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CN110467674A - 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途 Download PDF

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CN110467674A
CN110467674A CN201910374787.0A CN201910374787A CN110467674A CN 110467674 A CN110467674 A CN 110467674A CN 201910374787 A CN201910374787 A CN 201910374787A CN 110467674 A CN110467674 A CN 110467674A
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Abstract

本申请提供了针对肿瘤坏死因子受体超家族的成员4(TNFRSF4)(也称为OX40和CD134)的全人单克隆抗体。本申请还提供了使用人源化转基因大鼠产生杂交瘤的方法、编码抗OX40抗体的核酸分子、用于表达抗OX40抗体的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了用于体外验证抗体功能和体内抗体功效的方法。本发明的抗体提供了用于通过调节人免疫功能治疗多种癌症的非常有效的药剂。

Description

抗OX40的全人抗体及其制备方法和用途
优先权信息
本申请要求2018年5月11日提交的PCT申请号PCT/CN2018/086574和2018年5月29日提交的中国申请号201810529840.5的优先权。
序列表
本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请一般而言涉及抗体。更具体地，本申请涉及抗OX40的全人单克隆抗体、其制备方法及其用途。
发明背景
来自临床前和临床结果的越来越多的证据表明，靶向免疫检查点正在成为治疗癌症患者的最有前途的方法。肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，也称为OX40、CD134和ACT35)是免疫检查点蛋白之一，其通过增强T细胞受体信号传导并导致其活化而在T细胞功能中起着主要作用。
OX40主要由活化的CD4+和CD8+T细胞、记忆T细胞、调节性T(Treg)细胞和天然杀伤(NK)细胞表达。活化的T细胞上表达的OX40与在抗原呈递细胞上表达的其配体(OX40L)的相互作用显著促进T细胞活化、增殖和迁移、增加效应T细胞的存活，增强生发中心形成和树突细胞成熟。另外，OX40信号传导可抑制Treg的分化和扩增，拮抗诱导型Tregs的产生并阻断Treg抑制功能。已经在多种临床前小鼠肿瘤模型和临床试验中证明了OX40的激动剂是治疗癌症和感染性疾病的颇有前景的策略。制药公司诸如MedImmune,GlaxoSmithKline(GSK),Pfizer和Incyte已经开发了靶向OX40的多种激动性药剂。在晚期癌症患者的I期临床试验中使用由MedImmune开发的靶向OX40的激动型鼠抗体(9B12，AgonOX)。用一个疗程的抗体“9B12”治疗的患者显示出可接受的毒性特征，并且在30位患者中的12位中至少有一个转移性病变发生消退。从机制上说，这种治疗增加了对报道抗原免疫(例如KLH)的T和B细胞应答，导致肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+FoxP3+Treg细胞上OX40的优先上调，并增加了黑色素瘤患者中T和B细胞的抗肿瘤反应性。GSK也在开发用于潜在治疗包括实体瘤和血液恶性肿瘤在内的癌症的GSK-3174998，其是通过与MD Anderson癌症中心合作鉴定出的一种人源化IgG1单克隆抗体，其激活T细胞表面上的OX-40。临床开发中的靶向OX40的其他药物包括Pfizer的全人IgG2激动剂抗体PF-04518600，其目前正在处于广谱恶性肿瘤的临床开发中；和Incyte的INCAGN-1949，其为抗OX40人IgG1抗体，具有最佳激动剂特性和选择性消耗肿瘤内调节性T细胞的能力，用于潜在地治疗癌症。
对于作为治疗剂的针对OX40的抗体存在一些改进的空间。作为抗共刺激受体的激动剂，毒性可能是最受关注的问题，例如细胞因子风暴，这限制了临床应用。此外，目前在临床试验中测试的抗OX40抗体是人-小鼠嵌合或人源化抗体，由于小鼠来源的蛋白质序列而产生的高免疫原性降低了功效。全人抗体克服了这些缺点，并且在体内显示出更高的效率和更低的毒性。
在本发明中，通过利用我们专有的杂交瘤技术，我们已经产生了针对OX40的全人抗体。本发明的抗体具有高结合亲和力；特异性结合人和猴OX40蛋白；并有效地调节免疫应答，包括增强T细胞增殖和增加细胞因子IFN-γ和白细胞介素-2的产生以及削弱Treg细胞的抑制功能。
发明概述
本发明提供了广义而言，涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品的这些和其它目标。本发明提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。本发明提供了与人OX40结合的抗体，优选全人单克隆抗体。还提供了使用人源化大鼠产生杂交瘤的方法，编码抗OX40抗体的核酸分子，用于表达抗OX40抗体的载体和宿主细胞。本发明进一步提供了体外和体内验证抗体功能的方法。本发明的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗多种疾病(包括癌症)的有效药剂。
在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下性质：
(a)以1×10-8M或更低的KD结合人OX40；
(b)在CD4+T细胞中诱导细胞因子(例如，IL-2或IFN-γ)产生；
(c)增强原代人CD4+T细胞的增殖；
(d)在Treg细胞存在的情况下增强原代人CD4+T效应细胞的增殖；
(e)分别结合人或猕猴OX40；或
(f)对人CD40、CD137和CD271没有交叉反应性。
在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分结合OX40的CRD2和/或CRD3结构域。
在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：
(i)与如选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；
(ii)与如选自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和
(iii)与如选自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；
B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：
(i)与如选自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；
(ii)与如选自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和
(iii)与如选自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或
C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：
(i)选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的CDRH1，或与所述CDRH1在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的CDRH2，或与所述CDRH2在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和
(iii)选自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的CDRH3，或与所述CDRH3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3；
B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：
(i)选自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的CDLH，或与所述CDRL1在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的CDRL2，或与所述CDRL2在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和
(iii)选自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的CDRL3，或与所述CDRL3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；或
C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)包含SEQ ID NO:5、11、19、25或31的CDRH3；或
B)与如选自SEQ ID NO:5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；或
C)与(A)的CDRH3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3，
并且其中分离的抗体或其抗原结合部分以1×10-8M或更低的KD结合人OX40。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：1或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：3或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：5或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：2或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：4或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：6或由其组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：7或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：8或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：13或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：14或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：15或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：17或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：19或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：16或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：18或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：20或由其组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：21或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：23或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：25或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：22或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：24或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：26或由其组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：27或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：29或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：31或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：28或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：30或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：32或由其组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(A)重链可变区(VH)，其中：
(i)包含选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列；
