CN110494447A

CN110494447A - 使用抗人gpv1抗体抑制血小板聚集

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Publication number: CN110494447A
Application number: CN201880010227.0A
Authority: CN
Inventors: P·比亚阿多; M·扬德特-佩吕; G·阿弗纳尔
Original assignee: French National Institute Of Health And Medicine; Ai Cody Kerr Biotech Corp; Universite Paris Diderot Paris 7; Universite Paris Sud Paris 11; Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13
Current assignee: Paris Thackeray, University of; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Universite Sorbonne Paris Nord Paris 13; Universite de Paris; Acticor Biotech SAS
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: AU2021202612A1; AU2018214222C1; EP3577136A1; AU2018214222B2; NZ755339A; KR102633644B1; US20230391869A1; MA47415A; CN110494447B; BR112019016065A8; WO2018141909A1; TWI810173B; IL268299B2; IL268299A; JP2020507317A; CA3051169A1; MX2019009137A; BR112019016065A2; US11692033B2; IL268299B1

Abstract

本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述分离的人源化蛋白质在至少2小时期间、优选在4至6小时期间施用于受试者。

Description

使用抗人GPV1抗体抑制血小板聚集

发明领域

本发明涉及心血管疾病的治疗。特别地，本发明涉及治疗心血管疾病的方法，包括将新的抗人糖蛋白VI抗体或其片段连续施用于有此需要的人患者。

发明背景

急性冠状动脉和脑血管事件是目前世界上的主要死亡原因。此外，在急性冠状动脉综合征后的治疗后6个月周期中复发和死亡的全球发生率仍为8-15％。

在具有ST段抬高的急性冠状动脉综合征的情况中，采用冠状动脉血管成形术和引入支架的机械治疗对于紧急恢复冠状动脉血流是高度有效的，但不能防止在接下来的6个月内约15％患者的发病率/死亡率。基于长期纤维蛋白溶解药物、抗凝药物和抗聚集药物联合的溶栓治疗给出甚至不太令人欣喜的结果。事实上，尽管血栓症的医学治疗有所改善，但6个月时的发病率/死亡率相似于无ST段抬高的急性冠状动脉综合征的观察结果。

对于脑血管缺血事件，由于对大多数患者整体晚的医护以及目前可用的抗血栓症治疗的出血风险，治疗仍是非常有限。

因此临床上仍然需要改善对心血管疾病的治疗，特别是对于与现有分子相比具有改善特征的新分子和用于施用所述分子的特定剂量方案。面临的挑战是获得对病理性血栓症具有优异功效但没有出血风险的分子和给药方案。

为了满足这种要求，靶标在患病血管中发生的血栓症中必须发挥比在为限制健康血管出血所需的生理止血中更大的作用。血小板糖蛋白VI就是这种情况，已经证实其在动物的实验性血栓症(包括中风、血管重塑)中起作用并且证实其在动脉粥样硬化血栓症中至关重要。

与目前在血栓症治疗中使用的并抑制血小板最终活化阶段(即血小板聚集)的αIIbβ3整合素拮抗剂以及血小板募集拮抗剂(P2Y12 ADP受体和阿司匹林的抑制剂)相反，GPVI牵涉到血小板栓形成的几个步骤：通过与受损血管壁相互作用的引发；通过初始血小板活化导致次级激动剂(secondary agoni sts)的分泌、整合素和血小板促凝血活性的激活的扩张；经由与纤维蛋白相互作用的生长和稳定(Mammadova-Bach et al.,2015.Blood.126(5):683-91)。因此，GPVI拮抗剂不仅可以防止血小板聚集，还可以防止次级激动剂释放以及生长因子和细胞因子分泌，从而导致出现血管损害。最后，GPVI表达被限制于血小板和巨核细胞，并因此代表了抗血栓症治疗的完美特异性靶标。

GPVI拮抗剂因此被开发用于治疗心血管疾病。

WO 2001/000810和WO 2003/008454均描述了可溶性GPVI重组蛋白，其是GPVI胞外结构域和人Ig Fc结构域之间的融合蛋白。这种可溶性重组GPVI蛋白与血小板GPVI竞争结合胶原蛋白。这种可溶性GPVI蛋白首先在血栓症鼠模型中获得了令人欣喜的结果，但是这些结果未被证实。此外，这种方法涉及结构、功能和药理学缺点。首先，这种化合物是高分子量嵌合蛋白(～160kDa)。GPVI-Fc靶向在血管损伤部位暴露的胶原蛋白，其量和可接近性是难以预测的，因此，待注射的产品的量对GPVI-Fc的使用构成潜在的限制。另一个限制可能是对在融合蛋白上可能暴露的新表位免疫的风险。

本领域还描述了针对人GPVI的中和性单克隆抗体。

例如，EP 1224942和EP 1228768公开了特异性结合小鼠GPVI的大鼠单克隆抗GPVI抗体JAQ1，用于治疗血栓性病症。JAQ1抗体诱导小鼠血小板上的GPVI受体不可逆内化。

EP 1538165描述了另一种大鼠单克隆抗GPVI抗体(hGP 5C4)，发现其Fab片段对由胶原蛋白刺激诱导的血小板的主要生理功能具有明显的抑制作用：对胶原蛋白介导的生理活化标记物PAC-I和CD62P-选择素的刺激被hGP 5C4 Fab完全阻止，并且hGP 5C4 Fab离体时有效抑制人血小板聚集而没有任何内在活性。然而，5C4是一种大鼠抗体，因此仅具有非常有限的治疗潜力。

WO 2005/111083描述了4种小鼠单克隆抗GPVI抗体OM1、OM2、OM3和OM4，发现它们在体外抑制GPVI与胶原蛋白的结合、胶原蛋白诱导的分泌和血栓素A2(TXA2)的形成，以及静脉内注射到食蟹猴后离体时胶原蛋白诱导的血小板聚集。OM4还可以在大鼠血栓症模型中抑制血栓症。

WO 2001/000810还描述了命名为8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J24.2、6E12.3、1P10.2、4L7.3、7H4.6、9O12.2、7H14.1和9E18.2的各种鼠单克隆抗GPVI抗体以及命名为A9、A10、C9、A4、C10、B4、C3和D11的几种人噬菌体抗体scFv片段。发现这些抗体和scFv片段中的一些抑制GPVI与胶原蛋白的结合，包括抗体9E18.3、7H4.6和9O12.2以及scFv片段A10、A4、C10、B4、C3和D11。此外，发现9O12.2 Fab片段完全阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集和分泌，阻断纤维蛋白诱导的血小板聚集，抑制胶原蛋白刺激的或纤维蛋白刺激的血小板的促凝血活性以及在静态条件下血小板与胶原蛋白或纤维蛋白的粘附，在动脉血流条件下损害血小板粘附和防止血栓形成。

WO 2008/049928描述了衍生自9O12.2的scFv片段，其由(Gly₄Ser)₃肽连接的9O12.2单克隆抗体的VH和VL结构域构成。

然而，目前已知的抗GPVI抗体均没有显示在体内可有效用于预防和/或治疗心血管疾病。具体而言，已报道的大多数抗GPVI抗体似乎不适合用于开发人类医学用途的抗血栓剂，尤其是由于其动物来源。

具体而言，已报道一些针对人GPVI的人噬菌体抗体scFv是抑制性的，但其亲和力似乎较低。此外，血小板表面上GPVI被二价或多价配体(如9O12.2完整IgG)交联导致血小板经由GPVI二聚化以及经由GPVI与低亲和力Fc受体(FcγRIIA)交联而活化。相比之下，单价的9O12.2 Fab和scFv片段是抑制性的。

然而，这些片段不能用于治疗，因为它们的大小和它们的动物来源使得它们在人类患者中具有免疫原性。而且，scFv片段呈现短的半衰期，这限制了它们的治疗潜力。

因此仍然需要在人体中无免疫原性的中和性GPVI拮抗剂。

US 2006/0088531描述了人scFv片段10B12，其与人GPVI结合的K_D为约7.9.10^-7M。Smethurst(Smethurst et al.,2004.Blood.103(3):903-11)进一步描述了在人GPVI的Ig样C2型结构域1(D1)上被10B12结合的表位。这一表位包含人GPVI的残基R58、K61、R66、K79和R80(基于UniProtKB登录号Q9HCN6编号)。

O’Connor(O'Connor et al.,2006.J.Biol.Chem.281(44):33505-10)还描述了对GPVI具有低亲和力(5.4 10^-7M)的人scFv片段1C3，其既不阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集，也不阻断GPVI与胶原蛋白的结合，但其增强了10B12抗体的抑制作用。GPVI中的1C3表位包含氨基酸I168，并且进一步推测这一表位可能包括残基S164和S182之间的区域，该区域是从小鼠到人类均高度保守的区域。

因此，需要与现有技术的拮抗剂相比具有改善的亲和力、功效和半衰期的人源化抗体(即，在人体内无免疫原性的抗体)，作为有效且充分预防和/或治疗人心血管疾病的手段。而且，这些拮抗剂应当优选是易于纯化的。

在本领域中，描述了诱导GPVI耗竭表型的抗GPVI抗体(WO 2006/118350、WO 2011/073954、EP 2363416)。具体而言，WO 2006/118350公开了针对所有哺乳动物的抗GPVI抗体。描述了这一抗体结合的GPVI的表位，其对应于GPVI的Ig样C2型结构域2的环9和11，分别对应于氨基酸残基136-142和158-162。

然而，GPVI耗竭是不期望的，因为它不能被控制，并且是不可逆的(即由于巨核细胞上的GPVI耗竭，它持续血小板的寿命，或甚至更长时间)。

在治疗中，需要快速、安全且延长(在数小时范围内)的抗血小板作用。因此，应当开发不诱导GPVI耗竭表型并且优选不诱导体内血小板计数降低(即具有可逆效应)的抗体。

申请人开发了与一种抗GPVI抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段与新型的、无记载的构象表位结合。所述抗GPVI抗体对人GPVI具有强亲和力，并且阻断GPVI与其配体(包括胶原蛋白和纤维蛋白)的相互作用，而不会降低体内血小板计数，也不会耗竭体内GPVI。当连续施用至少2小时时，所述抗体(或其片段)表现出延长的体内效应。因此，本发明涉及改进的对人GPVI或其片段具有特异性的人源化中和性抗体。

发明概述

本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述分离的人源化蛋白质在至少2小时期间、优选至少4至6小时期间施用于受试者。

在一个实施方案中，注射分离的人源化蛋白质，优选静脉输注。在另一个实施方案中，腹膜内注射分离的人源化蛋白质。

在一个实施方案中，向患者施用剂量范围为约0.5mg/kg至约50mg/kg，优选约1mg/kg至约32mg/kg，更优选约2.5mg/kg至约25mg/kg，甚至更优选约5mg/kg至约15mg/kg，并且仍然更优选约8mg/kg的人源化蛋白质。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质的剂量范围为约125mg至约2000mg，优选约250mg至约1000mg或约500mg至约1000mg。

在一个实施方案中，施用第一次大剂量(bolus)，其中优选地，所述第一次大剂量给药包含待施用的分离的人源化蛋白质总剂量的约10至50％，优选约20％，并且其中优选地，所述第一次大剂量在约5至30分钟内，优选约15分钟内施用。

在一个实施方案中，所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：

-至少一个来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142的氨

基酸残基或至少一个来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114

至142上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基；和

-至少一个来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187的氨

基酸残基或至少一个来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165

至187上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含至少一个来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135的氨基酸残基或至少一个来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基；和至少一个来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183的氨基酸残基或至少一个来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含至少一个来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至136的氨基酸残基或至少一个来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至136上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基；和至少一个来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183的氨基酸残基或至少一个来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％同一性的序列的氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述蛋白质与hGPVI结合的K_D小于15nM，其中所述K_D是使用960至1071RU可溶性人GPVI并使用pH 7.4PBS作为运行缓冲液通过表面等离振子共振测量的，并且其中所述分离的人源化蛋白质在体内不诱导GPVI耗竭表型。

在一个实施方案中，用于本发明用途的与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质是选自由以下组成的组的抗体分子：完整抗体、人源化抗体、单链抗体、Fv、Fab；或选自由以下组成的组的抗体片段：单抗体、结构域抗体和纳米抗体；或选自由以下组成的组的单体抗体模拟物：亲和体、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer和versabody，优选单价抗体。

在一个实施方案中，与hGPV结合的分离的抗体分子是如下抗体分子，其中：

-重链的可变区包含以下CDR中的至少一个：

VH-CDR1：GYTFTSYNMH(SEQ ID NO:1)；

VH-CDR2：GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQ ID NO:2)；和

VH-CDR3：GTVVGDWYFDV(SEQ ID NO:3)；

或具有与SEQ ID NO：1-3具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CDR：和

-轻链的可变区包含以下CDR中的至少一个：

VL-CDR1：RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:4)；

VL-CDR2：RVSNRFS(SEQ ID NO:5)；和

VL-CDR3：LQLTHVPWT(SEQ ID NO:6)；

或具有与SEQ ID NO:4-6具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CDR。

在一个实施方案中，重链的可变区包含以下CDR：GYTFTSYNMH(SEQ ID NO:1)、GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQ ID NO:2)和GTVVGDWYFDV(SEQ ID NO:3)，及轻链的可变区包含以下CDR：RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:4)、RVSNRFS(SEQ ID NO:5)和LQLTHVPWT(SEQ IDNO:6)，或具有与所述SEQ ID NO：1-6具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CDR。

在一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:7，编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:8，或具有与所述SEQ ID NO：7或8具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何序列。

在一个实施方案中，编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO：7，编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:9，或具有与所述SEQ ID NO:7或9具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何序列。

在一个实施方案中，所述GPVI相关的病症是选自动脉和静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征和由动脉粥样硬化引起的脑血管事件的心血管疾病。

在一个实施方案中，所述GPVI相关的病症是选自以下的心血管疾病：动脉和静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征、由动脉粥样硬化引起的脑血管事件、心肌梗塞、肺栓塞、严重肢体缺血和外周动脉疾病。

发明详述

“糖蛋白VI(GPVI)”是参与血小板-胶原蛋白相互作用的血小板膜糖蛋白。GPVI是在血小板表面上表达的跨膜胶原蛋白受体。在一个实施方案中，人GPVI的氨基酸序列是SEQID NO:13(登录号：BAA89353.1)或与SEQ ID NO:13呈现至少约90％同一性、优选与SEQ IDNO:13具有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的任何氨基酸序列。

(SEQ ID NO:13)

MSPSPTALFCLGLCLGRVPA(信号肽)

QSGPLPKPSLQALPSSLVPLEKPVTLRCQGPPGVDLYRLEKLSSSRYQDQAVLFIPAMKRSLAGRYRCSYQNGSLWSLPSDQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSSGGDVTLQCQTRYGFDQFALYKEGDPAPYKNPERWYRASFPIITVTAAHSGTYRCYSFSSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGN(胞外结构域)

LVRICLGAVILIILAGFLAEDWHSRRKRLRHRGRAVQRPLPPLPPLPQTRKSHGGQDGGRQDVHSRGLCS(跨膜结构域和胞浆结构域)

GPVI的胞外结构域包含通过域间铰链连接的两个Ig样C2型结构域(即D1和D2)。在一个实施方案中，D1包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基21至109。在一个实施方案中，D1和D2之间的域间铰链(hinge interdomain)包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基110至113。在一个实施方案中，D2包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基114至207。

