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CN110726784A - 一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法 - Google Patents

一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法 Download PDF

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CN110726784A CN201911017308.6A CN201911017308A CN110726784A CN 110726784 A CN110726784 A CN 110726784A CN 201911017308 A CN201911017308 A CN 201911017308A CN 110726784 A CN110726784 A CN 110726784A
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张丽
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Abstract

本发明属于环境中痕量污染物分析检测领域，涉及一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法。针对现有技术中提取不同类型的抗生素时，其适用的适宜提取液组成和pH条件不同的问题，本发明的技术方案是：在步骤2‑步骤5中，首先确认适用于对应样品的提取液的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件。随后采用适宜条件的提取液提取鸡粪样品，在步骤6‑步骤9中，确定过HLB固相萃取小柱前提取物溶液适宜的pH条件。最后采用上述确定的适宜的条件对鸡粪样品进行提取、净化和检测。这样能够保证对鸡粪样品中的抗生素具有高的回收率，从而使得检测结果更加准确。本发明方法适用于对鸡粪中的抗生素含量进行检测。

Description

一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法
技术领域
本发明属于环境中痕量污染物分析检测领域，涉及一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法。具体涉及磺胺二甲异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉17种磺胺类抗生素；诺氟沙星、环丙沙星、恩氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、达氟沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星、氟罗沙星9种喹诺酮类抗生素；四环素，土霉素，金霉素和强力霉素4种四环素类抗生素；甲氧苄氨嘧啶和奥美普林2种抗生素增效剂。
背景技术
抗生素主要用于治疗各种细菌感染或致病微生物感染类疾病，抗生素的使用分为治疗性使用和预防性使用两种。抗生素在饲料添加剂中得到了广泛应用，饲料中添加抗生素对动物某些疾病的治疗作用是抗生素的正常药理作用。对某些动物疫病的预防作用，保证畜禽的健康生长；改善动物饲养环境，因为抗生素使环境中各种致病菌减少；提高动物机能的抵抗力，增强动物应付外界不良环境的能力，以及减少动物因各种应激反应所造成的损失等等。
由于饲料中添加抗生素具有多种优点，因此出现饲料抗生素的乱用和滥用现象，长期使用所带来的耐药性、药物残留和环境污染等问题，最终威胁人类健康。农业部要求全面禁止在动物饲料中添加抗生素，虽然禁用抗生素的呼声很高，但实际养殖生产中抗生素应用仍然十分广泛，用量也越来越大，甚至在一些地方出现滥用。
通过动物粪便中抗生素残留检测是一种较为直接方便了解养殖户使用抗生素的情况。抗生素测定包括样品前处理和测定两个步骤。样品前处理包括样品采集冷冻干燥粉碎过筛预处理，提取、HLB固相萃取净化浓缩、洗脱、氮吹干燥浓缩、定容等环节，每个环节严格控制条件保障结果的准确性。抗生素的提取中提取液的组成、pH和提取温度以及固相萃取净化浓缩条件等都是影响测定结果的重要因素，因此现有技术有的采用控温超声和控温离心控制提取的温度条件并严格控制提取液的组成和pH以及过固相萃取小柱的提取物溶液的pH。目前有关抗生素检测的报道较多，以高效液相色谱-质谱联用技术检测方法为主。
然而，在现有技术中各种提取方法只会采用一种确定的根据经验、文献报道或标准样品测试等方式优选的提取液pH和温度等条件对鸡粪进行提取。动物粪便组成复杂，根据动物的饲料、环境因素和动物的生理因素，技术人员优选的提取液组成和pH条件并不一定适用于所有的鸡粪样品，此外，针对同一鸡粪样品，提取不同类型的抗生素其最适宜的条件也是不同的，提取液的组成和pH会对所提取的抗生素类别和提取率产生影响，从而导致检测结果和结论不准确。
发明内容
针对现有技术中提取抗生素时，对于不同的鸡粪样品，其适用的适宜提取液组成和pH条件不同的问题，本发明提供一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其目的在于：通过空白加标和样品加标回收率的测定选择提取条件和提取物溶液过HLB小柱的净化条件，优化同时适合磺胺类、喹诺酮类和四环素类的方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，包括如下步骤：