(ii)包含与选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列相比具有一个或多个(如1－10个，1－5个，1－3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或
(B)轻链可变区(VL)，其中：
(i)包含选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列；
(ii)包含与选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列相比具有一个或多个(如1－10个，1－5个，1－3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明包含与上文所定义的分离的抗体或其抗原结合部分竞争结合同一表位的分离的抗体或其抗原结合部分。
在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。
在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子的载体。
在一些方面，本发明涉及包含如本文所公开的表达载体的宿主细胞。
在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
在一些方面，本发明涉及用于制备抗OX40抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分并从宿主细胞分离抗体或抗原结合部分。
在一些方面，本发明涉及调节受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答受到调节。
在一些方面，本发明涉及用于治疗受试者中的异常细胞生长的方法，其中包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
在一些方面，本发明涉及用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，其中包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
在一些方面中，本发明涉及用于减少受试者中的肿瘤细胞转移的方法，其中包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
在一些方面，本发明涉及用于削弱受试者中的Treg细胞的抑制功能的方法，其中包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
在一些方面，本发明涉及用于治疗或预防受试者中的疾病(包括增殖性病症(诸如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染性疾病)的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防疾病(包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染性疾病)的药物中的用途。
在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性疾病(包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染性疾病)的诊断剂中的用途。
在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防疾病(包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染性疾病)的用途。
在一些方面，本发明涉及使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的试剂盒或装置和相关方法，以及如本文所公开的药物组合物，其可用于治疗疾病(包括增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染性疾病)。为此，本发明优选提供可用于治疗此类病症的制品，其包含含有如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的容器以及用于使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分来治疗、改善或预防增殖性病症或其进展或复发的说明材料。
以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些概念的集合，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。
附图简述
图1显示PTM突变后抗OX40抗体1.62.3-u1-IgG1K的变体之间的比较的图。
图2显示结合人OX40转染的CHO-K1细胞的抗体的图。
图3显示结合活化的人CD4+T细胞的抗体的图。
图4显示与OX40L竞争性结合OX40的抗体的图。
图5显示结合猕猴OX40转染的293F细胞的抗体的图。
图6显示通过ELISA进行的抗OX40抗体对其它TNFR家族成员(包括人CD40、CD137和CD271)的家族交叉结合测试的结果的图。
图7A、7B和7C是显示针对基准抗体BMK1(图7A)、BMK7(图7B)和BMK10(图7C)的抗体的抗原表位竞争结合测试(epitope binning)的图。
图8A、8B和8C是显示使用游离抗体或通过表达CD32b的CHO-K1细胞或抗人IgG Fc试剂的FcγR交联，抗体对Jurkat细胞中OX40刺激的NFkB荧光素酶活性的影响的图。分别显示了(图8A)游离抗体或(图8B)F(ab')2山羊抗-人IgG或(图8C)表达CD32b的CHO-K1细胞交联的报道分子活性。
图9是显示抗体对抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞的IL-2分泌的作用的图。
图10是显示抗体对抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞的IFN-γ分泌的作用的图。
图11是显示抗体对抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞的增殖的作用的图。
图12是显示在Treg细胞存在的情况下抗体对CD3/CD28 Dynabeads诱导的原代人CD4+T效应细胞的增殖的作用的图。
图13A是显示活化的人CD4+T细胞上的OX40表达的图，图13B是显示过表达OX40的Jurkat细胞上的OX40表达的图。
图14A是显示OX40抗体对过表达OX40的Jurkat细胞的ADCC作用的图，图14B是显示OX40抗体对活化的人CD4+T细胞的ADCC作用的图。
图15A是显示OX40抗体对过表达OX40的Jurkat细胞的CDC作用的图,图15B是显示OX40抗体对活化的人CD4+T细胞的CDC作用的图。
图16是显示施用抗体1.134.9-u1-IgG1L后携带MC38肿瘤的小鼠的肿瘤生长的图。
图17是显示施用抗体1.134.9-u1-IgG1L后携带MC38肿瘤的小鼠的体重变化的图。
发明详述
虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。
通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6th ed.,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
定义
为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。
如本文所用，术语“抗体”或“Ab”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，其可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。在一些条件下，抗原结合片段包括Fab,Fab',F(ab')2,Fd,Fv,dAb和互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如scFv)，嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的此类多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的单克隆抗人OX40抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”或“全人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。
术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体的抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从对于另一物种的免疫球蛋白基因而言是转基因的动物分离的抗体，使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
如本文所用，术语“抗OX40抗体”或“OX40抗体”是指如本文所定义的能够与例如人OX40受体的OX40受体结合的抗体。
在本文中可互换使用的术语“OX40”、“OX40受体”、“OX40蛋白”、“肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)”或“CD134”是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。术语“OX40”可以包括人OX40受体，以及其变体、同工型和物种同源物。因此，如本文中所定义和公开的抗体或其抗原结合部分也可以结合来自除人外的物种的OX40，例如猕猴OX40。
如本文所用，术语“人OX40”是指人序列OX40，例如具有Genbank登录号CAE11757.1的人OX40的完整氨基酸序列。人OX40序列可以与Genbank登录号CAE11757.1的人OX40不同，例如在非保守区中具有保守的突变，并且OX40具有与Genbank登录号CAE11757.1的人OX40基本上相同的生物学功能。
如本文所用，术语“小鼠OX40”是指小鼠序列OX40，例如具有Genbank登录号CAA59476.1的小鼠OX40的完整氨基酸序列。
如本文所用，术语“猕猴OX40”是指猕猴序列OX40，例如具有Genbank登录号XP_001090870.1的猕猴OX40的完整氨基酸序列。
如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“KD”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如系统。
如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原例如OX40受体具有1×10-7M或更低，更优选5×10-8M或更低，甚至更优选1×10-8M或更低，甚至更优选5×10-9M或更低，甚至更优选1×10-9M或更低的KD的抗体。
如本文所用的术语“EC50”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC50的单位为“nM”。
如本文所用，术语“竞争结合”是指两种抗体在它们与结合靶标结合中的相互作用。如果在第二抗体存在的情况下第一抗体与其同源表位的结合相比于在第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合而言可检测地降低，则第一抗体与第二抗体竞争结合。相对的情况可以成立但不必如此，即在第一抗体存在的情况下第二抗体与其表位的结合也可检测地降低，但不必如此。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位的结合的情况下，无论是相同、更大还是更小程度，抗体均被认为彼此“交叉竞争”对它们各自的表位的结合。
如本文所用，“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子(例如人OX40和人抗OX40抗体)的结合至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。
如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境发生变化，或者物质与天然环境分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。
如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合OX40蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除OX40蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人OX40蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的OX40蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生目标蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿类动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞、酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，而且还涵盖这种细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后续世代中发生，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:AcademicPress；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysisin Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo etal,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。
