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CN110747268B - 一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用 - Google Patents

一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种血清外泌体ssc‑miR‑17‑5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用。所述的血清外泌体ssc‑miR‑17‑5p的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。使用该分子标记来检测妊娠状态具有早期、方便、快捷、特异和灵敏的特点，从而缩短假孕母猪的空怀期，及早采取复配，有利于生产管理，提高生产效率。本发明还提供了一种检测上述分子标志物的引物和试剂盒，为母猪早期妊娠诊断提供了新的途径。

Description

一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子 标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用。
背景技术
母猪繁殖性能是养猪业生产效率的重要指标，繁殖性能的指标之一就是母猪年生产力(PSY)，其反映了猪场养猪技术水平和生产效率的核心指标，据统计我国母猪PSY不足20头，其生产性能偏低的状况严重制约着我国养猪业的发展。为了提高母猪的生产力，则须保证其正常的繁殖周期。早期的妊娠诊断可以确认配种后的母猪是否受孕，对于已经受孕的母猪要及时进行保胎，对于未孕母猪及时采取复配措施，缩短其空怀期，对于屡配不孕的母猪及早进行淘汰。B超诊断是目前猪场最普及的妊娠诊断方法，但B超诊断需要在母猪妊娠30天左右开展才能达到较高的准确性。为了在妊娠早期准确判定母猪妊娠状况，我们利用外泌体及其携带的MicroRNA作为妊娠标志物以期快速准确的检测其妊娠状况。
外泌体(exosome)是直径30～150nm的磷脂双分子层囊泡，并由各种细胞分泌至细胞外。外泌体内可选择性包含各类核酸分子，如DNA、mRNA、microRNA、circRNA、lncRNA等以及各种脂质和蛋白质。外泌体因其表面含有特殊的蛋白分子(CD9、CD63、CD81、CD82等)可被鉴定出。外泌体及其携带物可作为信号分子通过体液传导给其他细胞组织从而行使其功能。在其他物种中有研究表明血液miRNA可以作为妊娠的生物标志物。miRNA是内源的，短的17-25nt非编码RNA，通过与mRNA互补结合来破坏和降解转录或抑制翻译。miRNA表达具有高度组织特异性，其表达水平随发育、生理或病理阶段而发生明显变化。
已有相关文献研究介绍外泌体及其携带物在其他物种的不同体液中作为疾病或生理标记的载体的研究。我们假设外泌体也存在于猪血清中，它们的分布会随着妊娠状态而变化，本发明是发现并确定在妊娠时期相对空怀期/发情期表达差异显著的外泌体miRNAs，确定其应用于早期妊娠诊断的分子标志物的可能。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测上述母猪早期妊娠诊断分子标志物的引物。
本发明的再一目的在于提供一种包含上述引物的试剂盒。
本发明的第四个目的在于提供上述引物和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用，所述的血清外泌体ssc-miR-17-5p的核苷酸序列如下所示：
5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’；
一种用于检测上述母猪早期妊娠诊断分子标志物的引物，包含引物ssc-miR-17-5p-F和ssc-miR-17-5p-R，其核苷酸序列如下所示：
引物ssc-miR-17-5p-F：5’-GCCAAAGTGCTTACAGTGC-3’；
引物ssc-miR-17-5p-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
所述的用于检测母猪早期妊娠诊断分子标志物的引物，优选还包含茎环法反转录引物ssc-miR-17-5p_1，其核苷酸序列如下所示：
引物ssc-miR-17-5p_1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT-3’；
所述的用于检测母猪早期妊娠诊断分子标志物的引物，优选还包含茎环法外参反转录引物cel-miR-39_1，其核苷酸序列如下所示：
引物cel-miR-39_1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT-3’；
