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CN110665465A - 用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用 - Google Patents

用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用 Download PDF

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CN110665465A CN201910952400.5A CN201910952400A CN110665465A CN 110665465 A CN110665465 A CN 110665465A CN 201910952400 A CN201910952400 A CN 201910952400A CN 110665465 A CN110665465 A CN 110665465A
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Abstract

本发明公开了一种用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用，该磁性共价有机框架材料由Fe3O4纳米磁球、包覆于Fe3O4纳米磁球表面的共价有机框架层、接枝于共价有机框架层上的谷胱甘肽构成，制备方法的工艺步骤为：制备Fe3O4/COFs纳米粒子，制备Fe3O4/COF‑GSH材料；该磁性共价有机框架材料在糖肽富集方面表现出选择性高、结合能力强、富集效率高、回收效率好等优势，在研究生理行为糖基化过程中具有十分重要的意义，且应用前景良好。

Description

用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及磁性共价有机框架材料及其制备方法与在内源性糖肽富集中的应用。
背景技术
现有磁性共价有机框架材料是由磁性纳米球及包裹在磁性纳米球表面的亲水性共价有机框架(covalent organic frameworks,COFs)构成，在具有良好磁响应性能的同时，兼具了COFs的孔隙率高、高度有序介孔、有机配体丰富以及结构稳定等独特性质。因此，近年来磁性共价有机框架材料备受关注，已经被广泛应用于生物医学领域，尤其是蛋白或多肽分离、药物传递、磁共振成像等方面。
目前磁性共价有机框架材料对于糖肽的富集应用基本都是采用亲水作用色谱方法，即只利用共价有机框架本身的亲水性来对于糖肽进行富集。Xiangmin Zhang等公开了一种共价有机框架修饰的磁性石墨烯复合材料的制备方法，并给出了该复合材料在糖肽富集方面的应用，该共价有机框架修饰的磁性石墨烯复合材料以石墨烯为基底材料，然后在石墨烯表面修饰上纳米磁球，最后再在磁球修饰的石墨烯表面修饰一层以2,3,6,7,10,11-六羟基三苯(HHTP)和对苯二硼酸(BDBA)为有机配体的共价有机框架层，即获得该共价有机框架修饰的磁性石墨烯复合材料，该磁性复合材料基于共价有机框架的亲水性能用于糖肽的富集(Self-assembling covalent organic framework functionalized magneticgraphene hydrophilic biocomposites as an ultrasensitiv matrix for N-linkedglycopeptide recognition,Nanoscale,2017,9,10750-10756,Xiangmin Zhang等)。
然而，由于共价有机框架材料本身亲水性能的局限性以及缺乏灵活的功能修饰，使得上述基于共价有机框架复合材料对于糖肽的富集性能并不是十分理想。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法，以提高共价有机框架材料的亲水性，实现对糖肽的高效率富集。
本发明所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，由Fe3O4纳米磁球、包覆于Fe3O4纳米磁球表面的共价有机框架(COF)层、接枝于共价有机框架层上的谷胱甘肽(GSH)构成；所述共价有机框架层是由1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛按照物质的量之比1：1.5经加成反应得到的蜂窝状结构，所述谷胱甘肽接接枝于共价有机框架层的乙烯基上。
