CN110756238A - 一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，属于微流控技术领域。本发明的双层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片和下层芯片内均设有微柱阵列以实现对肿瘤细胞的多次捕获；且下层芯片内还设有碗形结构以聚集肿瘤细胞，当利用激光检测富集CTCs的特征光谱时信号增强，可以获得该肿瘤病人的肿瘤类型及基因蛋白质光谱特征。本发明的双层微流控芯片，克服了现有技术中肿瘤细胞捕获率不高的不足，其结构设计巧妙，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

Description

一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片

技术领域

本发明属于微流控技术领域，更具体地说，涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片。

背景技术

癌症是威胁人类健康的第一大疾病。2018年全球新增1810万癌症病例，死亡人数达960万，全球癌症负担进一步加重。在全球癌症发病率中排在前三是肺癌、乳腺癌和结肠癌，同时它们分别在各类癌症死亡率排行榜上排第一、第五和第二。综合看来，这三类癌症发病率和死亡率占据了全球癌症的1/3。90％的癌症病人死于癌转移，攻克癌症是人类孜孜以求不停追求的目标。传统的切除、化疗、放射线治疗等方法成本高，给病人带来较大痛苦且具有复发性。循环肿瘤细胞(CTCs)是从原生瘤或再生瘤脱落，进入血液循环系统或淋巴系统中的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞定植远端组织，最终形成癌症转移，导致病人死亡。然而，对循环肿瘤细胞的分离及后续分子生物学、基因分析等对肿瘤的检测诊断、肿瘤的进展转移研究和疗效评价具有重要意义。血液循环系统CTCs的数目是极其稀少的，癌症病人血液中分离循环肿瘤细胞具有高技术的难度。CTCs的数目与癌症的严重程度有着密切的联系。数目多，病情严重，数目少病情轻或治疗有效。

微流控芯片的微通道与细胞的尺寸相当，是一种体积小、成本低、试剂消耗低、便携性好的新技术，被称为“液体活检”。现有的利用微流控芯片研究CTCs的捕获分离方法大体可分为三类：

一类利用亲和性(Affinity-based)原理进行细胞的捕获与分离，该方法基于在微流控芯片内部的微通道或微结构上修饰能够与肿瘤细胞表面抗原结合的特异性抗体如anti-EpCAM如CTC-chip，或者适配体。Herringbone-chip(HB-Chip)的微漩产生的鱼鳞形芯片改变微柱阵列(CTC-Chip设计78,000圆柱形微柱)为鱼鳞形，提高了细胞与抗体修饰的微结构碰撞几率，提高了捕获效率与纯度。但这种微流控芯片的结构通常非常复杂，修饰时间长，抗体昂贵且依赖于EpCAM的不同表达。当肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)时，肿瘤细胞的EpCAM的表达降低。因此依赖于该方法捕获CTCs有可能会失去一部分不表达或低表达EpCAM的肿瘤细胞。该捕获方法依赖于细胞与抗体修饰的柱子的碰撞几率，加速流速时，细胞与抗体修饰柱子的碰撞几率降低且相互作用的时间减少，捕获率下降。典型的基于亲和性微流控芯片结构有CTC-chip、HB-Chip、氧化石墨烯芯片(a graphene oxide chip)、HTMSU、Onco-Bean Chip和a GO-polymer device。

另一类是基于物理特性比如尺寸形变(ISET：isolation by size of epithelialtumor cells)进行捕获，利用CTCs比血细胞大且不易形变的特征，滤过血细胞。该方法操作简单，结构勿需过于复杂、不需修饰且不依赖于任何表面的标志物。但由于CTCs与白细胞的尺寸有重叠的部分，所以一部分CTCs可能会通过滤网或微柱间隙导致损失一部分和白细胞尺寸有重叠部分的CTCs，尤其是那些尺寸较小的CTCs。因为经历了EMT的转变，所以漏掉的CTCs恶性程度更高，且容易破裂、纯度不高，容易发生堵塞。但与亲和性或其他如双向电泳等方法相比较，该方法简易切实可行，更适于临床应用如利用惯性分离的圆形螺旋形芯片、CTC聚合芯片、MOA过滤器和微流棘齿。

