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CN110719955B - 提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用 - Google Patents

提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用 Download PDF

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CN110719955B CN201780090467.1A CN201780090467A CN110719955B CN 110719955 B CN110719955 B CN 110719955B CN 201780090467 A CN201780090467 A CN 201780090467A CN 110719955 B CN110719955 B CN 110719955B
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Abstract

提供一组提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用。所述Phi29 DNA聚合酶突变体是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙得到的蛋白质，所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基，所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基，所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。所述Phi29 DNA聚合酶突变体的稳定性高于phi29 DNA聚合酶。

Description

提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用。
背景技术
Phi29 DNA聚合酶是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Phi29噬菌体的DNA聚合酶，属于B族DNA聚合酶。Phi29 DNA聚合酶的晶体结构显示，除了具有一般B族DNA聚合酶的保守的手掌(Palm)、拇指(Thumb)、手指(Finger)和外切(Exo)结构域外，Phi29 DNA聚合酶还拥有另外两个独特的结构域：TPR1和TPR2结构域。TPR2结构域参与形成围绕下游模板DNA链的狭小通道，迫使双链DNA的解离；与此同时，Palm、Thumb、TPR1和TPR2结构域形成圆圈状结构，紧密地结合在上游模板链形成的双链DNA上。Phi29 DNA聚合酶的结构特征赋予了其特殊的高持续合成能力和较强的链置换功能，以及3’→5’外切酶校正活性。常应用于微量的环状质粒的滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)或基因组的多重链置换扩增(Multiple Displacement Amplification，MDA)等恒温扩增过程，进一步地可应用于高通量测序的文库制备及链置换扩增等步骤。
Phi29 DNA聚合酶是中温酶，热稳定性较差，65℃加热10min即可失活。在实际的应用中，常因此而影响Phi29 DNA聚合酶的产品储存期限、DNA扩增和测序的效果等。
针对Phi29 DNA聚合酶的热稳定性改良及扩增效率优化，目前的研究主要从两方面展开：一方面是对储存缓冲液或反应缓冲液进行优化，比如加入一些表面活性剂或相溶性溶质；另一方面是对蛋白序列进行突变改造或构建嵌合体蛋白。
现有的技术发明虽然在一定程度上改善了Phi29 DNA聚合酶的热稳定性，但对具有较高热稳定性Phi29 DNA聚合酶的改造还需持续进行。一方面是因为针对热稳定性的突变会对聚合酶的其他结构域功能造成影响，进而影响下游应用，结合不同应用对Phi29 DNA聚合酶的改造仍具有现实意义。另一方面，商业竞争和专利权的约束，也会趋使企业避开专利侵权风险，开发出自己的专利产品。
发明公开
本发明的目的是提供提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用。
本发明提供了一种蛋白质，是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基；所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。
所述点突变甲具体可为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为H、A或K。所述点突变乙具体可为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为K、F、I或H。所述点突变丙具体可为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为G或P。
所述蛋白质具体为如下(1)-(19)中的任一种：
(1)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(2)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(3)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(4)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(5)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(6)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(7)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(8)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(9)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(10)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(11)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(12)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为I；
(13)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(14)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(15)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A；
(16)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K；
(17)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第123位氨基酸残基由L突变为K；
(18)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第515位氨基酸残基由E突变为G；