本发明所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，呈现完整的球形，粒径均匀且分布较窄，平均粒径为240～300nm左右，这种形状规整、尺寸均匀的纳米粒子比较适合用于蛋白和多肽的富集与分离应用。该磁性共价有机框架材料以超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4纳米磁球)作为内核，具有高的磁饱和强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能；本发明采用的Fe3O4纳米磁球占磁性共价有机框架材料质量的48％左右，从而使磁性共价有机框架材料的饱和磁化强度达到45emu g-1左右。包覆于Fe3O4纳米磁球表面的COF层具有高的孔隙率、高度有序的介孔以及大的比表面积，从而有利于糖肽的富集应用。上述COF层的原料选用1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛两种有机配体。其中对于2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛有机配体，一方面其为合成共价有机框架的组分之一，同时其剩余的碳碳双键可以为进一步引入高亲水性能的两性离子谷胱甘肽作为反应活性位点。本发明在COF层利用高效率的巯烯点击方法修饰上谷胱甘肽(GSH)，GSH为两性离子，从而在很大程度上提高了基于COFs的磁性共价有机框架材料的亲水性能，克服了已有的COFs复合材料在亲水性能上的局限性，同时GSH能够实现对糖肽的高效率富集。
本发明所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，主要是通过外延生长的机理来实现，在温和的条件下通过外延生长的方法在磁球表面包裹一层共价有机框架层(两种配体通过共价键作用形成COF层)，然后通过高效率的巯烯点击的方法在共价有机框架层表面修饰上高亲水性能的两性离子谷胱甘肽。
本发明所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，步骤如下：
(1)制备Fe3O4/COFs纳米粒子
在超声条件下，将Fe3O4纳米磁球、1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛于二甲基亚砜中混合分散均匀形成混合液；之后在超声的条件下，向上述混合液中滴加醋酸形成反应体系；继后将所得反应体系于室温静置孵育10～30分钟；孵育结束后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，将所得固体产物进行洗涤除去吸附在固体产物表面未反应的物料，得到共价有机框架层包覆Fe3O4纳米磁球的纳米粒子，简称Fe3O4/COFs纳米粒子；所述Fe3O4纳米磁球与1,3,5-三(4-氨苯基)苯的质量比为1：(0.2～1),1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛的物质的量之比为1:1.5，所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛两种配体的质量之和与醋酸的体积比为(30～210)：1，质量的单位为mg，体积的单位为mL；
(2)制备Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料
将偶氮二异丁腈、谷胱甘肽和Fe3O4/COFs纳米粒子依次加入到复合溶剂中形成混合液，然后在氮气保护下，将所得混合液于60～80℃进行巯烯点击反应至Fe3O4/COFs纳米粒子表面呈黄色；巯烯点击反应完成后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物经洗涤除去吸附在固体产物表面未反应的物料并干燥后即得到用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，简称Fe3O4/COF-GSH材料；所述复合溶剂由乙醇与去离子水按照体积比1:3混合均匀得到，所述混合液中，Fe3O4/COFs纳米粒子与谷胱甘肽的质量比为1:(0.3～1)；所述谷胱甘肽与偶氮二异丁腈的质量比为1:(0.05～0.25)。
上述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，步骤(1)中，所述Fe3O4纳米磁球主要是以氯化铁、醋酸钠、柠檬酸钠为原料，以乙二醇为溶剂的水热法合成粒径大概在200nm～250nm的超顺磁性四氧化三铁纳米球；此外通过调节水热反应时间可调控磁球粒径分布。制备Fe3O4纳米磁球的具体实现方式可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见The design and synthesis of a hydrophilic core-shell-shellstructured magnetic metal-organic framework as a novel immobilized metal ionaffinity platform for phosphoproteome research Chem.Commun.,2014,50,6228-6231,Chunhui Deng等以及Ti4+-immobilized multilayer polysaccharide coatedmagnetic nanoparticles for highly selective enrichment of phosphopeptidesJ.Mater.Chem.B 2014,2,4473-4480,Hanfa Zou等。