数字前面的“约”意指所述数字的加上或少于10％的值。

“抗体”或“免疫球蛋白”-如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括具有两个重链和两个轻链的组合的蛋白质，而无论其是否具有任何相关的特异免疫反应性。“抗体”是指对感兴趣的抗原(例如人GPVI)具有显著的已知特异免疫反应活性的装配体。术语“抗GPVI抗体”在本文中是指对人GPVI蛋白表现出免疫特异性的抗体。如本文其他地方所解释的，针对人GPVI的“特异性”不排除与GPVI的种同源物的交叉反应。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间具有或不具有链间共价连接。脊椎动物系统中的基础免疫球蛋白结构已经相对得到深入了解。上位术语“免疫球蛋白”包括在生化上可以区分的五种不同类型的抗体。所有五类抗体都在本发明的范围内；以下讨论一般是针对IgG类免疫球蛋白分子进行的。关于IgG，免疫球蛋白包含分子量为约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽链和分子量为约53,000-70,000道尔顿的两条相同的重链。四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的口开始并持续穿过可变区而括上重链。抗体的轻链被分类为κ或λ([κ]，[λ])。每个重链类可以与κ或λ轻链结合。一般而言，当免疫球蛋白由杂交瘤细胞、B细胞或基因工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，并且两条重链的“尾部”区域通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉末端的N末端运行至每条链底部的C末端。本领域技术人员理解，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其中具有一些亚类(例如γ1-γ4)。这条链的性质决定了抗体的“类型”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被充分表征，并且已知赋予功能特化。鉴于本发明的公开内容，这些类型和同种型中的每一种的修改版本对于本领域技术人员是容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。如上文所述，抗体的可变区允许抗体选择性地识别和特异性地结合抗原上的表位。即，抗体的轻链可变结构域(VL结构域)和重链可变结构域(VH结构域)组合以形成界定三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成在“Y”的每个臂末端存在的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由每条VH和VL链上的三个互补决定区(CDR)限定。

“分离的抗体”–如本文所用，“分离的抗体”是已从其天然环境的组分中分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染性组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质组分。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：(1)如通过Lowry法测定的，大于抗体的80、85、90、91、92、93、94、95重量％或更多，并且最优选大于99重量％；(2)通过使用旋杯式序列分析仪足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)如在还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色通过SDS-PAGE显示均质。因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在，分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。

“亲和力变体”-如本文所用，术语“亲和力变体”是指与参考抗GPVI抗体相比表现出氨基酸序列的一个或多个变化的变体抗体，其中亲和力变体与参考抗体相比表现出对人GPVI蛋白的亲和力的改变。通常，与参考抗GPVI抗体相比，亲和力变体将表现出改善的对人GPVI的亲和力。这种改善可以是对人GPVI的K_D更低，对人GPVI的K_A更高，对人GPVI的结合速率(on-rate)更快或对人GPVI的解离速率(off-rate)更慢，或者与非人GPVI同源物的交叉反应性模式改变。与参考抗GPVI抗体相比，亲和力变体通常表现出在氨基酸序列(例如在CDR中)的一个或多个变化。这样的取代可能导致用不同的氨基酸残基置换在CDR中给定位置存在的原始氨基酸，所述不同的氨基酸残基可以是天然存在的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。氨基酸取代可以是保守的或非保守的。

“结合位点”-如本文所用，术语“结合位点”包含负责选择性地结合感兴趣的靶抗原(例如人GPVI)的蛋白质的区域。结合结构域或结合区包含至少一个结合位点。示例性结合结构域包括抗体可变结构域。本发明的蛋白质可以包含单个抗原结合位点或多个(例如两个、三个或四个)抗原结合位点。然而，优选地，本发明的蛋白质包含单个抗原结合位点。

“保守氨基酸取代”-如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似性质的氨基酸残基置换的那些，使得肽化学领域的技术人员期望多肽的二级结构和亲水性质基本上不变。因此，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行氨基酸取代。

例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其他氨基酸组包括：(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；(2)半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；(3)颉氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)赖氨酸、精氨酸、组氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。本领域已经定义了具有相似侧链的其他氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方案中，一段氨基酸可以用结构相似的段(string)替换，所述段在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。

“嵌合”-如本文所用，“嵌合”蛋白质包含与本质上不是天然连接的第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列。所述氨基酸序列通常可以存在于在融合蛋白中将其聚在一起的独立的蛋白质中，或者它们通常可以存在于同一蛋白质中但以新的排列方式置于融合蛋白质中。嵌合蛋白质可以例如通过化学合成或通过产生并翻译其中肽区以期望的关系编码的多核苷酸来产生。

“CDR”-如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内都发现的非连续抗原结合位点。根据由Kabat(Kabat et al.,1991..J..lmmunol.147(5):1709-19)和Chotia和Lesk(Chothia C.和A.M.Lesk,1987.J.Mol.BioI.196(4):901-17)推导的以下规则来鉴定CDR：

-CDR-L1：

开始-大约残基24；

之前的残基总是Cys；

之后的残基总是Trp。通常为TRP-TYR-GLN，但还可以是TRP-LEU-GLN，TRP-PHE-GLN，TRP-TYR-LEU；

长度为10至17个残基；

-CDR-L2：

开始-在L1结束之后总是16个残基；

之前的残基一般为ILE-TYR，还可以是VAL-TYR、ILE-LYS、ILEPHE长度总是为7个残基；

-CDR-L3：

开始-在L2结束之后总是33个残基；

之前的残基总是Cys；

之后的残基总是PHE-GLY-XXX-GLY(SEQ ID NO:21)；

长度为7至11个残基；

-CDR-H1：

开始-大约残基26(在CYS之后总是4个)[Chothia/AbM定义]

Kabat定义以更后面的5个残基开始；

之前的残基总是CYS-XXX-XXX-XXX(SEQ ID NO:22)；

之后的残基总是TRP。通常为TRP-VAL，还可以是TRP-ILE、TRP-ALA长度为10至12个残基(AbM定义)Chothia定义排除最后4个残基；

-CDR-H2：

开始-在CDR-H1结束(Kabat/AbM定义)之后总是15个残基之前的残基通常为LEU-GLU-TRP-ILE-GLY(SEQ ID NO:23)，但有一些变化；

之后的残基为LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA长度Kabat定义为16至19个氨基酸(AbM定义以更早的7个残基结束)；

-CDR-H3：

开始-在CDR-H2结束后总是33个残基(在CYS之后总是2个)；

之前的残基总是CYS-XXX-XXX(通常为CYS-ALA-ARG)；

之后的残基总是TRP-GLY-XXX-GLY(SEQ ID NO:24)；

长度为3至25个残基。

“CH2结构域”-本文所用，术语“CH2结构域”包括通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340的重链分子的区域。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N-连接的支链碳水化合物链插入在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物，并帮助稳定CH2结构域(Burton,Molec.Immunol.22(1985)161-206)。

“来源于”-如本文所用，术语“来源于”指定的蛋白质(例如抗GPVI抗体或其抗原结合片段)是指蛋白质的来源。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质的蛋白质或氨基酸序列是CDR序列或与其相关的序列。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质的氨基酸序列是不连续的。例如，在一个实施方案中，一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR来源于起始抗体。在一个实施方案中，来源于特定起始蛋白质或氨基酸序列的蛋白质或氨基酸序列具有与起始序列或其区域基本上相同的氨基酸序列，其中该区域由至少3-5个氨基酸、至少5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸或至少30-50个氨基酸组成，或者在起始序列中具有其起始点(origin)而使本领域普通技术人员可以其他方式识别的氨基酸序列。在一个实施方案中，改变来源于起始抗体的一个或多个CDR序列以产生变体CDR序列，例如亲和力变体，其中变体CDR序列保持GPVI结合活性。

“双抗体”-如本文所用，术语“双抗体”是指通过在VH和VL结构域之间用短连接体(约5-10个残基)构建sFv片段(参见sFv段落)制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中这两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述在例如以下文献中：EP 0404097；WO 1993/011161；和Holliger(Holligeret al.,1993.Proc.Natl.Acad.Sci.90(14):6444-6448)。

“工程化”-如本文所用，术语“工程化”包括通过合成手段(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的某些组合)处理核酸或多肽分子。优选地，本发明的抗体被工程化，包括例如人源化抗体和/或嵌合抗体以及已被工程化以改善一种或多种性质(如抗原结合、稳定性/半衰期或效应子功能)的抗体。

“表位”-如本文所用，术语“表位”是指位于抗体结合的一种或多种蛋白质上的氨基酸的特定排列。表位通常由分子(如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面分组组成，并且具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。表位可以是线性的或构象的，即涉及抗原不同区域中的可能不一定是连续的两个或更多个氨基酸序列。

“框架区”-如本文所用，术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不是CDR的一部分(例如使用CDR的Kabat/Chothia定义)的氨基酸残基。因此，可变区框架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅包括CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变区的特定实例以及对于Kabat/Chothia定义的CDR，构架区1可以对应于包含氨基酸1-25的可变区的结构域；框架区2可以对应于包含氨基酸36-49的可变区的结构域；框架区3可以对应于包含氨基酸67-98的可变区的结构域；框架区4可以对应于可变区的从氨基酸110到可变区末端的结构域。轻链的构架区类似地被每个轻链可变区CDR分隔开。在天然存在的抗体中，每个单体抗体上存在的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，当抗体在含水环境中呈现其三维构型时，这些序列特异定位以形成抗原结合位点。重可变结构域和轻可变结构域的剩余部分的氨基酸序列显示较少的分子间变异性并且被称为框架区。框架区域主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，这些框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用将六个CDR定位在正确方向上。由定位的CDR形成的抗原结合位点界定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这一互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域的普通技术人员可以容易地确定CDR的位置。

“片段”-如本文所用，术语“片段”是指包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基的抗体或抗体链的部分或区域。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的蛋白质片段，其结合抗原或与完整抗体(即其由之衍生的完整抗体)竞争抗原结合(即与人GPVI的特异性结合)。如本文所用，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如抗体轻链可变结构域(VL)、抗体重链可变结构域(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab')₂片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段(DAb)、单臂(单价)抗体、双抗体或由此类抗原结合片段的结合、组装或缀合形成的任何抗原结合分子。片段可以例如经由化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链或通过重组手段来获得。

抗体的“Fc”片段包含通过二硫键结合在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定，该区域也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。

“Fv”-如本文所用，术语“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这种片段由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链各自三个环)，其有助于抗原结合并赋予抗体结合抗原的特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

“重链区”-如本文所用，术语“重链区”包括来源于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列。包含重链区的蛋白质包含以下结构域的至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或其变体或片段。在一个实施方案中，本发明的结合分子可以包含免疫球蛋白重链的Fc区(例如铰链部分、CH2结构域和CH3结构域)。在另一个实施方案中，本发明的结合分子缺少恒定结构域的至少一个区域(例如，CH2结构域的全部或部分)。在某些实施方案中，至少一个并优选全部的恒定结构域来源于人免疫球蛋白重链。例如，在一个优选实施方案中，重链区包含完全人铰链结构域。在其他优选实施方案中，重链区包含完全人Fc区(例如来自人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域序列)。在某些实施方案中，重链区的组成性恒定结构域来自不同的免疫球蛋白分子。例如，蛋白质的重链区可以包含来源于IgG1分子的CH2结构域和来源于IgG3或IgG4分子的铰链区。在其他实施方案中，恒定结构域是包含不同免疫球蛋白分子的区域的嵌合结构域。例如，铰链可以包含来自IgG1分子的第一区域和来自IgG3或IgG4分子的第二区域。如上文所述，本领域普通技术人员理解，重链区的恒定结构域可被修饰，使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的(野生型)免疫球蛋白分子。也就是说，本文公开的本发明的蛋白质可以包含对一个或多个重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2或CH3)和/或轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。

“铰链区”-如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的区域。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立移动。铰链区可以再分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux et al.,1998.J.Immunol.161(8):4083-90)。

术语“高变环”和“互补决定区”严格地说并不是同义词，因为高变环(HV)是基于结构来定义的，而互补决定区(CDR)是基于序列变异性来定义的(Kabat,Elvin A.(1983).Sequences of proteins of immunological interest(5th edition).Besthesda,MD:Public Health Service,National Institutes of Health)，并且HV和CDR的限定在一些VH和VL结构域中可能不同。VL和VH结构域的CDR通常可以根据Kabat/Chothia定义(参见上文)来定义。在一个实施方案中，VL和VH结构域的CDR可以包含以下氨基酸：轻链可变结构域中的残基24-39(CDRL1)、55-61(CDRL2)和94-102(CDRL3)，以及重链可变结构域中的残基26-35(CDRH1)、50-66(CDRH2)和99-109(CDRH3)。因此，除非另有说明，HV可以包含在相应的CDR内，并且本文提到VH和VL结构域的“高变环”时应当解释为也涵盖相应的CDR，反之亦然。如下文所定义的，可变结构域的较高度保守的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变环连接的四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，大部分采用β-折叠构型。每条链中的高变环通过FR紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变环一起促成抗体的抗原结合位点的形成。抗体的结构分析揭示了序列与由互补决定区形成的结合位点的形状之间的关系(Chothia et al.,1992.J.Mol.Biol.227(3):799-817；Tramontanoet al.,1990.J.Mol.Biol.215(1):175-182)。尽管它们具有高度的序列变异性，但六个环中的五个仅采用一小部分主链构象，称为“规范结构”。这些构象首先由环的长度决定，其次由环中和框架区中某些位置上存在的关键残基决定，这些关键残基通过它们的堆积、氢键或呈现不寻常的主链构象来决定构象。

“人源化”-如本文所用，术语“人源化”是指嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来源于鼠免疫球蛋白的最小序列。例如，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自初始抗体(供体抗体)的CDR的残基置换，同时保持期望的原始抗体特异性、亲和力和能力。

“人源化取代”-如本文所用，术语“人源化取代”是指氨基酸取代，其中在非人抗GPVI抗体(例如鼠抗GPVI抗体)的VH或VL结构域中的特定位置存在的氨基酸残基被在参考人VH或VL结构域的等同位置出现的氨基酸残基置换。参考人VH或VL结构域可以是由人种系编码的VH或VL结构域，在这种情况下，取代的残基可以被称为“种系取代”。人源化取代/种系取代可以在本文定义的抗GPVI抗体的构架区和/或CDR中进行。

“高度人同源性”-如果VH结构域和VL结构域合起来表现出与最接近匹配的人种系VH和VL序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的氨基酸序列同一性，则包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体将被认为具有高度人同源性。具有高度人同源性的抗体可以包括包含天然非人抗体的VH和VL结构域的抗体，所述天然非人抗体表现出足够高的百分比序列同一性人种系序列，以及此类抗体的工程化(特别是人源化)变体以及“完全人”抗体。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域可以跨框架区FR1、FR2、FR3和FR4显示出与一个或多个人VH结构域75％、80％或更高的氨基酸序列同一性或序列同源性。在其他实施方案中，本发明蛋白质的VH结构域与最接近匹配的人种系VH结构域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以是85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％或甚至100％。在一个实施方案中，与最接近的匹配人VH序列相比，具有高度人同源性的抗体的VH结构域可以跨框架区FR1、FR2、FR3和FR4含有一个或多个(例如1至20个)氨基酸序列错配。在另一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VL结构域可以跨框架区FRl、FR2、FR3和FR4显示出与一个或多个人VL结构域80％或更高的序列同一性或序列同源性。在其他实施方案中，本发明蛋白质的VL结构域与最接近的匹配人种系VL结构域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以是85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％或甚至100％。