一种用于检测上述母猪早期妊娠诊断分子标志物的试剂盒，包含上述引物；
所述的用于检测母猪早期妊娠诊断分子标志物的试剂盒，优选还包含如下组分：2×TS Reaction Mix、RT/RI Enzyme Mix、gDNA Remover、RNase-free Water、Green qPCRSuperMix；
所述的用于检测上述母猪早期妊娠诊断分子标志物的引物在制备母猪早期妊娠诊断产品中的应用；
所述的用于检测上述母猪早期妊娠诊断分子标志物的试剂盒在制备母猪早期妊娠诊断产品中的应用；
所述的应用，包含如下步骤：
从待测母猪血清中提取外泌体，然后从外泌体中提取RNA；RNA反转录得到cDNA后进行荧光定量PCR；
所述的反转录的体系优选为：
Figure BDA0002244434900000031
所述的反转录的程序优选为：
将待测样品RNA、反转录引物与RNase-free Water混匀，65℃孵育5min后，冰浴2min；然后再加入其他反应组分，轻轻混匀，42℃孵育15min；最后85℃加热5秒，得到cDNA；
所述的荧光定量PCR的体系优选为：
Figure BDA0002244434900000032
所述的荧光定量PCR的程序优选为：
94℃预变性30sec；94℃5sec，60℃30sec，40个循环；94℃15sec，60℃1min，94℃15sec；
所述的荧光定量PCR结果判定：如果待测样品中ssc-miR-17-5p的表达水平相对于阴性对照显著升高，P<0.05，则代表母猪成功受孕；反之，则未成功受孕；其中，阴性对照为未受孕母猪血清中外泌体RNA；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明通过Illumina测序及差异基因的筛选等方法，首次确定了最早在怀孕的第9天血清中外泌体miRNA的水平变化并进一步确定了在妊娠第9至15天期间ssc-miR-17-5p表达的水平增加，该miRNA可以作为猪早期妊娠的新的生物标记物。相比传统B超诊断妊娠状态的方法，B超诊断需要在母猪妊娠30天左右开展才能达到较高的准确性，而本发明使用外泌体ssc-miR-17-5p来检测妊娠状态具有早期、方便、快捷、特异和灵敏的特点，从而缩短未孕母猪空怀期，及早进行复配，有利于生产管理，提高生产效率。
(2)为了识别怀孕初期的空怀母猪和妊娠状况，我们使用外泌体及其miRNA作为妊娠标记，以快速方便地检测其妊娠状况，并进一步开发相关早期妊娠快速检测的引物和试剂盒，为母猪早期妊娠诊断提供了新的途径。
附图说明
图1是实施例1制得的血清外泌体样品的透射电镜(TEM)鉴定图。
图2是Western Blot所示的血清外泌体膜表面蛋白分子的条带图。
图3是ssc-miR-17-5p_ssc-mir-17二级结构图。
图4是高通量测序样本数据验证结果分析图。
图5是实际生产中独立样本差异基因ssc-miR-17-5p的验证结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、实验设计及样本的采集
在某繁殖场里挑选20头经产母猪(品种大白)进行同期发情处理，对其中15头进行人工输精，另外5头进行假受精处理。分别在发情9天和妊娠9天、12天、15天用促凝管进行耳缘静脉采血。并在授精后第6周进行超声证实妊娠状况。对采集的血液在一个小时内进行促凝析出血清，并及时放入-80℃放冰箱保存备用。
二、血清外泌体的分离鉴定
(1)血清外泌体的分离
将步骤一分离好的血清在4℃环境下以2,000×g离心20min，去除漂浮的细胞和碎片；所得上层清液进一步离心机在4℃环境下以11,000×g速度高速离心30min排除更大的膜囊泡；为进一步去除颗粒物，高速离心所得的上层清液利用0.22μm的过滤器(MerckMillipore,Ireland)轻轻地挤压过滤，过滤上清液利用Optima XPN-100超速离心机(Beckman Coulter,USA)在转子SW 32Ti中以111,000×g转速，4℃环境下超速离心2h；超速离心后得到的外泌体等颗粒在PBS下反复吹洗溶解，并存储在-80℃冰箱。同时，外泌体的分离除了用超速离心法，也可采用外泌体分离提取试剂盒获得。
(2)透射电镜分析
外泌体的负染步骤包括：首先处理铜网，对铜网进行辉光放电以消除静电，在真空室内放置带有栅格的顶部(碳朝上)，并拉动真空和辉光放电30～60秒。排空后，将其置于培养皿中并置于超净工作台。然后剪一小块Parafilm(封口膜)紧贴于倒扣放的平板皿上；之后用移液枪吸取10μL步骤(1)制得的外泌体样品滴于封口膜上，用镊子夹取铜网轻轻倒贴于样品滴上，让铜网在样品滴上吸附(孵育)10min；再用移液枪吸取10μL乙酸铀滴于样品旁的封口膜上；待孵育时间结束后，用镊子轻轻夹起样品上的铜网，用Whatman纸在铜网边缘轻轻吸收多余的样品缓冲液；将铜网倒置于3wt％的醋酸铀滴上吸附(孵育)2min；孵育时间结束后，用镊子夹起吸附过醋酸铀的铜网，在铜网边缘用Whatman纸轻轻吸附多余的液体，并将负染好的铜网放回至铜网盒里自然干燥以待透射电镜观察，记录好每个样品放至铜网盒的坐标位置。最后利用FEI TalosTM场发射透射电镜对外泌体进行形态学的观察。
