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CN110484466B - 一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法 - Google Patents

一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法 Download PDF

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CN110484466B CN201910751703.0A CN201910751703A CN110484466B CN 110484466 B CN110484466 B CN 110484466B CN 201910751703 A CN201910751703 A CN 201910751703A CN 110484466 B CN110484466 B CN 110484466B
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Abstract

本发明属于应用工业微生物领域，公开了一种提高嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)发酵性能的方法，包括三种方法：1)在发酵培养基中添加外源甲硫氨酸；2)代谢工程手段提高嗜热厌氧杆菌甲硫氨酸的转运和/或胞内合成；3)结合前两种方法；然后进行发酵，碳源为葡萄糖、木糖或两者的混合糖。本发明通过外源添加和/或代谢工程改造手段提高其甲硫氨酸的供给水平，能够实现在避免向培养基中添加昂贵营养物质(酵母膏和胰蛋白胨)的同时，提升嗜热厌氧杆菌的发酵性能，有助于降低发酵成本、提升经济可行性。

Description

一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法
技术领域
本发明涉及一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法，属于应用工业微生物领域。
背景技术
基于生物质资源的化学品和能源生产，是解决目前石化资源枯竭和环境问题的重要措施，对经济社会的可持续发展具有重要意义。目前发酵工业的主要碳源为淀粉基生物质，存在与人争粮、与粮争地的问题，因此各国都在大力开发基于木质纤维素的生物炼制工艺。
高温厌氧菌由于拥有发酵木质纤维素的能力，因此成为转化纤维素类生物质生产生物基化学品和生物燃料的重要研究对象。申请人课题组前期筛选得到一株嗜热厌氧杆菌，鉴定为ThermoanaerobacteriumaotearoenseSCUT27(Genome Announcements 2014,2(1):e00041-14)，该菌具有如下优势：首先，底物谱宽，甚至可以在不添加任何酶的条件下直接利用廉价生物质中的半纤维素成分；其次，可耐受较宽范围的pH和温度变化，该特性被认为在推进其商业化运用进程中至关重要；最后，高温生长环境(55℃)有利于发酵产物(乙醇)的回收，并能避免微生物污染。特别令人关注的是，SCUT27能够在营养丰富的培养基中同时利用葡萄糖和木糖。此外，课题组前期通过代谢工程改造，获得了可以高效积累氢气(Bioresource Technology 2010,101:8718–8724)、乙醇(Enzyme and MicrobialTechnology2011,48:155–161)和乳酸(Biotechnology for Biofuels 2013,6:124)的工程菌，在廉价生物质转化生物基化学品和生物燃料方面显示出潜在的应用前景。
嗜热厌氧杆菌工业化应用的主要问题为乙醇耐受性和发酵性能较差，前者可以通过适应性驯化和代谢工程改造的方式得到提高(基于RNA-Seq及全基因组测序的嗜热厌氧杆菌乙醇耐受性机制的研究.华南理工大学2017)，然而后者需要添加大量昂贵的营养物质(酵母膏和胰蛋白胨)才能提升其发酵性能。
从工业化角度来看，如果能够找到一种经济高效的提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法，对于推动其工业化应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法，有助于提高菌株的生物量以及目标产物的生产效率，降低培养基的成本，从而提升嗜热厌氧杆菌发酵法生产生物基化学品和生物燃料的经济可行性。
本发明的具体技术方案如下：
一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法，选择下面任意一种或两种方法：