步骤1：对鸡粪样品进行冷冻干燥、粉碎和过筛；
步骤2：配制待检抗生素的混标使用液，向经过步骤1处理的鸡粪样品中加入混标使用液；
步骤3：将缓冲溶液和提取组分混合配制成提取液，所述提取液根据pH条件和/或组分条件的变化制备数组；将经过步骤2处理的鸡粪样品用所述数组提取液分别单独使用或数次交错使用，进行提取和分离操作，得到数组提取物溶液；
步骤4：将步骤3得到的提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到检测样品液；
步骤5：检测步骤4得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于步骤3操作的不同而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；
步骤6：选用步骤5确定的适宜的pH和组分条件的提取液，对经过步骤2处理的鸡粪样品进行提取和分离操作，得到提取物溶液；
步骤7：调节步骤6得到的提取物溶液的pH，根据pH不同分为多组；
步骤8：将步骤7得到的数组提取物溶液分别用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到数组提取物洗脱液，所述数组提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到数组检测样品液；
步骤9：检测步骤8得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于步骤7调节pH而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取物溶液适宜的pH条件；
步骤10：利用前述步骤所确定的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件的提取液对步骤1得到的鸡粪样品进行提取和分离操作，得到提取物溶液；调节提取物溶液至步骤9所确定的适宜的pH条件；将所述提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到用于给出最终检测结果的检测样品液。
相比于现有技术中，对所有鸡粪样品都采用相同的条件进行提取和净化，本技术方案中，考虑到不同的鸡粪样品之间的差异。因而，在步骤2-步骤5中，首先确认适用于对应样品的提取液的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件。随后采用适宜条件的提取液提取鸡粪样品，在步骤6-步骤9中，确定过HLB固相萃取小柱前提取物溶液适宜的pH条件。最后采用上述确定的适宜的条件对鸡粪样品进行提取、净化和检测。这样能够保证对鸡粪样品中的抗生素具有高的回收率，从而使得检测结果更加准确。
优选的，在步骤3-步骤5中对混标使用液进行相同的操作，得到混标使用液的空白加标回收率，利用空白加标回收率与样品加标回收率对比，辅助确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；在步骤6-步骤9中对混标使用液进行相同的操作，得到混标使用液的空白加标回收率，利用空白加标回收率与样品加标回收率对比，辅助确定提取物溶液适宜的pH条件。采用该优选方案后，在确定适宜提取和净化条件的过程中，可通过空白加标回收率与样品加标回收率之间的比较，为技术人员提供更多的信息，帮助其分析如何为摸索适宜条件而调节实验条件的方向。
优选的，在步骤9完成后还进行如下额外步骤：
额外步骤9-1：将缓冲溶液和提取组分混合配制成提取液，所述提取液根据pH条件和/或组分条件的变化制备数组；将经过步骤2处理的鸡粪样品用所述数组提取液分别单独使用或数次交错使用，进行提取和分离操作，得到数组提取物溶液；
额外步骤9-2：调节额外步骤9-1得到的数组提取物溶液的pH全部调至步骤9所确定的适宜的pH条件；
额外步骤9-3：将额外步骤9-2得到的提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到检测样品液；
额外步骤9-4：检测额外步骤9-3得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于额外步骤9-1操作的不同而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；
额外步骤9-4完成后进行步骤10的操作，在步骤10中，利用额外步骤9-4所确定的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件的提取液对步骤1得到的鸡粪样品进行提取和分离操作。
采用该优选方案后，先确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件，然后在使用适宜提取液条件的前提下确定提取物溶液过HLB固相萃取小柱前适宜的pH条件，最后在使用上述提取物溶液过HLB固相萃取小柱前适宜的pH条件的前提下，再次确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件。通过上述优选方案，能够更加准确地找到提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件，进一步提高鸡粪样品中抗生素的回收率。