(19)将(1)-(18)中的任一种蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述蛋白质具体可为将(1)-(18)中的任一种蛋白质的末端连接His6标签得到的融合蛋白质。所述蛋白质具体可为将(1)-(18)中的任一种蛋白质的N端连接His6标签得到的融合蛋白质。
所述蛋白质的稳定性高于phi29 DNA聚合酶。所述稳定性具体可为热稳定性。所述热稳定性具体可为37℃下的热稳定性。
本发明还保护编码所述蛋白质的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、含有所述核酸分子的重组菌或含有所述核酸分子的转基因细胞系。
所述核酸分子具体可为如下(1)-(19)任一所述的DNA分子：
(1)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”；
(2)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”；
(3)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“TTT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”；
(4)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”；
(5)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“AAA”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”；
(6)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“TTT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(7)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(8)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(9)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(10)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“CAT”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(11)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“CAT”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(12)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”；
(13)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(14)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(15)将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”；
(16)将序列表的序列2所示的DNA分子第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“AAA”；
(17)将序列表的序列2所示的DNA分子第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”；
(18)将(1)-(17)中的任一种DNA分子的5’端或/和3’端连接编码标签序列的核苷酸得到的融合DNA分子；
(19)与(1)-(18)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码上述蛋白质的DNA分子。
所述重组载体为在表达载体中插入所述核酸分子得到的。
所述表达载体具体可为pET28a(+)载体。
所述重组菌为将所述重组载体导入出发菌得到的菌。
所述出发菌可为大肠杆菌。
所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述转基因细胞系可为将所述重组载体转化受体细胞获得的。所述转基因细胞系为非植物繁殖材料。
本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)或(f)或(g)：
(a)作为DNA聚合酶；
(b)催化DNA复制和/或催化DNA扩增；
(c)催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增；
(d)制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的试剂盒；
(e)制备用于催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增的试剂盒；
(f)进行DNA测序或RNA测序；
(g)制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。
本发明还保护编码所述蛋白质的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、含有所述核酸分子的重组菌或含有所述核酸分子的转基因细胞系的应用，为如下(h)或(i)或(j)或(k)：
(h)制备DNA聚合酶；
(i)制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的试剂盒；
(j)制备用于催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增的试剂盒；
(k)制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。
本发明还保护一种提高phi29 DNA聚合酶稳定性的方法，包括如下步骤：将phi29DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙；所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基；所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。
所述点突变甲具体可为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为H、A或K。所述点突变乙具体可为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为K、F、I或H。所述点突变丙具体可为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为G或P。
所述方法具体可为如下(1)-(18)中的任一种：