方法A为甲硫氨酸外源添加法，包括如下步骤：
(1)将嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)在种子培养基中活化，制备成种子液；
(2)以葡萄糖、木糖或两者的混合糖为碳源，以甲硫氨酸为添加剂，配制发酵培养基，并经过除菌；
(3)将步骤(1)种子液接种于步骤(2)制得的发酵培养基中，进行厌氧发酵即可；
方法B为菌株代谢工程改造法，包括如下步骤：
(1)在嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)中：1)过表达甲硫氨酸转运和/或合成相关基因；或2)敲除甲硫氨酸转运和/或合成相关基因前端调节序列(S-box)，然后构建工程菌；
(2)将上述工程菌在种子培养基中活化，制备成种子液；
(3)以葡萄糖、木糖或两者的混合糖为碳源配制发酵培养基，并经过除菌；
(4)将步骤(2)种子液接种于步骤(3)制得的发酵培养基中，进行厌氧发酵即可。
优选地，所述嗜热厌氧杆菌为ThermoanaerobacteriumaotearoenseSCUT27或其代谢途径改造的工程菌。
优选地，所述代谢途径改造工程菌为T.aotearoenseSCUT27Δldh。
优选地，所述甲硫氨酸浓度为10-200mg/L。
优选地，所述甲硫氨酸浓度为10-30mg/L。
优选地，所述甲硫氨酸为L-甲硫氨酸、D-甲硫氨酸或DL-甲硫氨酸。
优选地，所述方法A中种子培养基为MTC液体培养基，发酵培养基为改良MTC液体培养基，方法B中种子培养基为MTC液体培养基，发酵培养基为MTC液体培养基或改良MTC液体培养基。
优选地，所述MTC液体培养基包括如下成分(单位g/L)，A液：碳源5-100；B液：柠檬酸三钾盐0.1-6.25，一水柠檬酸0.1-3，硫酸钠0.1-5，磷酸二氢钾0.1-5，碳酸氢钠0.1-12.5；C液：尿素0.1-25，氯化铵0.1-7.5；D液：六水氯化镁0.1-5，四水氯化亚铁0.1-0.5，二水氯化钙0.1-1，一水半胱氨酸盐酸0.1-5；E液：二盐酸吡哆胺0.001-0.1，对氨基苯甲酸0.001-0.02，D-生物素0.001-0.01，维生素B12为0.001-0.01，维生素B1为0.001-0.02；所述改良MTC液体培养基为在上述MTC液体培养基中添加甲硫氨酸。
优选地，所述甲硫氨酸转运和/或合成相关基因包括以下一种或多种：甲硫氨酸转运相关基因metN(methionine ATP-binding protein)、metP(methionine permease)、metQ(methionine substrate-binding protein)，以及甲硫氨酸合成相关基因pckA(phosphoenolpyruvate carboxykinase)、metL(aspartate kinase)、asd(aspartylsemialdehyde dehydrogenase)、hom(homoserine dehydrogenase)、metA(homoserine O-succinyltransferase)、metY(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)、metE(vitamin B12-independentmethionine synthase)、metH(vitamin B12-dependent methioninesynthase)。
优选地，所述敲除甲硫氨酸转运相关基因前端调节序列(S-box)，优选为甲硫氨酸转运基因metNPQ前端核糖开关基因，所得工程菌为T.aotearoenseSCUT27△ldh/△S1。
优选地，所述方法A、B中发酵培养的条件为：温度为40-70℃，培养12～28h，pH为3.5-8，转速为100-300rpm。
优选地，所述方法A、B中除菌是指A、B、C和D液在115-121℃条件下灭菌15-30min，E液用0.22μM微孔滤膜过滤除菌。
优选地，所述方法A、B中种子液的接种量为5-15％(v/v)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
限制嗜热厌氧杆菌产业化应用的主要瓶颈之一是培养基中需要添加大量昂贵的营养物质(如酵母膏和胰蛋白胨)，增加了培养基和发酵成本。本发明通过外源添加和/或代谢工程改造手段提高其甲硫氨酸的供给水平，能够实现在避免昂贵营养物质添加的同时，提升嗜热厌氧杆菌的发酵性能，这将极大提升嗜热厌氧杆菌发酵的经济可行性。
附图说明