上述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，步骤(1)中，两种配体是通过加成反应制备得到COF层的，其中醋酸作为催化剂，Fe3O4纳米磁球作为载体。在超声条件下，将Fe3O4纳米磁球、1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛混合分散均匀，一般超声5～10min即可；二甲基亚砜的用量只要能够将1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛完全溶解，并使Fe3O4纳米磁球分散均匀即可。之后再在超声条件下，向混合液中滴加醋酸，一般控制滴加时间为5～15min。醋酸滴加结束后，所得混合液在室温的条件下静置孵育10-30分钟，所得反应液中的固体产物即为Fe3O4/COFs纳米粒子。因此将反应液进行固液分离、并对固体产物进行洗涤，即得到Fe3O4/COFs纳米粒子。洗涤的目的是除去吸附在固体产物表面未反应的物料，本发明中采用的洗涤方式为：将分离出的固体产物依次用无水四氢呋喃、无水甲醇、乙醇、去离子水洗涤，一般每种洗液洗涤3～5遍即可。
上述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，步骤(2)中，通过高效率的巯烯点击的方法，将两性离子谷胱甘肽修饰在共价有机框架层表面。该反应需要在无氧的条件下进行，本发明所得混合液在氮气保护下反应之前，先进行除氧处理以除去混合液内及反应器内混合液上方的氧气。具体处理方式为：先将偶氮二异丁腈、谷胱甘肽和Fe3O4/COFs纳米粒子依次加入到含有去离子水和乙醇的复合溶剂中超声混匀；然后采用氮气吹扫方式对混合液进行除氧，除氧时间约为0.5-2h；再采用抽真空-通氮气的循环操作方式除去反应器内的氧气，一般循环3～5次，每个循环中，先将反应器内抽真空至真空度不大于100Pa，然后再通氮气至常压。为了便于后期清洗操作，用于偶氮二异丁腈、谷胱甘肽和Fe3O4/COFs纳米粒子依次加入到复合溶剂中超声混匀的容器与后面巯烯点击反应的反应器可以不同，混合液和反应器分别除氧后，再将上述除氧后的混合液转移至除氧后的反应器中，再在磁力搅拌条件下、于60～80℃反应至纳米粒子表面呈黄色，且混合液中磁性纳米粒子分散良好、无贴壁现象即可，一般反应时间约为6～24h。所得反应液中的固体产物即为Fe3O4/COF-GSH材料。因此将反应液进行固液分离、并对固体产物进行洗涤、干燥即得到Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料。洗涤的目的是除去吸附在固体产物表面未反应的物料，本发明中采用的洗涤方式为：将分离出的固体产物依次用乙醇和去离子水洗涤，一般每种洗液洗涤3～5遍即可。
本发明进一步提供了所述磁性共价有机框架材料在内源性糖肽富集中的应用。所述磁性共价有机框架材料对于生物样本中的糖肽具有很好的富集效果，尤其是在对于人唾液中内源性的糖肽富集过程中显现出极其优异的性能，在研究生理行为蛋白糖基化过程中具有很重要的意义。
本发明所述磁性共价有机框架材料富集糖肽的操作为：
(1)对糖肽的吸附：首先将糖基化蛋白免疫球蛋白G用胰蛋白酶消化成糖肽，并用缓冲液进行稀释，然后加入本发明所述磁性共价有机框架材料混合搅拌均匀，之后于室温下利用摇床摇动10～60min使糖肽都富集在磁性共价有机框架材料表面，再在外加磁场的作用下利用磁分离将表面吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料从溶液中分离出来；
(2)对糖肽的解吸附：将表面吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到解吸附液中将糖肽从磁性共价有机框架材料上解吸附下来。
上述对糖肽的吸附过程中，其中共价有机框架上的修饰的高亲水分子GSH利用亲水作用色谱层析法原理实现对糖肽的富集。由于本发明所提供的磁性共价有机框架材料中，COF层为高度有序的介孔材料，其孔径约为3.6nm左右，可以将大分子(蛋白，外泌体等)阻挡在材料外面，从而有利于内源性糖肽肽段的富集应用。通过改变缓冲液的组分实现了被吸附糖肽从磁性共价有机框架材料表面脱离，从而实现了糖肽的捕获和分离。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的磁性共价有机框架材料，以Fe3O4纳米磁球作为内核，在Fe3O4纳米磁球表面引入由1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛组成的共价有机框架，以2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛上剩余的碳碳双键为反应位点，通过巯烯点击反应修饰上亲水的两性离子GSH，该材料不仅表现出良好的磁响应性能，而且通过将COF层和两性离子相结合的设计，从而在很大程度上提高了基于COF的磁性共价有机框架材料的亲水性能，在糖肽富集方面表现出选择性高、结合能力强、富集效率高、回收效率好等优势，在研究生理行为糖基化过程中具有十分重要的意义，且应用前景良好。