(1)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(2)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(3)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(4)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(5)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(6)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(7)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(8)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(9)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(10)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(11)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(12)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为I；
(13)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(14)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(15)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为A；
(16)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第97位氨基酸残基由M突变为K；
(17)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第123位氨基酸残基由L突变为K；
(18)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变：第515位氨基酸残基由E突变为G。
所述稳定性具体可为热稳定性。所述热稳定性具体可为37℃下的热稳定性。
所述phi29 DNA聚合酶具体可为如下(I)或(II)或(III)：
(I)序列表的序列1所示的蛋白质；
(II)与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性且来源于枯草芽孢杆菌的蛋白质；
(III)与序列表的序列1所示的蛋白质具有95％以上同一性且来源于枯草芽孢杆菌的蛋白质。
实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的各个溶液或缓冲液，如无特殊说明，溶剂均为水。
pET28a(+)载体：Novagen公司。
大肠杆菌BL21(DE3)：TIANGEN，CB105-02。
储存缓冲液：10mM Tris-HCl，100mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5％(v/v)
Figure GPA0000280281650000081
20，0.5％(v/v)NP-40，50％(v/v)Glycerol；pH7.4@25℃。
下述实施例中的141 RCA Primer：TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT。
下述实施例中的141Ad ssDNA：BGI自制，为一定大小范围的单链环文库，无固定序列(由A/T/C/G四种核苷酸组成的随机文库，主带长度为200-300bp)。
实施例1、重组菌的构建和蛋白的纯化
一、重组载体的构建
将序列表的序列2所示的DNA分子插入pET28a(+)载体的NdeI和BamHI酶切位点之间，得到重组载体WT。序列表的序列2所示的DNA分子表达序列表的序列1所示的蛋白质。序列表的序列1所示的蛋白质即野生型Phi29 DNA聚合酶(用WT表示)。
以重组载体WT为出发载体，采用表1所示的各个引物对引入点突变，得到各个重组载体。
表1
Figure GPA0000280281650000091
与重组载体WT相比，重组载体M97A的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”。突变后的DNA分子编码突变体M97A。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97A的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了A。
与重组载体WT相比，重组载体M97K的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”。突变后的DNA分子编码突变体M97K。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K。
与重组载体WT相比，重组载体L123K的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“AAA”。突变后的DNA分子编码突变体L123K。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体L123K的差别仅在于将第123位氨基酸残基由L突变为了K。
与重组载体WT相比，重组载体E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体E515G的差别仅在于将第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97A-L123I的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”。突变后的DNA分子编码突变体M97A-L123I。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97A-L123I的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了A，并且第123位氨基酸残基由L突变为了I。
与重组载体WT相比，重组载体M97A-L123H-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97A-L123H-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97A-L123H-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了A，并且第123位氨基酸残基由L突变为了H，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97A-L123F-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“TTT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97A-L123F-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97A-L123F-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了A，并且第123位氨基酸残基由L突变为了F，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97A-L123H-E515P的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“GCG”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”。突变后的DNA分子编码突变体M97A-L123H-E515P。