如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。
如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人XO40基因转染入293F细胞。
如本文所用，术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例5和U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，Calif.)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FLa)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Colo.)的MoFlo。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。
术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。
如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。
本文在治疗病情的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。
如本文所用，术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗OX40相关疾病或病症联合使用时，“有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。
如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”，“防治”或“防止”是指预防或延迟所述疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。
抗OX40抗体
在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。
在本申请的上下文中，“抗体”可以包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化和灵长类动物化抗体，CDR移植抗体，人抗体，重组产生的抗体，胞内抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，单价抗体，多价抗体，抗独特型抗体，合成抗体，包括其突变蛋白及变体；及其衍生物(包括Fc融合蛋白和其他修饰)，以及任何其他免疫反应性分子，只要其表现出与OX40蛋白的优先缔合或结合。此外，除非上下文另外规定，否则该术语还包括所有类别的抗体(即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是人单克隆抗体。
人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。一种技术是噬菌体展示，其中在噬菌体上合成(优选人)抗体文库，用感兴趣的抗原或其抗体结合部分筛选文库，并分离结合抗原的噬菌体，从其中可以获得免疫反应性片段。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域众所周知的，并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参见例如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991))。
人抗体还可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活并且已引入人免疫球蛋白基因的小鼠)中来制备。在攻击时，观察到人抗体产生，其与在人中各方面观察到的非常相似，包括基因重排、装配和抗体库。这种方法例如描述于美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和关于技术的美国专利6,075,181和6,150,584；和Lonbergand Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)中。或者，可以通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(这样的B淋巴细胞可以从患有肿瘤性疾病或者可能已经在体外被免疫的个体中获得)的永生化来制备人抗体。参见例如Cole等人,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；和U.S.P.N.5,750,373。
单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术来制备，包括杂交瘤技术，重组技术，噬菌体展示技术，转基因动物(例如)或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤和本领域公认的生物化学和遗传工程技术来生产单克隆抗体，如详细描述于An,Zhigiang(ed.)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,JohnWiley and Sons,1st ed.2009；Shire et.al.(eds.)Current Trends in MonoclonalAntibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC,1sted.2010；Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,2nd ed.1988；Hammerling,等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中，每篇文献在此全部引入作为参考。应该理解，可以进一步改变选定的结合序列，例如以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。在一个优选的实施方案中，通过使用杂交瘤来制备抗人OX40单克隆抗体。
产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了获得产生本发明抗体例如本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞并将其融合至合适的永生化细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。就抗原特异性抗体的产生筛选产生的杂交瘤。杂交瘤的产生在本领域中是众所周知的。参见例如Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Publications,New York。
产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生
本发明的抗体还可以在宿主细胞转染瘤中使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)来产生。在一个实施方案中，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，使得所述基因可操作地连接于转录和翻译调节序列。在此上下文下，术语“可操作地连接”意在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。
术语“调控序列”旨在包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子；还有，由不同来源的序列组成的调控元件，如SRa启动子系统，其包含来自SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复序列的序列(Takebe等人(1988)MoI.Cell.Biol.8:466-472)。表达载体和表达控制序列被选择为与使用的表达宿主细胞相容。
可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同或不同的表达载体中。在一些实施方案中，可变区用于通过将其插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段和VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择导入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物(例如G418，潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖转染等。可以在原核或真核宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞(其可以装配和分泌适当折叠和免疫活性的抗体)中表达本发明的抗体。
用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括与DHFR选择标记(例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol.159:601-621中所述的)一起使用的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr CHO细胞)，NSO骨髓瘤细胞，COS细胞和SP2细胞。特别地，为了与NSO骨髓瘤一起使用，另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达的时间段或将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中来产生抗体。使用标准蛋白质纯化方法可从培养基中回收抗体。
具有某些性质的抗OX40抗体
本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或性质。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下性质：
(a)以1×10-8M或更低的KD结合人OX40；
(b)诱导CD4+T细胞中细胞因子(例如，IL-2或IFN-γ)的产生；
(c)增强原代人CD4+T细胞的增殖；
(d)在Treg细胞存在的情况下增强原代人CD4+T效应细胞的增殖；
(e)分别结合人或猕猴OX40；或
(f)对人CD40、CD137和CD271没有交叉反应性。
本发明的抗体以高亲和力结合人OX40。本发明的抗体与OX40的结合可以使用本领域中充分建立的一种或多种技术，例如ELISA来评估。本发明抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达OX40蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人OX40的细胞系例如已经转染以在其细胞表面上表达OX40的CHO细胞反应。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然OX40的抗CD3-刺激的CD4+活化T细胞。另外或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd值)。其他合适的结合分析包括ELISA分析，例如使用重组OX40蛋白。例如，本发明的抗体以1×10-8M或更低的KD结合人OX40蛋白，以1×10-9M或更低的KD结合人OX40蛋白，以5×10-10M或更低的KD结合人OX40蛋白，以2×10-10M或更低的KD结合人OX40蛋白，以1×10-10M或更低的KD结合人OX40蛋白，以5×10-11M或更低的KD结合人OX40蛋白，以3×10-11M或更低的KD结合人OX40蛋白，或以2×10-11M或更低的KD结合人OX40蛋白。
包含与特定序列具有序列同一性的CDR的抗OX40抗体
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：
(i)与如选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；
(ii)与如选自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和
(iii)与如选自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；
B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：
(i)与如选自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；
(ii)与如选自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和
(iii)与如选自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或
C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。
