CN110628736B

CN110628736B - 色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110628736B
Application number: CN201910955751.1A
Authority: CN
Inventors: 王喜庆; 魏研欣; 蒋胜胜
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-10-09
Filing date: 2019-10-09
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-10-09
Also published as: CN110628736A

Abstract

本发明公开了一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白质工程领域。本发明色氨酸2,3双加氧酶突变体由色氨酸2,3双加氧酶的氨基酸序列在第51位和第127位进行突变得到。本发明构建的生物催化剂可以利用不带有保护基的色氨酸、5‑氯色氨酸和6‑氯色氨酸作为底物，一步合成3a‑羟基六氢吡咯[2,3‑b]吲哚‑2‑羧酸（HPICs）及其衍生物。该新型酶将色氨酸双加氧酶转化为单加氧酶，其产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量，具有优秀非对映选择性；反应和纯化过程均在环保的水溶液中，在室温下进行，反映体系简单，反应条件温和，低能耗。

Description

色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白质工程领域。

背景技术

三元环的3a-羟基六氢吡咯 [2,3-b]吲哚-2-羧酸及衍生物（简称HPICs）是许多生物碱和多肽类中常见的分子骨架，具有强大的结构多样性和生物活性。例如，kapakahine C对P388小鼠白血病细胞具有细胞毒性；NWG家族中大部分天然产物(如NWG01)对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于对革兰氏阴性菌的抗菌活性。除了抗菌活性外，himastatin和chloptosin还能抑制几种癌细胞系的生长。因此，含有HPICs结构单元的天然产物是合成和药理学研究的热门目标。HPIC还可以被氧化成pyrrolobenzoxazine合成中有用的中间体，例如：paeciloxazine、CJ12662 和 CJ12663。此外，具有HPICs骨架的单环肽可以利用酶法转化为生物活性提高的双环肽。因此，HPICs除了存在于各种各样的生物活性分子中，它也是重要的合成中间体。

由色氨酸衍生物构建HPICs已被成为有机化学合成领域研究的热点。早先，Danishefsky能够以游离的Trp为底物，通过3-4步制备非对映选择性的HPICs，这为合成复杂的天然产物提供了有力策略。这些阳离子引发的环化反应利用N-苯基硒代酞酰亚胺(N-PSP)或N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)等亲电试剂来激活吲哚环;然后通过间氯过苯甲酸(mCPBA)或AgNO₃水溶液氧化脱氮，实现氧原子取代活化的杂环原子。与上述分步方法不同，DMDO的氧化可以直接将 Trp 衍生物转化为 HPICs，但非对映选择性取决于羧基和胺基的保护基团。如果没有像三苯甲基(Tr)和叔丁基(tBu)这样庞大的保护基团，得到的HPIC是1:1非对映体的混合物。最近，自由基引发的环化也被用于从受保护的Trp衍生物逐步制备HPIC。尽管取得了显著的进步，但是在制备HPIC的过程中需要多个保护基团，这不是一种环保的合成方式。为了解决这一问题，Nakagawa研究者已经尝试利用光敏通过两步/一锅法氧化未受保护的色氨酸，包括被Me₂S还原裂解生成的三环过氧化物。反应过程虽然简单，但这种方法的立体选择性很差。此外，不稳定的过氧化物中间体易于迅速分解成N’-甲酰基犬尿氨酸(NFK)。

2011年研究发现，色氨酸2,3双加氧酶xcTDO可以催化色氨酸通过一步反应生成HPIC，这为产生HPIC提供了一种新思路，但是由于反应主要生成NFK，HPIC产量极低的问题，限制了此酶合成HPICs的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，制备的色氨酸2,3双加氧酶突变体产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量，具有优秀非对映选择性。

为解决上述技术问题，本发明提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体，含有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供包含上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸的载体。

本发明还提供表达上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的细胞。

本发明还提供一种提高色氨酸2,3双加氧酶催化效率的方法，将色氨酸2,3双加氧酶第51位的氨基酸残基苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，将第127位的氨基酸残基谷氨酰胺替换为络氨酸。

本发明还提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体的制备方法，包括：

（1）构建表达野生型色氨酸2,3双加氧酶的质粒：将SEQ ID NO:3核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；