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97A-L123H-E515P的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了A，并且第123位氨基酸残基由L突变为了H，并且第515位氨基酸残基由E突变为了P。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-L123K-E515P的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“AAA”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-L123K-E515P。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-L123K-E515P的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第123位氨基酸残基由L突变为了K，并且第515位氨基酸残基由E突变为了P。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-L123F-E515P的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“TTT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-L123F-E515P。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-L123F-E515P的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第123位氨基酸残基由L突变为了F，并且第515位氨基酸残基由E突变为了P。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-L123I-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-L123I-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-L123I-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第123位氨基酸残基由L突变为了I，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-L123H-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-L123H-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-L123H-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第123位氨基酸残基由L突变为了H，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-L123I-E515P的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-L123I-E515P。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-L123I-E515P的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第123位氨基酸残基由L突变为了I，并且第515位氨基酸残基由E突变为了P。
与重组载体WT相比，重组载体M97K-L123H-E515P的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“AAA”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“CCG”。突变后的DNA分子编码突变体M97K-L123H-E515P。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97K-L123H-E515P的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了K，并且第123位氨基酸残基由L突变为了H，并且第515位氨基酸残基由E突变为了P。
与重组载体WT相比，重组载体M97H-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97H-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97H-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了H，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97H-L123I-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“CAT”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“ATT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97H-L123I-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97H-L123I-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了H，并且第123位氨基酸残基由L突变为了I，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
与重组载体WT相比，重组载体M97H-L123H-E515G的差别仅在于：将序列表的序列2所示的DNA分子第289-291位核苷酸由“ATG”突变为了“CAT”，并且第367-369位核苷酸由“CTG”突变为了“CAT”，并且第1543-1545位核苷酸由“GAA”突变为了“GGC”。突变后的DNA分子编码突变体M97H-L123H-E515G。与野生型Phi29 DNA聚合酶相比，突变体M97H-L123H-E515G的差别仅在于将第97位氨基酸残基由M突变为了H，并且第123位氨基酸残基由L突变为了H，并且第515位氨基酸残基由E突变为了G。
二、重组菌的构建
分别将步骤一构建的各个重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到各个重组菌。
按照与重组载体名称对应的原则，依次命名为重组菌WT、重组菌M97A、重组菌L123K、重组菌E515G、重组菌M97A-L123I、重组菌M97A-L123H-E515G、重组菌M97A-L123F-E515G、重组菌M97A-L123H-E515P、重组菌M97K-E515G、重组菌M97K-L123K-E515P、重组菌M97K-L123F-E515P、重组菌M97K-L123I-E515G、重组菌M97K-L123H-E515G、重组菌M97K-L123I-E515P、重组菌M97K-L123H-E515P、重组菌M97H-E515G、重组菌M97H-L123I-E515G和重组菌M97H-L123H-E515G。
三、重组菌的诱导表达