电镜结果显示血清外泌体形态良好，质膜明显，呈椭圆凹陷状，其大小主要分布在100nm左右，直径大部分分布在30～150nm。外泌体电镜结果见图1。
(3)蛋白免疫印迹分析(Western Blot)
用RIPA裂解缓冲液(CWBIO，PMSF：RIPA＝1：100)处理步骤(1)制得的外泌体样品以分离总蛋白，得到外泌体蛋白，然后使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(CWBIO)来测量蛋白质浓度。将分离得到的外泌体蛋白热变性，并通过12％(W/V)的SDS-PAGE凝胶分离。将外泌体蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，USA)上，并在室温下用6％(W/V)脱脂奶粉封闭2.5小时。然后孵育抗CD9/CD63(Abcam,UK)和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Abcam,UK)。使用BeyoECL Moon化学发光开发套件(Beyotime)进行了印迹曝光。
如图2所示，Western Blot检测到了外泌体表面标志蛋白CD9、CD63的存在。
三、外泌体RNA的分离提取
将步骤二(1)超速离心分离获得的外泌体样品进行解冻，利用miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，Germany)进行抽提外泌体RNA，具体方法如下：
(1)每体积外泌体样品添加700μL QIAzol Lysis Reagent，通过简短地涡旋含有裂解物的试管后并在室温(15～25℃)下孵育5min，该步骤促进核蛋白复合物的解离；
(2)向每个样品中添加外源3.5μL cel-miR-39(Qiagen，Germany)作为外参并充分混合；
(3)向含有裂解液的试管中加入90μL氯仿并盖紧试管盖子，剧烈震荡15秒，并在室温(15～25℃)下孵育2min；
(4)在4℃环境下以12,000×g转速离心15min(离心后，样品分离为3个相：含有RNA的上无色水相、一种薄的白色相间、以及较低的红色有机相，水相的体积应该是大约400μL)；
(5)将上层水相转移到新的收集管，避免转移任何其它液相。加入2倍体积的无水乙醇并通过吸管上下吸吹数次充分混合；
(6)将最多700μL样品吸入RNeasy MinElute吸附柱中，轻轻盖上盖子，在室温(15～25℃)下以≥8,000×g转速离心15秒，丢弃滤液；对于剩下的样品液体可重复该步骤进行富集，弃掉滤液；
(7)将700μL RWT缓冲液加入RNeasy MinElute吸附柱上；轻轻盖上盖子，以≥8,000×g转速离心15秒，弃掉离心下的滤液；
(8)将500μL RPE缓冲液加到RNeasy MinElute吸附柱上；轻轻盖上盖子，以≥8,000×g转速离心15秒，弃掉离心下的滤液；
(9)将500μL RPE缓冲液移液到RNeasy MinElute吸附柱上；盖上盖子，以≥8,000×g转速离心2min，丢弃收集管和离心下的滤液；
(10)将RNeasy MinElute离心柱放入新的2mL收集管中；打开吸附柱的盖子，全速离心5min以干燥吸附柱膜，弃掉离心下的滤液；
(11)将RNeasy MinElute离心柱放入新的1.5mL收集管中；将14μL无RNase的水直接添加到吸附柱膜的中心。轻轻盖上盖子，让柱子静置孵育1min，然后全速离心1min以洗脱RNA，得到小RNA样品；
四、Illumina测序及差异基因的筛选
按照制造商的建议使用
Figure BDA0002244434900000061
(NEB,USA)的NEBNext Multiplex对每个时期(n＝3)的小RNA样品(步骤三制得)制备生成cDNA文库；文库准备工作在Illumina Novaseq6000平台上进行测序。
利用生物信息学技术对测序结果进行分析，获得6个显著差异表达的潜在miRNAs标志物，其中一个为：血清外泌体ssc-miR-17-5p，其核苷酸序列如下所示：
5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’；
血清外泌体ssc-miR-17-5p的前体ssc-mir-17序列如下所示，其二级结构如图3所示：
