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CN110564624B - 一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用 - Google Patents

一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用,在250.0g/L含有不同浓度NaCl的玉米秸秆粉培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的秸秆粉悬浮液,处理重复3次,培养4‑15天后挑取生长良好的单菌落,接种于筛选培养基CMC‑Na固体培养基上,产生透明圈状的菌株,得到产黄青霉菌,保藏名称:产黄青霉W2;保藏编号:CGMCC NO.17972;本发明中的高抗盐碱产黄青霉菌具有高抗渗特性,有利于提高在高盐碱环境下对秸秆的降解能力,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理具有良好的效果。

Description

一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物学工程与技术领域,尤其涉及一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用。
背景技术
我国秸秆资源丰富,来源广泛,居世界首位,特别是农业改革以来,随着粮食产量的大幅增长,农作物秸秆产量也快速增加,已经成为我国秸秆资源的重要来源。随着科学技术的不断发展,秸秆的利用领域也得到了极大的拓展,如秸秆可作为燃料、饲料、基料(育苗基质)、工业原料等等。但目前农作物秸秆资源化综合利用率仍然较低,多为粗放处理,甚至直接在田间地头直接焚烧,既给环境造成严重的污染,也意味着肥料的大量流失,已引起了全社会的广泛关注;
高抗盐碱真菌是从高盐、高碱或高盐碱共存环境中分离的微生物资源,具有重要的研究、应用与开发价值,因此高抗盐碱真菌的挖掘、开发和利用意义重大。目前,人们已将这些高抗盐碱真菌应用于环境治理中,如盐碱地的修复改造、淤泥污水的净化处理,以及农业废弃物的循环利用等;
利用微生物降解秸秆并还田是改良土壤,特别是修复盐碱土壤的一种重要措施,但目前市面上的大部分微生物菌剂在正常土壤中可以发挥很好的作用,而在盐碱土壤中,由于高浓度的盐和高PH值的环境,这些菌株很难发挥应有的作用,为了盐碱地秸秆能在短时间内被高效降解、实现肥料还田,从盐碱土壤中筛选高抗盐碱真菌是十分有必要的,因此,本发明提出一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用,以解决现有技术中的不足之处。
发明内容
针对上述问题,本发明提出一种高抗盐碱产黄青霉菌及其分离方法和应用,本发明中的高抗盐碱产黄青霉菌具有高抗渗特性,有利于提高在高盐碱环境下对秸秆的降解能力,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理具有良好的效果。
本发明提出一种高抗盐碱产黄青霉菌,所述高抗盐碱产黄青霉菌于2019年06月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏名称:产黄青霉W2;分类命名:产黄青霉(Penicilliumchrysogenum);保藏编号:CGMCC NO.17972。
一种高抗盐碱产黄青霉菌的分离方法,包括以下步骤:
步骤一:在250.0g/L含有不同浓度NaCl的玉米秸秆粉培养基固体平板上涂布经过
梯度稀释的秸秆粉悬浮液,每个玉米秸秆粉培养基固体平板上处理重复3次,然后培养4-15天后挑取生长良好的单菌落保存备用;
步骤二:将步骤一中挑取后进行保存备用的单菌落接种于筛选培养基CMC-Na固体培养基上,直至产生透明圈状的菌株;
步骤三:将步骤二中产生的透明圈状的菌株进行保藏,并进行ITS序列鉴定,以得出鉴定结果。
进一步改进在于:所述步骤一中玉米秸秆粉培养基由10g玉米秸秆粉、4g(NH4)2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、2gKH2PO4、1g蛋白胨、16g琼脂和1000mL去离子水组成。