2、本发明提供的磁性共价有机框架材料，在Fe3O4纳米磁球表面引入共价有机框架，其具有高的比表面积及高度有序的介孔结构，使得磁性共价有机框架材料十分适合用于蛋白或者肽段，尤其是内源性糖肽的富集分离应用。
3、本发明提供的磁性共价有机框架材料的制备方法，首先采用外延生长方式在Fe3O4纳米磁球表面包裹上COF层，然后采用高效率的巯烯点击反应在COF层上接枝亲水分子GSH，整个过程操作简单、反应条件温和，并且可在短时间内制备得到磁性共价有机框架材料，因此易于在生物医药领域内推广。
附图说明
图1为本发明所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料制备工艺流程图以及对糖肽的富集流程图，A为磁性共价有机框架材料制备工艺流程图，B为磁性共价有机框架材料对糖肽的富集流程图。
图2为本发明实施例制备的磁性纳米材料形貌表征图，其中A为实施例1制备的Fe3O4纳米磁球的扫描电镜(SEM)图，B为实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子的扫描电镜(SEM)图，C为实施例12制备的Fe3O/COF-GSH材料的扫描电镜(SEM)图，D为实施例1制备的Fe3O4纳米磁球的透射电镜(TEM)图，E为实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子的透射电镜(TEM)图,F为实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料的扫描电镜(SEM)图。
图3为本发明实施例制备的磁性纳米材料的X射线衍射图谱，其中a对应实施例1制备的Fe3O4纳米磁球，b对应实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子，c对应实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料。
图4为本发明实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料的元素组成表征图。
图5为本发明实施例2和实施例12制备的磁性纳米材料的氮气吸附-解吸附曲线和介孔尺寸分布图，其中A为实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子的氮气吸附-解吸附曲线，B为实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料的氮气吸附-解吸附曲线，C为实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子的介孔尺寸分布图，D为实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料的介孔尺寸分布图。
图6为本发明实施例制备的磁性纳米材料在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线图谱，其中a对应实施例1制备的Fe3O4纳米磁球，b对应实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子，c对应实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料。
图7为本发明应用例1中免疫球蛋白G消化液的MS图谱，其中A为未经富集处理的免疫球蛋白G消化液的MS图谱，B为经实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料富集处理的免疫球蛋白G消化液的MS图。
具体实施方式
以下将通过实施例并结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
本发明提出的用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料结构，如图1所示，该磁性共价有机框架材料由Fe3O4纳米磁球，包覆于Fe3O4纳米磁球表面的COF中间层、接枝于COF层上的两性离子GSH构成。本发明是基于图1给出的工艺流程制备该磁性共价有机框架材料的，如图1A所示，首先利用水热法制备Fe3O4纳米磁球；再依据外延生长法在制得的Fe3O4纳米磁球表面包覆一层COF中间层，得到COF层包覆Fe3O4的磁性纳米粒子(Fe3O4/COFs纳米粒子)，最后将两性离子GSH通过巯烯点击反应接枝到Fe3O4/COFs纳米粒子表面制备得到Fe3O4/COF-GSH材料。