除非另有说明，否则将氨基酸分配给每个CDR可以根据以下提供的编号方案之一：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242；Chothia等人,1987,PMID:3681981；Chothia等人,1989,PMID:2687698；MacCallum等人,1996,PMID:8876650；或Dubel,Ed.(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,3rd Ed.,Wily-VCHVerlag GmbH and Co.。
抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann andDubel,eds.,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547,也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat的Abysis数据库网站获得。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
在其他实施方案中，CDR氨基酸序列可与上述相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。作为说明性实例，抗体可包含与如选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的CDRH1。
包含具有氨基酸添加、缺失和/或取代的CDR的抗OX40抗体
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：
(i)选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的CDRH1，或与所述CDRH1在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的CDRH2，或与所述CDRH2在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和
(iii)选自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的CDRH3，或与所述CDRH3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3；
B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：
(i)选自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的CDLH，或与所述CDRL1在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的CDRL2，或与所述CDRL2在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和
(iii)选自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的CDRL3，或与所述CDRL3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；或
C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分的CDR包含不超过1个氨基酸的保守取代。本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
包含CDR的抗OX40抗体
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：1的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：3的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：5的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：2的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：4的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：6的CDRL3。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)由SEQ ID NO：1组成的CDRH1；
(b)由SEQ ID NO：3组成的CDRH2；
(c)由SEQ ID NO：5组成的CDRH3；
(d)由SEQ ID NO：2组成的CDRL1；
(e)由SEQ ID NO：4组成的CDRL2；和
(f)由SEQ ID NO：6组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：7的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：9的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：11的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：8的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：10的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：12的CDRL3。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：(a)由SEQ ID NO：7组成的CDRH1；
(b)由SEQ ID NO：9组成的CDRH2；
(c)由SEQ ID NO：11组成的CDRH3；
(d)由SEQ ID NO：8组成的CDRL1；
(e)由SEQ ID NO：10组成的CDRL2；和
(f)由SEQ ID NO：12组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：13的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：9的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：11的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：14的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：10的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：12的CDRL3。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)由SEQ ID NO：13组成的CDRH1；
(b)由SEQ ID NO：9组成的CDRH2；
(c)由SEQ ID NO：11组成的CDRH3；
(d)由SEQ ID NO：14组成的CDRL1；
(e)由SEQ ID NO：10组成的CDRL2；和
(f)由SEQ ID NO：12组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：15的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：17的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：19的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：16的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：18的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：20的CDRL3。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)由SEQ ID NO：15组成的CDRH1；
(b)由SEQ ID NO：17组成的CDRH2；
(c)由SEQ ID NO：19组成的CDRH3；
(d)由SEQ ID NO：16组成的CDRL1；
(e)由SEQ ID NO：18组成的CDRL2；和
(f)由SEQ ID NO：20组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：21的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：23的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：25的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：22的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：24的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：26的CDRL3。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)由SEQ ID NO：21组成的CDRH1；
(b)由SEQ ID NO：23组成的CDRH2；
(c)由SEQ ID NO：25组成的CDRH3；
(d)由SEQ ID NO：22组成的CDRL1；
(e)由SEQ ID NO：24组成的CDRL2；和
(f)由SEQ ID NO：26组成的CDRL3。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：27的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：29的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：31的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：28的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：30的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：32的CDRL3。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)由SEQ ID NO：27组成的CDRH1；
(b)由SEQ ID NO：29组成的CDRH2；
(c)由SEQ ID NO：31组成的CDRH3；
(d)由SEQ ID NO：28组成的CDRL1；
(e)由SEQ ID NO：30组成的CDRL2；和
(f)由SEQ ID NO：32组成的CDRL3。
包含重链可变区和轻链可变区的抗OX40抗体
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(A)重链可变区(VH)，其中：
(i)包含选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列；
(ii)包含与选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或
(B)轻链可变区，其中：
(i)包含选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列；
(ii)包含与选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO：35的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：38的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO：39的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：40的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO：41的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：42的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在一个具体的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在其它实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列可以与上述各个序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。作为说明性实例，抗体可以包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列组成的重链可变区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重链可变区。
在一些进一步的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分可以包含重链和/或轻链的可变区中的氨基酸的保守取代或修饰。本领域理解的是，可以进行某些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell等人(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等人(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10:341-6and Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