第三类是磁性捕获，将肿瘤细胞修饰上EpCAM抗体修饰的微磁珠，通过混合摇晃将靶细胞(肿瘤细胞)包被上微磁珠。这样肿瘤细胞就被包被上磁珠，尺寸放大并且具有磁性。捕获时在微流控的下方放置一块磁性很强的肿瘤细胞，连接上磁珠具有“磁性”的肿瘤细胞被磁铁的强磁性吸引在微流控芯片的下方被捕获，没有磁性的血细胞流走。例如免磁检测腔室、“Ephesia”、CTCs磁性捕获的量子点与磁珠，微磁与微流相结合的芯片μ-MACS+GASI。另外，也有将红细胞裂解后，白细胞“孵育”上磁珠，利用磁性去除白细胞，再利用尺寸捕获住肿瘤细胞。

精巧地设计微流控芯片可以实现微流控CTCs的应用。微流控CTCs应满足以下几点要求：(1)高捕获率：1ml的血液中仅有1-10个肿瘤细胞却有10⁷个白细胞和10⁹个红细胞，所以高捕获率的检测到血样中的每一个肿瘤细胞具有至关重要的意义；(2)高纯度：分离的CTCs没有掺杂其他的细胞如白细胞与红细胞等血细胞，更利于检测如光学检测、识别与计数；(3)高通量：高效快速地分离出肿瘤细胞以满足临床的需求；(4)保持细胞的活性：捕获后肿瘤细胞的富集、活性，以便于分子生物学基因分析，从而确定病人的病情与治疗方案。目前唯一应用于临床的只有捕获率不高的得到美国FDA认证的Cell Search，仅局限于乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌，但仍存在效率低、半自动化的缺陷。

发明人此前基于微流控技术设计一种肿瘤细胞捕获微流控芯片，申请日为2016年1月22日，专利申请号为2016100441060，该方案中的微流控芯片包括基材、以及形成于所述基材内的微通道，该微通道沿平滑曲线方向延伸，其两端分别形成有入口和出口，所述微通道内沿竖直方向凸伸有微柱阵列，该微柱阵列沿所述微通道的延伸方向阵列分布，其位于入口处的一端贴合于所述微通道的一侧壁，其位于出口处的一端贴合于所述微通道的另一侧壁，所述微柱阵列的中部等间距阵列分布有三角形横截面的捕获腔体，该捕获腔体的三个顶角分别形成三个5微米的间隙，用于一个肿瘤细胞的2-3次捕获。该方案中的芯片结合了2种捕获方法，实用于表达EpCAM与不表达EpCAM的CTCs，不表达和低表达EpCAM的CTCs及未连接上磁珠的CTCs可利用5微米间距的微柱阵列进行捕获，但是该方案对于循环肿瘤细胞的捕获率并不高，有待进一步提高和改进。

再如专利申请号：2015102305988，申请日：2015年5月8日，发明创造名称为：一种用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片，其包括第一芯片和位于第一芯片下方的第二芯片，所述第一芯片的表面具有样品通道，与所述样品通道相对的第二芯片的表面具有缓冲液通道，所述样品通道与缓冲液通道交叉相通。相对于CellSearch检测方法，利用该方案中的双层微流控芯片分析肿瘤细胞的技术不需要多步操作，可一步连续完成，操作简单，检测速度更快，富集的CTCs纯度更高。但是由于该方案中的微流控芯片不使用抗体，只是单一地采用物理尺度筛选方法，难以实现对血液内循环肿瘤细胞的精准捕获。因此，针对上述问题，亟需设计一种高精度并且能够实现快速捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片，以满足临床上对于血液中循环肿瘤细胞的检测。

发明内容

1.发明要解决的技术问题

本发明提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，克服了现有技术中肿瘤细胞捕获率不高的不足，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片内自圆心沿半径方向向外延伸形成多簇上层通道，上层芯片在圆心处设置上层入口、在圆周处设置上层出口，上层入口、上层出口分别与上层通道相连通，上层通道内设有上层微柱阵列，上层微柱阵列形成用于捕获循环肿瘤细胞的微柱通道，微柱通道的宽度小于循环肿瘤细胞的直径；