从理论上分析，1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛两种有机配体按照物质的量的比为1:1.5通过加成反应得到如图1A中所示的以六元环为基本单元的蜂窝状结构的COF层。每个六元环是由六个1,3,5-三(4-氨苯基)苯和六个2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛通过共价键间隔排列形成。这种蜂窝状结构的COF层理论介孔尺寸约为3.9nm。每个2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛有两个碳碳双键作为巯烯点击反应的反应位点。
从上述分析可知，通过本发明提供的Fe3O4/COFs纳米粒子表面能够修饰较多的两性离子GSH，从而在很大程度上提高磁性共价有机框架材料的亲水性能。
实施例1水热法制备超顺磁性Fe3O4纳米磁球
以下实施例中采用的Fe3O4纳米磁球的具体制备过程为：将原料2.43g FeCl3·6H2O、3.6gNaAc(醋酸钠)和0.4g Na3CT(柠檬酸钠)加入到盛有60mL乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1h使上述原料混合均匀；然后移除搅拌子，将反应釜升温至200℃，反应12小时；再将反应釜冷却至室温，对反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇、去离子水对固体产物进行洗涤(每种洗液洗涤五遍)，即得到Fe3O4纳米磁球。
通过该方法得到的Fe3O4纳米磁球能够均匀分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。对得到的Fe3O4纳米磁球进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析显示，所述Fe3O4磁球粒径在220nm左右。
通过调节水热反应时间10～16h，可以调节得到的Fe3O4纳米磁球粒径在200～300nm之间。
实施例2-实施例8制备Fe3O4/COFs纳米粒子(选用220nm的Fe3O4纳米磁球)
按照表1称取原料，并结合表1中给出的工艺参数依据下述操作过程制备Fe3O4/COFs纳米粒子：
将Fe3O4纳米磁球,1,3,5-三(4-氨苯基)苯(Tab)和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛(Dva)两种有机配体加入到含有二甲基亚砜溶剂的锥形瓶中，之后在超声条件下将两种有机配体完全溶解，并使Fe3O4纳米磁球完全分散得到分散均匀的混合液，继后在超声条件下，向所得混合液中逐滴滴加醋酸，滴加完毕后将整个反应体系于室温下静置孵育。最后，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用无水四氢呋喃，无水甲醇，乙醇、去离子水洗涤(每种洗液洗涤三次)，即得到Fe3O4/COFs纳米粒子。对得到的Fe3O4/COFs纳米粒子进行DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)分析显示，所得Fe3O4/COFs纳米粒子粒径在250～670nm左右，见表1所示。
表1制备Fe3O4/COFs纳米粒子的原料及其配比和工艺参数
Figure BDA0002226187460000071
从表1中可以看出，通过调控两个有机配体的比例、超声时间、以及孵育时间可以调整包裹在Fe3O4纳米磁球表面的COF中间层的厚度以及纳米复合材料的形貌。从COF中间层包覆牢固性、尺寸大小、纳米复合材料的形貌及节约药品等因素考虑，现选择实施例2所述方法制备的270nm的Fe3O4/COFs纳米粒子用于以下实施例Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料的制备。
实施例9-实施例16制备Fe3O4/COF-GSH材料(选用270nm的Fe3O4/COFs纳米粒子)
以下实施例9-实施例16采用的是巯烯点击的反应方法，用到的反应装置为油浴加热、磁力搅拌的二口瓶反应容器。
按照表2称取原料，并结合表2中给出的工艺参数依据下述操作过程制备Fe3O4/COF-GSH材料：
将偶氮二异丁腈、谷胱甘肽和Fe3O4/COFs纳米粒子依次加入到含有20mL复合溶剂中(复合由乙醇与去离子水按照体积比1:3混合均匀得到)，利用超声处理，使得Fe3O4/COFs纳米粒子完全分散，偶氮二异丁腈、谷胱甘肽完全溶解。然后采用氮气吹扫方式对混合液进行除氧1h；再采用抽真空-通氮气的循环操作方式对作为反应器的支口瓶除氧(循环次数为3次)。继后在氮气保护下，将除氧后的混合液加入到提前除好氧气的支口瓶中，之后通过油浴得到表2所述反应温度，在磁力搅拌下按表2所述反应温度、反应时间完成巯烯点击反应。最后，对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物依次用乙醇、去离子水洗涤(每种洗液洗涤三次)，即得到Fe3O4/COF-GSH材料。对得到的Fe3O4/COF-GSH材料进行DLS(DynamicLight Scattering，动态光散射)分析考察其在水中的分散性能：GSH改性越成功，Fe3O4/COF-GSH材料在水中的分散性能越好，DLS测试的PDI值越小。