如上所述，本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
表位竞争结合和表位作图
将进一步理解的是，所公开的抗体将与由所选择的靶或其片段呈递的离散表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在一些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在一些实施方案中，表位可以具有特定的三维结构特征和/或特异性电荷特性。因此，如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，抗体被认为特异性结合(或免疫特异性结合或反应)抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数(KD)小于或等于10-6M或者小于或等于10-7M时，更优选当KD小于或等于10-8M时，甚至更优选当KD小于或等于10-9M时，抗体被认为特异性结合抗原。
由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。在任何情况下，抗体表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常地至少5或8-10个氨基酸。
在这方面，应该理解的是，在一些实施方案中，表位可以与例如PD-1蛋白的一个或多个区域、结构域或基序结合或位于其中。类似地，本领域公认的术语“基序”将根据其通用含义使用，并且通常应该是指通常十至二十个连续氨基酸残基的蛋白质的短保守区域。
无论如何，一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽免疫。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可以阐明关于位于特定结构域或基序中的期望表位的信息。从这些信息中，有可能竞争性筛选与相同表位的结合的抗体。实现这一点的方法是进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争结合抗原。在WO 03/48731中描述了基于其交叉竞争对抗体进行竞争结合的高通量方法。竞争结合或结构域水平或表位作图包括抗体竞争或在酵母上的抗原片段表达的其他方法在本领域中是公知的。
如本文所用，术语“竞争结合”是指用于基于抗原结合特征和竞争对抗体进行分组或分类的方法。尽管这些技术对于定义和分类本发明的抗体是有用的，但是这些仓(bin)并不总是直接与表位结合，并且表位结合的这种初始测定可以通过本领域中和如本文所述的其他公认的方法进一步改进和确认。然而，可以理解的是，将抗体凭经验性地分配至各个仓提供了可以指示所公开的抗体的治疗潜力的信息。
更具体地，可以通过使用本领域已知和本文实施例中所示的方法确定选定的参考抗体(或其片段)是否结合相同的表位或与第二测试抗体交叉竞争结合(即，在相同的仓内)。
其他相容的表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体，肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)(特别地通过引用整体并入本文)或肽切割分析。另外，可以使用诸如抗原的表位切除，表位提取和化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science9：487-496)(特别地通过引用整体并入本文)。
编码本发明抗体的核酸分子
在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。
本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。
通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat等(1991)，同上)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，但更优选是IgG1或IgG4恒定区。
通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等，同上)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一DNA片段例如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段连接成使得两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区的核酸序列。
在一些具体的实施方案中，分离的核酸分子编码分离的抗体的重链可变区并且包含选自以下的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43所示的重链可变区的核酸序列；
(B)如SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示的核酸序列；或
(C)在高度严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
例如，核酸分子由SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55组成。或者，核酸分子与SEQ IDNO：45、47、49、51、53或55共有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些具体实施方案中，同一性百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。
在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的轻链可变区的核酸序列。
在一些具体的实施方案中，分离的核酸分子编码分离的抗体的轻链可变区，其包含选自以下的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO：34、36、38、40、42或44所示的轻链可变区的核酸序列；
(B)如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的核酸序列；或者
(C)在高度严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
例如，核酸分子由SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56组成。或者，核酸分子与SEQ IDNO：46、48、50、52、54或56共有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些具体实施方案中，同一性百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。
示例性的高严格条件包括在45℃下在5X SSPE和45％甲酰胺中杂交，并在65℃在0.1X SSC中进行最终洗涤。本领域中应理解，可通过改变温度和缓冲液或盐浓度来实现等同严格度的条件，如Ausubel等人(编辑),Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1994),第6.0.3至6.4.10页中所述。可以基于探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比，凭经验确定或精确计算杂交条件中的改变。可如Sambrook等人(编辑)，Molecular Cloning:A laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,New York(1989)，第9.47至9.51页中所述计算杂交条件。
药物组合物
在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
组合物的组分
药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗OX40抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液，或右旋糖和乳酸林格注射液、非含水媒介物例如植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂、等渗剂例如氯化钠或葡萄糖、缓冲剂例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂、抗氧化剂例如硫酸氢钠、局部麻醉剂例如盐酸普鲁卡因、悬浮剂和分散剂例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化剂例如聚山梨酯80(TWEEN-80)、隔离试剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可将用作载体的抗微生物剂添加到包含酚类或甲酚类、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
施用、制剂和剂量
本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。
用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。
适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。
施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。
本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。
通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在某些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。
无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。
在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。
在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。
用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，ADC浓度将包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。
本发明的应用
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如OX40的检测或免疫应答的增强。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被调节，例如被增强、刺激或上调。
优选的受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适用于治疗具有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将抗OX40抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如携带肿瘤或病毒的受试者)。当抗OX40的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。
本发明进一步提供了用于检测样品中人OX40抗原的存在或测量人OX40抗原的量的方法，包括在允许抗体或其部分与人OX40之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与特异性结合人OX40的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间的差异复合物形成表明样品中存在人OX40抗原。此外，本发明的抗OX40抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人OX40。
治疗包括癌症在内的病症
在一些方面，本发明提供了治疗哺乳动物中的病症的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如人)施用治疗有效量的本文所公开的抗体或其抗原结合部分。例如，所述病症是癌症。