下层芯片自圆周沿半径方向延伸形成下层通道，下层芯片在圆周处设置下层入口、在半径处设置下层出口，下层入口、下层出口分别与下层通道相连通，且上层出口与下层入口相连通；

下层通道内设有下层微柱阵列，下层微柱阵列包括碗形结构，碗形结构上设有缺口，相邻的两个碗形结构的缺口形成用于富集循环肿瘤细胞的捕获腔，缺口的曲率半径不大于30微米，相邻两个碗形结构形成的碗底通道宽度不大于8微米。

作为本发明更进一步的改进，上层微柱阵列位于上层入口的一端与上层通道外侧相贴合，上层微柱阵列位于上层出口的一端与上层通道内侧相贴合，上层微柱阵列与该上层通道基本平行，血样沿上层通道内侧向上层通道外侧流动并穿过上层微柱阵列。

作为本发明更进一步的改进，上层微柱阵列包括并列设置的弧形微柱、矩形微柱以及三角形微柱，各微柱沿上层通道延伸方向等间距阵列分布，相邻的矩形微柱沿其相对的侧边形成第一通道，矩形微柱的另一侧边与相邻的三角形微柱的侧边形成第二通道，第一通道的宽度大于第二通道的宽度。

作为本发明更进一步的改进，第一通道的宽度为8微米，第二通道的宽度为5微米。

作为本发明更进一步的改进，三角形微柱与上层通道外侧之间还设有圆柱形微柱，圆柱形微柱之间形成5微米的第四通道。

作为本发明更进一步的改进，弧形微柱设置于靠近上层通道内侧的一侧，圆柱形微柱设置于靠近上层通道外侧的一侧。

作为本发明更进一步的改进，下层微柱阵列包括沿下层通道延伸方向等间距阵列分布的碗形结构，碗形结构相对下层通道内侧的侧边开设两个缺口，缺口的曲率半径为30微米。

作为本发明更进一步的改进，碗形结构与下层通道内侧之间、碗形结构与下层通道外侧之间的微流通道为15微米，相邻两个碗形结构形成的碗底通道的宽度为8微米。

作为本发明更进一步的改进，下层微柱阵列还包括至少两组沿下层通道延伸方向设置的梯形微柱，且各组梯形微柱自通道侧壁向通道中心方向阵列并于通道中心处交汇，该交汇处设有碗形结构。

作为本发明更进一步的改进，梯形微柱为非等距阵列分布，梯形微柱之间形成微柱通道，各微柱通道的宽度沿梯形微柱的阵列方向依次递增，微柱通道的宽度不大于5微米。

3.有益效果

采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：

(1)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片和下层芯片内均设有微柱阵列以实现对肿瘤细胞的多次捕获，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

(2)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，下层芯片内还设有碗形结构以富集肿瘤细胞，当利用激光检测富集CTCs的特征光谱时信号增强，可以获得该肿瘤病人的肿瘤类型及基因蛋白质光谱特征。

(3)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，下层微柱阵列还包括至少两组沿下层通道延伸方向设置的梯形微柱，各组梯形微柱自通道侧壁向通道中心方向阵列并于通道中心处交汇，该交汇处设有碗形结构；梯形微柱与碗形结构相结合，可以实现肿瘤细胞的高效捕获，利用缓冲液将CTCs冲至碗形结构的捕获腔内，可以提高待测肿瘤细胞的纯度。

(4)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，上层芯片内设置至少六个均匀分布的上层通道，下层通道对应设置，上层通道呈簇状分布可以有效避免流体流动时的各种阻力，提高通量，快速有效地实现循环肿瘤细胞的分离。

附图说明

图1为本发明中上层芯片的俯视图；

图2为本发明中上层芯片的立体图；

图3为本发明中上层通道的内部结构示意图；

图4为本发明中下层芯片的俯视图；

图5为本发明中下层芯片的内部结构示意图；

图6为本发明中下层芯片的立体图；

图7为本发明中下层芯片的另一种内部结构示意图；

图8为本发明中下层芯片的另一种立体图；

图9为本发明的双层微流控芯片的抗体修饰结构图；

图10为本发明中循环肿瘤细胞包被免疫磁珠的照片。

附图标记：

100、上层通道；110、上层通道内侧；111、上层通道外侧；112、上层入口；113、上层出口；

200、上层微柱阵列；210、弧形微柱；211、矩形微柱；212、三角形微柱；213、圆柱形微柱；220、第一通道；221、第二通道；222、第三通道；223、第四通道；