表2制备Fe3O4/COF-GSH材料的原料及其配比和工艺参数
Figure BDA0002226187460000081
从表2中可以看出，通过调控加入两性离子GSH和催化剂AIBN的量、反应温度以及反应时间可以达到最佳的GSH修饰效果。从修饰效果、节省反应时间及节约原料等因素考虑，现选择实施例12的方案制备Fe3O4/COF-GSH材料对结构特征、性能以及对糖肽的富集等方面进行研究。
结构表征
为了探究COFs是否成功复合到Fe3O4纳米磁球上，对实施例1制备的Fe3O4纳米磁球、实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子、实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料的形貌尺寸和微观结构进行了表征，如图2至图5所示。
对实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子和实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料采用扫描电镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行形貌分析，结果如图2所示。从图2可以看出，制备的Fe3O4/COFs纳米粒子以及Fe3O4/COF-GSH材料均成大小均一、形貌规整的球形。此外，从图2E看出，纳米粒子表面呈现粗糙的网络结构，表明COFs层已经成功包裹在Fe3O4纳米磁球表面；从图2F看出，Fe3O4/COF-GSH材料与Fe3O4/COFs纳米粒子形貌几乎相同，表面修饰两性离子GSH后对Fe3O4/COFs纳米粒子的形貌没有明显的影响。
对实施例1制备的Fe3O4纳米磁球、实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子和实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料进行X射线衍射分析，分析结果如图3所示。从图3中可以看出，三种材料均具有与标准Fe3O4衍射峰一致的特征峰，说明Fe3O4/COF-GSH材料保留了Fe3O4纳米磁球的晶体结构。同时Fe3O4/COF-GSH材料在2.7°出现了新的衍射峰，该衍射峰为共价有机框架的特征衍射峰，说明共价有机框架成功合成在了磁性纳米粒子表面。
对实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料进行X射线能谱分析(EDX)，分析结果如图4及表3所示所示。从图4及表3中可以，Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料中，C元素原子百分比为55.97％、N元素原子百分比为15.52％、O元素原子百分比为23.28％、S元素原子百分比为2.01％，Fe原子百分比为3.22％。从上述检测结果可以看出，Fe3O4/COF-GSH材料中存在S元素以及高含量的N元素，进一步证明COFs层和两性离子GSH已经成功在Fe3O4纳米磁球表面形成以及修饰，高含量的GSH有利于对于糖肽的富集应用。
表3 EDX分析中得到的各元素原子百分比
Element Weight％ Atomic％
C 44.63 55.97
N 14.43 15.52
o 24.72 23.28
S 4.29 2.01
Fe 11.92 3.22
Total 100 100
对实施例2和实施例12制备的Fe3O4/COFs纳米粒子和Fe3O4/COF-GSH材料进行N2吸附/解吸附测试，测试结果如图5所示，所得N2吸附/解吸附等温曲线表明此磁性共价有机框架纳米复合材料具有较大的比表面积和孔隙率，同时孔径分布较窄，大在3.6nm左右(与理论分析结果相近)，说明具有高度有序的介孔材料共价有机框架成功合成在了磁球表面，这有利于对于肽段的富集应用。
综上所述，Fe3O4/COF-GSH材料中的壳层具有共价有机框架结构，且该结构并没有明显影响复合纳米材料的磁晶体结构，这种独特的COF壳层将有利于在糖肽捕获和分离中的应用。
磁性能测试
对实施例1制备的Fe3O4纳米磁球、实施例2制备的Fe3O4/COFs纳米粒子、实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)在-18000Oe到18000Oe范围内进行磁性测试，测试得到的磁滞回线如图6所示。从图6中可以看出，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe3O4纳米磁球、Fe3O4/COFs纳米粒子、Fe3O4/COF-GSH材料都具有超顺磁性，其中Fe3O4/COF-GSH材料的饱和磁化强度达到45emug-1左右。