在一个实施方案中，与最接近的匹配人VL序列相比，具有高度人同源性的抗体的VL结构域可以跨框架区FRl、FR2、FR3和FR4含有一个或多个(例如1至20个，优选1至10个，更优选1至5个)氨基酸序列错配。在分析具有高度人同源性的抗体与人种系VH和VL之间的百分比序列同一性之前，可以确定规范折叠，这允许鉴定对H1和H2或L1和L2(和L3)具有相同的规范折叠组合的人种系片段的家族。随后选择与感兴趣的抗体的可变区具有最高程度序列同源性的人种系家族成员来对序列同源性进行评分。可使用可在网页www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page上公开获得的生物信息学工具确定高变环L1、L2、L3、H1和H2的Chothia规范类型。程序的输出显示数据文件中的关键残基要求。在这些数据文件中，在每个位置处用允许的氨基酸来显示关键残基位置。感兴趣的抗体的可变区的序列作为输入给出，并首先与共有抗体序列比对以分配Kabat/Chothia编号方案。对规范折叠的分析使用由Martin和Thornton开发的一套自动化方法得到的一组关键残基模板(Martin et al.,1996.J.Mol.Biol.263(5):800-815)。采用已知的特定人种系V区段(其使用对H1和H2或L1和L2(和L3)相同的规范折叠组合)，就序列同源性而言可以确定最佳匹配家族成员。采用生物信息学工具，可确定感兴趣的抗体的VH和VL结构域框架氨基酸序列与人种系编码的相应序列之间的百分比序列同一性，但实际上也可应用手动比对序列。可以从若干蛋白质数据库鉴定人免疫球蛋白序列，如VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或Pluckthun/Honegger数据库(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines)。为了比较人序列与感兴趣的抗体中的VH或VL结构域的V区，可使用序列比对算法，如可经由诸如www.expasy.ch/tools/#align的网站获得的算法，但也可对有限的序列组进行手动比对。选择具有相同的规范折叠组合并与每条链的构架区1、2和3具有最高同源性程度的家族的人种系轻链和重链序列，并将其与感兴趣的可变区进行比较；还针对人种系JH和JK或JL区检查FR4。注意，在总百分比序列同源性的计算中，使用来自具有相同的规范折叠组合的人种系家族的最接近的匹配序列来评价FR1、FR2和FR3的残基。只有不同于具有相同规范折叠组合的相同家族的最接近的匹配或其他成员的残基才被评分(NB-不包括任何引物编码的差异)。然而，出于人源化的目的，与不具有相同的规范折叠组合的其他人种系家族的成员相同的框架区中的残基可以被认为是“人”，尽管事实上根据上述严谨条件这些残基的评分为“负”。这一假设是基于人源化的“混合和匹配”方法，其中FR1、FR2、FR3和FR4中的每一个分别与其最接近的匹配人种系序列进行比较，因此人源化分子含有不同的FR组合，如Qu和同事们(Quet al.,Clin.Cancer Res.5:3095-3100(1999))和Ono和同事们(Ono et al.,Mol.Immunol.36:387-395(1999))所做的那样。可以使用IMGT编号方案来分配各个框架区域的边界，所述IMGT编号方案是Chothia编号方案的改编(Lefranc et al.,Nucleic acid res 27:209-212(1999)；http://im.gt.cines.fr)。具有高度人同源性的抗体可以包含具有人的或类似于人的规范折叠的高变环或CDR，如下文详细讨论的。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或CDR可以从非人抗体的VH或VL结构域获得或衍生，但仍表现出预测的或实际的与人抗体中存在的规范折叠结构基本上相同的规范折叠结构。本领域公认，尽管在由人种系编码的VH结构域和VL结构域中都存在的高变环的一级氨基酸序列根据定义是高度可变的，但除VH结构域的CDRH3之外的所有高变环仅采用几种不同的结构构象，称为规范折叠(Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Tramontano et al.,Proteins 6:382-94(1989))，其既取决于高变环的长度也取决于所谓的规范氨基酸残基的存在(Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。可通过结构分析(例如X射线晶体学)来确定完整VH或VL结构域中高变环的实际规范结构，但是也可以基于特定结构特征性的关键氨基酸残基来预测规范结构(在下文进一步讨论)。实质上，决定每个规范结构的残基的特定模式形成“标记(signature)”，其使得规范结构在未知结构的VH或VL结构域的高变环中也能够被识别；因此可单独基于一级氨基酸序列来预测规范结构。可使用可从www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html、www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/antibodies.html和www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html公开获得的算法来分析对具有高度人同源性的抗体中任何给定的VH或VL序列的高变环预测的规范折叠结构。这些工具允许比对查询VH或VL序列与已知规范结构的人VH或VL结构域序列比对，并允许预测查询序列的高变环的规范结构。在VH结构域的情况下，如果满足以下标准中的至少第一个、并且优选两个，则H1和H2环可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构：

1.与最接近的匹配人规范结构类型相同的长度，由残基的数量决定。

2.与对相应的人H1和H2规范结构类型所描述的关键氨基酸残基具有至少33％的同一性，优选至少50％的同一性(注意：为了前述分析的目的，分别对H1和H2环进行处理并将每个与其最接近的匹配人规范结构类型进行比较)。前述分析依赖于对感兴趣的抗体的H1和H2环的规范结构的预测。如果感兴趣的抗体中的H1和H2环的实际结构是已知的，例如基于X射线晶体学，则如果环的长度不同于最接近的匹配人规范结构类型的环的长度(通常为+1个或+2个氨基酸)，但是感兴趣的抗体中的H1和H2环的实际结构与人规范折叠的结构相匹配，那么感兴趣的抗体中的H1和H2环也可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构。Chothia et al.,J.Mol.Biol.227:799-817(1992)描述了在人VH结构域(H1和H2)的第一和第二高变环的人规范结构类型中发现的关键氨基酸残基，该内容以其整体通过引用的方式并入本文。具体而言，Chothia等人的第802页的表3(其通过引用的方式明确并入本文)列出了在人种系中发现的H1规范结构的关键位点处的优选氨基酸残基，而第803页的表4(也通过引用的方式明确并入本文)列出了在人类种系中发现的CDR H2规范结构的关键位点处的优选氨基酸残基。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2均表现出与在人抗体中出现的规范折叠结构基本上相同的预测的或实际的规范折叠结构。具有高度人同源性的抗体可以包含VH结构域，其中高变环H1和H2形成规范折叠结构的组合，该组合与已知在至少一个人种系VH结构域中出现的规范结构的组合相同。已经观察到，仅H1和H2处的规范折叠结构的某些组合实际上出现在由人种系编码的VH结构域中。在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2可以从非人物种的VH结构域获得，但形成预测的或实际的规范折叠结构的组合，该组合与已知在人种系或体细胞突变的VH结构域中存在的规范折叠结构相同。在非限制性实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2可以从非人物种的VH结构域获得，并且形成下列规范折叠组合之一：1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1和3-5。具有高度人同源性的抗体可以含有VH结构域，其显示出与人VH的高度序列同一性/序列同源性，并且其含有与人VH显示出结构同源性的高变环。在具有高度人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2存在的规范折叠及其组合，在总体一级氨基酸序列同一性方面对于代表与具有高度人同源性的抗体的VH结构域最接近的匹配的人VH种系序列是“正确”的，这可能是有利的。举例来说，如果与人种系VH3结构域是最接近的序列匹配，则有利于H1和H2形成在人VH3结构域中也是天然存在的规范折叠的组合。这对于来源于非人物种的具有高度人同源性的抗体而言可能尤其重要，例如含有来源于骆驼科动物常规抗体的VH和VL结构域的抗体，特别是含有人源化骆驼科动物VH和VL结构域的抗体。因此，在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗GPVI抗体的VH结构域与人VH结构域跨框架区FR1、FR2、FR3和FR4可以显示出70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高或高至99％或甚至100％的序列同一性或序列同源性，并且另外，同一抗体中的H1和H2从非人VH结构域获得，但形成与已知在同一人VH结构域中天然存在的规范折叠组合相同的预测的或实际的规范折叠结构的组合。在其他实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VL结构域中的L1和L2各自从非人物种的VL结构域获得，并且各自显示出与人抗体中存在的规范折叠结构基本上相同的预测或实际的规范折叠结构。如同VH结构域一样，Vλ和Vκ型的VL结构域的高变环可采用有限数量的构象或规范结构，其部分由长度确定，并且还由某些规范位置处关键氨基酸残基的存在决定。在具有高度人同源性的感兴趣的抗体内，从非人物种(例如骆驼科物种)的VL结构域获得的L1、L2和L3环如果满足以下标准的至少第一个、并且优选两个，则可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构：

1.与最接近的匹配人结构类型相同的长度，由残基的数量决定。

2.与对来自Vλ或Vκ库的相应人L1或L2规范结构类型所描述的关键氨基酸残基具有至少33％的同一性、优选至少50％同一性(注意：为了前述分析的目的，分别对H1和H2环进行处理并将每个与其最接近的匹配人规范结构类型进行比较)。前述分析依赖于对感兴趣的抗体的VL结构域中的L1、L2和L3环的规范结构的预测。如果L1、L2和L3环的实际结构是已知的，例如基于X射线晶体学，则如果环的长度不同于最接近的匹配人规范结构类型的环的长度(通常为+1个或+2个氨基酸)，但是感兴趣的抗体中的环的实际结构与人规范折叠的结构相匹配，那么来源于感兴趣的抗体的L1、L2或L3环也可以被评分为具有与已知在人抗体中存在的规范折叠结构“基本上相同”的规范折叠结构。Morea et al.,Methods,20:267-279(2000)和Martin et al.,J.Mol.Biol.,263:800-815(1996)描述了在人规范结构类型中发现的对人的Vλ和Vκ结构域的CDR的关键氨基酸残基。而且Tomlinson et al.,EMBOJ.14:4628-4638(1995)描述了人Vκ结构域的结构库，Williams et al.,J.Mol.Biol.,264:220-232(1996)描述了Vλ结构域的结构库。所有这些文献的内容都通过引用的方式并入本文。具有高度人同源性的抗体的VL结构域中的L1和L2可以形成与已知在人种系VL结构域中存在的规范折叠结构的组合相同的预测的或实际的规范折叠结构的组合。在非限制性实施方案中，具有高度人同源性的抗体的Vλ结构域中的L1和L2可以形成下列规范折叠组合中的一种：11-7、13-7(A、B、C)、14-7(A、B)、12-11、14-11和12-12(如Williams et al.,J.Mol.Biol.264:220-32(1996)中所定义的，以及如http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html上所示的)。在非限制性实施方案中，Vκ结构域中的L1和L2可以形成下列规范折叠组合中的一种：2-1、3-1、4-1和6-1(如在Tomlinson et al.,EMBO J.14:4628-38(1995)中所定义的，以及如在http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html上所示的)。

在一个进一步的实施方案中，具有高度人同源性的抗体的VL结构域中的L1、L2和L3中的全部三个都可以显示出基本上为人的结构。优选的是，具有高度人同源性的抗体的VL结构域显示出与人VL的高度序列同一性/序列同源性，而且VL结构域中的高变环显示出与人VL的结构同源性。

在一个实施方案中，具有高度人同源性的抗GPVI抗体的VL结构域可以显示出与人VL结构域在跨框架区FR1、FR2、FR3和FR4的70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或高达99％或甚至100％的序列同一性，此外高变环L1和高变环L2可以形成与已知在相同人VL结构域中天然存在的规范折叠组合相同的预测的或实际的规范折叠结构的组合。当然，设想与人VH显示出高度序列同一性/序列同源性并且与人VH的高变环显示出结构同源性的VH结构域将与显示出与人VL具有高度序列同一性/序列同源性并且还与人VL的高变环显示出结构同源性的VL结合域组合，以提供含有具有最大序列的VH/VL配对的具有高度人同源性的且与人编码的VH/VL配对具有结构同源性的抗体。

“免疫特异性的”、“对……具有特异性的”或以“特异性结合”-如本文所用，如果抗体以可检测的水平与抗原反应，优选地，亲和常数K_A为大于或等于约10⁶M^-1、大于或等于约10⁷M^-1、或大于或等于10⁸M^-1、或大于或等于1.5 10⁸M^-1、或大于或等于10⁹M^-1、或大于或等于510⁹M^-1，则抗体被说成是“免疫特异性的”、“对抗原具有特异性的”或“特异性结合”抗原。抗体对其同源抗原的亲和力通常也用解离常数K_D表示，并且在某些实施方案中，如果抗体以小于或等于10^-6M、小于或等于10^-7M、小于或者等于1.5 10^-8M、或小于或等于10^-8M、或小于或者等于5 10^-9M或小于或等于10^-9M的K_D结合抗原，则抗体与抗原特异性结合。抗体的亲和力可使用常规技术容易地确定，例如，Scatchard G et al.(The attractions of proteinsfor small molecules and ions.Ann NY Acad Sci 1949；51:660-672)描述的那些技术。通常可以使用免疫检测方法(包括例如ELISA、基于免疫荧光的分析如免疫组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS))或者通过表面等离子体共振(SPR，BIAcore)来确定和评估抗体与抗原、细胞或其组织的结合特性。

“分离的核酸”-如本文所用，“分离的核酸”是与其他基因组DNA序列以及天然伴随天然序列的蛋白质或复合物(如核糖体和聚合酶)基本上分离的核酸。该术语包括已从其天然存在的环境取出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括分离形式的核酸。当然，这是指最初分离的核酸并且不排除后来通过人工添加到分离的核酸中的基因或序列。

术语“多肽”以其常规含义使用，即为少于100个氨基酸的序列。多肽通常是指单体实体。术语“蛋白质”是指超过100个氨基酸的序列和/或多聚体实体。本发明的蛋白质不受限于产品的具体长度。该术语不是指或排除蛋白质的表达后修饰(例如糖基化、乙酰化、磷酸化等)以及本领域已知的其他修饰(包括天然存在的和非天然存在的)。蛋白质可以是整个蛋白质或其子序列。本发明上下文中的感兴趣的特定蛋白质是包含CDR并能够结合抗原的氨基酸子序列。“分离的蛋白质”是从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的蛋白质。在优选的实施方案中，分离的蛋白质将被纯化至：(1)如通过Lowry法测定的，大于蛋白质的80、85、90、95重量％，并且最优选大于96、97、98或99重量％，(2)通过使用旋杯式序列分析仪足以获得至少N-末端或内部氨基酸序列的15个残基的程度，或(3)通过SDS-PAGE在还原性或非还原性条件下使用考马斯蓝或优选银染色显示均质。因为蛋白质天然环境的至少一种组分将不存在，分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的蛋白质。

“同一性”或“相同的”-如本文所用，术语“同一性”或“相同的”当用于表示两个或更多个氨基酸序列的序列之间的关系时，是指氨基酸序列之间的序列关联性程度，通过具有两个或更多个氨基酸残基的段之间的匹配数量来确定。“同一性”利用通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)解决的间隙比对(如果有的话)计算两个或更多个序列中的较小者之间的相同匹配的百分比。相关氨基酸序列的同一性可通过已知方法容易地计算出。这些方法包括但不限于在以下文献中描述的那些方法：Arthur M.Lesk,ComputationalMolecular Biology:Sources and Methods for Sequence Analysis(New-York:OxfordUniversity Press,1988)；Douglas W.Smith,Biocomputing:Informatics and GenomeProjects(New-York:Academic Press,1993)；Hugh G.Griffin和Annette M.Griffin,Computer Analysis of Sequence 15Data,Part 1(New Jersey:Humana Press,1994)；Gunnar von Heinje,Sequence Analysis in Molecular Biology:Treasure Trove orTrivial Pursuit(Academic Press,1987)；Michael Gribskov和John Devereux,SequenceAnalysis Primer(New York:M.Stockton Press,1991)和Carillo et al.,1988.SIAM1.Appl.Math.48(5):1073-1082。用于测定同一性的优选方法被设计成给出测试序列之间的最大匹配。在公众可用的计算机程序中描述了测定同一性的方法。用于测定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux et al.,1984.Nucl.Acid.Res.12(1Pt 1):387-395；Genetics Computer Group,University ofWisconsin Biotechnology Center,Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、TBLASTN和FASTA(Altschul et al.,1990.J.Mol.Biol.215(3):403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual,Altschul et al.,NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul et al.,1990.J.Mol.Biol.215(3):403-410)公开获得。众所周知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。