优选的，所述抗生素包括磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素和抗生素增效剂中的一种或多种；所述磺胺类抗生素包括磺胺二甲异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉中的一种或多种；所述喹诺酮类抗生素抗生素包括诺氟沙星、环丙沙星、恩氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、达氟沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星和氟罗沙星中的一种或多种；所述四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素中的一种或多种；所述抗生素增效剂包括甲氧苄氨嘧啶和奥美普林中的一种或多种。本发明的技术方案适用范围广，包括各种常用于饲料的抗生素。
优选的，步骤3所述缓冲溶液包括Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液或Na2EDTA-Na2HPO4缓冲溶液中的一种或多种。
优选的，步骤3所述提取组分为甲醇或乙腈。
上述优选方案提供了适用于配制提取液的组分。
优选的，对检测样品液中抗生素进行检测的方法为高效液相色谱-串联质谱法或高效液相色谱荧光检测法中的一种。本优选方案提供了适用于检测抗生素含量的方法。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.相比于现有技术中，对所有鸡粪样品都采用相同的条件进行提取和净化，本技术方案中，考虑到不同的鸡粪样品之间的差异，根据空白加标回收率和样品加标回收率的大小，对不同的鸡粪样品预先进行适宜提取和净化条件的确定。采用上述确定的适宜的条件对鸡粪样品进行提取、净化和检测。这样能够保证对鸡粪样品中的抗生素具有高的回收率，从而使得检测结果更加准确。
2.在确定适宜提取和净化条件的过程中，可通过空白加标回收率与样品加标回收率之间的比较，为技术人员提供更多的信息，帮助其分析如何为摸索适宜条件而调节实验条件的方向。
3.先确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件，然后在使用适宜提取液条件的前提下确定提取物溶液过HLB固相萃取小柱前适宜的pH条件，最后在使用上述提取物溶液过HLB固相萃取小柱前适宜的pH条件的前提下，再次确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件。通过上述优选方案，能够更加准确地找到提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件，进一步提高鸡粪样品中抗生素的回收率。
4.本发明的技术方案适用范围广，包括各种常用于饲料的抗生素。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1是本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
下面结合图1对本发明作详细说明。
一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，包括如下步骤：
步骤1：对鸡粪样品进行冷冻干燥、粉碎和过筛。
步骤2：配制待检抗生素的混标使用液，向经过步骤1处理的鸡粪样品中加入混标使用液。
步骤3：将缓冲溶液和提取组分混合配制成提取液，所述提取液根据pH条件和/或组分条件的变化制备数组；将经过步骤2处理的鸡粪样品用所述数组提取液分别单独使用或数次交错使用，进行提取和分离操作，得到数组提取物溶液。
步骤4：将步骤3得到的提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到检测样品液。
步骤5：检测步骤4得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于步骤3操作的不同而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件。
步骤6：选用步骤5确定的适宜的pH和组分条件的提取液，对经过步骤2处理的鸡粪样品进行提取和分离操作，得到提取物溶液。
步骤7：调节步骤6得到的提取物溶液的pH，根据pH不同分为多组。
步骤8：将步骤7得到的数组提取物溶液分别用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到数组提取物洗脱液，所述数组提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到数组检测样品液。
步骤9：检测步骤8得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于步骤7调节pH而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取物溶液适宜的pH条件。