可以使用本公开提供的方法治疗或预防各种涉及OX40的癌症，无论是恶性的还是良性的，以及无论是原发性的还是继发性的。所述癌症可以是实体癌症或血液恶性肿瘤。此类癌症的实例包括肺癌例如支气管癌(例如鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌例如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤、软骨瘤(condromas)、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤因氏瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、血管母细胞瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如结肠癌、平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂肪瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液癌如急性淋巴细胞性(淋巴母细胞性)白血病、急性髓性(髓细胞性、髓系、成髓细胞性、骨髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞白血病)、慢性髓细胞性(髓性、髓系、粒细胞性)淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、蕈样真菌病和骨髓增殖性疾病(包括骨髓增生性疾病如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、血小板增多症和慢性髓细胞性白血病)；皮肤癌如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卡波西氏肉瘤和佩吉特氏病；头颈癌；与眼相关的癌症如视网膜母细胞瘤和眼内黑色素瘤；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈的癌症(宫颈癌)、卵巢的癌症(卵巢癌)、外阴癌、阴道癌、输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状、滤泡状、间变性或髓质癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是结肠癌。
在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于B细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中等等级/滤泡NHL；中等等级弥散性NHL；高等级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非裂解细胞NHL；庞大疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)白血病；毛细胞白血病；慢性骨髓母细胞性白血病；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的)、B细胞增殖性疾病和麦格氏综合征。更多具体的实例包括但不限于复发性或难治性NHL、前线低级NHL、III/IV期NHL，化疗耐受性NHL、前体B淋巴母细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结节边缘区-MALT淋巴瘤、结节边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低度/滤泡性淋巴瘤、中度/滤泡性NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡)、中度弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、侵袭性NHL(包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或难治性NHL(NHL relapsing after or refractory to autologous stem cell transplantation)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高度免疫母细胞性NHL、高度淋巴母细胞NHL、高度小非裂解细胞性NHL、庞大疾病NHL、伯基特淋巴瘤、前体(外周)大颗粒淋巴细胞性白血病、蕈样肉芽肿病和/或塞扎里综合征、皮肤(皮肤的)淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。
在一些实施方案中、癌症的实例还包括但不限于B细胞增殖性病症，其还包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的非裂解细胞性淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤、散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)、结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和/或j)霍奇金氏病。
在一些其他实施方案中，所述病症是自身免疫性疾病。可用抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎。抗体或其抗原结合部分还可用于治疗或预防感染性疾病、炎症性疾病(例如过敏性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。
免疫应答的刺激
在一些方面，本发明还提供增强(例如刺激)受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，以使受试者中的免疫应答增强。例如，受试者是哺乳动物。在一个具体的实施方案中，该受试者是人。
术语“增强免疫应答”或其语法变化意味着刺激、诱发、增加、改善或增强哺乳动物免疫系统的任何反应。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，例如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是一级或二级免疫应答。增强免疫应答的实例包括增加的CD4+辅助T细胞活性和细胞溶解性T细胞的产生。可以使用本领域技术人员已知的许多体外或体内测量来评估免疫应答的增强，所述测量包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定、细胞因子释放(例如IL-2产生或IFN-γ产生)、肿瘤消退、携带肿瘤的动物的存活、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标志物的表达和细胞毒性。通常地，本公开的方法当与未治疗的哺乳动物或没有使用本文公开的方法治疗的哺乳动物的免疫应答相比，增强了哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分用于增强人对微生物病原体(例如病毒)的免疫应答。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分用于增强人对疫苗的免疫应答。在一个实施方案中，该方法增强细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。在另一个实施方案中，细胞免疫应答是T辅助细胞应答。在又一个实施方案中，免疫应答是细胞因子产生，特别是IFN-γ产生或IL-2产生。抗体或其抗原结合部分可用于增强人对微生物病原体(例如病毒)或疫苗的免疫应答。
抗体或其抗原结合部分可以作为单一疗法单独使用，或者可以与化学疗法或放射疗法组合使用。
与化疗组合使用
抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。
术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在某些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在某些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。
为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。
可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗-雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
与放射疗法组合使用
本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。
诊断
本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展，包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或报道分子。
在一些实施方案中，抗体与样品中特定细胞的结合可表示样品可能含有致瘤细胞，从而表明具有癌症的个体可用本文所述的抗体有效治疗。
可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞术测定法。兼容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术，例如本领域技术人员已知的磁共振成像，计算机化断层摄影(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如PET扫描)，放射线照相术，超声波等。
药物包装和试剂盒
还提供了包含包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在某些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。
本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。
更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。
如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。
序列表概述
本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A、B和C提供了所包含的序列的概述。
如本文所公开的六种说明性抗体是全人抗OX40单克隆抗体，分别称为“1.62.3-u1-IgG1K”、“1.62.3-u1-3-IgG1K”、“1.7.10-u1-IgG1K”、“1.134.9-u1-IgG1L”、“1.186.19-u1-IgG1K”和“1.214.23-u1-IgG1K”。
表A
CDR氨基酸序列
表B
可变区氨基酸序列
表C
可变区核苷酸序列
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例并不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
实施例1
材料的制备
1.1免疫原的产生
由Sangon Biotech合成编码OX40蛋白的胞外结构域(ECD)的cDNA(GenBank refCAB96543.1)，并将其插入经修饰的表达载体pcDNA3.3(ThermoFisher)中。大规模制备质粒DNA，并通过测序验证插入的DNA序列。通过将人OX40ECD基因转染入Freestyle 293F(ThermoFisher)或Expi-293F细胞(ThermoFisher)来获得与人Fc或His标签偶联的融合蛋白OX40ECD。5天后，从瞬时转染的细胞培养物中收获上清液。对融合蛋白进行纯化和定量以用于免疫和筛选。
1.2基准抗体的生产
在实施例中使用四种基准抗体即BMK1、BMK5、BMK7和BMK10作为阳性对照。根据美国专利第US8236930B2号(Pfizer)的11D4的克隆合成BMK1。根据美国专利申请第US20140308276号(University of Texas System)的106-222的克隆合成BMK5。根据PCT公开第WO2016057667号(MedImmune)的OX40mAb24的克隆合成BMK7。根据PCT公开第WO2015153513号(Genentech)的1A7.gr1的克隆合成BMK10。
1.3建立稳定的细胞系
为了获得用于抗体筛选和验证的工具，我们产生了OX40转染细胞系。简而言之，根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000或PlasFect转染试剂盒用含有全长OX40基因的经修饰的表达载体pcDNA3.3转染CHO-K1或293F细胞。在转染48-72小时后，将转染的细胞在含有杀稻瘟菌素的培养基中培养以供筛选。随着时间推移，这将筛选具有稳定地整合至其基因组DNA中的表达质粒的细胞。同时检查细胞的OX40表达。一旦表达被证实，则单个目标克隆通过有限稀释挑选并扩大到大量。然后将所建立的单克隆细胞系维持在含有杀稻瘟菌素的培养基中培养。
实施例2
抗体杂交瘤的产生
2.1免疫和细胞融合
使用OMT大鼠制备针对OX40的全人单克隆抗体，其包含可用于具有人独特型的功能性免疫球蛋白的最佳产生的嵌合多核苷酸。如PCT公开WO2014/093908中所述，该大鼠品系携带人重链和轻链转基因。为了产生针对OX40的全人单克隆抗体，用磷酸铝(Alum-Phos)作为佐剂混合20μg人OX40 ECD蛋白在足垫部位免疫6-8周龄的OMT大鼠，并将TiterMax混合20μg人OX40 ECD蛋白皮下注射用于第一次加强，并用Alum-Phos和TiterMax混合人OX40ECD蛋白每两周重复免疫。每1或2周通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清抗体滴度。当血清抗体效价足够高时，用无佐剂的DPBS混合40μg人OX40 ECD蛋白质对大鼠进行最终加强免疫。细胞融合如下进行：准备骨髓瘤细胞SP2/0，在融合前一周将骨髓瘤细胞解冻复苏，并且每天以1：2传代直到融合前一天，以保持细胞处于对数生长期。将从经免疫的OMT大鼠的淋巴结分离的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞(以1:1.1的比例)混合。将细胞混合物洗涤并以2x106个细胞/mL重悬浮于ECF溶液中，准备好进行ECF。在细胞电融合后，将来自融合室的细胞悬液立即转移至含有更多培养基的无菌管中，并在37℃培养箱中孵育至少24小时。将细胞悬液混合并转移到96孔板(1x104个细胞/孔)中。将96孔板在37℃，5％CO2下培养，并定期监测。当克隆足够大时，将100uL上清液从组织培养板转移到96孔测定板中用于抗体筛选。