“修饰的抗体”-如本文所用，术语“修饰的抗体”包括被改变使得它们不是天然存在的合成形式的抗体，例如包含至少两个重链区但不是两个完整重链的抗体(例如结构域缺失的抗体或微型抗体)；被改变以与两个或更多个不同的抗原或单个抗原上的不同表位结合的多特异性形式的抗体(例如双特异性、三特异性等)；与scFv分子连接的重链分子等。ScFv分子是本领域中已知的并且描述于例如美国专利5,892,019中。另外，术语“修饰的抗体”包括多价形式的抗体(例如与三个或更多个拷贝的相同抗原结合的三价、四价等抗体)。在另一个实施方案中，本发明的修饰的抗体是融合蛋白，其包含至少一个缺少CH2结构域的重链区并包含蛋白质的结合结构域，所述蛋白质包含受体配体对的一个成员的结合区。

“哺乳动物”-如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人、家养动物和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。优选地，哺乳动物是灵长类动物，更优选是人。

“单克隆抗体”-如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即群体中包含的个体抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以被合成而不被其他抗体污染。修饰词“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，本发明的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利号4,816,567)。还可以使用例如在Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库分离“单克隆抗体”。

“天然序列”-如本文所用，术语“天然序列”核苷酸是指与来源于自然界的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸。因此，“天然序列”蛋白质是与来源于自然界(例如来源于任何物种)的蛋白质(例如抗体)具有相同的氨基酸序列的蛋白质。这样的天然序列多核苷酸和蛋白质可以从自然界分离或可以通过重组或合成手段产生。如本文使用的术语多核苷酸“变体”是通常与本文具体公开的多核苷酸有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的不同的多核苷酸。这样的变体可以是天然存在的或者可以是合成生成的，例如通过修饰本发明的一个或多个多核苷酸序列并如本文所述和/或使用本领域中众所周知的一些技术中的任何技术评价编码蛋白质的一种或多种生物活性。如本文使用的术语蛋白质“变体”是与通常本文具体公开的蛋白质有一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的不同的蛋白质。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成生成的，例如通过修饰本发明的一个或多个上述蛋白质序列并如本文所述和/或使用本领域众所周知的一些技术中的任何技术评价蛋白质的一种或多种生物学活性。可以在本发明的多核苷酸和蛋白质的结构中进行修饰，并且仍获得编码具有期望特征的变体或衍生蛋白质的功能性分子。当期望改变蛋白质的氨基酸序列以产生本发明蛋白质的等同的或甚至改进的变体或区域时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其他氨基酸，而不会明显丧失其结合其他蛋白质(例如抗原)或细胞的能力。因为是蛋白质的结合能力和性质定义该蛋白质的生物功能活性，可以在蛋白质序列(当然包括其下的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列取代，然而仍获得具有相似性质的蛋白质。因此包括可以在所公开的组合物的氨基酸序列或编码所述蛋白质的相应DNA序列中进行各种改变，而不会明显丧失其生物学效用或活性。在许多情况下，蛋白质变体含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中的氨基酸被具有相似性质的另一种氨基酸取代使得肽化学领域的技术人员将预期蛋白质的二级结构和亲水性基本上不变的取代。如上文所述，因此氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑几个前述特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。氨基酸取代可进一步基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其他氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体也可以或者可选地含有非保守变化。在一个优选的实施方案中，变体蛋白质通过取代、缺失或添加5个或更少的氨基酸而不同于天然序列。变体还可以(或者可选地)通过例如缺失或添加对蛋白质的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸来修饰。

“药学上可接受的赋形剂”-如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述赋形剂在施用于动物(优选人)时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。对于人体施用，制剂应符合监管部门(举例来说如FDA管理局或EMA)要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。

“特异性”-如本文所用，术语“特异性”是指与给定靶标(例如GPVI)特异性结合(例如发生免疫反应)的能力。蛋白质可以是单特异性的并且含有特异性结合靶标的一个或多个结合位点，或者蛋白质可以是多特异性的并且含有特异性结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在一个实施方案中，本文所述的抗体对多于一个靶标具有特异性。例如，在一个实施方案中，多特异性结合分子与GPVI和第二分子结合。

“单链Fv”又缩写为“sFv”或“scFv”-如本文所用，术语“单链Fv”、“sFv”或“scFv”是包含连接成单个氨基酸链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv氨基酸序列还包含VH和VL结构域之间的肽连接体，其使得sFv能够形成期望的用于抗原结合的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Borrebaeck1995，同下。

“受试者”-如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，受试者可以是等待接收或正在接受医疗护理或者曾经是/现在是/将是医疗程序的对象，或被监测病症发展的“患者”，即温血动物，更优选人。

“合成的”-如本文所用，关于蛋白质的术语“合成的”包括包含不是天然存在的氨基酸序列的蛋白质。例如，非天然存在的蛋白质是天然存在的蛋白质的修饰形式(例如，包含诸如添加、取代或缺失的突变)或者是包含以线性氨基酸序列连接至第二氨基酸序列(其可能是或可能不是天然存在的)的第一氨基酸序列(其可能是或可能不是天然存在的)的蛋白质，所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列在自然界中不是天然连接的。

“治疗有效量”是指在对靶标不造成显著的负面或不利副作用的情况下旨在实现以下目标的药剂的水平或量：(1)延迟或预防GPVI相关疾病的发作；(2)减缓或停止GPVI相关疾病的一种或多种症状的进展、加剧或恶化；(3)使GPVI相关疾病的症状得到缓解；(4)降低GPVI相关疾病的严重程度或发生率；或(5)治愈GPVI相关疾病。治疗有效量可以在GPVI相关疾病发作之前施用，起预防或防止作用。可选地或另外地，治疗有效量可以在GPVI相关疾病开始后施用，起治疗作用。

“治疗”或“减轻”-如本文所用，术语“治疗”或“减轻”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施；其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理状况或病症。需要治疗的患者包括那些已经患有该病症的患者以及那些容易患有该病症的患者或者那些将要预防该病症的患者。如果在接受治疗量的本发明的蛋白质后，患者就以以下一项或多项显示可观察的和/或可测量的改善(improvement)，则对受试者或哺乳动物成功“治疗”了靶向的病理状况或病症：减少致病细胞的数量；减少总致病性细胞的百分比；和/或在一定程度上缓解与特定疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率，和/或以及改善生活质量问题。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可通过医生熟悉的常规程序容易地测量。

“可变区”或“可变结构域”-如本文所用，术语“可变”是指这样的事实，即可变结构域VH和VL的某些区域的序列在抗体之间广泛不同，并且用于每个特定抗体对其靶抗原的结合和特异性。然而，变异性不是均匀分布在整个抗体的可变结构域中。它集中在构成抗原结合位点的一部分的每个VL结构域和VH结构域中称为“高变环”的三段中。Vλ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并且可以被定义为包含VL结构域中的残基24-33(L1(λ)，由9、10或11个氨基酸残基组成)、49-53L2(λ)，由3个残基组成)和90-96(L3(λ)，由6个残基组成)(Morea et al.,Methods 20:267-279(2000))。Vκ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并且可以被定义为包含VL结构域中的残基25-33(L1(κ)，由6、7、8、11、12或13个残基组成)、49-53(L2(κ)，由3个残基组成)和90-97(L3(κ)，由6个残基组成)(Morea et al.,Methods 20:267-279(2000))。VH结构域的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3，并且可以被定义为包含VH结构域中的残基25-33(H1，由7、8或9个残基组成)、52-56(H2，由3或4个残基组成)和91-105(H3，长度是高度可变的)(Morea et al.,Methods 20:267-279(2000))。除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别是指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括从Vκ和Vλ同种型获得的高变环。术语H1、H2和H3分别是指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且包括从任何已知的重链同种型获得的高变环，包括γ、ε、δ、α或μ。如上文所定义，高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3各自可包含“互补决定区”或“CDR”的一部分。

“价态”–如本文所用，术语“价态”是指蛋白质中潜在的靶标结合位点的数量。每个靶标结合位点特异性结合一个靶标分子或靶标分子上的特定位点。当蛋白质包含多于一个靶标结合位点时，每个靶标结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如，可以与不同的配体或不同的抗原或同一抗原上的不同表位结合)。主题结合分子优选具有至少一个对人GPVI分子具有特异性的结合位点。优选地，本文提供的蛋白质是单价的。

本发明的目的是用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症或在治疗中使用的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述的分离的人源化蛋白质在至少2小时期间施用(或待施用)于受试者，优选至少4至6小时期间。

在一个实施方案中，与人GPVI结合的分离的人源化蛋白质是针对人GPVI的分离的人源化抗体。

在一个实施方案中，分离的蛋白质是纯化的。

在一个实施方案中，蛋白质与GPVI的胞外结构域结合。

在一个实施方案中，蛋白质与人GPVI的Ig样C2型结构域2(D2)结合。

因此，在一个实施方案中，所述蛋白质与包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至207的至少一个氨基酸残基的表位结合，或者与包含来自在人GPVI(SEQ IDNO:13)的氨基酸残基114至207上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基的表位结合。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8)下列残基：125S、126S、128G、133Q、136T、171T、172A和/或174H。在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4、5、6或7)下列残基：125S、126S、128G、133Q、171T、172A和/或174H。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4或5)以下残基：125S、126S、128G、133Q和/或136T。在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3或4)以下残基：125S、126S、128G和/或133Q。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列中的至少一个(例如1、2或3)下列残基：171T、172A和/或174H。

在一个实施方案中，所述分离的蛋白质与构象表位结合。

在一个实施方案中，所述构象表位包含人GPVI至少一个、优选至少2个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含人GPVI的Ig样C2型结构域2(D2)的至少一个、优选至少2个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的114至207的至少一个、优选至少2个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184、甚至更优选121至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184，甚至更优选121至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基，或者包含在人GPVI(SEQID NO:13)的氨基酸残基114至187、优选115至187、更优选116至187、更优选117至187、更优选118至186、更优选119至185、更优选120至184，甚至更优选121至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8)下列残基：125S、126S、128G、133Q、136T、171T、172A和/或174H。在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4、5、6或7)下列残基：125S、126S、128G、133Q、171T、172A和/或174H。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4或5)下列残基：125S、126S、128G、133Q和/或136T。在一个实施方案中，所述表位包含GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3或4)下列残基：125S、126S、128G和/或133Q。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含GPVI序列中的至少一个(例如1、2或3)下列残基：171T、172A和/或174H。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基，或者来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142、优选115至141、更优选116至140、更优选117至139、更优选118至138、更优选119至137、更优选120至136、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28个氨基酸残基；和

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基，或者来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183的至少一个氨基酸残基，或者来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187、优选166至186、更优选167至185、更优选168至184、甚至更优选169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基，或者来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至135、优选115至135、更优选116至135、更优选117至135、更优选118至135、更优选119至135、更优选120至135、甚至更优选121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个氨基酸残基；和

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

因此，在一个实施方案中，所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至180的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至180上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

因此，在一个实施方案中，所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和包含来自人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至180的至少一个氨基酸残基，或者包含来自在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至180上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3、4或5)下列残基：125S、126S、128G、133Q和/或136T；和

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2或3)下列残基：171T、172A和/或174H。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的至少一个(例如1、2、3或4)下列残基：125S、126S、128G和/或133Q；和

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的下列残基：125S、126S、128G、133Q和136T；和

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的下列残基：171T、172A和174H。

在一个实施方案中，所述构象表位包含：

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的下列残基：125S、126S、128G和133Q；和

-GPVI序列(SEQ ID NO:13)中的下列残基：171T、172A和174H。

在一个实施方案中，所述构象表位由以下组成：

-人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136，或者在人GPVI(SEQID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列；和

-人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183，或者在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。

因此，在一个实施方案中，所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位由以下组成：

在一个实施方案中，所述构象表位由以下组成：

-人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至180，或者在人GPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至180上具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明用途的与人GPVI结合的分离的蛋白质与人GPVI(优选可溶性人GPVI)结合的K_D小于或等于15nm，优选小于或等于10nm，更优选小于或等于5nm。

在一个实施方案中，所述分离的蛋白质与人GPVI结合的k_off为小于或等于约8.10^- ⁴sec^-1，优选小于或等于约6.10^-4sec^-1，并且更优选小于或等于约4.10^-4sec^-1。

在一个实施方案中，所述分离的蛋白质与人GPVI结合的k_on至少约5.10⁴M^-1sec^-1，优选至少约5.5.10⁴M^-1sec^-1，更优选至少约5.9.10⁴M^-1sec^-1，并且更优选至少约6.10^-4sec^-1。

在一个实施方案中，K_D可以通过表面等离子体共振(SPR，BIAcore)使用固定的可溶性GPVI以约700至约1600个共振单位(RU)(相当于约8.5至约11.3fmol/mm2)、优选约850至约1200RU、更优选约950至约1075RU的剂量和/或使用PBS pH 7.4作为运行缓冲液和/或使用BIAevaluation3.0版本软件分析数据来测定。在一个实施方案中，可溶性GPVI对应于其C-末端经由连接体(举例来说，如经由Gly-Gly-Arg连接体)融合至hFc序列的GPVI的胞外结构域。这种可溶性GPVI可以被称为可溶性GPVI-Fc。

测定蛋白质对配体的亲和力的方法是本领域熟知的。下面示出了测定蛋白质对可溶性GPVI的亲和力的方法：

使用BIAcore 2000系统(Uppsala，瑞典)用表面等离子体共振来分析所述蛋白质与可溶性人GPVI的结合。

使用胺偶联法(Wizard程序)将可溶性GPVI-Fc以约700至约1600RU(相当于约8.5至约11.3fmol/mm2)、优选约850至约1200RU、更优选约950至约1075RU、并且甚至更优选约960至约1071RU的剂量固定在羧基-甲基葡聚糖CM5传感器芯片上。然后使蛋白质在25℃下以20μL/min的流速在PBS pH 7.4(10mM磷酸盐、138mM NaCl、2.7mM KCl，pH 7.42，25.4℃)中的固定的GPVI-Fc上通过(pass over)。使用BIAevaluation 3.0版本软件通过将数据拟合至结合模型来确定动力学常数(k_on、k_off)和亲和力。PBS pH 7.4是运行缓冲液。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是选自由完整抗体、人源化抗体、单链抗体、二聚单链抗体、Fv、Fab、F(ab)’₂、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody组成的组的抗体分子及其片段。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是选自由亲和体(affibody)、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer、versabody和duocalin组成的组的抗体模拟物。

结构域抗体是本领域中众所周知的，并且是指抗体的最小功能结合单位，对应于抗体的重链或轻链的可变区。

纳米抗体是本领域中众所周知的，并且是指含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性的由抗体衍生的治疗性蛋白质。这些重链抗体可以含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。

unibody是本领域中众所周知的，并且是指缺乏IgG4抗体铰链区的抗体片段。铰链区的缺失导致得到大小基本上是传统IgG4抗体的一半并具有IgG4抗体的单价结合区而不是二价结合区的分子。

affibody是本领域中众所周知的，并且是指基于来源于葡萄球菌蛋白A的一个IgG结合结构域的一个58个氨基酸残基的蛋白质结构域的亲和蛋白质。

DARPins(设计的锚蛋白重复蛋白质)是本领域中众所周知的，并且是指开发用于利用非抗体蛋白质的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复蛋白质)技术。

Anticalins是本领域中众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术，其中结合特异性来源于lipocalins。Anticalins也可以被格式化为双重靶向蛋白质，称为Duocalins。

Avimers是本领域中众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术。

Versabodies是本领域中众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术。它们是3-5kDa的小蛋白质，具有>15％的半胱氨酸，其形成高二硫化物密度支架，替代一般蛋白质所具有的疏水核心。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是单价的，并且优选地选自完整的单价抗体、人源化单价抗体、单链抗体、Fv、Fab或者抗体片段，所述抗体片段选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组；或单体抗体模拟物，所述单体抗体模拟物选自由亲和体、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer和versabody组成的组。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是包含与治疗剂缀合的抗体或其片段的免疫缀合物。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是包含与成像剂缀合的蛋白质的缀合物。所述蛋白质可以用于例如成像应用。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是单克隆抗体或其片段。