图1为不同浓度L-甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27菌体生物量的影响。
图2为不同浓度L-甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27Δldh葡萄糖发酵性能的影响，A、B、C、D分别为菌体生物量、葡萄糖消耗、乙醇生成、乙酸生成随时间变化曲线。
图3为不同浓度L-甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27Δldh木糖发酵性能的影响，A、B、C、D分别为菌体生物量、木糖消耗、乙醇生成、乙酸生成随时间变化曲线。
图4为不同浓度L-甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27Δldh混合糖(葡萄糖：木糖＝1:2)发酵性能的影响，A、B、C、D分别为菌体生物量、混合糖消耗、乙醇生成、乙酸生成随时间变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：不同浓度L-甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27菌体生物量和嗜热厌氧杆菌SCUT27△ldh发酵性能的影响
(1)种子培养基的配制
种子培养基使用液体MTC培养基，由A、B、C、D和E五部分组成，详细组分如下表所示(1L体系)。
Figure BDA0002167387770000041
Figure BDA0002167387770000051
培养基配制方法：将A、B、C和D液按上表所示的配方与浓度配置于100mL血清瓶中，用抽气充气装置先抽真空，然后充氮气至0.05MPa，连续反复充气抽气三次；115℃灭菌20分钟备用。E液高温灭菌维生素会失效，故配制定容后用0.22μM微孔滤膜在超净工作台中过滤除菌。试验时A、B、C、D、E液在超净工作台内按46:1:1:1:1比例混合。
(2)发酵培养基的配制
MTC发酵培养基将A液改为15-100g/L的葡萄糖、木糖或混合糖；改良MTC液体培养基需要向E液中额外添加不同浓度的甲硫氨酸(0-200mg/L)，其余成分不变。
(3)摇瓶发酵实验
菌种的活化：取保存于-80℃冰箱的嗜热厌氧杆菌菌液涂布在平板上，置于55℃厌氧培养箱中培养24h，然后挑取单克隆接种于新鲜种子培养基中，在55℃、150rpm条件下培养8-10h，所得的菌液作为种子液备用。
摇瓶发酵实验：将活化扩大培养后的T.aotearoenseSCUT27Δldh种子液于超净工作台内按10％(v/v)的接种量接种到含有不同碳源(葡萄糖、木糖或混合糖)和发酵培养基的血清瓶中，在55℃、150rpm条件下摇瓶发酵，在发酵过程中每隔4h取样用于检测菌体密度、底物消耗和产物的生成。
(4)分析测定方法
细胞密度的测定：将发酵液稀释适当的倍数，用紫外可见分外光度计在600nm波长条件下测定菌液的生物量。
发酵底物和产物的测定：将发酵样品在高速离心机中按照12000rpm的转速离心10min后，取380μL上清液和1520μL去离子水，并与100μL浓度为10％(v/v)稀硫酸混匀，然后过滤除菌，最后通过Waters2695高效液相色谱仪测定。相关参数为：色谱柱为AminexHPX-87H(Biorad)；检测器为RI-2414示差检测器；流动相为2.5mM H2SO4；流速为0.6mL/min；柱温箱温度设置为60℃；检测室温度为40℃；进样量为10μL。
如图1所示，向培养基中添加不同浓度L-甲硫氨酸(50-200mg/L)能够提高嗜热厌氧杆菌T.aotearoenseSCUT27的生物量，且浓度为50mg/L时菌体生物量最高。随后选取高产乙醇突变株SCUT27△ldh，在不同底物条件下进一步优化L-甲硫氨酸的添加量，发酵结果如图2-4所示，向培养基中添加不同浓度的L-甲硫氨酸(10-30mg/L)均能够提高SCUT27Δldh的发酵性能，而且木糖发酵(图3)效果的提升要显著强于葡萄糖发酵(图2)。值得一提的是，混合糖底物中添加一定浓度的甲硫氨酸有助于菌株对葡萄糖和木糖的高效共利用(图4)，因此在木质纤维素类生物质的利用中将发挥重要的作用。
实施例2：敲除甲硫氨酸转运基因metNPQ前端核糖开关基因，对嗜热厌氧杆菌SCUT27Δldh发酵性能的影响