300、下层通道；310、下层入口；311、下层出口；312、下层通道内侧；313、下层通道外侧；

400、下层微柱阵列；410、梯形微柱；411、第五通道；412、第六通道；413、第七通道；414、第八通道；420、碗形结构；421、缺口；422、捕获腔；423、碗底通道。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。

实施例1

结合图1至图4，本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，上层芯片内自圆心沿半径方向向外延伸形成多簇上层通道100，上层芯片在圆心处设置上层入口112、在圆周处设置上层出口113，上层入口112、上层出口113分别与上层通道100相连通，上层通道100内设有上层微柱阵列200，上层微柱阵列200形成用于捕获循环肿瘤细胞的微柱通道，微柱通道的宽度小于循环肿瘤细胞的直径。

具体在本实施例中，上层微柱阵列200包括并列设置的弧形微柱210、矩形微柱211以及三角形微柱212，本实施例中弧形微柱210、矩形微柱211以及三角形微柱212的横截面分别为弧形、矩形和三角形，各微柱沿上层通道100延伸方向等间距阵列分布，相邻的矩形微柱211沿其相对的侧边形成第一通道220，矩形微柱211的另一侧边与相邻的三角形微柱212的侧边形成第二通道221，第一通道220的宽度大于第二通道221的宽度，且小于循环肿瘤细胞的直径，第一通道220、第二通道221这两个捕获间隙通道可以用于捕获CTCs。

为了进一步地分选循环肿瘤细胞，本实施例中下层芯片自圆周沿半径方向延伸形成下层通道300，下层芯片在圆周处设置下层入口310、在半径处设置下层出口311，下层入口310、下层出口311分别与下层通道300相连通，且上层出口113与下层入口310相连通以实现两层芯片的连通；血细胞和漏掉的CTCs从上层出口113进入下层芯片，CTCs富集在碗形结构420形成的捕获腔422内。

具体地，本实施例中下层通道300内设有下层微柱阵列400，下层微柱阵列400包括碗形结构420，碗形结构420上设有缺口421，相邻的两个碗形结构420的缺口421形成用于富集循环肿瘤细胞的捕获腔422，缺口421的曲率半径不大于30微米，相邻两个碗形结构420形成的碗底通道423宽度不大于8微米。

值得说明的是，为了控制血样流向，本实施例中上层微柱阵列200位于上层入口112的一端与上层通道外侧111相贴合，上层微柱阵列200位于上层出口113的一端与上层通道内侧110相贴合，上层微柱阵列200与该上层通道100基本平行，以使血样沿上层通道内侧110向上层通道外侧111流动并穿过上层微柱阵列200。

为了提高捕获率，本实施例将现有技术中的线通道优化为面通道，具体地，本实施例中弧形微柱210、矩形微柱211以及三角形微柱212的横截面分别为半圆形、正方形和等边三角形，半圆形的直径、矩形的边长以及等边三角形的边长分别为100微米、100微米和103微米，且弧形微柱210的平面与矩形微柱211相连接。本实施例中第一通道220的宽度为8微米，第二通道221的宽度为5微米，相邻两个三角形微柱212的顶角之间也形成5微米的微流通道，本实施例中第一通道220和第二通道221构成捕获间隙通道，该捕获间隙通道面积增大、路径延长，形成类似于迷宫密封结构，从而提高CTCs的捕获率。

优选地，本实施例中三角形微柱212与上层通道外侧111之间还设有圆柱形微柱213，圆柱形微柱213之间形成5微米的第四通道223。

由于肿瘤细胞水分含量多，为了防止微柱刺破肿瘤细胞，本实施例中弧形微柱210设置于靠近上层通道内侧110的一侧，圆柱形微柱213设置于靠近上层通道外侧111的一侧，血样经上层入口112进入上层通道100后，依次经过弧形微柱210、矩形微柱211、三角形微柱212以及圆柱形微柱213组成的微柱通道，肿瘤细胞被捕获在微柱通道内。