在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是多克隆抗体或其片段。

因此，本发明的另一个目的是一种用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段(或在其中的用途)，其中所述抗hGPVI抗体或其抗原结合片段在至少2小时期间施用(或待施用)于受试者，优选至少4至6小时期间。

在一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含以下CDR中的至少一个：

VH-CDR1：GYTFTSYNMH(SEQ ID NO:1)；

VH-CDR2：GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQ ID NO:2)；和

VH-CDR3：GTVVGDWYFDV(SEQ ID NO:3)。

CDR编号和定义是根据Kabat/Chothia定义。

在一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含以下CDR中的至少一个：

VL-CDR1：RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:4)；

VL-CDR2：RVSNRFS(SEQ ID NO:5)；和

VL-CDR3：LQLTHVPWT(SEQ ID NO:6)。

CDR编号和定义是根据Kabat/Chothia定义。

在一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段包含：

-在重链中，以下CDR中的至少一个：GYTFTSYNMH(SEQ ID NO:1)、GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQ ID NO:2)和GTVVGDWYFDV(SEQ ID NO:3)；和/或

-在轻链中，以下CDR中的至少一个：RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:4)、RVSNRFS(SEQ ID NO:5)和LQLTHVPWT(SEQ ID NO:6)。

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段在其重链中包含3个CDR：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段在其轻链中包含3个CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段包含在其重链中的3个CDR：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，以及在其轻链中的3个CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段包含在其重链中的3个CDR：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3以及在其轻链中的3个CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，任选地，其中所述序列任一者中的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。

根据本发明，重链和轻链的CDR1、2和3中的任一者可以表征为具有与相应SEQ IDNO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段是具有以下氨基酸序列的抗体：

(i)分别如SEQ ID NO:1、2和3中所示的重链CDR 1、2和3(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3)氨基酸序列；和

(ii)分别如SEQ ID NO:4、5和6中所示的轻链CDR 1、2和3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列；

任选地，其中所述序列中任一者的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。

在一个实施方案中，本发明用途的抗GPVI抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区含有序列SEQ ID NO:7或由序列SEQ ID NO:7组成。

(SEQ ID NO:7)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPGNGDTSYNQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGTVVGDWYFDVWGQGTLVTVSS

在一个实施方案中，本发明用途的抗GPVI抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区含有序列SEQ ID NO:8或由序列SEQ ID NO:8组成。

(SEQ ID NO:8)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLENSNGNTYLNWYQQKPGKAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQLTHVPWTFGQGTKVEITR

在一个实施方案中，本发明用途的抗GPVI抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区含有序列SEQ ID NO:9或由序列SEQ ID NO:9组成。

(SEQ ID NO:9)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQSLENSNGNTYLNWYQQKPGKAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQLTHVPWTFGQGTKVEIKR

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗GPVI抗体(ACT017抗体)或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有序列SEQ ID NO:7或由序列SEQ ID NO:7组成，所述轻链可变区含有序列SEQ ID NO:8或由序列SEQ ID NO:8组成。

在本发明的另一个实施方案中，本发明用途的抗GPVI抗体(ACT006抗体)或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有序列SEQ ID NO:7或由序列SEQ ID NO:7组成，所述轻链可变区含有序列SEQ ID NO:9或由序列SEQ ID NO:9组成。

根据本发明，如上文所述的重链或轻链可变区的一个、两个、三个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代。

在另一个实施方案中，本发明用途的抗体(或其片段)包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与本文所述的ACT017抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留了本发明蛋白质的期望的功能特性。

在另一个实施方案中，本发明用途的抗体(或其片段)包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与本文所述的ACT006抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留了本发明蛋白质的期望的功能特性。

根据本发明，重链可变区包含与SEQ ID NO:7具有60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

根据本发明，轻链可变区包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的序列。

在本发明用途的任意抗体(例如ACT017或ACT006)中，特定的可变区和CDR序列可以包含保守序列修饰。保守序列修饰是指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入到本发明用途的抗体中。保守氨基酸取代通常是其中氨基酸残基被具有相似物理化学性质的侧链的氨基酸残基置换的那些取代。特定的可变区和CDR序列可以包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代时，优选的取代是保守修饰。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明用途的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的测定法对改变的抗体测试保留的功能(即，本文所述的性质)。

在一个实施方案中，本发明用途的抗体(或其片段)结合与ACT017或ACT006抗体结合的表位基本上相同的表位。在本发明中，结合与ACT017或ACT006抗体结合的表位基本上相同的表位的抗体将分别称为ACT017样抗体或ACT006样抗体。

在一个实施方案中，本发明用途的抗体(或其片段)与如上文所述的抗体竞争结合hGPVI，特别是与选自ACT017和ACT006的抗体。

在本发明的一些实施方案中，包含VH和VL结构域或其CDR的抗hGPVI抗体或其片段可以包含CH1结构域和/或CL结构域，其氨基酸序列是完全人的或基本上人的。当GPVI结合蛋白是旨在用于人类治疗用途的抗体时，通常抗体的整个恒定区或其至少一部分具有完全的或基本上的人氨基酸序列。因此，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(和CH4结构域，如果存在的话)的一个或多个或任何组合就其氨基酸序列而言可以是完全或基本上人的。有利地，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(和CH4结构域，如果存在的话)全都可以具有完全或基本上人的氨基酸序列。在人源化或嵌合抗体或抗体片段的恒定区的情况下，术语“基本上人的”是指与人的恒定区具有至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的氨基酸序列同一性。这种情况中的术语“人的氨基酸序列”是指由人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，所述基因包括种系、重排和体细胞突变的基因。本发明还涵盖包含“人”序列的恒定结构域的蛋白质的用途，所述“人”序列的恒定结构域已通过相对于人序列的一个或多个氨基酸添加、缺失或取代而被改变，除了明确要求存在“完全人”铰链区的那些实施方案。本发明用途的抗hGPVI抗体中“完全人”铰链区的存在对于最小化免疫原性和优化抗体的稳定性都可能是有益的。认为在重链和/或轻链的恒定区内、特别是在Fc区内可以进行一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸取代可以导致用不同的天然存在的氨基酸或用非天然或修饰的氨基酸置换取代的氨基酸。其他结构修饰也是允许的，举例来说，如糖基化模式的变化(例如通过添加或缺失N-或O-连接的糖基化位点)。根据抗体的预期用途，可能期望就抗体与Fc受体的结合特性来修饰抗体，例如用于调节效应子功能。例如半胱氨酸残基可以被引入Fc区中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。因此生成的同型二聚体抗体可以具有改善的效应子功能。参见Caron et al.,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。

在一个实施方案中，序列SEQ ID NO:7的重链可变区由SEQ ID NO:10编码：

(SEQ ID NO:10)

CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGGTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCCAGGGCCGAGTTACTATGACTCGGGACACTTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGCACCGTGGTCGGCGACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTGAGCAGT

在一个实施方案中，序列SEQ ID NO:8的轻链可变区由SEQ ID NO:11编码：

(SEQ ID NO:11)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAAGTAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCACCCGG

在一个实施方案中，序列SEQ ID NO:9的轻链可变区由SEQ ID NO:12编码：

(SEQ ID NO:12)

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGTGCCAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGC

在一个实施方案中，编码本发明用途的抗GPVI抗体或其片段的核酸序列包含在表达载体中。在一个实施方案中，表达载体包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一个或具有与所述SEQ ID NO:10-12具有至少60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的核苷酸序列的任何序列。

在一个实施方案中，载体包含序列SEQ ID NO:10和编码重链恒定区的序列。编码重链恒定区的序列的非限制性实例是SEQ ID NO:14。

(SEQ ID NO:14)

GCCTCCACCAAGGGTCCCTCAGTCTTCCCACTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGTGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTCTTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTCGAGCCTAAGTCATGCGACAAGACTCAC

在一个实施方案中，载体包含序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12和编码轻链恒定区的序列。编码轻链恒定区的序列的非限制性实例是SEQ ID NO:15。

(SEQ ID NO:15)

ACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACCGGGGAGAGTGT

在一个实施方案中，载体包含编码信号肽的序列。信号肽序列的非限制性实例包括但不限于SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。

(SEQ ID NO:16)

ATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGT

(SEQ ID NO:17)

ATGGACTGGACTTGGAGAATCCTATTCTTGGTTGCTGCAGCTACAGGTGCTCATTCA

在一个实施方案中，载体包含SEQ ID NO:10和编码重链恒定区的序列(举例来说，如SEQ ID NO:14)和信号肽序列。这样的载体的实例是包含SEQ ID NO:18的载体。SEQ IDNO:18还包含克隆位点。

(SEQ ID NO:18)

GCGGCCGCCACCATGGACTGGACTTGGAGAATCCTATTCTTGGTTGCTGCAGCTACAGGTGCTCATTCACAGGTTCAGCTGGTTCAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGGTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCCAGGGCCGAGTTACTATGACTCGGGACACTTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACCGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGCACCGTGGTCGGCGACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTGAGCAGTGCCTCCACCAAGGGTCCCTCAGTCTTCCCACTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGTGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCTGTCTTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTCGAGCCTAAGTCATGCGACAAGACTCACTGATGAGGATCC

在一个实施方案中，本发明的载体包含SEQ ID NO:8和编码轻链恒定区的序列(举例来说，如SEQ ID NO:15)和信号肽序列。这样的载体的实例是包含SEQ ID NO:19的载体。SEQ ID NO:19还包含克隆位点。

(SEQ ID NO:19)

GACGTCACCATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAAGTAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCACCCGGACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACCGGGGAGAGTGTTGATGATATC

在一个实施方案中，本发明的载体包含SEQ ID NO:9和编码轻链恒定区的序列(举例来说，如SEQ ID NO:15)和信号肽序列。这样的载体的实例是包含SEQ ID NO:20的载体。SEQ ID NO:20还包含克隆位点。

(SEQ ID NO:20)

GACGTCACCATGGATATGCGTGTACCAGCTCAACTACTTGGACTTCTATTGCTTTGGCTTCGTGGTGCTAGATGTGACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAGTGCCAGTCAGAGCCTTGAGAACAGCAACGGAAACACCTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTCTCTGGTGTGCCAAGCAGATTCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAGCTGACTCATGTCCCATGGACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCAAGTGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTCCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAGGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAAGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACTCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCCCCTGTCACAAAGAGCTTCAACCGGGGAGAGTGTTGATGATATC

在一个实施方案中，如上文所述的载体包含在分离的宿主细胞中。所述宿主细胞可以用于重组生产本发明用途的抗体。在一个实施方案中，宿主细胞可以是原核生物、酵母或真核生物细胞，优选哺乳动物细胞，举例来说，如：由SV40(COS-7、ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠赛尔托利细胞(mouse Sertoli cells)(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14(ATCC CRL 1581；ATCC CRL 8287)或NSO(HPA培养物收集编号：85110503)；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(buffalo ratliver cells)(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)以及DSM的PERC-6细胞系。适合用于这些宿主细胞中的每一种的表达载体也是本领域中众所周知的。应该指出，术语“宿主细胞”通常是指培养的细胞系。“宿主细胞”的定义明确排除了已引入了的编码本发明用途抗原结合蛋白质的表达载体的整个人类。

生产用于本发明用途的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段的方法是本领域熟知的。合适的方法的实例包括在适合于表达抗hGPVI抗体或其片段的条件下培养含有编码本发明用途的抗hGPVI抗体或其片段的分离的多核苷酸序列的宿主细胞，和回收表达的抗hGPVI抗体或其片段。这种重组方法可用于大规模生产用于本发明用途的抗hGPVI抗体或其片段，包括预期用于体内治疗用途的单克隆抗体。这些方法是本领域中可用的并且将被本领域技术人员知晓。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质可以通过色谱法纯化，优选通过亲和色谱法纯化，更优选通过在蛋白L琼脂糖上的亲和色谱法纯化。

因此，在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质包含结合蛋白L(PpL)的结构域。在Muzard et al.,Analytical Biochemistry 388,331-338,2009和Lakhrif et al.,MAbs.2016；8(2):379-88中描述了将PpL结合活性转移到本发明蛋白质上的方法，这两篇文献通过引用的方式并入本文。

本发明用途的抗体的片段和衍生物(除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则其被本申请中使用的术语“抗体”所涵盖)，优选ACT017样或ACT006样抗体，可以通过本领域已知的技术进行生产。“片段”包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂和Fv片段；双抗体；任何抗体片段，其是具有由连续氨基酸残基的一个不间断序列组成的一级结构的蛋白质(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链蛋白质”)，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链蛋白质，或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含相关的重链部分和(3)仅含有一个重链可变区的单链蛋白质或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而不含相关的轻链部分；和由抗体片段形成的多特异性抗体。可使用标准方法来获得本发明抗体的片段。例如，根据常规技术，Fab或F(ab')₂片段可以通过蛋白酶消化分离的抗体来生产。应该理解，可使用已知方法来修饰免疫反应性片段，例如为了减缓体内清除并获得更期望的药代动力学特性，所述片段可以用聚乙二醇(PEG)修饰。PEG偶联和位点特异性缀合至Fab'片段的方法在例如Leong et al.,Cytokines 16(3):106-119(2001)和Delgado et al.,Br.J.Cancer 73(2):175-182(1996)中予以描述，这两篇文献的公开内容通过引用的方式并入本文。

可选地，可以修饰编码本发明用途的抗体(优选ACT017样或ACT006样抗体)的DNA，以编码片段。然后将修饰的DNA插入到表达载体中并用于转化或转染合适的细胞，其然后表达期望的片段。

本发明的另一个目的是一种用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的组合物(或在其中的用途)，其中所述组合物包含至少一个如上文所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，并且其中所述组合物在至少2小时期间、优选至少4至6小时期间施用(或待施用)于受试者。

本发明的另一个目的是一种用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的药物组合物(或在其中的用途)，其中所述药物组合物包含至少一个如上文所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质和至少一个药学上可接受的赋形剂，并且其中所述药物组合物在至少2小时期间、优选至少4至6小时期间施用(或待施用)于受试者。

可以用在这些组合物中的药学上可接受的赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白质如人血清白蛋白、缓冲物质如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、糖类如葡萄糖、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的药物组合物(或在其中的用途)，其中药物组合物的pH在4至6之间，并且优选约5.0。

本发明的另一个目的是一种用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症的药物(或在其中的用途)，其中所述药物包含至少一个如上文所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，并且其中所述药物在至少2小时期间、优选至少4至6小时期间施用(或待施用)于受试者。

在一个实施方案中，本发明用途的组合物、药物组合物或药物还包含另一个可用于治疗GPVI相关病症的药剂，举例来说，如血栓溶解剂。血栓溶解剂的一个例子是t-PA，包括天然t-PA和重组t-PA，以及保留天然t-PA的酶活性和/或纤维蛋白溶解活性的t-PA的修饰形式。如本文所用，t-PA具有其在本领域中的一般含义，并且是指组织型纤溶酶原激活物。可以通过评估分子将纤溶酶原转化为纤溶酶的能力来测定修饰形式的t-PA的酶活性。可以通过本领域已知的任何体外凝块溶解测试来测定修饰形式的t-PA的纤维蛋白溶解活性。T-PA可作为阿替普酶(或)从市场上获得。本领域已经描述了重组t-PA，并且是本领域技术人员已知的。本领域已经描述了t-PA的修饰形式并且是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于具有缺失或取代的氨基酸或结构域的t-PA、修饰的糖基化状态以及与其他分子缀合或融合的变体。例如，在EP0352119、WO93/24635、EP0382174和WO2013/034710中描述了t-PA的修饰形式的实例，其通过引用并入本文。