应用例
本发明进一步提供了上述Fe3O4/COF-GSH材料在富集糖肽方面的应用，Fe3O4/COF-GSH材料对于糖肽的捕获与分离过程，如图1B所示，首先将Fe3O4/COF-GSH材料加入到待处理的样本中，然后在摇床中进行捕获，时间可以根据样本多少进行调整，捕获过程结束后通过磁分离方式将固体产物分离出来，之后再用解吸附的缓冲液对表面吸附有糖肽的磁球进行解吸附，从而得到含有糖肽的缓冲液。可以对得到的含有糖肽的缓冲液进行MS(MassSpectrometry，质谱)分析，以进一步确定Fe3O4/COF-GSH材料对糖肽的富集效果。
应用例1糖基化蛋白免疫球蛋白G消化液中糖肽的富集
取2mg免疫球蛋白G溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH4HCO3缓冲液里，再加入50μg的胰蛋白酶，于37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(体积浓度为90％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为1％的三氟乙酸，即90％ACN-H2O包含1％TFA)稀释到10-7M的浓度得到免疫球蛋白G消化液。取1mg实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料加入到200μl免疫球蛋白G消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温孵育45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次200μl)把非特异性吸附的多肽从磁性共价有机框架材料表面除去；最后将吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到10μl第二缓冲液(体积浓度为30％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为0.1％的三氟乙酸，即30％ACN-H2O包含0.1％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附30min，利用磁分离分离出磁性共价有机框架材料，得到解吸附液。然后取1μl解吸附液和1μl未经富集处理的免疫球蛋白G消化液进行质谱分析，分析结果如图7所示。
从图7可以看出，未经富集处理的免疫球蛋白G消化液，用质谱检只得到5条糖肽的信号，而且信号很低，整个MS图基本都是杂肽段的信号【见图7】；用Fe3O4/COF-GSH材料富集后，整个质谱图上可以检测到35条糖肽的信号，而且整个MS图都是糖肽的信号峰【见图7，圆点标记的都为糖肽的特征峰】。上述分析结果表明本发明所述的Fe3O4/COF-GSH材料能很好的富集糖肽，同时具有很好的选择性和很高的效率。
应用例2人唾液中内源性糖肽的富集
取10微升健康人唾液加入到200μl第一缓冲液(体积浓度为90％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为1％的三氟乙酸，即90％ACN-H2O包含1％TFA)中。取1mg实施例12制备的Fe3O4/COF-GSH材料加入到上述样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温孵育45min；之后用第一缓冲液清洗3遍(每次200μl)把非特异性吸附的多肽从磁性共价有机框架材料表面除去；最后将吸附了糖肽的磁性共价有机框架材料加入到60μl第二缓冲液(体积浓度为30％的乙腈水溶液，其中含有体积浓度为0.1％的三氟乙酸，即30％ACN-H2O包含0.1％TFA)中，在摇床800-1200rpm剧烈摇动状态下解吸附30min，利用磁分离分离出磁性共价有机框架材料，得到解吸附液。然后将吸附液体用于LC-MS-MS分析，结果如表4显示，一共可以检测到322条内源性糖肽。
表5给出了本发明所提供的Fe3O4/COF-GSH材料与已经报道材料对人唾液中内源性糖肽富集性能比较。从表5中看出，相比已经报道的材料，本发明提供的Fe3O4/COF-GSH材料可以在人唾液中富集最多的内源性糖肽。
综上所述，本发明所述的Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料可以实现对于糖肽以及人唾液中内源性糖肽的优异富集性能。
表4 Fe3O4@COF-GSH磁性共价有机框架材料
从人唾液中富集得到的内源性糖肽的详细信息
Figure BDA0002226187460000131
Figure BDA0002226187460000141
Figure BDA0002226187460000151
Figure BDA0002226187460000161