（2）通过三轮定点饱和突变，构建饱和突变库；

（3）将步骤（1）、（2）构建的表达色氨酸2,3双加氧酶和突变体的质粒转化到大肠杆菌中；

（4）色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的表达：将步骤（3）得到的菌种在LB液体培养基中过夜培养之后，加入TB液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；

（5）含有色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤（4）中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；

（6）含有色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤（4）中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；

（7）色氨酸2,3双加氧酶TDO和突变体的纯化：将步骤（5）的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合，然后于较低咪唑浓度下除去杂蛋白，最后用含有高浓度咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱；将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后-80℃保存。

色氨酸2,3双加氧酶突变体的制备方法，具体步骤为：

（1）色氨酸2,3双加氧酶TDO基因表达载体的构建：将全基因合成的xcTDO片段，经限制性内切酶NdeI和XhoI依据说明书进行双酶切操作后，用T4连接酶连接到被NdeI和XhoI双酶切过的表达载体pET22b（+）上；用连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞；从含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220 rpm的条件下过夜培养；从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定；

（2）色氨酸2,3双加氧酶突变体质粒的构建：将上述测序成功的质粒作为PCR的模板，通过Quickchange方法构建突变质粒并送测序鉴定；

（3）色氨酸2,3双加氧酶TDO及突变体的制备：将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，将阳性克隆挑入5 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500 ml 含有100 μg/ml卡那霉素TB液体培养基，在37℃，摇床转速220 rpm下进行扩培；待OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.5 mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.5 mM的IPTG诱导；在22℃，摇床转速220 rpm下表达20 h后，离心转速5000rpm离心10 min收菌；舍弃上清培养基后，用85 ml的buffer A将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000 rpm，离心45 min，获得上清细胞裂解液；将上述细胞裂解液加入事先以buffer A预处理的10 ml镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含20 mM，85 mM咪唑的buffer C除去杂蛋白，并用buffer B将目的蛋白从柱上洗脱下来；目的蛋白的纯度由SDS-PAGE鉴定；将洗脱下的目的蛋白用buffer D4℃下过夜透析，以除去咪唑；离心浓缩后，-80℃下保存；其中buffer A为0.1 M KPi（磷酸钾），0.3MKCl，10 % 甘油，pH 7.8的缓冲液；buffer B为0.1 M KPi，0.3M KCl，300 mM咪唑，10 % 甘油，pH7.8的缓冲液；buffer C为20 mM或85 mM咪唑，0.1 M KPi，0.3M KCl，10% 甘油，pH7.8的缓冲液。Buffer D为50 mM Tris，10%甘油，pH8.0的缓冲液。

所述三轮定点饱和突变的具体方法为：

（1）第一轮定点饱和突变的xcTDO残基是：Y24、Y27、L28、F51、H55、Y113、R117 和L120。它们位于 αB (F51 和 H55) 和αD (Y113、R117 和 L120) 螺旋和来自其它单体(Y24、Y27 和 L28)的氨基末端残基中，并且都位于活性中心的一侧。

（2）构建第二轮饱和突变库，以第一轮突变筛选得到的较野生型活性提高的突变质粒为模板，构建双突变质粒，这一轮筛选的目标为残基G121、P122、S123、S124、G125、Q127、G253、T254和G255，它们都位于活性位点的另一侧。这些残基位于αD-αE(残基121-126和127)和αJ-αK(残基253-255)螺旋间的环中。在xcTDO 晶体结构中观察到这两个环的不同构象，显示出与底物的动态相互作用。

（3）第三轮突变筛选第一轮或第二轮筛选得到的最高活性突变质粒作为模板，这一轮筛选的目标为与血红素结合相关的靶残基(W102、L105、F126、Y131、R132、W236、H240、V244、I248、G256、F262 和 L263)。

本发明还提供一种生产3a-羟基六氢吡咯[2,3-b]吲哚-2-羧酸及其衍生物的方法，以色氨酸、5-氯色氨酸、6-氯色氨酸为底物，加入过氧化氢酶、亚甲基蓝、抗坏血酸和反应缓冲液，利用权利要求1所述的色氨酸2,3双加氧酶突变体为催化剂进行催化反应。