在一个实施方案中，本发明用途的组合物、药物组合物或药物还包含在WO2013/034710中所述的突变的t-PA。

在一个实施方案中，所述突变的t-PA包含序列SEQ ID NO:25(对应于人wt t-PA成熟形式)或SEQ ID NO:26(对应于tc-t-PA的人wt t-PA第一链)，优选由SEQ ID NO:25组成或由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的组合组成(对应于tc-t-PA的人wt t-PA第二链)，或其具有至少80％同一性的变体，其中所述序列包含由以下组成的突变：选自精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸(优选精氨酸)的亲水性氨基酸对SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的赖氨酸结合位点的任意氨基酸取代，和/或由以下组成的突变：丝氨酸对SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的275位的精氨酸的取代。

在一个实施方案中，所述突变的t-PA包含序列SEQ ID NO:25(对应于人wt t-PA成熟形式)或SEQ ID NO:26(对应于双链t-PA的人wt t-PA第一链)，优选由SEQ ID NO:25组成或由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的组合组成(对应于双链t-PA的人wt t-PA第二链)，或其具有至少80％同一性的变体，其中所述序列包含由以下组成的突变：选自精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸(优选精氨酸)的亲水性氨基酸对SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的253位的色氨酸的取代，和/或由以下组成的突变：丝氨酸对SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的275位的精氨酸的取代。

在一个实施方案中，所述突变的t-PA还包含以下突变中的至少一种：

-精氨酸取代SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的125位的脯氨酸：

-SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26中，N末端的Finger结构域的缺失和/或EGF样结构域的缺失，和/或谷氨酰胺取代SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的117位的天冬酰胺；

-天冬酰胺取代SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的103位的苏氨酸，和/或谷氨酰胺取代SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的117位的天冬酰胺，和/或丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸(AAAA)取代SEQ ID NO：25的296至299位的赖氨酸-组氨酸-精氨酸-精氨酸(KHRR)；

-丝氨酸取代SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的84位的半胱氨酸；

-谷氨酸或甘氨酸取代SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的275位的精氨酸，和/或SEQID NO:25或SEQ ID NO:26中Kringle 1结构域的缺失。

因此，在一个实施方案中，本发明用途的组合物、药物组合物或药物包含至少一种如上文所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，优选至少一种如上文所述的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段，和t-PA(天然、重组或修饰形式)。

本发明的一个目的是试剂盒，其包含在第一部分中的至少一种如上文所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质(优选至少一种如上文所述的分离的抗hGPVI抗体或其抗原结合片段)和在第二部分中的至少一种t-PA(天然、重组或修饰形式)。

因此，另一个目的是如上文所述的试剂盒，用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是抗hGPVI抗体或其抗原结合片段，其抑制GPVI信号传导和/或GPVI的配体的信号传导。如本文所用，术语“抑制”是指本发明用途的蛋白质能够阻断、减少、预防和中和GPVI与其配体的相互作用、GPVI信号传导和/或来自GPVI信号传导途径的分子的活化。

GPVI的配体的实例包括但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质是中和性抗hGPVI抗体或其片段。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质抑制GPVI与其配体(举例来说，如胶原蛋白、纤维蛋白或任何其他能够诱导下游信号传导和血小板活化的GPVI配体)的结合。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质抑制和/或防止响应于GPVI的配体(举例来说，如胶原蛋白)的血小板活化、分泌和聚集。在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质抑制和/或防止血小板粘附至GPVI的配体，举例来说，如胶原蛋白。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质抑制和/或防止响应于GPVI的配体(举例来说，如纤维蛋白)的GPVI依赖性凝血酶产生。在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质抑制和/或防止响应于胶原蛋白和/或组织因子的血小板催化的凝血酶产生。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质抑制和/或防止GPVI的配体(举例来说，如纤维蛋白)经由GPVI引起的血小板募集。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质当以约1至约200μg/mL、优选约2至约100μg/mL、更优选约5至约50μg/mL的浓度存在时，诱导全血或富含血小板血浆中的血小板饱和。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质当以至少约15μg/mL、优选至少约10μg/mL的浓度使用时，抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。优选地，当以这样的浓度使用时，本发明用途的蛋白质完全抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质用于抑制胶原蛋白诱导的血小板聚集的IC50为约0.5至约10μg/mL，优选约1至约6μg/mL，更优选约2至约3.2μg/mL。

在一个实施方案中，将胶原蛋白诱导的血小板聚集速度降低50％的本发明用途的蛋白质的浓度为约0.5至约5μg/mL、优选约1至约3μg/mL、更优选约2μg/mL。

在一个实施方案中，降低胶原蛋白诱导的血小板聚集强度的本发明用途蛋白质的浓度为约0.5至约10μg/mL、优选约1至约6g/mL、更优选约3.2g/mL。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质当在体内施用时，举例来说，例如当以0.01至500mg的剂量施用时，不诱导GPVI的耗竭。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质当在体内施用时，举例来说，例如当以0.01至500mg的剂量施用时，不引起血小板计数的降低即血小板减少症。

GPVI相关病症的实例是本领域熟知的，包括但不限于炎症，血栓症，与异常或畸变巨核细胞和/或血小板增殖、分化、形态学、迁移、聚集、脱粒和/或功能相关的病症，血栓病症(举例来说，如冠状动脉的血栓性闭塞)，表现出定量或定性血小板功能障碍的疾病和显示内皮功能障碍的疾病，脑血管病症，冠状动脉疾病，由任何导致血小板聚集的血管损伤引起的病症，与响应于GPVI的配体的异常信号转导有关的病症，与GPVI在正常表达GPVI的细胞或不表达GPVI的细胞中的异常表达和/或活性水平相关的病症，骨髓和外周血或其中的血小板通过调节炎症反应而促成的病症。

在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是选自以下的心血管疾病：动脉和静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征、由动脉粥样硬化引起的脑血管事件、心肌梗塞、肺栓塞、严重肢体缺血和外周动脉病症。

在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是静脉血栓症。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是再狭窄。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是急性冠状动脉综合征。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是由于动脉粥样硬化引起的脑血管事件。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是心肌梗塞。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是肺栓塞。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是严重的肢体缺血。在一个实施方案中，所述GPVI相关病症是外周动脉疾病。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于调节炎症和/或血栓中的白细胞-血小板。因此，根据一个实施方案，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗炎症和/或血栓症。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于调节(优选防止)血小板粘附聚集和脱粒。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗血栓性病症(举例来说，如冠状动脉的血栓性闭塞)、表现出定量或定性血小板功能障碍的病症和显示内皮功能障碍的病症。这些病症包括但不限于冠状动脉和脑动脉病症。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗脑血管疾病，包括缺血性中风、静脉血栓栓塞性疾病(举例来说，如涉及腿部肿胀、疼痛和溃疡、肺栓塞、腹部静脉血栓形成的疾病)、血栓性微血管病、血管性紫癜。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗冠状动脉疾病(举例来说，如心血管疾病，包括不稳定型心绞痛、心肌梗塞、急性心肌梗塞、冠状动脉疾病、冠状动脉血管重建术、冠状动脉再狭窄、心室血栓栓塞、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病(例如动脉闭塞性病症)、斑块形成、心肌缺血，包括与冠状动脉手术(如经皮冠状动脉血管成形术(球囊血管成形术)手术)有关的并发症。关于冠状动脉手术，这种治疗可以经由在该手术之前、期间或之后施用上文所述的蛋白质来实现。在一个优选的实施方案中，这种施用可用于预防血管成形术后的急性心肌缺血。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗由任何可导致血小板聚集的血管损害引起的病症。这样的血管损害包括但不限于血管壁损伤，如导致在原本完整的血管内暴露的高度血栓形成表面的血管损伤，例如导致ADP、凝血酶和/或肾上腺素释放的血管壁损伤，在血管狭窄部位发生的流体剪切应力，在动脉粥样硬化斑块部位的破裂和/或撕裂，以及由气囊血管成形术或粥样硬化切除术引起的损伤。

此外，在某些实施方案中，优选所述蛋白质不影响其他血小板属性或功能，如激动剂诱导的血小板形状变化(例如，GPIb-vWF介导的血小板活化)、内部血小板颗粒组分的释放、信号转导通路的激活或由不与GPVI相互作用的激动剂引起的血小板活化后钙动员的诱导。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗与响应于GPVI的配体(包括但不限于胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白)或响应于其他胞外基质蛋白质的异常信号转导相关的病症。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗与GPVI在正常表达GPVI的细胞或不表达GPVI的细胞中的异常表达和/或活性水平相关的病症。例如，所述蛋白质可用于调节在通常不表达GPVI的癌(例如肿瘤)细胞中的GPVI异常表达相关的病症。这样的病症可包括例如与肿瘤细胞迁移和发展成转移相关的病症。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于调节血小板的免疫调节功能。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗骨髓和外周血的病症。

在一个实施方案中，如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物用于治疗其中血小板通过调节炎症反应而促成的病症，包括但不限于与感染相关的持续或延长的炎症、关节炎、纤维化，或用于治疗其中血小板调节细胞功能的病症，包括但不限于癌细胞增殖和/或传播。

与GPVI有关的疾病、病症或病况的其他实例包括但不限于心血管病症和/或心血管事件，举例来说，如动脉血栓症包括动脉粥样硬化血栓症、缺血事件、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞(心脏病发作)、急性脑血管缺血(中风)、经皮冠状动脉干预、支架血栓症、缺血性的(ischemic)、再狭窄、缺血(ischemia)(急性和慢性)、主动脉及其分支的病症(如主动脉动脉瘤、血栓症)、外周动脉疾病、静脉血栓症、急性静脉炎和肺栓塞、癌症相关血栓症(特鲁索综合征(Trousseau syndrome))、炎性血栓症和与感染相关的血栓症。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物或药物用于治疗动脉或静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征或由于动脉粥样硬化导致的脑血管事件，优选血栓症，或在其中的用途。

在一个实施方案中，受试者受到(优选诊断患有)与GPVI相关的疾病、病症或病况的影响，优选心血管疾病和/或事件。

在一个实施方案中，受试者在施用本发明用途的蛋白质之前经历了小于48小时(优选小于24小时、12小时或更短)的心血管事件(举例来说，例如血栓症、中风、心肌梗塞或脑血管事件)。

在一个实施方案中，受试者接受如上文所述的蛋白质、组合物、药物组合物或药物作为治疗方案的一部分。

在一个实施方案中，所述治疗方案还包括施用本发明蛋白质之前、同时或之后施用另一种可用于治疗GPVI相关病症的药剂，举例来说，例如溶栓剂，优选t-PA(包括天然t-PA和重组t-PA，以及保留天然t-PA的酶和/或纤维蛋白溶解活性的t-PA的修饰形式)。

在一个实施方案中，所述治疗方案还包括在施用本发明蛋白质之前、同时或之后，通过血管内治疗和/或通过血栓切除术(也称为栓子切除术)治疗受试者。

因此，在一个实施方案中，待治疗的受试者先前已经过或将要接受通过血管内治疗和/或通过血栓切除术的治疗。

在一个实施方案中，向患者施用(或待施用)剂量为约0.5mg/kg至约50mg/kg，优选约1mg/kg至约32mg/kg，更优选约8mg/kg的本发明用途的蛋白质。在另一个实施方案中，向患者施用剂量为约2.5mg/kg至约25mg/kg，优选约5mg/kg至约15mg/kg，更优选约8mg/kg的人源化蛋白质。在一个实施方案中，向受试者施用(或待施用)剂量为约0.5mg/kg、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50mg/kg的本发明用途的蛋白质。

在一个实施方案中，向患者施用(或待施用)剂量为约30mg至约3000mg，优选约60mg至约2000mg，更优选约100至约1000mg，甚至更优选约500mg的本发明用途的蛋白质。在一个实施方案中，向受试者施用(或待施用)剂量为约30、60、62.5、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500或约3000mg的本发明用途的蛋白质。在另一个实施方案中，本发明用途的蛋白质的剂量为约100mg至约2000mg，约125mg至约2000mg，优选约250mg至约1000mg或约500mg至约1000mg。

组合物将被配制成用于施用于受试者。本发明的组合物可以肠胃外、通过吸入喷雾、直肠、鼻部或经由植入的储库进行施用。本文使用的术语施用包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。

在一个实施方案中，本发明用途的蛋白质通过注射，优选通过静脉内输注。在另一个实施方案中，腹膜内注射本发明用途的蛋白质。在另一个实施方案中，皮内注射本发明用途的蛋白质。

适用于注射的形式的实例包括但不限于溶液，举例来说，例如无菌水溶液、凝胶剂、分散液、乳剂、悬浮液、适合用于在使用之前加入液体后制备溶液或悬浮液的固体形式，举例来说，例如粉末、脂质体形式等。

组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。在可接受的媒介物和溶剂中，可以使用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射剂，如天然药学上可接受的油如橄榄油或蓖麻油尤其是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬液)的类似分散剂。出于配制的目的，也可以使用通常用于生产药学上可接受的固体、液体或其他剂型的其他常用表面活性剂(如Tweens、Spans)和其他乳化剂或生物利用度增强剂。

在一个实施方案中，将本发明用途的蛋白质在约2小时、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5内或约12小时期间施用(或待施用)于受试者。

在一个实施方案中，将本发明用途的蛋白质在至少2小时期间，优选在至少4至6小时期间(例如在约2小时、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或约12小时期间)连续施用于受试者。如本文所用，术语“连续施用”是指以基本恒定的施用速度长时间施用化合物。

在另一个实施方案中，第一次大剂量的所述蛋白质通过注射，然后是连续施用剩余计量的所述蛋白质。

在一个实施方案中，所述第一次大剂量施用包含待施用的分离的人源化蛋白质的总剂量的约10至50％，优选约20％。在一个实施方案中，所述第一次大剂量施用包含待施用的分离的人源化蛋白质的总剂量约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50％。

在一个实施方案中，所述第一次大剂量在约5至30分钟内施用，优选在约15分钟内施用。

在一个实施方案中，在施用的第一个15分钟期间施用本发明用途的蛋白质总剂量的约20％，然后在接下来的5个小时45分钟期间连续施用剩余的80％。

在一个实施方案中，所述特定施用方案(在至少2小时期间的连续施用，任选地第一次大剂量)允许蛋白质的延长效果，这可以在施用所述蛋白质结束后观察到，如实施例中所证明的。在一个实施方案中，在蛋白质施用结束后观察蛋白质对血小板聚集的影响至少约1、2、3、4、5、6、12、18、24、36或48小时。

在一个实施方案中，药物组合物中存在的本发明用途的蛋白质可以以约1至约100mg/mL范围内的浓度供应，举例来说，如以1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL或100mg/mL的浓度。在一个实施方案中，蛋白质以约10mg/mL的浓度供应在100mg(10mL)或500mg(50mL)的单次使用的小瓶中。

在一个实施方案中，药物组合物可以包含在pH 7.2-7.7的PBS中的本发明的蛋白质。

在一个实施方案中，药物组合物可包含在柠檬酸钠缓冲液(20mM、NaCl 130mM、pH5.0)中的本发明的蛋白质。

本发明的另一个目的是治疗GPVI相关病症的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者施用如上文所述的与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，或如上文所述的组合物、药物组合物或药物。根据本发明，本发明的方法包括在至少2小时期间、优选在至少4至6小时期间向受试者施用所述蛋白质、组合物、药物组合物或药物。

在一个实施方案中，治疗本发明的GPVI相关病症的方法还包括用血管内治疗和/或血栓切除术治疗患者。在一个实施方案中，所述血管内治疗和/或血栓切除术在施用本发明的蛋白质(优选抗体)之前、同时或之后进行。

在一个实施方案中，治疗本发明的GPVI相关病症的方法还包括施用另一种可用于治疗GPVI相关病症的药剂的步骤，举例来说，例如血栓溶解剂，优选t-PA(包括天然t-PA和重组t-PA以及保留天然t-PA的酶和/或纤维蛋白溶解活性的t-PA的修饰形式)。在一个实施方案中，在施用本发明的蛋白质(优选抗体)之前、同时或之后施用所述另外的试剂。