步骤10：利用前述步骤所确定的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件的提取液对步骤1得到的鸡粪样品进行提取和分离操作，得到提取物溶液；调节提取物溶液至步骤9所确定的适宜的pH条件；将所述提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到用于给出最终检测结果的检测样品液。
作为一种优选的方式，在步骤3-步骤5中对混标使用液进行相同的操作，得到混标使用液的空白加标回收率，利用空白加标回收率与样品加标回收率对比，辅助确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；在步骤6-步骤9中对混标使用液进行相同的操作，得到混标使用液的空白加标回收率，利用空白加标回收率与样品加标回收率对比，辅助确定提取物溶液适宜的pH条件。
作为一种优选的方式，在步骤9完成后还进行如下额外步骤：
额外步骤9-1：将缓冲溶液和提取组分混合配制成提取液，所述提取液根据pH条件和/或组分条件的变化制备数组；将经过步骤2处理的鸡粪样品用所述数组提取液分别单独使用或数次交错使用，进行提取和分离操作，得到数组提取物溶液；
额外步骤9-2：调节额外步骤9-1得到的数组提取物溶液的pH全部调至步骤9所确定的适宜的pH条件；
额外步骤9-3：将额外步骤9-2得到的提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到检测样品液；
额外步骤9-4：检测额外步骤9-3得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于额外步骤9-1操作的不同而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；
额外步骤9-4完成后进行步骤10的操作，在步骤10中，利用额外步骤9-4所确定的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件的提取液对步骤1得到的鸡粪样品进行提取和分离操作。
作为一种优选的方式，所述抗生素包括磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素和抗生素增效剂中的一种或多种；所述磺胺类抗生素包括磺胺二甲异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉中的一种或多种；所述喹诺酮类抗生素抗生素包括诺氟沙星、环丙沙星、恩氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、达氟沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星和氟罗沙星中的一种或多种；所述四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素中的一种或多种；所述抗生素增效剂包括甲氧苄氨嘧啶和奥美普林中的一种或多种。
作为一种优选的方式，步骤3所述缓冲溶液包括Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液或Na2EDTA-Na2HPO4缓冲溶液中的一种或多种。
作为一种优选的方式，步骤3所述提取组分为甲醇或乙腈。
例如，提取液的组成和使用方法可以从如下组合方式中进行选取：pH 3.0 EDTA-NaH2PO4缓冲液5.0mL+5.0mL乙腈提取3次、pH 10.0 EDTA-Na2HPO4缓冲液5.0mL+5.0mL乙腈提取3次、pH 3.0 EDTA-NaH2PO4缓冲液5.0mL+5.0mL乙腈与pH 10.0 EDTA-Na2HPO4缓冲液5.0mL+5.0mL乙腈交错各提取2次、pH 3.5 EDTA-Mcllvaine缓冲液6.0mL+4.0mL甲醇提取3次、pH 9.5 EDTA-Na2HPO4缓冲液6.0mL+4.0mL甲醇提取3次、pH 3.5 EDTA-Mcllvaine缓冲液6.0mL+4.0mL甲醇与pH 9.5 EDTA-Na2HPO4缓冲液6.0mL+4.0mL甲醇交错各提取2次。
作为一种优选的方式，对检测样品液中抗生素进行检测的方法为高效液相色谱-串联质谱法或高效液相色谱荧光检测法中的一种。
下面通过一个具体的实施例对本申请的方案做进一步的说明。
实施例1
本实施例的具体过程如下：
1.标准溶液的准备
1.1标准品选用：磺胺二甲异嘧啶钠(DR)、磺胺醋酰(DR)、磺胺嘧啶(DR)、磺胺噻唑(DR)、磺胺吡啶(DR)、磺胺甲基嘧啶(DR)、磺胺二甲基嘧啶(DR)、磺胺甲噻二唑(DR)、磺胺甲氧哒嗪(DR)、磺胺对甲氧嘧啶钠盐(DR)、磺胺间甲氧嘧啶钠盐(DR)、磺胺氯哒嗪(DR)、磺胺邻二甲氧嘧啶(DR)、磺胺甲噁唑(DR)、磺胺二甲异噁唑(DR)、磺胺间二甲氧嘧啶(DR)、磺胺喹噁啉(DR)17种磺胺类抗生素；诺氟沙星(中检所)、环丙沙星(中检所)、恩氟沙星(DR)、氧氟沙星(中检所)、盐酸二氟沙星(DR)、达氟沙星(DR)、甲磺酸培氟沙星(DR)、盐酸洛美沙星(DR)、氟罗沙星(DR)9种喹诺酮类抗生素，四环素(中检所)、土霉素(中检所)、盐酸金霉素(中检所)和盐酸强力霉素(DR)4种四环素类抗生素；甲氧苄氨嘧啶(DR)和奥美普林(DR)2种抗生素增效剂。