重组质粒构建以及工程菌的获得：首先用试剂盒提取T.aotearoenseSCUT27的基因组DNA，然后以此为模板，特异性扩增获得核糖开关基因(长度为100bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)的上、下游同源臂基因片段(约为700bp)，对PCR产物进行纯化回收用于下一步的酶切连接，接着将核糖开关上游基因与带有卡那霉素抗性标记的pBluescriptⅡSK(+)载体同时用SacⅠ与BamHⅠ进行双酶切，酶切后产物纯化回收，然后直接进行连接反应。核糖开关下游基因同源臂的扩增、酶切和连接操作与上游基因基本一致。最后成功构建的pBlu2KSP-S转化到DH5α中扩大培养，提取得到的质粒使用电转化的方法转化到T.aotearoenseSCUT27Δldh，最终获得工程菌SCUT27Δldh/ΔS(具体步骤参见FEMSMicrobiology.Letters.1997,148:163-167)。
摇瓶发酵测试：将活化扩大培养后的T.aotearoenseSCUT27Δldh和T.aotearoenseSCUT27△ldh/ΔS种子液于超净工作台内按10％(v/v)的接种量接种到含有不同碳源(葡萄糖、木糖或混合糖)和发酵培养基的血清瓶中，在55℃、150rpm条件下摇瓶发酵，发酵结束取样，检测菌体密度、底物消耗和产物的生成。
发酵结果如表1所示，敲除甲硫氨酸转运基因metNPQ前端核糖开关基因对菌株T.aotearoenseSCUT27Δldh/ΔS发酵性能的提升效果十分显著，这主要是因为核糖开关对于甲硫氨酸的转运具有调控作用。
表1 敲除甲硫氨酸转运基因metNPQ前端核糖开关对嗜热厌氧杆菌发酵性能的影响
Figure BDA0002167387770000061
Figure BDA0002167387770000071
实施例3：不同构型甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27Δldh/ΔS木糖发酵性能的影响
摇瓶发酵测试：将活化扩大培养后的T.aotearoenseSCUT27△ldh/ΔS种子液于超净工作台内按10％(v/v)的接种量接种到含有木糖和发酵培养基的血清瓶中，在55℃、150rpm条件下摇瓶发酵，发酵结束取样，检测菌体密度、底物消耗和产物的生成。
发酵结果如表2所示，添加30mg/L DL-甲硫氨酸对菌株T.aotearoenseSCUT27Δldh/ΔS木糖发酵性能的提升效果与30mg/L L-甲硫氨酸基本一致，因此，可以选用价格更为低廉DL-甲硫氨酸来替代L-甲硫氨酸。继续增加DL-甲硫氨酸的浓度至60mg/L，菌株的发酵性能反而降低，可能是过量的DL-甲硫氨酸对菌体产生一定的毒害作用。
表2 不同构型甲硫氨酸对嗜热厌氧杆菌SCUT27Δldh/ΔS木糖发酵性能的影响
Figure BDA0002167387770000072
实施例4：不同添加剂对T.aotearoenseSCUT27△ldh/△S利用木糖发酵产乙醇的性能及培养基成本比较
摇瓶发酵测试：将活化扩大培养后的T.aotearoenseSCUT27△ldh/ΔS种子液于超净工作台内按10％(v/v)的接种量接种到含有木糖和发酵培养基的血清瓶中，在55℃、150rpm条件下摇瓶发酵，发酵结束取样，检测菌体密度、底物消耗和产物的生成。
结果如表3所示，嗜热厌氧杆菌在添加4g/L酵母粉与2g/L蛋白胨、30mg/L L-甲硫氨酸以及30mg/L DL-甲硫氨酸的发酵培养基中的发酵性能无显著差异，但是与对照相比(无任何添加剂)发酵性能均显著提高。所有添加剂中，DL-甲硫氨酸价格最低，与4g/L酵母膏与2g/L胰蛋白胨相比，添加剂成本降低200倍。
表3 不同添加剂对T.aotearoenseSCUT27△ldh/△S利用木糖发酵产乙醇的性能及成本比较
Figure BDA0002167387770000081
注:产品价格信息来源于试剂生产厂家网址，其中酵母膏和蛋白胨购自英国Oxoid，L-甲硫氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司，DL-甲硫氨酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例5：DL-甲硫氨酸对T.aotearoenseSCUT27△ldh/△S木糖发酵产乙醇的影响
5L发酵罐测试：将活化扩大培养后的T.aotearoenseSCUT27△ldh/ΔS种子液按10％(v/v)的接种量接种到含有木糖和发酵培养基的5L发酵罐内，在55℃、150rpm、pH＝6.5条件下进行发酵，定时取样检测菌体密度、底物消耗和产物的生成。
发酵结果如表4所示，添加30mg/LDL-甲硫氨酸对菌株T.aotearoenseSCUT27Δldh/ΔS木糖发酵性能的提升效果显著。例如，木糖消耗量和利用速率分别提高34％和46％，目标产物乙醇的浓度、得率和生产强度分别提高55％、19％和65％。