优选地，反应体系的pH 为6.0，反应温度为25℃，反应时间为24 h。反应结束后，加入50%乙腈沉淀蛋白30 min，离心20 min，取上清冻干。

本发明还提供色氨酸2,3双加氧酶突变体在制备含3a-羟基六氢吡咯[2，3-b]吲哚-2-羧酸及其衍生物的产品方面的应用。

本发明所达到的有益效果：

（1）本发明构建的生物催化剂可以利用不带有保护基的色氨酸、5-氯色氨酸和6-氯色氨酸作为底物，一步合成HPICs；

（2）本发明将来自于野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）的色氨酸2,3双加氧酶第51位的氨基酸残基苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，将第127位的氨基酸残基谷氨酰胺替换为络氨酸，形成色氨酸2,3双加氧酶突变体。该新型酶色氨酸2,3双加氧酶突变体将色氨酸双加氧酶转化为单加氧酶，其产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量（野生型色氨酸2,3双加氧酶HPICs产量<1%），具有优秀非对映选择性；

（3）反应和纯化过程均在环保的水溶液中，在室温下进行，反映体系简单，反应条件温和，低能耗。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

除非特定说明，以下所有的化合物和试剂都是从Sigma-Aldrich, EMDMillipore, Tokyo Chemical Industry，生工生物工程（上海）有限公司购买，纯度均>99%。

实施例1 xcTDO的基因表达载体的构建

将全基因合成的xcTDO片段（序列如SEQ ID NO：3所示，由苏州金唯智生物有限公司合成），经限制性内切酶NdeI和XhoI（New England Biolabs公司）依据说明书进行双酶切操作后，用T4连接酶（New England Biolabs公司）连接到被NdeI和XhoI双酶切过的表达载体pET22b（+）上。用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（天根生化科技有限公司）。从含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养。从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒（天根生化科技有限公司），依据说明书提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定（苏州金唯智生物有限公司）。

实施例2突变体库的建立

采用三轮定点饱和突变的方法。

第一轮定点饱和突变的xcTDO残基是：Y24、Y27、L28、F51、H55、Y113、R117 和L120。它们位于 αB (F51 和 H55) 和αD (Y113、R117 和 L120) 螺旋和来自其它单体(Y24、Y27 和 L28)的氨基末端残基中，并且都位于活性中心的一侧。在筛选过程中，以全基因合成的表达质粒（质粒上克隆有编码SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列）为模板，在每个突变位点周围设计引物，构建单突变库。筛选发现，F51X 库中的大多数突变株显示出明显高于野生型 xcTDO 的HPIC 产量，而用来自其他库的突变株检测到很少或没有产生HPIC。

（2）构建第二轮饱和突变库，以F51X库中高活性突变质粒为模板，这一轮筛选的目标为残基G121、P122、S123、S124、G125、Q127、G253、T254和G255，它们都位于活性位点的另一侧。这些残基位于αD-αE(残基121-127)和αJ-αK(残基253-255)螺旋之间的环中。在xcTDO晶体结构中观察到这两个环的不同构象，显示出与底物的动态相互作用。筛选发现，xcTDO-51M/Q127Y活性最为突出，显示出明显增加的总反应性(>99%的转化率)和适度提高的产物HPIC/NFK比值。

（3）构建第三轮饱和突变库，xcTDO-51M/Q127Y质粒为模板，这一轮筛选的目标为与血红素结合相关的靶残基(W102、L105、F126、Y131、R132、W236、H240、V244、I248、G256、F262 和 L263)。筛选没有发现更优秀的突变株。

实施例3 野生型xcTDO和突变体库的活化和诱导表达

将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）（天根生化科技有限公司）中，从上述培养过夜的平板上挑取单克隆至装有300 μl，含有终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基的96深孔板中，在37℃，摇床转速250 rpm下培养过夜。次日，从上述过夜培养的96深孔板中吸取15 μl培养液，加入到新鲜的1.5 ml，含有终浓度为100 μg/ml氨苄青霉素TB液体培养基的96深孔板中，37℃，摇床转速250 rpm，待OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.5 mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.5 mM的IPTG诱导。在22℃，摇床转速250 rpm下表达20 h后，离心转速5000 rpm离心10 min，弃上清。