1.2标准品储备液：称取适量的上述标准品，用甲醇配制为200μg/mL的储备液，储存于4℃冰箱中。用时取储备液各1.00mL于50mL容量瓶，加甲醇定容配制为4μg/mL的混标工作液，取混标工作液用CH3OH和体积分数0.5％的甲酸水溶液按比例3:7配制成的溶剂稀释为0.5μg/mL的混标使用液。
2.分析液的制备
2.1将鸡粪样品盛装在小烧杯中，冷冻干燥，粉碎过20目的筛子。
2.2提取
准确称取多份0.5g鸡粪样品于50mL离心管中，一半加入1.00mL0.5μg/mL的混标使用液，全部均加入10.0mL提取液(X mL缓冲溶液+(10－X)mL甲醇或乙腈，X的具体的值见下文)，涡旋1min，20℃超声10min(KQ-300GDV型恒温数控超声波清洗器完成)，20℃5000r/min离心10min(ST 16R centrifuge完成)，转出离心液，下层残渣重复2-3次上述提取操作。合并离心液转入500mL试剂瓶，加超纯水至300-400mL，得到提取物溶液。部分提取物溶液用磷酸调节pH至4.0-5.0待净化。同时作空白加标1.00mL 0.5μg/mL的混标使用液，所有步骤同鸡粪样品提取相同。
缓冲液配制如下几种：
Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：10.5g柠檬酸(C6H8O7.H2O)，7.8g磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)和37.2g Na2EDTA.2H2O，加水溶解配制成1000mL缓冲溶液，用2mol/L NaOH调节pH 3.5
Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液：7.8g磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)和18.6gNa2EDTA.2H2O，加水溶解配制成1000mL缓冲溶液(pH 4.5)，用2mol/LH3PO4调节pH 3.0。
Na2EDTA-Na2HPO4缓冲溶液：17.9g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)和18.6gNa2EDTA.2H2O，加水溶解配制成1000mL缓冲溶液(pH 6.6)。用时取足够量缓冲溶液用2mol/LH3PO4或2mol/L NaOH调节pH 6.0、7.5、8.5、9.5、10.0。
2.3过柱净化
用5mL甲醇、5mL水活化InertSep HLB 500mg/6mL固相萃取小柱，弃去流出液；将“2.2”节样品溶液、样品加标液和空白加标液上样，弃去流出液；用5mL水淋洗，弃去流出液。减压抽干小柱10min，用6mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液于15mL离心管中，得到提取物洗脱液。
2.4氮吹浓缩
将2.3节得到的收集液在35℃下氮吹至近干，用CH3OH和体积分数0.5％的HCOOH水溶液按比例3:7混合的溶剂定容至2.00mL，涡旋混匀，20℃超声10min,再20℃5000r/min离心10min，上清液过0.22μm微孔滤膜，供LC-MS/MS分析(岛津LCMS8030液相色谱-质谱联用仪)。
3.LC-MS/MS检测
3.1色谱条件
色谱柱Shim-pack GIST C18，100mm×2.1mm，2μm(P/N:227-30001-04)；流速0.3mL/min；进样量5μL；柱温40℃；运行时间17min；流动相A体积分数0.2％甲酸-水，B乙腈。梯度洗涤程序见表1。
表1高效液相色谱梯度洗涤程序
Figure BDA0002246105680000091
3.2质谱条件
离子化模式为ESI正离子模式；扫描模式为多反应监测(MRM)；碰撞气为氩气；雾化气为氮气3L/min；干燥气为氮气15L/min；加热模块温度400℃；DL温度250℃。各化合物的MRM参数见表2。
表2化合物MRM参数
Figure BDA0002246105680000092
Figure BDA0002246105680000101
4.净化条件的选择
4.1 InertSep HLB(日本岛津)固相萃取小柱净化磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗生素的条件选择
4.1.1提取物溶液过柱前未调pH
按“2.2”节提取，根据所采用的缓冲溶液的pH分为3组，第一组pH 3.0提取3次，第二组pH 10.0提取3次，第三组pH 3.0和pH 10.0交叉各提取2次，每次10mL提取液由缓冲溶液5.00mL加入5.00mL乙腈组成。合并每份提取鸡粪样品后的提取液加纯水至300mL-400mL得到提取物溶液，过已经活化的HLB小柱，过柱前未调节pH。样品加标回收比/空白加标回收比见表3。回收比的比较基准是取“1.2”节0.5μg/mL的混标使用液加入CH3OH与体积分数0.5％甲酸水溶液按比例3:7配制的溶剂稀释1倍与加标回收检测样品液的浓度相当，LC-MS/MS分析峰面积的比值代表回收比，样品加标回收比计算时样品中含有的组分扣除样品本底值(表3-表5回收比的计算方法相同)。
表3样品加标回收比/空白加标回收比(过柱前未调提取物溶液pH)
Figure BDA0002246105680000111
Figure BDA0002246105680000121