需要说明的是，循环肿瘤细胞的直径为10～20微米，红细胞的直径为4～6微米，白细胞的直径为7～12微米，由此可见，肿瘤细胞与白细胞的尺寸有部分重合，但白细胞相对肿瘤细胞容易变形，上层微柱阵列200构成的微柱通道利用物理尺寸大小对细胞进行初级筛选，本实施例中第一通道220的宽度为8微米，第二通道221的宽度为5微米，基于物理特性捕获时，对于尺寸略大、不易形变的循环肿瘤细胞，5微米和8微米的捕获间隙通道用于捕获循环肿瘤细胞；尺寸略小、易形变的血细胞通过间隙通道流走；捕获之后，用PBS冲洗1-3遍，提高捕获的纯度。

利用上述双层微流控芯片捕获循环肿瘤细胞，捕获方法可以分为四种：

(1)表达和不表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获测试：对于表达EpCAM(上皮粘附分子)的循环肿瘤细胞，将微流通道内修饰上各种抗体如三甲基硅氧烷(3mt),偶联剂(GMBS),亲和素(Ntra-aviden)，最后修饰上抗上皮粘附分子(anti-EpCAM)或者修饰适配体(aptamer)；当稀释后的病人血样流经微流控芯片时，肿瘤细胞的抗原与抗体相结合，肿瘤细胞被捕获住；同时基于物理尺寸的微柱间隙发挥作用，尺寸较大的肿瘤细胞被捕获，尺寸略小的血细胞从上层微柱阵列200中流过，这是利用亲和性和尺寸相结合的捕获方法。

结合图9，图9是微流控芯片基于亲和性的抗体修饰图，本实施例首先将微流通道修饰4％的三甲基硅氧烷(3mt,3-mercaptopropyl trimethoxysilane,溶入在酒精里)45分钟，然后用1μM的偶联剂GMBS(the coupling agent N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide ester)处理,再用10μg ml^-1亲和素(neutravidin)室温处理30分钟，最后用PBS里的10μg ml^-1抗上皮粘附分子(biotinylated EpCAM)4℃过夜处理即可实现微流通道的抗体修饰。

(2)将循环肿瘤细胞包被具有磁性的免疫磁珠，并在微流控芯片的下方放置一块磁性很强的永久磁铁，在微流控芯片内产生磁性很强的磁场，当血样注入上层入口112时，在强磁场作用下，血样从上层通道内侧110向上层通道外侧111流动，血细胞如白细胞、红细胞则由于小尺寸、易形变的特点可以钻过上层微柱阵列200，具有磁性的CTCs被强磁场吸引在微流控芯片的底面，粘附在芯片上。CTCs被捕获之后，通入磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，即可提高捕获的纯度；移除磁铁使磁性消失，以培养液或缓冲液向上层入口112处冲洗，即可将该微流通道内捕获的肿瘤细胞冲洗下来，实现富集。

(3)对于不表达EpCAM或低表达EpCAM的肿瘤细胞，则不连接免疫磁珠，直接利用细胞的尺寸与形变进行捕获。

(4)CTCs被捕获并富集在下层芯片中碗形结构420形成的捕获腔422内，由于CTCs被富集数量增多，用激光检测富集CTCs的特征光谱信号增强，可以获得该肿瘤病人的肿瘤类型及基因蛋白质光谱特征。

综上，本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其结构设计巧妙，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

实施例2

结合图5和图6，图5是下层芯片的内部结构示意图，本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其结构与实施例1基本相同，进一步地，本实施例中下层微柱阵列400包括沿下层通道300延伸方向等间距阵列分布的碗形结构420，碗形结构420相对下层通道内侧312的侧边开设两个缺口421，缺口421的曲率半径为30微米，相邻的两个碗形结构420的缺口421形成用于富集循环肿瘤细胞的捕获腔422；碗形结构420与下层通道300基本平行，碗形结构420与下层通道内侧312之间、碗形结构420与下层通道外侧313之间的微流通道为15微米，相邻两个碗形结构420之间的碗底通道423为8微米。