进一步改进在于:所述步骤一中的秸秆粉悬浮液为4-6cm厚的含有秸秆样品的秸秆土壤表层土样于4℃保存、稀释并取上清液后得到秸秆粉悬浮液。
进一步改进在于:所述步骤一中玉米秸秆粉培养基的PH值为5.0-10.0。
进一步改进在于:所述步骤三中透明圈状的菌株在进行ITS序列鉴定前,需要先进行形态学鉴定,其具体过程为:将步骤二中筛选得到的透明圈状的菌株接种到含有5%NaCL的玉米秸秆粉培养基上,在30℃环境温度下培养5天,然后观察菌落形态。
进一步改进在于:所述步骤三中透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定的具体过程为:
将扩增的ITS序列数据提交GenBank,利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对,以得出鉴定结果。
进一步改进在于:所述步骤三中对透明圈状的菌株进行ITS序列鉴定后,还需要对菌株进行高抗盐性及最适盐浓度的鉴定、菌株生长PH测定、菌株产纤维素酶活性测定及菌株降解秸秆效果测定。
一种高抗盐碱产黄青霉菌在盐碱地改造中的应用。
一种高抗盐碱产黄青霉菌在环境污染处理中降解秸秆的应用。
本发明的有益效果为:本发明中的高抗盐碱产黄青霉菌具有高抗渗特性,有利于提高在高盐碱环境下对秸秆的降解能力,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理具有良好的效果。
附图说明
图1为本发明实施例二中产黄青霉菌落形态特征示意图;
图2为本发明实施例二中分生孢子梗及分生孢子示意图;
图3为本发明实施例五中菌株降解秸秆效果示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解,下面将结合实施例对本发明做进一步详述,本实施例仅用于解释本发明,并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
一种高抗盐碱产黄青霉菌的分离方法,包括以下步骤:
步骤一:在250.0g/L含有不同浓度NaCl的玉米秸秆粉培养基固体平板上涂布经过梯度稀释的秸秆粉悬浮液,玉米秸秆粉培养基由10g玉米秸秆粉、4g(NH4)2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、2gKH2PO4、1g蛋白胨、16g琼脂和1000mL去离子水组成,米秸秆粉培养基的PH值为6.5,秸秆粉悬浮液为5cm厚的含有秸秆样品的秸秆土壤表层土样于4℃保存、稀释并取上清液后得到秸秆粉悬浮液,每个玉米秸秆粉培养基固体平板上处理重复3次,然后培养4天后挑取生长良好的单菌落保存备用;
步骤二:将步骤一中挑取后进行保存备用的单菌落接种于筛选培养基CMC-Na固体培养基上,直至产生透明圈状的菌株;
步骤三:将步骤二中产生的透明圈状的菌株进行保藏,然后进行ITS序列鉴定,得出鉴定结果为产黄青霉;
ITS序列鉴定具体过程为:将扩增的ITS序列数据提交GenBank,利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对,菌株与青霉菌属(Penicillium)菌株MG647847.1的同源性达99%,使用生物信息学分析软件MEGA 7.0中的Maximum likelihood方法构建系统发育树,得出鉴定结果,菌株为产黄青霉。
实施例二
根据图1、2所示,本实施例提出透明圈状的菌株的形态学鉴定:
将筛选得到的透明圈状的菌株接种到含有5%NaCL的玉米秸秆粉培养基上,在30℃环境温度下培养5天,然后观察菌落形态,其具体过程为:用镊子夹取灭菌的盖玻片,斜插到5%NaCL的玉米秸秆粉培养基中部,在盖玻片正前方接种一个直径为7mm的菌透明圈状的菌株(菌株的菌丝面朝下),然后将平板放置在30℃恒温培养箱中,定期观察菌丝生长情况,待菌丝爬上盖玻片后,将与盖玻片相连的培养基切下,取出盖玻片,在显微镜下观察菌丝及孢子形态,30℃在含5%NaCL的玉米秸秆粉培养基上培养9天后,圆形菌落直径约为55.56mm,边缘菌丝体为白色,产生大量灰绿色孢子,菌落结构为毡毛状,边缘为纤毛状,菌落反面呈浅黄褐色,在培养过程中,玉米秸秆粉培养基颜色无变化(如图1所示);
显微观察结果显示:分生孢子梗一般帚状三轮生,顶端稍膨大,瓶梗安瓿形,分生孢子(近)球形、(近)椭圆形,淡绿色,光滑,分生孢子链稍叉开而成疏松的柱状(如图2所示),经形态学鉴定为产黄青霉。
实施例三