实施例4 突变库的活性筛选

菌体用375μl buffer E（50 mM Tris，pH 8.0）悬浮，加入终浓度为1.0 mg/mL的溶菌酶，0.1 mg/mL的脱氧核糖核酸酶I，超声破碎细胞后，并于4℃，离心转速5000 rpm离心30min，取337.5μl上清转移至新的96孔板中，依次加入142 μl的buffer F（50 mM Tris， 5 mMTrp，pH 8.0），20 μl 的500 mM 抗坏血酸，0.5μl的10 mM亚甲基蓝。25℃，120 rpm，5 h。加入500μl乙腈沉淀蛋白30 min，5000 rpm离心20 min，取上清冻干。冻干后用500μl ddH₂O复溶，过滤后进行HPLC检测，以野生型酶作为对照。HPLC检测条件：C18 柱(5 μm, 2.1 × 150mm) ；流动相为乙腈/水（0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；检测波长295nm；柱温27℃。HPLC方法：100%水 10 min，100%水将至0%水 15 min，100%乙腈 3 min。

实施例5 突变体的表达和活性验证

（1）突变体的表达：将突变体克隆挑入5 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素LB液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500 ml 含有100 μg/ml卡那霉素TB液体培养基，在37℃，摇床转速220 rpm下进行扩培；待OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为0.5 mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.5 mM的IPTG诱导；在22℃，摇床转速220 rpm下表达20 h后，离心转速5000 rpm离心10 min收菌；舍弃上清培养基后，用85 ml的buffer A将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000 rpm，离心45 min，获得上清细胞裂解液；将上述细胞裂解液加入事先以buffer A预处理的10 ml镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含20 mM，85 mM咪唑的buffer C除去杂蛋白，并用buffer B将目的蛋白从柱上洗脱下来；目的蛋白的纯度由SDS-PAGE鉴定,一般纯度＞98%。将洗脱下的目的蛋白用buffer D 4℃下过夜透析，以除去咪唑；5000 rpm离心浓缩后，-80℃下保存；其中buffer A为0.1 M KPi，0.3M KCl，10 % 甘油，pH7.8的缓冲液；buffer B为0.1 M KPi，0.3M KCl，300 mM咪唑，10 % 甘油，pH7.8的缓冲液；buffer C为20 mM或85 mM咪唑，0.1 MKPi，0.3M KCl，10% 甘油，pH7.8的缓冲液。Buffer D为50 mM Tris，10%甘油，pH8.0的缓冲液。

（2）活性验证：反应体系：反应容器中分别加入反应缓冲液（Bis-Tris，pH 6.0）,色氨酸2，3双加氧酶突变体（1μM），色氨酸（5 mM），过氧化氢酶（10 μg/mL），亚甲基蓝（10 μM），抗坏血酸（20 mM），pH 6.0，25℃，120 rpm，反应24 h。反应结束后，加入50%乙腈沉淀蛋白，离心，取上清冻干。将冻干后的样品用ddH₂O水复溶，过滤，HPLC检测，以野生型酶作为对照。

HPLC检测条件：C18 柱(5 μm, 2.1 × 150 mm) ；流动相为乙腈/水（0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；柱温27℃；在295 nm下检测HPIC产量；在321 nm下检测NFK产量，在280 nm下检测Trp剩余量。HPLC方法：100%水 36 min，100%乙腈 13 min。

经HPLC检测，F51M/Q127Y突变株最适合应用于工业生产，其TON为3312，转化率为大于99%，产物HPIC/NFK比值为2.0：1。

实施例6：大规模制备HPIC、5Cl-HPIC、6Cl-HPIC

反应体系：反应容器中分别加入反应缓冲液（Bis-Tris，pH 6.0）, 色氨酸2，3双加氧酶突变体xcTDO-F51M/Q127Y，底物，过氧化氢酶（10 μg/mL），亚甲基蓝（10 μM），抗坏血酸（20 mM），pH 6.0，25℃，120 rpm，反应24 h。反应结束后，加入50%乙腈沉淀蛋白，1000 rpm离心20 min，取上清冻干。取少量水复溶，上样于事先用水平衡的阴离子交换住（DE52），用含有0.1%冰醋酸的水将NFK、HPIC分别洗脱出来。将样品冻干成粉末，称重，保存在-20℃。HPIC产量为132 mg（60%），5Cl-HPIC产量为66 mg（52%），6Cl-HPIC产量为39.5 mg（31%）。