在上层芯片中漏掉的肿瘤细胞可以经碗形结构420实现再次捕获，具体地，血样从下层入口310进入下层通道300，尺寸较大的肿瘤细胞流入捕获腔422并捕获于碗底通道423内，即使有个别肿瘤细胞从碗形结构420与下层通道内侧312微流通道经过，会被阵列分布的碗形结构420再次捕获，而其他血细胞则从碗形结构420与下层通道外侧313之间的微流通道流走，例如尺寸较大的白细胞。

实施例3

本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其结构与实施例1基本相同，进一步地，本实施例中下层微柱阵列400还包括至少两组沿下层通道300延伸方向设置的梯形微柱410，各组梯形微柱410自通道侧壁向通道中心方向阵列并于通道中心处交汇，该交汇处设有碗形结构420。

结合图7和图8，图7是下层芯片的另一种内部结构示意图，具体在本实施例中下层微柱阵列400包括四组沿下层通道300延伸方向设置的梯形微柱410，每两组梯形微柱410自通道侧壁向通道中心方向阵列并于通道中心处交汇，形成箭头状的捕获通道，进一步地，两组梯形微柱410交汇处形成的夹角为20°～40°，例如可以为20°、25°、30°、35°和40°，优选为30°。

本实施例中梯形微柱410为非等距阵列分布，梯形微柱410之间形成微柱通道，各微柱通道的宽度沿梯形微柱410的阵列方向依次递增，微柱通道的宽度不大于5微米。具体在本实施例中，梯形微柱410为直角梯形结构，其上底边长为15微米，高为5微米，每组梯形微柱410的斜边在同一延伸直线上，相邻梯形微柱410的上底与下底之间依次形成第五通道411、第六通道412、第七通道413以及第八通道414，各通道的宽度分别为2微米、3微米、4微米和5微米。

当血样从上层芯片的上层出口113进入下层芯片的下层入口310后，依次递增的微柱通道可以过滤尺寸较小的血细胞如白细胞与红细胞。同时，每两组梯形微柱410自通道侧壁向通道中心方向阵列并于通道中心处交汇，当缓冲液流入时可以将CTCs冲至该交汇处，该交汇处设有碗形结构420，CTCs汇聚富集于碗形结构420的捕获腔421内，此处的CTCs因富集数量增多，肿瘤细胞的特征光谱检测信号增强，有利于确定肿瘤类型和肿瘤细胞的基因蛋白质特征。

本实施例的双层微流控芯片，该微流控芯片是否能够成功捕获肿瘤细胞在很大的程度上取决于循环肿瘤细胞连接免疫磁珠的效率。如果所有的CTCs都能连接上直径4.5微米的免疫磁珠，并且每个肿瘤细胞连接的免疫磁珠越多，就能够使得CTCs具有磁性越强，在强磁场的作用下，CTCs被吸引在微流控芯片底面上的可能性越大，同时将肿瘤细胞的尺寸放大，可以进一步确保磁性捕获的成功性。

结合图10，图10是结直肠癌细胞连接磁性免疫磁珠的图片，由图片可以看出，所有的肿瘤细胞都连接上了直径4.5微米的磁性免疫磁珠，使得肿瘤细胞具有磁性并放大了4.5微米-9微米，从而实现上述第(2)种的捕获方法进行捕获。CTCs连接磁性免疫磁珠的方法实施起来也极为简单，在1ml的肿瘤细胞悬液中加25微升的免疫磁珠，半小时之内上下颠倒混匀该细胞悬液，即可得到图10的效果。

本实施例的芯片实用于表达EpCAM与不表达EpCAM的CTCs，同一块芯片可以实现抗体修饰与尺寸结合捕获，免疫磁珠磁性捕获、基于物理尺寸的微柱间隙捕获与富集在碗形底部的CTCs的光谱检测。

实施例4

本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其结构与实施例1基本相同，进一步地，本实施例中上层芯片内设置至少六个均匀分布的上层通道100，上层微柱阵列200与上层通道内侧110的最大间距为400微米，上层微柱阵列200与上层通道外侧111的最大间距为600微米，1000微米左右的通道宽度可以实现捕获后肿瘤细胞芯片上的培养，六个以上的花瓣形上层通道100可以实现高通量，满足临床7.5ml的检测需求，亦可实现多个血样的检测。