5’-GAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGUGAUAAUGUGCAUCUACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCAUUAUGG-3’。
五、RT-qPCR验证测序数据中差异表达的基因ssc-miR-17-5p
在测序样本中，我们对测序结果筛选出来的差异ssc-miR-17-5p进行荧光定量差异验证，具体方法如下：
(1)茎环反转录法合成cDNA
以步骤三分离提取的小RNA样品为模板与引物、RNase-free Water混匀，65℃孵育5min后，冰浴2min；然后再加入其他反应组分(反应体系如表1所示)，轻轻混匀，42℃孵育15min；最后85℃加热5秒钟失活RT/RI与gDNA Remover，得到cDNA；其中，RNA分离过程中添加外源cel-miR-39(Qiagen，Germany)作为外参，具体茎环法反转录引物序列如下所示；
引物ssc-miR-17-5p_1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT-3’；
引物cel-miR-39_1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAGCT-3’；
表1反转录反应体系
Figure BDA0002244434900000071
(2)荧光定量PCR
以步骤(1)制得的cDNA稀释10倍后作为模板，以ssc-miR-17-5p-F和ssc-miR-17-5p-R为扩增引物，进行荧光定量PCR，具体反应体系及程序见表2和表3，具体引物序列如下所示：
ssc-miR-17-5p-F：5’-GCCAAAGTGCTTACAGTGC-3’；
ssc-miR-17-5p-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
cel-miR-39-F：5’-GCGCTCACCGGGTGTAAATC-3’；
cel-miR-39-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
表2 Real time PCR体系
Figure BDA0002244434900000081
表3 Real time PCR程序(两步法)
Figure BDA0002244434900000082
结果显示：妊娠9天、12天、15天的母猪(P9、P12、P15)与非妊娠母猪(C9)的差异明显显著，符合测序结果，具体见图4。为进一步在实际生产中独立检测做准备。
实施例2在实际生产中RT-qPCR独立验证妊娠早期差异基因ssc-miR-17-5p
(1)在一个独立扩大样本(n＝8)的母猪群体中，我们对其进行上述同期发情处理并进行人工授精和假授精，分别采集0天(授精当天)，发情9天，妊娠9天、12天、15天的母猪血清。
(2)参照实施例1，使用超速离心法分离获得外泌体样品并利用RNA抽提试剂盒miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，Germany)进行抽提外泌体RNA，抽提过程中添加外源cel-miR-39(Qiagen，Germany)作为外参，所有候选基因和目标基因引物按照Oligo合成制造商(BGI)协议进行稀释。使用所有样本通过茎环引物法使用反转录试剂盒(TransGen,CHINA)创建了miRNA的cDNA文库。
(3)将合成的cDNA文库稀释10倍，然后在ABI 7300实时PCR仪(life，USA)上对一式三份miRNA cDNA进行初始实时PCR检测，具体反应体系及程序见实施例1荧光定量PCR部分。
(4)利用Microsoft Excel处理基因表达原始数据，使用2-ΔΔCt计算其每个miRNA的相对表达水平，采用配对t检验和方差分析两种方法进行分析，P值<0.05为显著差异，并使用GraphPad Prism 6软件进行作图统计分析。
对6个特别差异miRNAs进行独立定量结果显示，早在妊娠第9天采集的母体血清衍生外泌体中，ssc-miR-17-5p的表达水平均极显著升高，P<0.01。详见图5。
通过对猪血清外泌体miRNAs进行RNA测序和独立的qPCR分析，本发明首次确定了最早在怀孕的第9天血清中外泌体miRNA的水平变化。结果表明，循环血清外泌体miRNA可能在猪的早期妊娠中起重要作用。具体而言，我们确定了在妊娠第9至15天期间ssc-miR-17-5p表达的水平增加，该miRNA都可以作为猪早期妊娠的新的生物标记物。
实施例3加尾反转录法
除采用茎环反转录法，加尾法也可得到同样的结果。
(1)加尾转录法合成cDNA