2.2杂交瘤上清液的高通量筛选
使用ELISA作为第一筛选方法来测试杂交瘤上清液与人和猴OX40蛋白的结合。简而言之，将平板(Nunc)用1ug/mL的人或猕猴OX40 ECD的可溶性蛋白质在4℃包被过夜。在封闭和洗涤后，将杂交瘤上清液转移至包被的平板并在室温下孵育2小时。然后洗涤平板，随后用二抗(山羊抗-大鼠IgG HRP(Bethyl))孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止相互作用。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。
为了证实抗OX40抗体与细胞膜上表达的构象性OX40分子的天然结合，对OX40转染的细胞系进行流式细胞术(FACS)分析。将表达人OX40的293F细胞以1x105个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板(Corning)中。然后将杂交瘤上清液与细胞混合并在4℃下孵育1小时。在用1x PBS/1％BSA洗涤后，施用二抗山羊-抗大鼠Alexa647(Jackson ImmunoResearchLab)与细胞在4℃避光孵育半小时。然后洗涤细胞并重悬浮于1x PBS/1％BSA中或用4％多聚甲醛固定，并通过流式细胞术(BD)进行分析。将与未转染OX40的293F细胞系结合的抗体用作阴性对照。将使用Jurkat NFkB-萤光素酶报告T细胞测试抗体的生物活性用作第二筛选方法。简而言之，如上所述构建过表达人OX40/CD40融合蛋白的Jurkat NFkB-萤光素酶报告细胞。将细胞在含有10％FBS和0.5mg/mL潮霉素B(作为筛选)的完全RPMI1640培养基中培养。收集OX40Jurkat报道细胞并以4x 104个细胞/孔添加到96孔板中。向细胞中加入交联抗体F(ab')2山羊抗-大鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Lab)和RPMI 1640完全培养基稀释的杂交瘤上清液，然后将细胞在37℃，5％CO2中孵育过夜。第二天，将重构的萤光素酶底物(Promega)加入到每个孔(50μL/孔)并充分混合。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取萤光素酶强度。
2.3杂交瘤亚克隆：
一旦通过第一和确认筛选验证了特异性结合和生物活性，则将阳性杂交瘤细胞系用于亚克隆。简言之，对于每个杂交瘤细胞系，对细胞进行计数并稀释至每200μL克隆培养基中1个细胞的密度。将细胞悬液以200μL/孔接种到两个96孔板中。将平板在37℃，5％CO2下培养，直至它们准备好通过ELISA测定来检查。收集所选单克隆的耗尽上清液(ESN)，并纯化抗体以用于进一步表征。
实施例3
全人抗体分子的构建和纯化
3.1杂交瘤测序
使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)和Trizol试剂从单克隆杂交瘤细胞中抽提RNA。按如下方法扩增OX40嵌合抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。简言之，首先使用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，如下所述。
表1.cDNA扩增反应(20μL)
表2 cDNA扩增反应条件
步骤1 步骤2 步骤3 步骤4
温度 25 50 85 4
时间 10min 50min 5min ∞
将所得cDNA用作后续PCR扩增的模板，使用对目标基因特异的引物。PCR反应如下进行。
表3.PCR反应系统(50μL)
组分 用量
cDNA 2.0μL
Premix Ex Taq 25μL
5’-简并引物组(10pM) 2.5μL
3’-恒定区简并引物(10pM) 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O 19.5μL
表4.PCR反应条件
将PCR产物(10μL)插入到pMD18-T载体中；并将10μL连接产物转化入Top 10感受态细胞。将转化的细胞铺在2-YT+Cab平板上并培养过夜。使用M13-48和M13-47引物通过PCR检查阳性克隆，然后测序。
选择杂交瘤克隆1.7.10、1.62.3、1.134.9、1.186.19和1.214.23用于序列优化和进一步评估。
3.2抗体序列优化
通过将特定位点处的适当修饰引入编码抗体的核苷酸序列来进行抗体序列优化。根据制造商的方案，使用QuickChange诱变试剂盒通过定点诱变引入去除PTM(翻译后修饰)位点的突变。
杂交瘤克隆1.62.3重链的CDR1中的氨基酸NGG被鉴定为脱酰胺位点，因此设计反义诱变核苷酸以将以下突变引入“1.62.3-u1-IgG1K”重链：N至Q(NGG-QGG)、N至S(NGG-SGG)或G至A(NGG-NAG)。克隆1.62.3轻链的CDR1中的氨基酸C被鉴定为半胱氨酸残基，因此将半胱氨酸(C至S)突变为丝氨酸。通过测序验证所有的突变。
图1显示PTM突变后变体之间的比较。变体分别命名为抗体“1.62.3-u1-1-IgG1K”、“1.62.3-u1-2-IgG1K”和“1.62.3-u1-2-IgG1K”。抗体“1.62.3-u1-1-IgG1K”含有N至Q的突变，“1.62.3-u1-2-IgG1K”含有N至S的突变，“1.62.3-u1-3-IgG1K”含有G至A突变。
3.3全人抗体分子的构建和纯化
如上所述扩增OX40杂交瘤抗体的VH和VL。将合成基因重新克隆到经修饰的人IgG1表达载体pcDNA3.4(ThermoFisher)中以表达全人抗体。用载体瞬时转染Expi-293F细胞以用于抗体表达。收集含有抗体的培养上清液并使用蛋白A层析进行纯化。
全人单克隆抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K(序列优化的克隆命名为“1.62.3-u1-3-IgG1K”)、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K分别从杂交瘤克隆1.7.10、1.62.3、1.134.9、1.118.19和1.214.23杂交瘤获得。其序列概括于表A、B和C中。
实施例4
抗体表征
4.1通过表面等离子体共振(SPR)测试完整结合动力学亲和力
通过使用Biacore T200(GE)进行SPR测定来表征抗体针对OX40的亲和力和结合动力学。将抗人IgG抗体预固定到传感器芯片(CM5)上，并且当注射至芯片时捕获稀释于缓冲液(1×HBS-EP+，GE)中的抗OX40抗体。然后将不同浓度的人或猴OX40蛋白和缓冲液以30μL/min的流速流过传感器芯片，进行180s的缔合相，然后进行解离。使用BIAevaluation T200软件通过1：1Langmuir结合模型拟合结合和解离曲线。
实验结果显示于下表5中。
表5.通过SPR测定的针对人OX40的完全动力学结合亲和力
Abs ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M)
1.7.10-u1-IgG1K 8.60×10<sup>5</sup> 1.28×10<sup>-3</sup> 1.49×10<sup>-9</sup>
1.62.3-u1-IgG1K 5.26×10<sup>5</sup> 2.43×10<sup>-4</sup> 4.61×10<sup>-10</sup>
1.62.3-u1-3-IgG1K 6.97×10<sup>5</sup> 1.45×10<sup>-3</sup> 2.08×10<sup>-9</sup>
1.134.9-u1-IgG1L 2.07×10<sup>5</sup> 3.70×10<sup>-5</sup> 1.79×10<sup>-10</sup>
1.186.19-u1-IgG1K 3.90×10<sup>5</sup> 4.51×10<sup>-4</sup> 1.16×10<sup>-9</sup>
1.214.23-u1-IgG1K 4.26×10<sup>5</sup> 2.14×10<sup>-4</sup> 5.02×10<sup>-10</sup>
BMK7 2.44×10<sup>5</sup> 1.54×10<sup>-3</sup> 6.30×10<sup>-9</sup>
BMK10 4.42×10<sup>5</sup> 2.25×10<sup>-5</sup> 5.10×10<sup>-10</sup>
如表5所示，本发明的说明性抗体(包括1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K)以高特异性与人OX40结合，KD为1.79×10-10M至2.08×10-9M。
4.2通过流式细胞术测定的结合亲和力分析
将表达人OX40的CHO-K1细胞以5×104个细胞/mL的密度转移到96孔U形底板(Corning)中。将测试抗体在洗涤缓冲液(1x PBS/1％BSA)中以1:2梯度稀释，并与细胞在4℃下一起孵育1小时。加入二抗山羊抗-人IgG Fc FITC(3.2摩尔FITC/摩尔IgG，JacksonImmunoresearch Lab)并与细胞一起在4℃避光孵育半小时。然后洗涤细胞一次，重悬浮于1x PBS/1％BSA中并通过流式细胞术(BD)分析。基于定量小球QuantumTM MESF试剂盒(BangsLaboratories,Inc.)将荧光强度转化为每个细胞结合的分子数。使用Graphpad Prism5计算每种抗体的KD值。
将由流式细胞术测定的抗人OX40抗体针对表达人OX40的CHO-K1细胞的结合的数据显示于表6和图2中。数据证明说明性抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K对表达人OX40的CHO-K1细胞具有良好的结合效率。
表6.通过流式细胞术测试的抗-OX40抗体针对细胞表面人OX40的结合亲和力
Abs Bmax(M) K<sub>D</sub>(M)
1.134.9-u1-IgG1L 2.1×10<sup>-10</sup> 5.3×10<sup>-10</sup>
1.214.23-u1-IgG1K 1.7×10<sup>-10</sup> 6.7×10<sup>-11</sup>
BMK7 2.0×10<sup>-10</sup> 1.5×10<sup>-9</sup>
BMK10 1.8×10<sup>-10</sup> 2.3×10<sup>-10</sup>
如表6和图2中所示，抗体1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K以可与BMK7和BMK10相当或甚至高于其的高亲和力与细胞表面人OX40结合。
4.3抗OX40抗体与OX40的结合
基于细胞的FACS用于测试抗OX40抗体对OX40的结合活性。简而言之，将表达人OX40的CHO-K1细胞或活化的人CD4+T细胞以1x105个细胞/孔的密度转移到96孔U底板(Corning)中。将测试抗体在洗涤缓冲液(1x PBS/1％BSA)中连续稀释并与细胞一起在4℃下孵育1小时。在用1x PBS/1％BSA洗涤后，施用二抗山羊抗-人IgGFc-PE(JacksonImmunoResearch Lab)并与细胞一起在4℃避光孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬浮于1xPBS/1％BSA中或用4％多聚甲醛固定，然后通过流式细胞术(BD)分析。
图3显示了通过流式细胞术测定的抗OX40抗体对活化的人CD4+T细胞的结合的数据。数据显示说明性抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K以剂量依赖性方式与细胞表面人OX40结合。
4.4对配体与OX40的结合的竞争
使用基于ELISA的竞争测定来测试抗OX40抗体是否可竞争性阻断OX40与OX40配体(OX40L)的结合。简而言之，将酶标板(Nunc)在4℃用包被1μg/mL的人OX40 ECD过夜。将抗体在封闭缓冲液中梯度稀释并与恒定浓度的OX40L混合。封闭和洗涤后，将抗体/OX40L混合物加入酶标板中，然后在室温下孵育1小时。然后洗涤平板，随后用HRP偶联的二抗孵育1小时以检测OX40L与OX40 ECD的结合。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止相互作用。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取450nm和540nm处的吸光度。
如图4所示，说明性抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K与OX40L竞争地结合人OX40。
4.5直系同源物(物种交叉)结合测试
通过基于细胞的FACS测量抗OX40抗体与猕猴OX40的交叉反应性。简而言之，将表达猕猴OX40的293F细胞以2x105个细胞/孔的密度转移到96孔U形底板(Corning)中。将测试抗体在洗涤缓冲液(1x PBS/1％BSA)中梯度稀释并与细胞在4℃下孵育1小时。用1xPBS/1％BSA洗涤后，施用二抗山羊抗-人IgG Fc-PE(Jackson ImmunoResearch Lab)并与细胞一起在4℃避光孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬浮于1x PBS/1％BSA中或用4％多聚甲醛固定，然后通过流式细胞术(BD)分析。