本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，分离和富集循环肿瘤细胞(CTCs)集于一体，该芯片易于操作，不依赖于肿瘤细胞的标记物，不局限于肿瘤细胞是否表达上皮粘附分子(EpCAM)；微流控芯片内的微柱阵列可以有效地实现尺寸的捕获，尺寸与亲和性相结合或尺寸与磁性相结合的双重捕获以及特征光谱的检测；多簇上层通道100可以有效避免流体流动时的各种阻力，使血样在微通道内可以通畅的流动，快速有效地实现循环肿瘤细胞的分离。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：包括上下对应设置且相互连通的上层芯片和下层芯片，所述上层芯片内自圆心沿半径方向向外延伸形成多簇上层通道(100)，所述上层芯片在圆心处设置上层入口(112)、在圆周处设置上层出口(113)，所述上层入口(112)、上层出口(113)分别与上层通道(100)相连通，所述上层通道(100)内设有上层微柱阵列(200)，所述上层微柱阵列(200)形成用于捕获循环肿瘤细胞的微柱通道，所述微柱通道的宽度小于循环肿瘤细胞的直径；

所述下层芯片自圆周沿半径方向延伸形成下层通道(300)，所述下层芯片在圆周处设置下层入口(310)、在半径处设置下层出口(311)，所述下层入口(310)、所述下层出口(311)分别与下层通道(300)相连通，且所述上层出口(113)与所述下层入口(310)相连通；

所述下层通道(300)内设有下层微柱阵列(400)，所述下层微柱阵列(400)包括碗形结构(420)，所述碗形结构(420)上设有缺口(421)，相邻的两个碗形结构(420)的缺口(421)形成用于富集循环肿瘤细胞的捕获腔(422)，所述缺口(421)的曲率半径不大于30微米，相邻两个碗形结构(420)形成的碗底通道(423)宽度不大于8微米。

2.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述上层微柱阵列(200)位于上层入口(112)的一端与上层通道外侧(111)相贴合，所述上层微柱阵列(200)位于上层出口(113)的一端与上层通道内侧(110)相贴合，所述上层微柱阵列(200)与该上层通道(100)基本平行，血样沿上层通道内侧(110)向上层通道外侧(111)流动并穿过上层微柱阵列(200)。

3.根据权利要求2所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述上层微柱阵列(200)包括并列设置的弧形微柱(210)、矩形微柱(211)以及三角形微柱(212)，各微柱沿上层通道(100)延伸方向等间距阵列分布，相邻的矩形微柱(211)沿其相对的侧边形成第一通道(220)，所述矩形微柱(211)的另一侧边与相邻的三角形微柱(212)的侧边形成第二通道(221)，所述第一通道(220)的宽度大于第二通道(221)的宽度。

4.根据权利要求3所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述第一通道(220)的宽度为8微米，所述第二通道(221)的宽度为5微米。

5.根据权利要求3所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述三角形微柱(212)与上层通道外侧(111)之间还设有圆柱形微柱(213)，所述圆柱形微柱(213)之间形成5微米的第四通道(223)。

6.根据权利要求5所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述弧形微柱(210)设置于靠近上层通道内侧(110)的一侧，所述圆柱形微柱(213)设置于靠近上层通道外侧(111)的一侧。

7.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述下层微柱阵列(400)包括沿下层通道(300)延伸方向等间距阵列分布的碗形结构(420)，所述碗形结构(420)相对下层通道内侧(312)的侧边开设两个缺口(421)，所述缺口(421)的曲率半径为30微米。

8.根据权利要求7所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述碗形结构(420)与下层通道内侧(312)之间、所述碗形结构(420)与下层通道外侧(313)之间的微流通道为15微米，相邻两个碗形结构(420)形成的碗底通道(423)的宽度为8微米。

9.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述下层微柱阵列(400)还包括至少两组沿下层通道(300)延伸方向设置的梯形微柱(410)，且各组梯形微柱(410)自通道侧壁向通道中心方向阵列并于通道中心处交汇，该交汇处设有碗形结构(420)。

10.根据权利要求9所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其特征在于：所述梯形微柱(410)为非等距阵列分布，梯形微柱(410)之间形成微柱通道，各微柱通道的宽度沿梯形微柱(410)的阵列方向依次递增，所述微柱通道的宽度不大于5微米。

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