表5 Fe3O4/COF-GSH磁性共价有机框架材料与已经报道的材料在人唾液中富集内源性糖肽的性能比较
Figure BDA0002226187460000191

Claims (10)

1.一种用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，其特征在于由Fe3O4纳米磁球、包覆于Fe3O4纳米磁球表面的共价有机框架层、接枝于共价有机框架层上的谷胱甘肽构成；所述共价有机框架层是由1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛按照物质的量之比1：1.5经加成反应得到的蜂窝状结构，所述谷胱甘肽接枝于共价有机框架层的乙烯基上。
2.根据权利要求1所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，其特征在于形态为球形微粒，平均粒径为240～300nm。
3.权利要求1或2所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)制备Fe3O4/COFs纳米粒子
在超声条件下，将Fe3O4纳米磁球、1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛于二甲基亚砜中混合分散均匀形成混合液；之后在超声条件下，向上述混合液中滴加醋酸形成反应体系；继后将所得反应体系于室温静置孵育10～30分钟，孵育结束后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，将所得固体产物进行洗涤除去吸附在固体产物表面未反应的物料，得到共价有机框架层包覆Fe3O4纳米磁球的纳米粒子，简称Fe3O4/COFs纳米粒子；所述Fe3O4纳米磁球与1,3,5-三(4-氨苯基)苯的质量比为1：(0.2～1)，1,3,5-三(4-氨苯基)苯与2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛的物质的量之比为1:1.5，所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛的质量之和与醋酸的体积比为(30～210)：1，质量的单位为mg，体积的单位为mL；
(2)制备Fe3O4/COF-GSH材料
将偶氮二异丁腈、谷胱甘肽和Fe3O4/COFs纳米粒子依次加入到复合溶剂中形成混合液，然后在氮气保护下，将所得混合液于60～80℃进行巯烯点击反应至Fe3O4/COFs纳米粒子表面呈黄色；巯烯点击反应完成后对所得反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，所得固体产物经洗涤除去吸附在固体产物表面未反应的物料并干燥后即得到用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料，简称Fe3O4/COF-GSH材料；所述复合溶剂由乙醇与去离子水按体积比1:3混合均匀得到，所述混合液中，Fe3O4/COFs纳米粒子与谷胱甘肽的质量比为1:(0.3～1)；所述谷胱甘肽与偶氮二异丁腈的质量比为1:(0.05～0.25)。
4.根据权利要求3所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中，醋酸滴加时间为5～15min。
5.根据权利要求3或4所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤(2)中，所得混合液在氮气保护下进行巯烯点击反应之前，先进行除氧处理以除去混合液内及反应器内混合液上方的氧气。
6.根据权利要求5所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于除氧处理操作为：首先采用氮气吹扫方式对混合液进行除氧；再采用抽真空-通氮气的循环方式除去反应器内混合液上方的氧气。
7.根据权利要求3或4所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中的固体产物依次用无水四氢呋喃、无水甲醇、乙醇、去离子水进行洗涤，步骤(2)中的固体产物依次用乙醇和去离子水进行洗涤。
8.根据权利要求5所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中的固体产物依次用无水四氢呋喃、无水甲醇、乙醇、去离子水进行洗涤，步骤(2)中的固体产物依次用乙醇和去离子水进行洗涤。
9.根据权利要求6所述用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中的固体产物依次用无水四氢呋喃、无水甲醇、乙醇、去离子水进行洗涤，步骤(2)中的固体产物依次用乙醇和去离子水进行洗涤。
10.权利要求1或2所述磁性共价有机框架材料在内源性糖肽富集中的应用。
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