取步骤二获得的各个重组菌，依次进行诱导和纯化，得到N端融合有His6标签的各个蛋白质。按照与重组菌名称对应的原则，将得到的各个蛋白质依次命名为具有His6标签的野生型Phi29 DNA聚合酶、具有His6标签的突变体M97A、具有HIs6标签的突变体L123K、具有Hos6标签的突变体E515G、具有His6标签的突变体M97A-L123I、具有His6标签的突变体M97A-L123H-E515G、具有His6标签的突变体M97A-L123F-E515G、具有His6标签的突变体M97A-L123H-E515P、具有His6标签的突变体M97K-E515G、具有His6标签的突变体M97K-L123K-E515P、具有His6标签的突变体M97K-L123F-E515P、具有His6标签的突变体M97K-L123I-E515G、具有His6标签的突变体M97K-L123H-E515G、具有HIs6标签的突变体M97K-L123I-E515P、具有His6标签的突变体M97K-L123H-E515P、具有His6标签的突变体M97H-E515G、具有His6标签的突变体M97H-L123I-E515G和具有His6标签的突变体M97H-L123H-E515G。
1、诱导的具体步骤如下：
(1)活菌
将重组菌接种至3ml含Kana抗性的液体LB培养基中，过夜培养。
(2)转接
完成步骤(1)后，按1/100体积将以上菌液转接至2ml含Kana抗性的液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.6(实际应用中，OD600nm＝0.4-0.8均可)。
(3)诱导
完成步骤(2)后，向体系中加入加入终浓度0.5mM的IPTG，16℃、220rpm振荡培养12h。
(4)收集菌体
完成步骤(3)后，4℃、8000rpm离心5min，收集菌体。
2、使用GE公司的
Figure GPA0000280281650000131
Pure纯化系统进行纯化，具体步骤如下：
(1)取步骤1得到的菌体，用重悬缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mMImidazole，5％Glycerol；pH 7.9@25℃)震荡混匀后，置冰上超声破碎，然后4℃、12000rpm离心30min，收集上清液。
(2)取步骤(1)得到的上清液，采用镍柱亲和层析(HisTrap FF 5ml预装柱)进行纯化。具体步骤：先用10个柱体积的Buffer A平衡；然后上样；然后用20个柱体积的Buffer A冲洗；然后用15个柱体积的洗脱液进行洗脱并收集具有目的蛋白的过柱后溶液(洗脱液由Buffer A和Buffer B组成，洗脱过程中，Buffer B的体积份数由0％线性上升至100％，相应的Buffer A的体积份数由100％线性下降至0％)。
Buffer A：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM Imidazole，5％(v/v)Glycerol；pH7.9@25℃。
Buffer B：20mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mM Imidazole，5％(v/v)Glycerol；pH7.9@25℃。
(3)取步骤(2)得到的过柱后溶液，采用强阴离子柱层析(HiTrap Q HP 5ml预装柱)进行纯化。具体步骤：先用10个柱体积的由体积份数59％的Buffer A和体积份数41％的Buffer B组成的混合缓冲液平衡；然后上样；待蛋白峰出现后收集流穿液(UV检测值升至20mAu后即收集，UV检测值降至50mAu后停止收集)。
Buffer A：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，5％(v/v)Glycerol，pH7.5@25℃。
Buffer B：20mM Tris-HCl，1M NaCl，5％(v/v)Glycerol，pH7.5@25℃。
(4)取步骤(3)得到的流穿液，采用阳离子交换层析(HiTrap SP HP预装柱)进行纯化，获得纯度大于95％的蛋白样本溶液。具体步骤：先用10个柱体积的Buffer A平衡；然后上样；然后用15个柱体积的Buffer A冲洗；然后用10个柱体积的洗脱液进行洗脱(洗脱液由Buffer A和Buffer B组成，洗脱过程中，Buffer B的体积份数由0％线性上升至50％，相应的Buffer A的体积份数由100％线性下降至50％)并收集具有目的蛋白的过柱后溶液(UV检测值升至50mAu后即收集，UV检测值降至100mAu后停止收集)。
Buffer A：20mM Tris-HCl，150mM NaCl，5％(v/v)Glycerol，pH7.5@25℃。
Buffer B：20mM Tris-HCl，1M NaCl，5％(v/v)Glycerol，pH7.5@25℃。
(5)取步骤(4)收集到的目的蛋白转移到透析袋中，在透析缓冲液透析过夜后，收集透析袋中的蛋白溶液，加入其它试剂，得到蛋白浓度为1mg/ml的目的蛋白溶液。目的蛋白溶液中的其它组分的浓度如下：10mM Tris-HCl(pH7.4@25℃)，100mM KCl，1mM DTT，0.1mMEDTA，0.5％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Tween20，50％(v/v)Glycerol。
透析缓冲液：23.75mM Tris-HCl(pH7.4@25℃)，237.5mM KCl，2.375mM DTT，0.2375mM EDTA，5％(v/v)Glycerol。
实施例2、Phi29 DNA聚合酶野生型以及突变体的活性测试
取实施例1制备的目的蛋白溶液作为待测酶液，用储存缓冲液稀释至5000倍体积，用涡旋振荡器充分混匀，然后冰上静置5min，得到待测溶液。
1、将预反应体系在PCR管中混匀，置于PCR仪，进行如下程序：95℃1min，65℃1min，40℃1min，热盖温度设置为102℃。
预反应体系(80.8μl)：50mM Tris-HCl(pH7.5)，4mM DTT，10mM(NH4)2SO4，10mMMgCl2，50nM dNTP Mixture，2pM 141RCA Primer和18ng 141Ad ssDNA。
2、完成步骤1后，当温度达到4℃时取出PCR管置于冰上。试验组加入1μl待测溶液，阴性对照组加入1μl储存缓冲液。然后使用漩涡振荡器震荡混匀，短暂离心机离心5s后置于PCR仪，进行如下程序：30℃60min，热盖温度设置为65℃。
3、完成步骤2后，加入5μL 0.5M EDTA溶液终止反应，震荡混匀。
4、采用Qubit ssDNA Assay Kit(Q10212，INVITROGEN)并按说明书操作，使用Qubit fluorometer3.0检测反应产物中DNB(DNA Nano ball)浓度。
待测酶液的酶活＝ΔDNB×5000÷37.38。
说明：ΔDNB为试验组与阴性对照组终止反应后体系中的反应产物的浓度平均值的差值，5000是稀释倍数，37.38是酶活和ΔDNB之间函数关系的斜率。
待测酶液的酶活结果见表2。
表2
聚合酶 对照组平均值 实验组平均值 ΔDNB(ng/μl) 酶活(U/μl)
WT 0.42 1.23 0.81 108
E515G 0.40 0.76 0.37 49.2
L123K 0.40 0.8 0.4 53.8
M97A 0.40 0.77 0.38 50.5
实施例3、Phi29 DNA聚合酶野生型以及突变体的热稳定性测试
取实施例1制备的目的蛋白溶液，分成两份，分别处理如下：
第一份：置于预热至37℃的金属浴中10min，4℃、13000rpm离心1min，收集上清液；然后，取所述上清液，用储存缓冲液稀释至1000倍体积，用涡旋振荡器充分混匀，然后冰上静置5min，得到待测溶液1。
第二份：用储存缓冲液稀释至5000倍体积，用漩涡震荡仪充分混匀，然后冰上静置5min，得到待测溶液2。
按照实施例2的步骤1至4进行。
未热处理的酶活(U1)＝ΔDNB×5000÷37.38；ΔDNB为试验组(第二份)与阴性对照组终止反应后体系中的反应产物的浓度平均值的差值；