在一个实施方案中，本发明的方法包括施用一定剂量的本发明所述蛋白质，范围为约0.5mg/kg至约50mg/kg，优选范围为约1mg/kg至约32mg/kg，更优选约8mg/kg。在另一个实施方案中，本发明的方法包括施用一定剂量的本发明所述蛋白质，范围为约2.5mg/kg至约25mg/kg，优选约5mg/kg至约15mg/kg，更优选约8mg/kg。在一个实施方案中，本发明的方法包括施用一定剂量的本发明所述蛋白质，为约0.5mg/kg、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50mg/kg。

在一个实施方案中，本发明的方法包括施用一定剂量的本发明所述蛋白质，范围为约30mg至约3000mg，优选约60mg至约2000mg，更优选约100mg至约1000mg，甚至更优选约500毫克。在一个实施方案中，本发明的方法包括施用一定剂量的本发明所述蛋白质，为约30、60、62.5、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500或约3000mg。在另一个实施方案中，本发明的方法包括施用一定剂量的本发明所述蛋白质，为约100mg至约2000mg，约125mg至约2000mg，优选约250mg至约1000mg或约500mg至约1000mg。

在一个实施方案中，注射本发明所述蛋白质，优选通过静脉输注。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在约2小时、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5期间或约12小时期间施用所述蛋白质。

在一个实施方案中，本发明的方法包括在至少2小时期间，优选在至少4至6小时期间(例如，在约2小时、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5期间或约12小时期间)连续施用蛋白质。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括施用第一次大剂量的所述蛋白质，然后连续施用剩余剂量的所述蛋白质。

在一个实施方案中，所述第一次大剂量施用包含待施用的分离的人源化蛋白质的总剂量的约10至50％，优选约20％。在一个实施方案中，所述第一次大剂量施用包括待施用的分离的人源化蛋白质总剂量的约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50％。

在一个实施方案中，所述第一次大剂量在约5至30分钟内施用，优选在约15内分钟。

在一个实施方案中，在施用的前15分钟期间施用本发明用途的蛋白质总剂量的约20％，然后在接下来的5小时45分钟内连续施用剩余80％。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制GPVI受体功能和下游信号传导，从而治疗GPVI相关病症。

在一个实施方案中，用于抑制GPVI受体功能和下游信号传导的方法不影响血小板计数、GPVI在血小板表面的表达，也不影响出血时间。

在一个实施方案中，用于抑制GPVI受体功能和下游信号传导的方法是有效且可逆的。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制GPVI与其配体(优选但非排他地为胶原蛋白)的结合，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，用于抑制GPVI与其配体结合的方法不影响血小板计数、GPVI在血小板表面的表达，也不影响出血时间。

在一个实施方案中，用于抑制GPVI与其配体结合的方法是有效且可逆的。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制和/或预防血小板粘附于胶原蛋白，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制和/或预防胶原诱导的血小板聚集，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制和/或预防响应于胶原蛋白的血小板活化，特别是血小板聚集，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制和/或预防响应于胶原蛋白和/或组织因子的凝血酶产生，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制和/或预防GPVI与纤维蛋白的结合，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，本发明的方法经由GPVI通过纤维蛋白抑制和/或预防血小板募集，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，本发明的方法用于抑制和/或预防响应于纤维蛋白的GPVI依赖性凝血酶产生，从而治疗GPVI相关病况。

在一个实施方案中，将如上文所述的蛋白质施用于受试者不会在体内诱导GPVI的耗竭。

在一个实施方案中，将如上文所述的蛋白质施用于受试者不会诱导血小板计数的降低。因此，在一个实施方案中，将如上文所述的蛋白质施用于受试者不会诱导血小板减少症。

在一个实施方案中，将如上文所述的蛋白质施用于受试者不会诱导出血时间的增加。

在一个实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用治疗有效量的蛋白质。

本发明进一步涉及用于增强血栓溶解剂(优选t-PA(包括天然t-PA和重组t-PA，以及保留天然t-PA酶和/或纤维蛋白溶解活力的t-PA的修饰形式)效力的方法，用于治疗GPVI相关疾病，其中所述方法包括施用血栓溶解剂与本发明的蛋白质(优选治疗有效量的本发明蛋白质)的组合于受试者。

在一个实施方案中，本发明的方法允许降低施用于受试者的血栓溶解剂(优选t-PA)的剂量。

附图简要说明

图1显示向食蟹猴(n＝4)输注15分钟增加剂量(1、2、4、8mg/kg)的ACT017结束后在30分钟和2小时测量的胶原蛋白诱导的血小板聚集的平均值±SEM强度(A)和速度(B)的组合图。

图2显示在任何治疗(T0)前和输注增加剂量(1、2、4、8mg/kg)的媒介物或ACT017后24小时测量的食蟹猴的血小板计数的图。

图3显示在在治疗(时间＝0)和向食蟹猴输注ACT017(1、2、4、8mg/kg)或媒介物后30分钟和2小时，在4名受试者中测量的出血时间的组合图。

图4显示在开始用两种剂量的ACT017(2和8mg/kg)向食蟹猴(n＝8)进行一小时输注后，在不同时间测量的胶原蛋白诱导的血小板聚集的平均值±SD强度(A)和速度(B)的组合图。

图5显示在开始2mg/kg的ACT017一小时输注后在不同时间通过流式细胞术测量的食蟹猴(n＝8)血小板上的GPVI表达水平的图(MFI：平均荧光强度)。

图6显示向食蟹猴以8mg/kg的ACT017 25分钟大剂量注射(n＝4)、以8mg/kg的ACT017 1小时输注(n＝8)或以2mg/kg的ACT017 15分钟输注然后以6mg/kg的ACT017 5小时45分钟输注(n＝4)结束后，在不同时间(20分钟至24小时)测量的胶原蛋白诱导的血小板聚集的平均值±SD强度的图。

图7显示野生型GPVI-Fc(黑图)和GPVI双突变体(灰色图)在胶原蛋白上的结合的图。

图8显示ACT017在野生型GPVI-Fc(黑色图)或双突变体(灰色图)上的结合的图。

图9显示在不同时间(从15分钟至168小时)对组群4的两个健康受试者测量的血小板聚集百分比的图。将500mg的ACT017或安慰剂施用于组群4的受试者。“筛选时间”表示在施用ACT017或其匹配的安慰剂之前一周或24小时测量的血小板聚集百分比。“给药前”表示ACT017或其匹配的安慰剂施用的基线测量。黑色图显示健康受试者1，灰色图显示健康受试者2。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

实施例1：非人灵长类动物的生物学数据

材料和方法

动物

在本研究中使用没有任何在前处理的28只食蟹猴。

处理

首先，静脉施用增加剂量的ACT017(1、2、4、8mg/kg)或其载体(n＝4-8)15分钟。在施用后30分钟和2小时时，采集血液。

在第二个实验中，通过大剂量注射或输注将ACT017施用于动物。研究中包括三个治疗组：通过25分钟大剂量注射而施用8mg/kg(n＝4)的ACT017，通过输注1小时施用8mg/kg的ACT017(n＝8)，通过15分钟大剂量注射施用2mg/kg的ACT017然后5小时45分钟输注施用6mg/kg的ACT017(n＝4)。在不同时间(施用后20分钟至24小时)采集血液。

分析

血小板聚集：离心后(120×g；15分钟；20℃)从猴中获得富含血小板的血浆(PRP)并立即使用。针对含本发明各种浓度Fab的PRP使用聚集仪和2.5mg.mL-1胶原蛋白浓度(Horm胶原蛋白，Nycomed，DE)，测量聚集的速度和强度，并连续记录。以光透射的百分比增加测量血小板聚集的强度。显示注射开始后指定时间的平均值±SD。

在EDTA抗凝血中测量血小板计数。在针对猴参数设定的Scil Vet abc自动细胞计数器(Scil Animal Care Company，Holtzheim，France)中测定血小板计数。

根据标准临床程序(Ivy氏程序)并使用0.5cm SurgicuttTM出血时间装置，在vigil猴前臂表面上测量出血时间。

GPVI表达：在注射前和注射增加剂量的ACT017或等体积媒介物后30分钟，将血液样品收集到EDTA上，并与商业FITC一起孵育，所述FITC与和食蟹猴GPVI交叉反应的抗人GPVI单克隆抗体(克隆1G5，Biocytex)相偶联，并在Beckman Coulter Gallios流式细胞仪上测量荧光。

结果

施用ACT017的效果在非人灵长类动物中表征。在该研究中招募了8个食蟹猴。

首先，静脉施用增加剂量的ACT017(1、2、4、8mg/kg)15分钟。在施用后30分钟和2小时，采集血液。血小板聚集以剂量依赖性方式被可逆地抑制(图1)。将剂量从1mg/kg增加到2mg/kg和从2mg/kg到4mg/kg增加了效果，而8mg/kg与4mg/kg相比没有额外的效果。与注射前获得的值相比，注射后24小时测量的血小板计数未作修改(图2)。用载体或2、4或8mg/kgACT017处理后未观察到出血时间的显著增加(图3)。接下来，在洗涤期后，食蟹猴以一小时灌注施用的方式接受ACT017(2或8mg/kg)。在治疗开始后的不同时间(1、1.5、2、4和7小时)测量血小板聚集和GPVI表达(图4和5)。胶原蛋白诱导的血小板聚集被可逆地抑制，与2mg/kg处理相比，在食蟹猴中用8mg/kg处理延长了效果持续时间(图4)。与预处理的值相比，血小板上的GPVI表达在治疗开始后的不同时间保持稳定(图5)。

总之，这些结果证实在非人灵长类动物中ACT017的施用有效且可逆地抑制GPVI功能，而不影响血小板计数、血小板表面上GPVI的表达，也不影响出血时间。

另外，根据前述结果，在1小时输注后ACT017对血小板聚集的抑制作用似乎在有限的时间段内是有效的。实际上，ACT017仅在施用开始后2小时期间(即在1小时诱导结束后最多1小时)诱导对血小板聚集的显著和稳定的抑制(参见图4)。2小时后，即使8mg/kg延长抑制，ACT017抑制剂作用在所有测试剂量下也均消退。

在第二个实验中，进一步表征在不同施用时间(包括1小时和6小时施用)后，8mg/kg剂量的ACT017对血小板聚集的影响。血小板聚集以时间依赖性方式被可逆地抑制(图6)。

在0.5小时测量到以8mg/kg的25分钟大剂量注射诱导了对胶原蛋白诱导的血小板聚集的完全抑制。在2小时，血小板聚集的抑制消退并且聚集强度恢复至24±34％的值。在24小时未观察到ACT017的作用。

以8mg/kg的1小时输注导致胶原蛋白诱导的血小板聚集的延长抑制。然而，对于所有动物仅2小时抑制是安全的(<5％)。在ACT017施用后4小时和7小时，抑制消退并且总体平均聚集强度分别为16±29％和25±32％。因此，对于25分钟施用，ACT017的抑制作用似乎仅在其1小时施用后的短时间内是显著的。

8mg/kg的6小时输注导致对胶原蛋白诱导的血小板聚集的显著抑制，持续至少9小时。实际上，在6小时输注开始后9小时期间，血小板聚集强度低于2％。此外，由于在9小时至24小时之间未进行分析，因此不排除效果持续时间更长的可能性。在24小时，对于四只动物中的三只动物，ACT017的作用接近于被完全逆转，并且平均聚集强度达到47±30％。

总之，对于8mg/kg的相同剂量，6小时输注显示在施用结束后至少3小时期间对胶原蛋白诱导的血小板聚集的延长功效。

实施例2：健康志愿者中ACT017安全性、耐受性、药代动力学和药效动力学的研究

材料和方法

本研究是一项关于ACT017在健康志愿者中的安全性、耐受性、药代动力学和药效动力学的随机的、双盲的且安慰剂对照的上升的单剂量研究。受试者

研究中涉及的受试者是健康的男性或非怀孕、非哺乳的女性受试者，年龄在30至60岁之间(包括在内)，BMI≥18kg/m2且≤30kg/m2。共有48名受试者参加了6个上升剂量水平的群组，每个群组由8名受试者组成：6名接受活性剂，2名接受安慰剂。每个群组分成2个亚组：一个开始给药(1个接受活性剂和1个接受安慰剂)，另一个其后48小时给药(5个接受活性剂和1个接受安慰剂)。

在每个给药期的第-1天，受试者进入研究中心并在那里停留直到给药后至少48小时。在第7天进行随访。受试者从第-1天直到第-3天早晨住在医院。

治疗

研究药物是含有500mg ACT017和匹配的安慰剂溶液的50mL小瓶。在6小时输注期间给予治疗。

每个剂量均以6小时输注给予，第一次大剂量的15分钟注射对应于最终剂量的约1/4。

组1：治疗A：62.5mg ACT017(n＝6)，治疗B：匹配的安慰剂(n＝2)。

组2：治疗A：125mg ACT017(n＝6)，治疗B：匹配的安慰剂(n＝2)。

组3：治疗A：250mg ACT017(n＝6)，治疗B：匹配的安慰剂(n＝2)。

组4：治疗A：500mg ACT017(n＝6)，治疗B：匹配的安慰剂(n＝2)。

组5：治疗A：1000mg ACT017(n＝6)，治疗B：匹配的安慰剂(n＝2)。

组6：治疗A：2000mg ACT017(n＝6)，治疗B：匹配的安慰剂(n＝2)。分析

ACT017的药代动力学血液采样为每个受试者15个样品。

ACT017的尿液采集为每个受试者约5个采集间隔。

安全性和耐受性分析包括以下研究：

·不良事件：贯穿整个研究；

·生命体征：经常；

·心电图(electrocardiogram)：比生命体征频率低；

·包括血液学的临床实验室：2次；

·凝血参数：5次；

·出血时间：4次；

·血小板计数：7次；

·血小板聚集(胶原蛋白)：6次；

·免疫原性/ADA：3次。

血小板聚集：离心(120×g；15分钟；20℃)后从健康受试者中获得富含血小板的血浆(PRP)，所述健康受试者已经静脉接受了安慰剂或500mg ACT017，其中在前15分钟施用剂量的25％，在接下来的5小时45分钟内施用剂量的75％，并立即使用。使用聚集仪和浓度为2.5mg.mL-1的胶原蛋白(Horm胶原蛋白)，本发明各种浓度的Fab，测量聚集强度，并连续记录。以光透射的百分比增加测量血小板聚集的强度。

结果

如图9所示，与基线百分比相比，在施用开始后仅15分钟，受试者2中血小板聚集的百分比降低约70％，并且在接下来的8小时内保持在约10％，然后在24小时后其再次增加至约70％的聚集，然后在施用后48小时返回基线。施用后168小时没有观察到对血小板聚集的作用。因此在受试者2中观察到的作用是可逆的。在受试者1中，在试验的168小时期间血小板聚集的百分比似乎没有变化。

实施例3：ACT017对GPVI的表位亲和力的研究

GPVI上的ACT017表位在先前通过表位作图鉴定为构象表位，其包含G PVI上的两个区域：SEQ ID NO:13中的氨基酸121-135和氨基酸169-183。为了验证该表位，构建了双突变体，其包含以下突变：S125P、S126Q、G128R、Q133K、T136S、T171D、A172L和H174V，并测量了该突变体对胶原蛋白和ACT017的亲和力。

材料和方法

按照如下方法生产可溶性GPVI-Fc：在密码子优化后合成编码人GPVI的胞外域的基因，该胞外域自第一个甲硫氨酸至天冬酰胺269且通过三肽GGR与人IgG1 Fc结构域融合。将该基因克隆到pTT5载体中，然后转染到HEK 293-6E细胞中。使用MAbselect matrix(GEHealthcare，17519901)通过亲和色谱法从细胞的条件培养基中纯化分泌的GPVI-Fc，然后在Nuvia^TM HR-S阳离子交换树脂(BioRad，156051)上进行精制色谱。