由表3可知，32种监测物质在pH 10.0条件下过柱多数物质空白加标回收比远小于1，而空白加标体系除了缓冲物质之外就是加入混标物质，体系比较简单，说明三类抗生素在碱性条件下HLB固相萃取小柱对多数监测组分的保留弱；pH 3.0和pH 3.0+pH 10.0混合空白加标回收比在0.85-1.12，因此HLB柱子净化32种组分适合弱酸至中性环境过柱。鸡粪样品中多数监测组分pH 10.0的加标回收比较空白加标回收比大，说明样品基质复杂使溶液的pH有所下降。
4.1.2提取物溶液过柱前调pH 3.5-5.0
按“2.2”节提取，根据所采用的缓冲溶液的pH分为3组，第一组pH 3.5提取3次，第二组pH 9.5提取3次，第三组pH 3.5与pH 9.5交叉提取2次，每次提取液10mL由缓冲溶液6.00mL加入4.00mL甲醇。合并每份提取鸡粪样品后的提取液加纯水至300mL-400mL过HLB小柱，pH 3.5缓冲液配制提取液得到的提取物溶液在过柱前未调pH，而用pH 9.5和pH3.5+pH9.5的缓冲溶液配制的提取液得到的提取物溶液在过柱前用H3PO4调节pH至4.0-5.0之间。样品加标回收比/空白加标回收比见表4。
表4样品加标回收比/空白加标回收比(过柱前调溶液pH)
Figure BDA0002246105680000131
表中32种监测物质三种提取模式96种组合除金霉素pH 9.5提取空白回收比较小外，95种空白加标回收比在0.90-1.13，表明HLB固相萃取小柱对监测32种物质在pH 3.5-5.0有较好保留。pH3.5-5.0采用岛津HLB固相萃取小柱净化磺胺类、喹诺酮类、四环素类物质是可行的，即当提取物溶液pH不在该范围的用酸碱调节至pH4.0-5.0。
4.2提取液选择
4.2.1提取液组成的选择
分析表3和表4，由pH 3.0、pH 3.5、pH 9.5和pH3.5+pH9.5的缓冲液配制的提取液提取鸡粪样品，得到的提取物溶液在过柱调节pH至3.0-5.0的情况下，空白加标回收率为90％-112％。鸡粪样品中多数磺胺类物质在pH 9.5和pH3.5+pH9.5的缓冲液配制的提取液中的回收率相比pH 3.0和pH3.5的缓冲液配制的提取液更好；鸡粪中的喹诺酮类抗生素在pH3.0、pH3.5的缓冲液配制的提取液中回收比较低(在本技术方案中的提取液和温度情况下)，而pH3.5+pH9.5的缓冲液配制的提取液较pH 9.5的缓冲液配制的提取液提取效果更好，鸡粪中的四环素类抗生素在pH3.5+pH9.5的缓冲液配制的提取液中较pH 3.0、3.5和9.5的缓冲液配制的提取液中具有更好的回收率，因而可选择中性附近研究提取液的适宜pH。
4.2.2提取液pH的选择
按“2.2”节提取，根据所采用的缓冲溶液的pH分为4组，每份提取3次，每次所用10mL提取液由8.0mL(Na2EDTA+Na2HPO4)和2.0mL CH3OH组成。合并3次提取鸡粪样品后的提取液加纯水至300mL-400mL调pH4.0-5.0后过已经活化的HLB小柱，同时作空白加标、样品加标和样品，样品加标回收比/空白加标回收比见表5。
表5提取液pH不同的样品加标回收比/空白加标回收比(过柱前调pH4.0-5.0)
Figure BDA0002246105680000141
Figure BDA0002246105680000151
表5结果显示，提取液10mL由8.0mL Na2EDTA-Na2HPO4(pH6.0-6.6)和2.0mL CH3OH组成的情况下，20℃超声提取和20℃离心分离条件下提取3次鸡粪中的磺胺类、喹诺酮类和四环素类，样品加标回收率在67％-97％，空白加标回收率在90％-107％。四环素类尤其是金霉素受pH影响较大。
5结论
针对本实施例中的鸡粪样品，适宜条件的判断标准为兼顾磺胺类、喹诺酮类和四环素类回收率相对较好的条件，从而确定提取和净化的条件如下：提取液采用pH6.0-6.6Na2EDTA-Na2HPO4缓冲液与CH3OH体积比8:2配制而成，在20℃超声提取和20℃离心分离条件下提取鸡粪3次，提取液加水稀释至300-400mL得到提取物溶液，用H3PO4调节提取物溶液pH至4.0-5.0，过已活化的HLB固相萃取小柱净化，用甲醇洗脱，氮吹近干，用体积分数0.5％的HCOOH水溶液与CH3OH体积比7:3的比例配制的溶剂进行定容得到检测样品液。上述条件可作为同时提取和净化本实施例鸡粪样品中的磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗生素的前处理条件，得到的检测样品液可进一步进行抗生素浓度的检测，具有更高的回收率。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：对鸡粪样品进行冷冻干燥、粉碎和过筛；
步骤2：配制待检抗生素的混标使用液，向经过步骤1处理的鸡粪样品中加入混标使用液；
步骤3：将缓冲溶液和提取组分混合配制成提取液，所述提取液根据pH条件和/或组分条件的变化制备数组；将经过步骤2处理的鸡粪样品用所述数组提取液分别单独使用或数次交错使用，进行提取和分离操作，得到数组提取物溶液；
步骤4：将步骤3得到的提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到检测样品液；
步骤5：检测步骤4得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于步骤3操作的不同而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；