表4 DL-甲硫氨酸对T.aotearoenseSCUT27△ldh/△S木糖发酵产乙醇的影响
Figure BDA0002167387770000082
Figure BDA0002167387770000091
综上所述，在培养基中添加低浓度(≤30mg/L)的L-或DL-甲硫氨酸或/和通过代谢工程手段强化其甲硫氨酸转运(敲除甲硫氨酸转运基因metNPQ前端核糖开关基因)和/或生物合成途径，可以显著提高嗜热厌氧杆菌的发酵性能，同时免去培养基中昂贵的营养素(酵母膏和胰蛋白胨)的添加，有助于降低发酵成本、提升其经济可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应在本发明的保护范围内。
  序列表
<110>  华南理工大学
<120>  一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法
<160>  1
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  100
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
tcttatccag agaggtggag ggactggccc gatgaaaccc ggcaaccggc acgtatgtgc  60
aatggtgcca attcctgcag cgattgctga gagatgagag                       100

Claims (8)

1.一种提高嗜热厌氧杆菌发酵性能的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense）在种子培养基中活化，制备成种子液；
(2)以葡萄糖和/或木糖为碳源，以甲硫氨酸为添加剂替代酵母膏和胰蛋白胨，配制发酵培养基，并经过除菌；
(3) 将步骤 (1)种子液接种于步骤 (2)制得的发酵培养基中，进行厌氧发酵即可；
所述嗜热厌氧杆菌为Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27或其代谢途径改造的工程菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜热厌氧杆菌代谢途径改造的工程菌为T.aotearoenseSCUT27△ldh或在其基础上敲除甲硫氨酸转运相关基因前端调节序列S-box构建的工程菌；所述敲除甲硫氨酸转运相关基因前端调节序列S-box为甲硫氨酸转运基因metNPQ前端核糖开关基因，所得工程菌为T.aotearoenseSCUT27△ldh/△S。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲硫氨酸浓度为10-30 mg/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲硫氨酸为L-甲硫氨酸、D-甲硫氨酸或DL-甲硫氨酸。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述种子培养基为MTC液体培养基，步骤（3）发酵培养基为改良MTC液体培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述MTC液体培养基包括如下成分，A液：碳源5-100；B液：柠檬酸三钾盐0.1-6.25，一水柠檬酸0.1-3，硫酸钠0.1-5，磷酸二氢钾0.1-5，碳酸氢钠0.1-12.5；C液：尿素0.1-25，氯化铵0.1-7.5；D液：六水氯化镁0.1-5，四水氯化亚铁0.1-0.5，二水氯化钙0.1-1，一水半胱氨酸盐酸0.1-5；E液：二盐酸吡哆胺0.001-0.1，对氨基苯甲酸0.001-0.02，D-生物素0.001-0.01，维生素B12为0.001-0.01，维生素B1为0.001-0.02；单位g/L；所述改良MTC液体培养基为在上述MTC液体培养基中添加甲硫氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述除菌是指A、B、C和D液在115-121oC条件下灭菌15-30 min，E液用0.22μM微孔滤膜过滤除菌。
8.根据权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于，种子液的接种量为5-15%（v/v）；厌氧发酵的条件为：温度为40-70oC，培养12~28 h，pH为3.5-8，转速为100-300 rpm。
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