热处理后的酶活(U2)＝ΔDNB×1000÷37.38；ΔDNB为试验组(第一份)与阴性对照组终止反应后体系中的反应产物的浓度平均值的差值；
5000和1000分别是稀释倍数，37.38是酶活和ΔDNB之间函数关系的斜率；
酶活损失比(％)＝(U1-U2)÷U1×100％。
结果见表3。
表3
Figure GPA0000280281650000151
Figure GPA0000280281650000161
实施例4、Phi29 DNA聚合酶野生型和突变体在DNA测序中的应用效果
在实施例3的基础上，挑选若干个热稳定性提升的突变体，在BGISEQ-500测序仪上机测试，检测不同突变体在DNA测序中的应用效果，参照BGISEQ-500测序仪标准。整个测试所用试剂为BGI生产的全套PE50 V2.0试剂盒和BGI生产的的E.coil Ad153标准文库及Invitrogen生产的Qubit ssDNA Assay试剂。以下所用试剂除文库以及QubitssDNA Assay外均包括在PE50V2.0试剂盒中，而下述所写PE50V2.0试剂槽仅指上机测试所用试剂。
1、DNB制备
进行上机测试前，先制备DNB。
具体步骤：
(1)每管中取20μl DNB制备缓冲液，6ng E.coil Ad153标准文库，加入分子级水补足40μl体系，混匀离心放入pcr仪里，设置程序为：热盖103℃；95℃，1min；65℃，1min；40℃，1min；4℃，∞；结束后取出置于冰上。
(2)完成步骤(1)后，每管加入40μl DNB聚合酶混合液和2.5μl DNB聚合酶II，Vortex混匀5s，短暂离心，置于PCR仪中30℃反应20min，热盖温度60℃。
(3)完成步骤(2)后，每管加入20μl DNB终止缓冲液，扩口枪头轻吹混匀20次，终止反应。
(4)完成步骤(3)后，采用Invitrogen生产的QubitssDNA Assay检测DNB浓度，检测方法参见说明书，浓度大于10ng/μL以上为合格。
2、DNB加载
DNB制备好后，需把DNB加载至芯片上，即DNB加载。
具体步骤如下：
取出样品加载试剂板V2.1置于室温融化，震荡混匀，短暂离心后放于冰盒上备用。取出DNB加载缓冲液II，震荡均匀，短暂离心后放于冰盒上备用。将芯片和样品加载试剂板V2.1置于BGIDL-50上。取35μL DNB加载缓冲液II加到装有含100μL DNB的PCR管中，用阔口吸头温和混匀15次。然后，将上述混合液放于加载系统指定DNB放置区，选择DNB加载程序(Sample load 2.0)，开始加载。最后，加载完成后室温孵育30min后，放在2-8℃备用。
3、上机测试
对待测蛋白，在BGISEQ-500测序仪上进行上机测序检验，使用一张芯片和一个BGISEQ-500RS高通量测序试剂槽(PE50V2.0)。上机测试前，首先对测序试剂槽II，dNTPs混合液(V3.0)、dNTPs混合液II(V2.0)解冻融化后置于4℃冰箱或者冰盒上备用；并对测序酶振荡混匀，置于冰盒上备用。首先，配置5号孔试剂，即用1ml移液器移取1150μLDNA聚合酶混合液加入到5号孔以及移取1150μL dNTPs混合液(V3.0)加入到5号孔，并用移液器吹打混匀10-15次。其次，配置6号孔试剂，即用1ml移液器移取890μL DNA聚合酶混合液加入到6号孔以及移取890μL dNTPs混合液II(V2.0)加入到6号孔，并用移液器吹打混匀10-15次。然后，配置14号孔试剂，即用5ml移液器移取全部14号孔试剂，取其中2.8ml14号孔试剂与400μLphi29聚合酶突变体混匀后加入到14号孔。并把配置好的试剂槽组装。最后，进行上机测试，即启动测序仪并进行清洗，把试剂槽放入测序仪指定位置，按操作顺序进行实际预载，预载结束后，安装上述(2)步骤制备好的芯片，并填写相关测序信息，即开始测序，结束后取出芯片和试剂槽及清洗仪器。
4、数据分析
测序结束后，下载分析报告，比照先前指定的标准，判断phi29 DNA聚合酶突变体的性能。对此测试了phi29 DNA聚合酶野生型及突变体，示例结果见表4(表4中的突变体编号对应的蛋白同表3中的编号)。从测序质量参数AvgErrorRat％来看，突变体中，97K-123I-515P和97K-123H-515P最低，其次是97A-123F-515G，最后是97K-123K-515P和97A-123H-515P，野生型表现最差。另外，示例中的的突变体的MappingRate％参数值均比野生型要高。
表4
Figure GPA0000280281650000181
ESR(effective spot rate)：总的Reads数占芯片上总DNB数的比率；
Q30：质量值大于30以上的碱基占总碱基数的比率；
Mapping Rate：比对到参考序列上的Reads数占总Reads数的比率；
AvgErrorRate：相对参考序列的碱基平均错误率。
工业应用
现有技术中的phi29 DNA聚合酶(野生型)热稳定性较差，由此造成产品保质期短，且下游应用受限。本发明采用定点突变技术，从大量Phi29 DNA聚合酶的突变体中筛选出若干个显著提升热稳定性的突变体。在本发明基础上，可通过对本发明所述的突变位点的氨基酸进行饱和突变，进一步筛选出效果良好的突变体；或者在本发明所述突变体的基础上，再对本发明所包含氨基酸位点之外的其他氨基酸进行突变，获得类似的效果。与野生型蛋白相比，本发明所提供的突变体蛋白的热稳定性显著提高，可以极大地延长产品的保质期，有效地提升测序平台(如BGISEQ-500)的测序效果，既可以独立包装的DNA聚合酶产品形式存在，也可包装进DNA扩增试剂盒或DNA测序试剂盒中。本发明，还可应用的技术领域包括食品检测、病毒检测、RNA检测、单细胞测序等，也有可用于开发第三、四代测序仪技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大智造科技股份有限公司
<120> 提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 575
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys
565 570 575
<210> 2
<211> 1728
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 2
atgaaacata tgccgcgcaa aatgtatagc tgcgactttg aaaccaccac caaagtggaa 60
gattgccgcg tttgggcgta tggctatatg aacatcgaag accacagcga atacaaaatt 120
ggcaacagcc tggatgaatt tatggcgtgg gtgctgaaag ttcaggcgga tctgtatttt 180
cacaacctga aatttgacgg cgcgttcatt attaactggc tggaacgcaa cggctttaaa 240
tggagcgcgg atggcttacc gaacacctat aacaccatta ttagccgcat gggccagtgg 300
tatatgattg atatctgcct gggctataaa ggcaaacgca agattcatac cgtgatctat 360
gatagcctga agaaactgcc gtttccggtg aaaaaaatcg cgaaggactt taaactgacc 420
gtgctgaaag gcgatattga ctaccataaa gaacgcccgg tgggctataa aattaccccg 480
gaggaatatg cgtacatcaa gaacgacatc cagattattg cggaagcgct gctgattcag 540