底物：Trp（1.0 mmol，204 mg）、5Cl-Trp（0.5mmol，119 mg）、5Cl-Trp（0.5mmol，119mg）；xcTDO-F51M/Q127Y酶量分别为0.03 mol%、0.1 mol%、0.05 mol%。

以上显示出了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本发明构建的生物催化剂可以利用不带有保护基的色氨酸、5-氯色氨酸、6-氯色氨酸作为底物、一步合成HPICs的方法具有的优点有：1）该新型酶将色氨酸2,3双加氧酶转化为单加氧酶，其产生HPICs的产量远远大于野生型（HPIC产量<1%），具有优秀的非对映选择性；2）反应和纯化过程均在环保的水溶液中、室温下进行、反应体系简单、反应条件温和、低能耗。因此在在制备HPICs方面具有良好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Val Asp Lys Asn Leu Arg Asp Leu Glu Pro Gly Ile His Thr

1 5 10 15

Asp Leu Glu Gly Arg Leu Thr Tyr Gly Gly Tyr Leu Arg Leu Asp Gln

20 25 30

Leu Leu Ser Ala Gln Gln Pro Leu Ser Glu Pro Ala His His Asp Glu

35 40 45

Met Leu Met Ile Ile Gln His Gln Thr Ser Glu Leu Trp Leu Lys Leu

50 55 60

Leu Ala His Glu Leu Arg Ala Ala Ile Val His Leu Gln Arg Asp Glu

65 70 75 80

Val Trp Gln Cys Arg Lys Val Leu Ala Arg Ser Lys Gln Val Leu Arg

85 90 95

Gln Leu Thr Glu Gln Trp Ser Val Leu Glu Thr Leu Thr Pro Ser Glu

100 105 110

Tyr Met Gly Phe Arg Asp Val Leu Gly Pro Ser Ser Gly Phe Tyr Ser

115 120 125

Leu Gln Tyr Arg Tyr Ile Glu Phe Leu Leu Gly Asn Lys Asn Pro Gln

130 135 140

Met Leu Gln Val Phe Ala Tyr Asp Pro Ala Gly Gln Ala Arg Leu Arg

145 150 155 160

Glu Val Leu Glu Ala Pro Ser Leu Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Tyr Leu

165 170 175

Ala Arg Phe Gly His Ala Ile Pro Gln Gln Tyr Gln Ala Arg Asp Trp

180 185 190

Thr Ala Ala His Val Ala Asp Asp Thr Leu Arg Pro Val Phe Glu Arg

195 200 205

Ile Tyr Glu Asn Thr Asp Arg Tyr Trp Arg Glu Tyr Ser Leu Cys Glu

210 215 220

Asp Leu Val Asp Val Glu Thr Gln Phe Gln Leu Trp Arg Phe Arg His

225 230 235 240

Met Arg Thr Val Met Arg Val Ile Gly Phe Lys Arg Gly Thr Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Gly Val Gly Phe Leu Gln Gln Ala Leu Ala Leu Thr Phe Phe

260 265 270

Pro Glu Leu Phe Asp Val Arg Thr Ser Val Gly Val Asp Asn Arg Pro

275 280 285

Pro Gln Gly Ser Ala Asp Ala Gly Lys Arg

290 295

<210> 2

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcccgtcg acaagaacct gcgtgacctg gaacccggca tccacaccga tctggaaggg 60