双突变体对GPVI-Fc上胶原蛋白的结合的影响-用PBS中的胶原蛋白(20μg/mL，每孔100μL)包被微量滴定板4℃下过夜。用200μL PBS中的1％BSA使非特异性结合位点饱和30分钟。然后将板与增加浓度的野生型或双突变体GPVI-Fc制剂(在PBS中100μL含0.1％BSA和0.1％Tween 20)一起孵育30分钟。在3轮洗涤后，将板与过氧化物酶偶联的第二人抗-Fc(ab)一起孵育30分钟。最后，将100μL底物溶液加入各孔中4分钟，并通过25μL NaOH 3M终止比色反应。

双突变体对GPVI-Fc上ACT017的结合的影响-用PBS中的GPVI-Fc(20μg/mL，每孔100μL)包被微量滴定板4℃下过夜。用200μL PBS中的1％BSA使非特异性结合位点饱和30分钟。然后将板与增加浓度的ACT017制剂(在PBS中100μL含0.1％BSA和0.1％Tween 20)一起孵育30分钟。在3轮洗涤后，将板与过氧化物酶偶联的第二人抗IgG一起孵育30分钟。最后，向每个孔中加入100μL底物溶液4分钟，并通过25μL NaOH 3M终止比色反应。

分析

用Flustar Optima测量450nm处的吸光度。

结果

如图7所示，GPVI-Fc的双突变体仍然能够以剂量依赖性方式与胶原蛋白结合，这表明在这些突变体的存在下大体上保留了GPVI对胶原蛋白的亲和力。然而，如图8所示，ACT017能够结合野生型GPVI-Fc，但不能结合双突变体，即使在高浓度下。这些结果因此证实了在GPVI序列上ACT017表位的位置。

序列表

<110> 艾科迪科尔生物技术公司（ACTICOR BIOTECH）

巴黎大学迪德罗特第七分校（UNIVERSITÉ PARIS DIDEROT - PARIS 7）

巴黎第十三大学（UNIVERSITÉ PARIS XIII）

法国国家健康和医学研究院（INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE LA RECHERCHEMÉDICALE

(INSERM)）

巴黎第十一大学（UNIVERSITÉ PARIS-SUD 11）

P·比亚阿多（Billiald Philippe）

M·扬德特-佩吕（Martine JANDROT-PERRUS）

G·阿弗纳尔（Gilles AVENARD）

<120> 使用抗人GPV1抗体抑制血小板聚集

<130> CV - 739/PCT

<160> 27

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 2

Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 3

Gly Thr Val Val Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 5

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 6

Leu Gln Leu Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Val Val Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 10

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 10

caggttcagc tggttcagtc aggggctgag gtgaagaagc ctggagcctc agtgaaggtg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aagacaggct 120

cctggacagg gcctggaatg gatgggaggt atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180

aatcagaagt tccagggccg agttactatg actcgggaca cttccacctc tacagtgtac 240

atggagctca gcagcctgag atctgaggac accgcggtct attactgtgc aagaggcacc 300

gtggtcggcg actggtactt cgatgtgtgg ggccaaggca ccctggtcac cgtgagcagt 360

<210> 11

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 11

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60

atcacctgta gaagtagtca gagccttgag aacagcaacg gaaacaccta cctgaattgg 120

taccagcaga agccaggtaa ggctccaaag ctgctgatct acagagtttc caaccgattc 180

tctggtgtgc caagcagatt cagcggtagc ggtagcggta ccgacttcac cttcaccatc 240

agcagcctcc agccagagga catcgccacc tactactgcc tccagctgac tcatgtccca 300

tggaccttcg gtcagggcac caaggtggag atcacccgg 339

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 12

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60

atcacctgta gtgccagtca gagccttgag aacagcaacg gaaacaccta cctgaattgg 120

taccagcaga agccaggtaa ggctccaaag ctgctgatct acagagtttc caaccgattc 180

tctggtgtgc caagcagatt cagcggtagc ggtagcggta ccgacttcac cctcaccatc 240

agcagcctcc agccagagga cttcgccacc tactactgcc tccagctgac tcatgtccca 300

tggaccttcg gtcagggcac caaggtggag atcaaacgc 339

<210> 13

<211> 339

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 13

Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly

1 5 10 15

Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala

20 25 30

Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys

35 40 45

Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser

50 55 60

Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg

65 70 75 80

Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp

85 90 95

Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala

100 105 110

Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala

130 135 140

Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp

145 150 155 160

Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly

165 170 175

Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr

195 200 205

Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser

210 215 220

Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr

225 230 235 240

Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Thr Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser

245 250 255

Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg

260 265 270

Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala

275 280 285

Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala

290 295 300

Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys

305 310 315 320

Ser His Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly

325 330 335

Leu Cys Ser

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链恒定区

<400> 14

gcctccacca agggtccctc agtcttccca ctggcaccct cctccaagag cacctctggt 60

ggcacagctg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc cagaaccagt gactgtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ctgctgtctt gcagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agtcgagcct 300

aagtcatgcg acaagactca c 321

<210> 15

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链恒定区

<400> 15

actgtggctg caccaagtgt gttcatcttc ccacctagcg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg tcgtgtgcct cctgaacaac ttctacccac gggaggccaa ggtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atccggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaagatagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgactctga gcaaagcaga ctacgagaag 240

cacaaggtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gttcccctgt cacaaagagc 300

ttcaaccggg gagagtgt 318

<210> 16

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 16

atggatatgc gtgtaccagc tcaactactt ggacttctat tgctttggct tcgtggtgct 60

agatgt 66

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 17

atggactgga cttggagaat cctattcttg gttgctgcag ctacaggtgc tcattca 57

<210> 18

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链

<400> 18

gcggccgcca ccatggactg gacttggaga atcctattct tggttgctgc agctacaggt 60

gctcattcac aggttcagct ggttcagtca ggggctgagg tgaagaagcc tggagcctca 120

gtgaaggtgt cctgcaaggc ttctggctac acatttacca gttacaatat gcactgggta 180

agacaggctc ctggacaggg cctggaatgg atgggaggta tttatccagg aaatggtgat 240

acttcctaca atcagaagtt ccagggccga gttactatga ctcgggacac ttccacctct 300

acagtgtaca tggagctcag cagcctgaga tctgaggaca ccgcggtcta ttactgtgca 360

agaggcaccg tggtcggcga ctggtacttc gatgtgtggg gccaaggcac cctggtcacc 420

gtgagcagtg cctccaccaa gggtccctca gtcttcccac tggcaccctc ctccaagagc 480

acctctggtg gcacagctgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc agaaccagtg 540

actgtgtcat ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc tgctgtcttg 600

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660

acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720

gtcgagccta agtcatgcga caagactcac tgatgaggat cc 762

<210> 19

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 19

gacgtcacca tggatatgcg tgtaccagct caactacttg gacttctatt gctttggctt 60

cgtggtgcta gatgtgacat ccagatgacc cagagcccaa gcagcctgag cgccagcgtg 120

ggtgacagag tgaccatcac ctgtagaagt agtcagagcc ttgagaacag caacggaaac 180

acctacctga attggtacca gcagaagcca ggtaaggctc caaagctgct gatctacaga 240

gtttccaacc gattctctgg tgtgccaagc agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac 300

ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca gaggacatcg ccacctacta ctgcctccag 360

ctgactcatg tcccatggac cttcggtcag ggcaccaagg tggagatcac ccggactgtg 420

gctgcaccaa gtgtgttcat cttcccacct agcgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgtcgtgt gcctcctgaa caacttctac ccacgggagg ccaaggtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatccgg taactcccag gagagtgtca cagagcaaga tagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgact ctgagcaaag cagactacga gaagcacaag 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagttccc ctgtcacaaa gagcttcaac 720

cggggagagt gttgatgata tc 742

<210> 20

<211> 742

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 20

gacgtcacca tggatatgcg tgtaccagct caactacttg gacttctatt gctttggctt 60

cgtggtgcta gatgtgacat ccagatgacc cagagcccaa gcagcctgag cgccagcgtg 120

ggtgacagag tgaccatcac ctgtagtgcc agtcagagcc ttgagaacag caacggaaac 180

acctacctga attggtacca gcagaagcca ggtaaggctc caaagctgct gatctacaga 240

gtttccaacc gattctctgg tgtgccaagc agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac 300

ttcaccctca ccatcagcag cctccagcca gaggacttcg ccacctacta ctgcctccag 360

ctgactcatg tcccatggac cttcggtcag ggcaccaagg tggagatcaa acgcactgtg 420

gctgcaccaa gtgtgttcat cttcccacct agcgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480

tctgtcgtgt gcctcctgaa caacttctac ccacgggagg ccaaggtaca gtggaaggtg 540

gataacgccc tccaatccgg taactcccag gagagtgtca cagagcaaga tagcaaggac 600

agcacctaca gcctcagcag caccctgact ctgagcaaag cagactacga gaagcacaag 660

gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagttccc ctgtcacaaa gagcttcaac 720

cggggagagt gttgatgata tc 742

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L3 - 之后的残基

<220>

<221> 位点

<222> 3

<223> X是任意氨基酸

<400> 21

Phe Gly Xaa Gly

1

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H1 - 之前的残基

<220>

<221> 位点

<222> 2

<223> X是任意氨基酸

<220>

<221> 位点

<222> 3

<223> X是任意氨基酸

<220>

<221> 位点

<222> 4

<223> X是任意氨基酸

<400> 22

Cys Xaa Xaa Xaa

1

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H2 - 之前的残基

<400> 23

Leu Glu Trp Ile Gly

1 5

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H3 - 之后的残基

<220>

<221> 位点

<222> 3

<223> X是任意氨基酸

<400> 24

Trp Gly Xaa Gly

1

<210> 25

<211> 527

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 25

Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu

20 25 30

Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val

35 40 45

Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln

50 55 60

Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala

65 70 75 80

Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln

85 90 95

Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly

115 120 125

Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys

130 135 140

Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His

180 185 190

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile

195 200 205

Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys

225 230 235 240

Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys

245 250 255

Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro

260 265 270

Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro

275 280 285

Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg

290 295 300

Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile

325 330 335

Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe

340 345 350

Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr

355 360 365

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys

370 375 380

Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp

385 390 395 400

Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys

405 410 415

His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His

420 425 430

Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn

435 440 445

Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly

450 455 460

Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly

465 470 475 480

Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile

485 490 495

Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr

500 505 510

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

515 520 525

<210> 26

<211> 275

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 26

Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu

20 25 30

Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val

35 40 45

Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln

50 55 60

Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala

65 70 75 80

Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln

85 90 95

Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly

115 120 125

Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys

130 135 140

Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala

145 150 155 160

Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His

180 185 190

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile

195 200 205

Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu

210 215 220

Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys

225 230 235 240

Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys

245 250 255

Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro

260 265 270

Gln Phe Arg

275

<210> 27

<211> 252

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 27

Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys

20 25 30

Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys

35 40 45

Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg

50 55 60

Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu

65 70 75 80

Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp

85 90 95

Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu

100 105 110

Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu

115 120 125

Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala

130 135 140

Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu

145 150 155 160

Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val

165 170 175

Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln

180 185 190

Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val

195 200 205

Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly

210 215 220

Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr

225 230 235 240

Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro

245 250

Claims

1.与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，用于治疗有此需要的受试者中GPVI相关病症，其中所述分离的人源化蛋白质在至少2小时期间、优选至少4至6小时期间施用于所述受试者。

2.根据权利要求1用途的所述与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述分离的人源化蛋白质经注射，优选通过静脉输注。

3.根据权利要求1或2用途的所述与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中向所述患者施用剂量为约0.5mg/kg至约50mg/kg，优选约1mg/kg至约32mg/kg，更优选约8mg/kg的人源化蛋白质。

4.根据权利要求1或2用途的所述与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中向所述患者施用剂量约125mg/kg至约2000mg/kg，优选约250mg/kg至约1000mg/kg或约500mg/kg至约1000mg/kg的人源化蛋白质。

5.根据权利要求1或4任一项用途的所述与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中施用第一次大剂量，其中优选所述第一次大剂量施用包含待施用的分离的人源化蛋白总剂量的约10至50％，优选约20％，并且其中优选所述第一次大剂量在5至30分钟内、优选在约15分钟内施用。

6.根据权利要求1至5任一项用途所述的与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：

-来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142的至少一个氨基酸残基，或来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基114至142上具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和

-来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187的至少一个氨基酸残基，或来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基165至187上具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

7.根据权利要求6用途的所述与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述构象表位包含来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136的至少一个氨基酸残基，或包含来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基121至135或121至136上具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和包含来自hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或包含来自在hGPVI(SEQ ID NO:13)的氨基酸残基169至183上具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

8.根据权利要求1至7任一项用途所述的与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与hGPVI结合的K_D小于15nM，其中所述K_D是使用960至1071 RU的可溶性人GPVI以及使用PBS pH7.4作为运行缓冲液，通过表面等离子体共振测量的，并且其中所述分离的人源化蛋白质在体内不诱导GPVI耗竭表型。

9.根据权利要求1至8中任一项用途的所述与hGPVI结合的分离的人源化蛋白质，其是选自由以下组成的组的抗体分子：完整抗体、人源化抗体、单链抗体、Fv、Fab；或是选自由以下组成的组的抗体片段：单抗体、结构域抗体和纳米抗体；或选自由以下组成的组的单体抗体模拟物：亲和体、aff ilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynome r和versabody，优选单价抗体。

10.根据权利要求9用途的所述与hGPVI结合的分离的抗体分子，其中

-重链的可变区包含以下CDR中的至少一个：

VH-CDR1：GYTFTSYNMH(SEQ ID NO:1)；

VH-CDR2：GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQ ID NO:2)；和

VH-CDR3：GTVVGDWYFDV(SEQ ID NO:3)；

或具有与SEQ ID NO:1-3具有至少60％同一性的氨基酸序列的任意CDR。

-轻链的可变区包含以下CDR中的至少一个：

VL-CDR1：RSSQSLENSNGNTYLN(SEQ ID NO:4)；

VL-CDR2：RVSNRFS(SEQ ID NO:5)；和

VL-CDR3：LQLTHVPWT(SEQ ID NO:6)；

或具有与SEQ ID NO:4-6具有至少60％同一性的氨基酸序列的任意CDR。

11.根据权利要求9至10任一项用途的所述与hGPVI结合的分离的抗体分子，其中重链的可变区包含以下CDR：GYTFTSYNMH(SEQ ID NO:1)、GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQ ID NO:2)和GTVVGDWYFDV(SEQ ID NO:3)，并且轻链的可变区包含以下CDR：RSSQSLENSNGNTYLN(S EQ IDNO:4)、RVSNRFS(SEQ ID NO:5)和LQLTHVPWT(SEQ ID NO:6)，或者具有与所述SEQ ID NO:1-6具有至少60％同一性的氨基酸序列的任意CDR。

12.根据权利要求9至11任一项用途所述的与hGPVI结合的分离的抗体分子，其中编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:7，编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:8，或具有与所述SEQ ID NO:7或8具有至少60％同一性的氨基酸序列的任意序列。

13.根据权利要求9至11任一项用途所述的与hGPVI结合的分离的抗体分子，其中编码重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:7，编码轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:9，或具有与所述SEQ ID NO:7或9具有至少60％同一性的氨基酸序列的任意序列。

14.根据权利要求1至13任一项用途所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述的GPVI相关病症是选自以下的心血管疾病：动脉和静脉血栓症、再狭窄、急性冠状动脉综合征、由动脉粥样硬化引起的脑血管事件、心肌梗塞、肺栓塞、严重肢体缺血和外周动脉疾病。