进行ROC分析，得到一系列ROC曲线下面积(AUC)，其中发现有10种代谢物的AUC>0.9，说明这10个代谢物作为寒凝血瘀证的诊断指标具有较高的诊断价值。各代谢物的ROC结果表2所示。
表2各代谢物的ROC结果
Figure BDA0002277491310000141
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于，包括：
采用超高效液相色谱串联质谱检测分析冰水浴加肾上腺素诱导雌性大鼠形成寒凝血瘀证及当归四逆汤干预后的不同时间点变化的内源性代谢产物，获得指纹图谱；
利用多元变量统计分析方法，从多个变量中筛选并鉴定出二十一个显著发生变化的代谢物，作为与寒凝血瘀证发生发展潜在相关差异代谢物；
通过metaboanalyst开源在线代谢组学分析网站，富集出与寒凝血瘀证不同发展时期相关的八条代谢通路。
2.如权利要求1所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于，获得当归四逆汤抗寒凝血瘀证的差异代谢物代谢通路的具体步骤如下：
(1)当归四逆汤的制备
将当归12g、桂枝9g、白芍9g、细辛3g、通草6g、炙甘草6g、大枣12g置于1000mL圆底烧瓶中，先用重量为上述组分重量8倍的蒸馏水浸泡1h，接着在常压、100℃下进行加热回流提取2h，收集第一次提取液，保留滤渣；
向1000mL圆底烧瓶中加入重量为上述组分重量6倍的水，将滤渣继续加热回流提取2h，收集第二次提取液；
合并第一次提取液和第二次提取液，并用200目纱布过滤；
将过滤后的滤液置于真空旋转蒸发仪中，于60℃条件下进行浓缩至最终浓缩液浓度为2.0g/mL，即得当归四逆汤；
(2)动物模型的确定
将24只雌性大鼠适应性喂养一周后，按照随机数字法随机分为空白组、模型组、DSD治疗组，每组8只，将模型组和DSD治疗组的大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳，当大鼠出现反应迟钝、呼吸微弱、腿部僵直欲溺水时取出，每天刺激一次，持续刺激14天；根据平行对照原则，空白组大鼠则被置于35-37℃水浴中游泳5-10min，每日游泳1次，连续游泳14天；当实验进行至第10天时，在模型组和DSD治疗组的大鼠皮下注射盐酸肾上腺素两次，间隔为4小时，剂量为0.8mg/kg；在第一次注射结束后2h，将模型组和DSD治疗组大鼠置于0-2℃冷水浴中游泳5min，空白组大鼠则被置于35-37℃水浴中游泳5min；
本研究的给药方法为：在建模期间DSD治疗组每天灌胃当归四逆汤，剂量为1.8mg/g，空白组和模型组则平行给与等剂量的蒸馏水灌胃，每天一次，持续14天；
(3)大鼠尿液的采集、保存和前处理
在动物造模期间的第0，5，10，14天，收集每组大鼠晚上20：00到早晨8：00这一时间段的尿液样本，并分别用5mL离心管采集尿液样本后，将各根离心管埋于冰盒中，使各个尿液样本均处于0-4℃；
从每个尿液样本中取出等量的600μL尿液样本后，向每个尿液样本中加入质量浓度为0.1％的叠氮化钠，之后将各根离心管在-80℃下冻存；
在室温解冻各个尿液样本，并将各个尿液样本用600μL的去离子水进行稀释，接着将各个尿液样本离心去沉淀，再将各个尿液样本通过0.22微米聚偏二氟乙烯滤膜过滤后，分别装入进样小瓶，之后从每个样本中取10μL尿液样本混合在1个新的离心管中制成质量控制QC样本；
(4)尿液样本的超高效液相色谱串联质谱检测分析
(5)数据预处理
采用Masslynx软件对采集到的超高效液相色谱和质谱检测数据进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐及归一化处理，得到各个峰的峰高或者峰面积及保留时间；
(6)利用多元变量统计分析代谢轮廓差异和动态变化
将预处理后的数据导入SIMCA-P14.1软件，将数据采用Par缩放方法进行预处理，之后对空白组、模型组、QC样本进行主成分分析，对不同时间点收集的空白组，模型组和DSD治疗组尿液样本进行PCA轨迹分析，对空白组，模型组以及DSD治疗组进行偏最小二乘法判别分析；
(7)筛选潜在生物标志物
以空白组和模型组预处理后的超高效液相色谱和质谱检测数据建立正交偏最小二乘法分析模型，对两组间的差异代谢物进行筛选，采用SPSS 16.0软件进行统计学处理；差异代谢物的筛选条件为：选择变量重要性投影值>1，且差异在两组间具有统计学意义；
(8)潜在生物标志物的鉴定
根据变量所对应的精确质量数和二级特征碎片，通过检索公共数据库KEGG、HMDB和METLIN对潜在生物标志物进行鉴定，并与有描述代谢物鉴定质谱信息的文献进行比较，最终共鉴定二十一个与BSS发生发展相关的差异代谢产物：1-甲基烟酰胺、肌酐、N-甲基组氨酸、酪胺葡萄糖醛酸、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、3-羟氨苯甲酸、亮氨酸-脯氨酸、2-苯乙酰胺、吲哚啉、2-甲基-1,2,3,4-四氢-6,7-异喹啉二醇、黄尿酸、3-吲哚羧酸葡萄糖醛酸酯、马尿酸、核黄素、苯乙酰甘氨酸、5-甲氧吲哚乙酸酯、皮质酮、别胆酸、四氢皮质酮；
(9)代谢通路富集分析
将鉴定出的二十一个差异代谢产物上传到metaboanalyst开源在线代谢组学分析网站，录入不同天数尿液代谢物名称，将代谢产物名字标准化后，选择大鼠物种的KEGG数据库，进行相关通路的富集；对BSS大鼠不同时期尿液中显著受影响的代谢通路进行富集分析和拓扑分析，共富集得到八条代谢通路：烟酸和烟酰胺代谢通路、淀粉和蔗糖代谢通路、组氨酸代谢通路、戊糖和葡萄糖醛酸代谢通路、色氨酸代谢通路、苯丙氨酸代谢通路、核黄素代谢通路和类固醇激素生物合成代谢通路。
3.如权利要求2所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于，超高效液相色谱检测采用Waters公司超高效液相系统进行检测，HSS T3色谱柱，规格为100mm×2.1mm，固定相粒径1.8μm，实验柱温设置为25℃，流动相A水，B为含色谱甲酸的乙腈，其中，色谱甲酸的体积分数为0.1％，流动相流速0.4mL·min-1，梯度洗脱程序为：1％B,0-0.5min；1-10％B,0.5-7min；10-50％B,7-15min；50-100％B,15-17min,100％B,17-19min；100-1％B,19-20min；自动进样室温度设为4℃，进样量为10μL。