步骤6：选用步骤5确定的适宜的pH和组分条件的提取液，对经过步骤2处理的鸡粪样品进行提取和分离操作，得到提取物溶液；
步骤7：调节步骤6得到的提取物溶液的pH，根据pH不同分为多组；
步骤8：将步骤7得到的数组提取物溶液分别用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到数组提取物洗脱液，所述数组提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到数组检测样品液；
步骤9：检测步骤8得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于步骤7调节pH而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取物溶液适宜的pH条件；
步骤10：利用前述步骤所确定的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件的提取液对步骤1得到的鸡粪样品进行提取和分离操作，得到提取物溶液；调节提取物溶液至步骤9所确定的适宜的pH条件；将所述提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到用于给出最终检测结果的检测样品液。
2.按照权利要求1所述的一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于：在步骤3-步骤5中对混标使用液进行相同的操作，得到混标使用液的空白加标回收率，利用空白加标回收率与样品加标回收率对比，辅助确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；在步骤6-步骤9中对混标使用液进行相同的操作，得到混标使用液的空白加标回收率，利用空白加标回收率与样品加标回收率对比，辅助确定提取物溶液适宜的pH条件。
3.按照权利要求1所述的一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于，在步骤9完成后还进行如下额外步骤：
额外步骤9-1：将缓冲溶液和提取组分混合配制成提取液，所述提取液根据pH条件和/或组分条件的变化制备数组；将经过步骤2处理的鸡粪样品用所述数组提取液分别单独使用或数次交错使用，进行提取和分离操作，得到数组提取物溶液；
额外步骤9-2：调节额外步骤9-1得到的数组提取物溶液的pH全部调至步骤9所确定的适宜的pH条件；
额外步骤9-3：将额外步骤9-2得到的提取物溶液用HLB固相萃取小柱净化浓缩，洗脱后得到提取物洗脱液，所述提取物洗脱液干燥浓缩定容后得到检测样品液；
额外步骤9-4：检测额外步骤9-3得到的检测样品液中各种抗生素的含量，计算由于额外步骤9-1操作的不同而得到的数组检测样品液的样品加标回收率，根据样品加标回收率确定提取液适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件；
额外步骤9-4完成后进行步骤10的操作，在步骤10中，利用额外步骤9-4所确定的适宜的pH条件、组分条件和组合使用条件的提取液对步骤1得到的鸡粪样品进行提取和分离操作。
4.按照权利要求1所述的一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于：所述抗生素包括磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素和抗生素增效剂中的一种或多种；所述磺胺类抗生素包括磺胺二甲异嘧啶、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉中的一种或多种；所述喹诺酮类抗生素抗生素包括诺氟沙星、环丙沙星、恩氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、达氟沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星和氟罗沙星中的一种或多种；所述四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和强力霉素中的一种或多种；所述抗生素增效剂包括甲氧苄氨嘧啶和奥美普林中的一种或多种。
5.按照权利要求1所述的一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于：步骤3所述缓冲溶液包括Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液、Na2EDTA-NaH2PO4缓冲溶液或Na2EDTA-Na2HPO4缓冲溶液中的一种或多种。
6.按照权利要求1所述的一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于：步骤3所述提取组分为甲醇或乙腈。
7.按照权利要求1所述的一种提高回收率的鸡粪抗生素提取和净化方法，其特征在于：对检测样品液中抗生素进行检测的方法为高效液相色谱-串联质谱法或高效液相色谱荧光检测法中的一种。
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