本实施例提出产黄青霉W2的高抗盐性及最适盐浓度鉴定:配制梯度NaCl含量的玉米秸秆粉培养基(PH为7.0),其盐浓度(质量分数)由0%增加到31%(饱和浓度),每级增加2%,将等量的菌株接种于培养基中心位置,30℃培养1周,结果发现,在30℃的温度下,在0%-31%NaCl玉米秸秆粉培养基中,菌株均能生长,但是随着盐浓度增长,菌株生长明显受到抑制,在1%-5%浓度下生长相对较缓慢;5%-11%浓度下菌株生长加快,15%-25%浓度下菌株生长急剧变慢,27%-31%浓度下菌体基本不生长,因此,该菌株具有抗盐的特性,属于高抗盐特性的真菌;
用高抗盐性鉴定过程中使用到的系列盐梯度PD(不加琼脂,且PH为7.0的马铃薯液体培养基)培养菌株,于25℃摇培一周后,离心收集菌丝,用去离子水反复冲洗4次,105℃下烘干测定菌丝干重,比较发现菌株在5-10%浓度下的干重最大,其最适生长的盐浓度为5-10%。
实施例四
本实施例提出菌株生长PH测定:配制PH为1.0-13.0的酸碱梯度玉米秸秆粉培养基,添加NaCl至终浓度(质量分数)为5%,然后接种菌株,在30℃环境温度下进行培养,然后观察结果发现,菌株在不同PH的玉米秸秆粉培养基上开始生长的时间不同,培养1天后,在PH=3.0-8.0的玉米秸秆粉培养基上可见菌丝生长,培养2天后在PH=9.0的玉米秸秆粉培养基中可见菌丝生长,培养5天后在PH=10.0的玉米秸秆粉培养基中可见菌丝生长,而PH=11的玉米秸秆粉培养基在培养第7天才生长出菌丝,在PH=1.0、2.0、12.0和13.0的玉米秸秆粉培养基中,始终未见菌丝生长,因此可以得出,菌株的生长PH范围为3.0-11.0;
为了确定该菌株生长的最适宜PH范围,利用上述PH梯度进一步用PD液体培养基培养,在30℃摇培1周后,离心收集菌丝,用去离子水反复冲洗4次,然后在105℃下进行烘干,比较菌丝干重,结果表示,菌株在PH为4.0-9.0的范围内,菌体干重最大,因此,该菌株的最适PH范围为4.0-9.0。
实施例五
根据图3所示,本实施例提出菌株产纤维素酶活性及菌株降解秸秆效果测定:将等量的菌株接种到不含NaCL和含5%NaCL的产酶培养基(由5.0g/L的CMC-Na、0.5g/L的酵母浸粉、0.5g/L的酶水解干酪素、1.0g/L的Ca(NO3)2、0.5g/L的酸水解干酪素、0.2g/L的K2HPO4、0.25g/L的MgSO4·7H2O0.25g/L制成,PH为7.0)中,在30℃环境温度下摇培4天,使用DNA方法测定菌株产纤维素酶的活性,结果表明使用0%NaCl产酶培养基培养4天,酶活达到43.73U/mL,使用5%NaCl产酶培养基培养4天,酶活达到82.67U/mL;
在50mL锥形瓶中放入0.6g经搅碎机打碎的秸秆(长度为5mm左右),121℃灭菌20min,向每个锥形瓶中接种3mL孢子悬液,调节孢子悬液浓度为1×105-1×107,置于30℃培养箱中进行培养,定期观察生长情况,培养5天后,发现该菌株可以在秸秆上生长,表明菌株能够降解秸秆(结果如图3所示)。
本发明的有益效果为:本发明中的高抗盐碱产黄青霉菌具有高抗渗特性,有利于提高在高盐碱环境下对秸秆的降解能力,还可以直接用于田间的秸秆发酵等生物物质的分解,对次生盐渍化或连作障碍土壤的改良与环境污染处理具有良好的效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种高抗盐碱产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum),其特征在于:所述高抗盐碱产黄青霉菌于2019年06月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏名称:产黄青霉W2;分类命名:产黄青霉(Penicillium chrysogenum);保藏编号:CGMCC NO.17972。
2.如权利要求1所述的一种高抗盐碱产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)在盐碱地改造中的应用。
3.如权利要求1所述的一种高抗盐碱产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)在环境污染处理中降解秸秆的应用。
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