cggctgacct acggcggcta cctgcgcctg gaccagttgc tgagtgcgca gcagcccttg 120

tccgagccgg cgcaccacga cgaaatgctg atgatcatcc agcaccagac ctccgagctg 180

tggctgaaac tgctggccca cgagctgcgc gcggccatcg tgcacctgca gcgcgacgag 240

gtctggcaat gccgcaaggt gctggcgcgc agcaagcagg tgctgcgcca gctgaccgag 300

caatggtcgg tgctggaaac gctgaccccc agcgagtaca tgggctttcg cgatgtgctc 360

ggcccctcat cgggcttcta ttcgctgcaa taccgctaca tcgagttcct gctgggcaac 420

aagaatccgc agatgctgca ggtgttcgcc tatgaccctg ccggccaggc acggctgcgc 480

gaagtactgg aagccccgag cctgtacgag gaattcctgc gctacctggc gcgcttcggg 540

catgcgattc cgcagcaata ccaggcccgc gactggaccg ctgcgcacgt ggccgacgac 600

acgctgcggc cggtgttcga gcgcatctac gaaaataccg accgctactg gcgcgaatat 660

tcgctgtgcg aagacctggt ggatgtggaa acccagttcc agctgtggcg cttccggcac 720

atgcgcacgg tgatgcgggt gatcggcttc aaacgcggca ccggcggctc cagtggcgtg 780

gggttcctgc agcaggccct ggcactgacc ttcttcccgg agctgttcga cgtgcgtacg 840

tccgtaggcg tggacaaccg accgccgcag gggagtgcgg acgctgggaa gcgctga 897

<210> 3

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcccgtcg acaagaacct gcgtgacctg gaacccggca tccacaccga tctggaaggg 60

cggctgacct acggcggcta cctgcgcctg gaccagttgc tgagtgcgca gcagcccttg 120

tccgagccgg cgcaccacga cgaaatgctg ttcatcatcc agcaccagac ctccgagctg 180

tggctgaaac tgctggccca cgagctgcgc gcggccatcg tgcacctgca gcgcgacgag 240

gtctggcaat gccgcaaggt gctggcgcgc agcaagcagg tgctgcgcca gctgaccgag 300

caatggtcgg tgctggaaac gctgaccccc agcgagtaca tgggctttcg cgatgtgctc 360

ggcccctcat cgggcttcca gtcgctgcaa taccgctaca tcgagttcct gctgggcaac 420

aagaatccgc agatgctgca ggtgttcgcc tatgaccctg ccggccaggc acggctgcgc 480

gaagtactgg aagccccgag cctgtacgag gaattcctgc gctacctggc gcgcttcggg 540

catgcgattc cgcagcaata ccaggcccgc gactggaccg ctgcgcacgt ggccgacgac 600

acgctgcggc cggtgttcga gcgcatctac gaaaataccg accgctactg gcgcgaatat 660

tcgctgtgcg aagacctggt ggatgtggaa acccagttcc agctgtggcg cttccggcac 720

atgcgcacgg tgatgcgggt gatcggcttc aaacgcggca ccggcggctc cagtggcgtg 780

gggttcctgc agcaggccct ggcactgacc ttcttcccgg agctgttcga cgtgcgtacg 840

tccgtaggcg tggacaaccg accgccgcag gggagtgcgg acgctgggaa gcgctga 897

Claims

1.一种色氨酸2,3双加氧酶突变体，其特征是，该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码如权利要求1所述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸序列，其特征是，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.包含如权利要求2所述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸序列的载体。

4.表达权利要求1所述色氨酸2,3双加氧酶突变体的细胞，包含权利要求3所述的载体。

5.根据权利要求1所述的一种色氨酸2,3双加氧酶突变体的制备方法，其特征是，包括：

将色氨酸2,3双加氧酶第51位的氨基酸残基苯丙氨酸替换为甲硫氨酸，将第127位的氨基酸残基谷氨酰胺替换为酪氨酸，获得如权利要求1所述的色氨酸2,3双加氧酶突变体；

将构建的表达色氨酸2,3双加氧酶突变体的质粒转化到大肠杆菌中；

色氨酸2,3双加氧酶突变体的表达及纯化。

6.一种生产3a-羟基六氢吡咯[2,3-b]吲哚-2-羧酸的方法，其特征是，以色氨酸、5-氯色氨酸、6-氯色氨酸为底物，加入过氧化氢酶、亚甲基蓝、抗坏血酸和反应缓冲液，利用权利要求1所述的色氨酸2,3双加氧酶突变体为催化剂进行催化反应。

7.根据权利要求6所述的一种生产3a-羟基六氢吡咯[2,3-b]吲哚-2-羧酸的方法，其特征是，反应体系的pH为6.0，反应温度为25℃，反应时间为24 h。

8.权利要求1所述的色氨酸2,3双加氧酶突变体在制备含3a-羟基六氢吡咯[2,3-b]吲哚-2-羧酸的产品方面的应用。