4.如权利要求2所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于，质谱检测采用Waters公司四极杆-飞行时间质谱仪进行检测，采集质谱质量数范围为100-1000Da，所有数据在电喷雾离子ESI源正离子模式下进行采集，其中，毛细管电压4.0kV，椎孔电压35kV，提取电压4.0kV；离子源温度120℃，脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量40L·h-1，脱溶剂流量800L·h-1，Centriod模式进行数据采集，采用Waters公司的LockSprayTM系统进行实时校正，以亮氨酸-脑啡肽为质量参比成分，参比液的流速为20μL/min，在序列中每分析8个尿液样本，进样一次QC样本。
5.如权利要求2所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于，数据预处理的主要的处理参数如下：保留时间范围0-20min；质量数范围100-1000Da；质量数容许度0.01；质量数窗口0.05；噪音去除程度6，数据经过80％过滤原则处理以后，将含空白值>80％的变量去除。
6.如权利要求2所述的当归四逆汤抗寒凝血瘀证差异代谢物代谢通路及研究方法，其特征在于，将各个尿液样本离心去沉淀时先以3500转/min的转速低速离心10分钟，接着以12000转/min的转速高速离心10分钟。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647640A (zh) * 2020-05-22 2020-09-11 中国药科大学 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法
CN113049664A (zh) * 2021-03-15 2021-06-29 东华理工大学 一种基于质谱代谢组学的通路分析建模方法
CN113984935A (zh) * 2021-11-17 2022-01-28 东莞理工学院 基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法
CN114414671A (zh) * 2021-12-10 2022-04-29 天津中医药大学 两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法
CN115290797A (zh) * 2022-09-13 2022-11-04 贵州医科大学 基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法
CN117705982A (zh) * 2023-12-14 2024-03-15 广州中医药大学第一附属医院 一种基于代谢组学评价芪葛汤协同降血脂作用配伍关系的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101361953A (zh) * 2008-09-22 2009-02-11 山西中医学院 四逆汤在制备治疗甲减性性功能降低的药物中的应用
CN103989163A (zh) * 2014-04-30 2014-08-20 新时代健康产业（集团）有限公司 一种血瘀体质保健食品及其制备方法
CN104524545A (zh) * 2014-12-11 2015-04-22 南京中医药大学 一种寒凝血瘀型原发性痛经动物模型的造模方法
CN108414635A (zh) * 2018-02-13 2018-08-17 广西医科大学 一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法
CN109115933A (zh) * 2018-08-31 2019-01-01 中国人民解放军第四军医大学 一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101361953A (zh) * 2008-09-22 2009-02-11 山西中医学院 四逆汤在制备治疗甲减性性功能降低的药物中的应用
CN103989163A (zh) * 2014-04-30 2014-08-20 新时代健康产业（集团）有限公司 一种血瘀体质保健食品及其制备方法
CN104524545A (zh) * 2014-12-11 2015-04-22 南京中医药大学 一种寒凝血瘀型原发性痛经动物模型的造模方法
CN108414635A (zh) * 2018-02-13 2018-08-17 广西医科大学 一种基于细胞代谢组学的甜茶素抗脂毒性的差异代谢物代谢通路及研究方法
CN109115933A (zh) * 2018-08-31 2019-01-01 中国人民解放军第四军医大学 一种筛选四逆汤抗心肌缺血药效物质基础的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUIMIN HUANG等: "Dynamic urinary metabolomics analysis based on UHPLC-Q-TOF/MS to investigate the potential biomarkers of blood stasis syndrome andthe effects of Danggui Sini decoction", 《JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647640A (zh) * 2020-05-22 2020-09-11 中国药科大学 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法
CN113049664A (zh) * 2021-03-15 2021-06-29 东华理工大学 一种基于质谱代谢组学的通路分析建模方法
CN113984935A (zh) * 2021-11-17 2022-01-28 东莞理工学院 基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法
CN113984935B (zh) * 2021-11-17 2024-04-02 东莞理工学院 基于代谢组分析研究产乙酸嗜蛋白菌代谢特性的方法
CN114414671A (zh) * 2021-12-10 2022-04-29 天津中医药大学 两色金鸡菊治疗糖尿病差异代谢物代谢通路的研究方法
CN115290797A (zh) * 2022-09-13 2022-11-04 贵州医科大学 基于气质联用技术的黑骨藤抗类风湿性关节炎代谢组学研究方法
CN117705982A (zh) * 2023-12-14 2024-03-15 广州中医药大学第一附属医院 一种基于代谢组学评价芪葛汤协同降血脂作用配伍关系的方法

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