tttaaacagg gcctggatcg tatgaccgcg ggtagcgata gcctgaaagg ctttaaggac 600
attatcacca ccaagaagtt caagaaagtg tttccgaccc tgagcctggg cctggataaa 660
gaagtgcgct atgcgtatcg cggtggcttt acctggctga acgatcgctt taaggaaaag 720
gaaattggcg aaggcatggt gtttgatgtg aacagcctgt atccggcgca gatgtatagc 780
cgcctgctgc cgtatggtga accgattgtg tttgaaggca agtatgtgtg ggatgaagat 840
tatccgctgc acattcagca tattcgctgc gaattcgaac tgaaggaagg ctatattccg 900
accattcaga ttaaacgcag ccgcttttat aaaggcaacg agtacctgaa aagcagcggc 960
ggcgaaattg cggatctgtg gctgagcaac gtggatctgg aactgatgaa agaacactac 1020
gatctgtaca acgtggaata tatcagcggc ctgaaattta aagcgaccac cggcctgttt 1080
aaggacttta tcgacaagtg gacctacatt aaaaccacca gcgaaggcgc gattaaacag 1140
ctggcgaaac tgatgctgaa cagcctgtat ggcaaatttg cgagcaaccc ggatgttacc 1200
ggcaaagtgc cgtatctgaa agaaaacggc gcgctgggct ttcgtttagg cgaagaggaa 1260
accaaagatc cggtgtatac cccgatgggc gtgtttatta ccgcgtgggc gcgctatacc 1320
accattaccg cggcgcaggc gtgttatgat cgcattatct attgcgatac cgatagcatt 1380
catctgaccg gcaccgaaat tccggatgtg atcaaagata ttgtggaccc gaaaaaactg 1440
ggctattggg cgcatgaaag cacctttaaa cgcgcgaaat atctgcgcca gaaaacctat 1500
atccaggaca tctacatgaa agaggtggat ggcaaactgg ttgaaggcag cccggatgat 1560
tataccgata ttaagttcag cgtgaaatgc gcgggcatga ccgataaaat taagaaggaa 1620
gtgaccttcg agaactttaa agtgggcttt agccgcaaaa tgaaaccgaa accggttcag 1680
gtgcctggcg gtgttgttct ggtggatgat accttcacca tcaagtga 1728

Claims (7)

1.一种蛋白质，是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲、点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；
所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为A或K；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为K、F、I或H；所述点突变丙为将phi29DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为P；
所述phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：
所述蛋白质为如下（1）-（6）中的任一种：
（1）将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
（2）将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为P；
（3）将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为P；
（4）将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
（5）将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为P；
（6）将（1）-（5）中的任一种蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的稳定性高于phi29 DNA聚合酶；
所述稳定性为热稳定性。
4.编码权利要求1-3中任一所述蛋白质的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、含有所述核酸分子的重组菌或含有所述核酸分子的转基因细胞系。
5.权利要求1-3中任一所述蛋白质的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）或（e）或（f）或（g）：
（a）作为DNA聚合酶；
（b）催化DNA复制和/或催化DNA扩增；
（c）催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增；
（d）制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的试剂盒；
（e）制备用于催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增的试剂盒；
（f）进行DNA测序或RNA测序；
（g）制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
6.编码权利要求1-3中任一所述蛋白质的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、含有所述核酸分子的重组菌或含有所述核酸分子的转基因细胞系的应用，为如下（h）或（i）或（j）或（k）：
（h）制备DNA聚合酶；
（i）制备用于催化DNA复制和/或催化DNA扩增的试剂盒；
（j）制备用于催化滚换扩增和/或催化多重链置换扩增的试剂盒；
（k）制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。
7.一种提高phi29 DNA聚合酶稳定性的方法，包括如下步骤：将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲、点突变乙和点突变丙；
所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为A或K；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为K、F、I或H；所述点突变丙为将phi29DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为P；
所述phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述稳定性为热稳定性。
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