参照实施例1，使用超速离心法分离获得外泌体样品并利用RNA抽提试剂盒miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen，Germany)进行抽提外泌体RNA，抽提过程中添加外源cel-miR-39(Qiagen，Germany)作为外参，所有候选基因和目标基因引物按照Oligo合成制造商(BGI)协议进行稀释。利用全式金试剂盒TransScript miRNA First-Strand cDNASynthesis Super Mix进行加尾法通用反转录，创建miRNA的cDNA文库，其中，反转录引物为TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒提供。按照表4配制反应体系，轻轻混匀，37℃孵育1小时；85℃加热5秒钟失活RT Enzyme Mix。
表4反转录反应体系
Figure BDA0002244434900000091
Figure BDA0002244434900000101
(2)荧光定量PCR
将反转录所得cDNA稀释10倍后作为模板使用，上游引物为miRNA特异引物，下游引物为TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Super Mix试剂盒提供的通用引物Universal miRNA qPCR Primer(10μM)，进行荧光定量PCR，具体反应体系及程序见表5和表6，根据目的miRNA设计其引物序列如下所示：
ssc-miR-17-5p_2：5’-GCCAAAGTGCTTACAGTGC-3’；
表5 qPCR体系
Figure BDA0002244434900000102
表6 qPCR程序(两步法)
Figure BDA0002244434900000103
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种血清外泌体ssc-miR-17-5p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物ssc-miR-17-5p-F
<400> 5
gccaaagtgc ttacagtgc 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物ssc-miR-17-5p-R
<400> 6
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物cel-miR-39-F
<400> 7
gcgctcaccg ggtgtaaatc 20
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物cel-miR-39-R
<400> 8
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物ssc-miR-17-5p_2
<400> 9
gccaaagtgc ttacagtgc 19

Claims (5)

1.一种检测血清外泌体ssc-miR-17-5p表达水平的试剂在制备母猪早期妊娠诊断产品中的应用，其特征在于所述的血清外泌体ssc-miR-17-5p的核苷酸序列如下所示：
5’-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3’；
所述的早期妊娠的时期为妊娠第9至15天期间，其中，成功受孕母猪相对于未受孕母猪血清中外泌体ssc-miR-17-5p的表达水平升高；
所述的母猪品种为大白品种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的试剂包含引物ssc-miR-17-5p-F和ssc-miR-17-5p-R，其核苷酸序列如下所示：
ssc-miR-17-5p-F：5’- GCCAAAGTGCTTACAGTGC-3’；
ssc-miR-17-5p-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的试剂还包含茎环法反转录引物ssc-miR-17-5p_1，其核苷酸序列如下所示：
引物ssc-miR-17-5p_1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT-3’。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述的产品为试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包含如下组分：2×TSReaction Mix、RT/RI Enzyme Mix、gDNA Remover、RNase-free Water、Green qPCRSuperMix。
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