如图5所示，说明性抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K与转染了猕猴OX40的293F细胞发生交叉反应性结合。
4.6同系物(家族交叉)结合
在4℃下将人OX40、CD40、4-1BB(CD137)和CD271 ECD包被在酶标板(Nunc)上过夜。封闭和洗涤后，将测试抗体在封闭缓冲液中稀释并加入酶标板并在室温下孵育1小时。然后洗涤酶标板，随后用二抗山羊抗-人IgG Fc-HRP(Bethyl)孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止相互作用。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取450nm和540nm处的吸光度。
通过ELISA测定的抗OX40抗体对人CD40、4-1BB(CD137)和CD271 ECD的家族交叉结合测试的结果显示于图6中。结果证明，OX40抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K特异性结合OX40(即，CD134)，并且不结合人CD40、CD137和CD271。
4.7针对BMK抗体的抗原表位竞争结合测试(epitope binning)
通过ELISA将抗OX40抗体的结合表位与基准抗体进行竞争结合。在4℃下将测试抗体包被在酶标板(Nunc)上过夜。封闭和洗涤后，将在封闭缓冲液中稀释的恒定浓度的人OX40蛋白加入酶标板并在室温下孵育1小时。然后将生物素化的基准抗体梯度稀释并加入到每个孔中并再孵育1小时。然后洗涤酶标板，随后加入二抗HRP偶联的链霉亲和素(LifeTechnology)孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物，并用2M HCl终止相互作用。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取450nm和540nm处的吸光度。
图7A、7B和7C分别显示了抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K针对基准抗体BMK1(图7A)、BMK7(图7B)和BMK10(图7C)的表位结合竞争情况。如图7A所示，抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K的表位与BMK1不同。如图7B和7C所示，抗体1.62.3-u1-IgG1K和1.134.9-u1-IgG1L的表位与BMK7和BMK10不同，而抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K的表位与BMK7和BMK10类似或接近。
4.8使用Jurkat NFkB-萤光素酶报告T细胞的生物活性测定
使用表达OX40/CD40融合蛋白和NFkB-萤光素酶报告基因的工程化Jurkat细胞系评估抗OX40抗体激活人OX40信号通路的能力。该实验检测了使用抗人IgG Fc试剂或表达人Fcγ受体的细胞交联的抗OX40抗体的生物活性。将Jurkat NFkB-萤光素酶报告细胞培养在含有10％FBS和0.5mg/mL潮霉素B(作为筛选)的RPMI 1640完全培养基中。
为了测定交联条件下抗OX40抗体的生物活性，使用表达CD32b的CHO-K1细胞或F(ab')2山羊抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch Lab)介导抗体交联，其聚集并活化在Jurkat报告细胞上的OX40受体。收集OX40 Jurkat报告细胞并加入到96孔板中。将在完全培养基中梯度稀释的OX40抗体在表达CD32b的CHO-K1细胞、亲本CHO-K1细胞或交联剂抗体存在的情况下加入到细胞中，并在37℃，5％CO2下孵育平板6小时或过夜。将重构的萤光素酶底物(Promega)加入到每个孔中并充分混合。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取萤光素酶强度。还测试了抗OX40抗体在游离条件下的生物活性。
图8A、8B和8C显示了使用游离抗体或通过表达CD32b的CHO-K1细胞或抗-人IgG Fc试剂的FcγR交联测试抗体对Jurkat细胞中OX40刺激的NFkB萤光素酶活性的影响。分别显示了(图8A)游离抗体或(图8B)被F(ab')2山羊抗-人IgG交联的抗体或(图8C)被表达CD32b的CHO-K1细胞交联的抗体的报告基因的活性。
如图8A、8B和8C所示，交联抗体可以有效激活OX40信号传导。
4.9通过基于细胞的测定法测试抗OX40抗体的体外功能
根据制造商的方案，使用人CD4+T Cell Enrichment试剂盒(StemCell)从人PBMC分离本实施例中使用的人CD4+T细胞。将细胞重悬浮于RPMI 1640完全培养基中。
4.9.1抗OX40抗体对白细胞介素2(IL-2)产生的影响
在该测定中，未经组织培养处理的平底96孔板(Corning)在4℃下用抗-CD3抗体预包被过夜。在实验当天，将平板用RPMI 1640完全培养基洗涤以去除未结合的抗体。将新鲜分离的人CD4+T细胞以1x105个细胞/孔的密度加入到每孔中，体积为100μL。然后将恒定浓度的交联抗体F(ab')2山羊抗-人IgG和梯度稀释的OX40抗体在100μL中混合，并加入到平板的每个孔中。将平板在37℃，5％CO2下培养3天，然后收获上清液通过ELISA测量IL-2的含量。
图9显示抗体对抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞的IL-2分泌的影响。证明了说明性抗体(包括1.7.10-u1-IgG1K,1.62.3-u1-IgG1K,1.134.9-u1-IgG1L,1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1K)增强了原代人CD4+T细胞的IL-2分泌能力。
4.9.2抗OX40抗体对细胞因子IFNγ分泌和CD4+T细胞增殖的影响
为了直接评估抗OX40抗体对增强IFNγ产生和CD4+T细胞增殖的作用，我们进行了通过OX40信号与CD3/T细胞受体(TCR)复合物的组合共同刺激人CD4+T细胞的测定。简言之，用100μL恒定浓度的抗CD3和不同浓度的抗OX40抗体的混合物预包被未经组织培养处理的平底96孔板(Corning)。将平板在4℃孵育过夜，然后用RPMI 1640完全培养基洗涤以去除未结合的抗体。将新鲜分离的人CD4+T细胞以1x105个细胞/孔的密度加入到每个孔中，体积为200μL。将平板在37℃，5％CO2下孵育3天，然后通过ELISA收获上清液用于IFNγ测量。收获细胞沉淀物按如下方法通过3H-胸苷测量CD4+T细胞增殖：以0.5μCi/孔将3H-胸苷(PerkinElmer)加入到细胞培养板中。将平板在37℃在5％CO2中培养16至18小时，然后使用Topcount NXT闪烁计数器(Perkin Elmer)测定增殖细胞中3H-胸苷的掺入情况。
图10显示了抗体对抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞的IFN-γ分泌的影响。证实了示例性抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1增强了原代人CD4+T细胞的IFN-γ分泌能力。
图11显示了抗体对抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞增殖的影响。证明了说明性抗体1.7.10-u1-IgG1K、1.62.3-u1-3-IgG1K、1.134.9-u1-IgG1L、1.186.19-u1-IgG1K和1.214.23-u1-IgG1增强了原代人CD4+T细胞的增殖能力。
4.9.3人抗OX40抗体对Tregs抑制性功能的影响
Tregs是T细胞的一个亚群，其是一种关键的免疫调节剂，在维持自我耐受中起着重要作用。有人提出CD4+CD25+调节性T细胞与肿瘤生长相关，因为在患有多种癌症的患者中发现Treg数量增加并且Treg数量增加与不良预后相关。为了直接评估抗OX40抗体对免疫抑制应答的作用，我们比较了在抗OX40抗体存在和不存在的情况下Treg的功能。使用特异性抗CD25微珠(StemCell)分离CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-效应T(Teff)细胞。将Teff细胞以1x105个细胞/50μL/孔接种，并以1x105个Treg/50μL/孔在96孔圆底平板(BD)中共培养。然后用在交联抗体以及抗OX40抗体存在的情况下以1个DC/10个Teff细胞用从单核细胞诱导的人同种异体树突细胞(DC)刺激细胞。无抗体或者同种型抗体被用作阴性对照。将共培养物在37℃，5％CO2下孵育5天。在第5天收集细胞沉淀以确定通过3H-胸苷掺入测量的Teff增殖。
图12显示在Treg细胞存在的情况下抗体对树突细胞诱导的原代人CD4+T效应细胞增殖的影响。通过逆转调节性T细胞的抑制功能，抗体1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K可以恢复CD4+CD25-T细胞增殖。
4.10 ADCC和CDC测试：
OX40在多种细胞类型上表达。为了评估它们触发Fc效应功能的能力，评估了抗OX40抗体是否可以对表达OX40的细胞诱导ADCC和CDC效应。
图13A显示活化的人CD4+T细胞上OX40的表达，图13B显示过表达OX40的Jurkat细胞上OX40的表达。
4.10.1 ADCC测试：
将表达OX40的Jurkat细胞或活化的人CD4+T细胞作为靶标，并将各种浓度的抗OX40抗体在96孔圆底平板(BD)中预孵育30分钟；然后以50:1的效应物/靶标比例加入同种异体PBMC作为效应物。将板在37℃，5％CO2下保持4小时。通过基于LDH的细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定靶细胞裂解。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取492nm处的吸光度。
图14A和14B分别显示OX40抗体对过表达OX40的Jurkat细胞(图14A)或活化的人CD4+T细胞(图14B)的ADCC作用。如图14A和14B所示，本发明的说明性抗体1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K对过表达OX40的Jurkat细胞和活化的人CD4+T细胞的ADCC作用较低。
4.10.2 CDC测试：
将表达OX40的Jurkat细胞或活化的人CD4+T细胞作为靶标，并将各种浓度的抗OX40抗体在96孔圆底平板(BD)中混合。以1:50的终稀释度添加人补体。将96孔板在37℃，5％CO2条件下孵育2小时。通过CellTiter-Glo(Promega)测定靶细胞裂解。使用微孔板读数仪(Molecular Device)读取发光。
图15A和15B分别显示OX40抗体对过表达OX40的Jurkat细胞(图15A)或活化的人CD4+T细胞(图15B)的CDC作用。如图15A和15B所示，本发明的说明性抗体1.134.9-u1-IgG1L和1.214.23-u1-IgG1K对过表达OX40的Jurkat细胞和活化的人CD4+T细胞的CDC作用较低。
4.11结构域作图
为了检查OX40抗体的结合结构域，使用一系列人/小鼠OX40嵌合变体。OX40抗体与人OX40特异性结合，而与小鼠OX40和人CD40没有交叉反应性，尽管它们的氨基酸(或者，在本文中称为“aa”)序列中分别共有60％和23％的同一性。简而言之，通过用相应的小鼠OX40(mPro1)氨基酸或人CD40氨基酸(hPro40)替换人OX40(hPro1)的胞外结构域的下列残基，构建了二十二个变体(命名为变体“x1”、“x2”...“x22”)。
·变体x1：xPro1.FL-x1：CRDmox40_1(将人OX40 aa 29至65用小鼠对应物替换)
·变体x2：xPro1.FL.x2：CRDmox40_2(将人OX40 aa 66至107用小鼠对应物替换)
·变体x3：xPro1.FL-x3：CRDmox40_3(将人OX40 aa 108至146用小鼠对应物替换)
·变体x4：xPro1.FL-x4：CRDmox40_4(将人OX40 aa 147至214用小鼠对应物替换)
·变体x5：xPro1.FL-x5：CRDmox40_1-2(将人OX40 aa 29至107用小鼠对应物替换)
·变体x6：xPro1.FL-x6：CRDmox40_2-3(将人OX40 aa 66至146用小鼠对应物替换)
·变体x7：xPro1.FL-x7：CRDmox40_3-4(将人OX40 aa 108至214用小鼠对应物替换)
·变体x8：xPro1.FL-x8：CRDmox40_1-3(将人OX40 aa 29至146用小鼠对应物替换)
·变体x9：xPro1.FL-x9：CRDmox40_2-4(将人OX40 aa 66至214用小鼠对应物替换)
·变体x10：xPro1.FL-x10：CRDmox40_1,2,4(将人OX40氨基酸29-107和147-214用小鼠对应物替换)
·变体x11：xPro1.FL-x11：CRDmox40_1,3,4(将人OX40氨基酸29至65和108至214用小鼠对应物替换)
·变体x12：xPro1.FL-x12：CRDhcd40_1(将人OX40 aa 29至65用人CD40 aa对应物替换)
·变体x13：xPro1.FL-x13：CRDhcd40_2(将人OX40 aa 66至107用人CD40 aa对应物替换)
·变体x14：xPro1.FL-x14：CRDhcd40_3(将人OX40 aa 108至146用人CD40 aa对应物替换)
·变体x15：xPro1.FL-x15：CRD hcd40_4(将人OX40 aa 147至214用人CD40 aa对应物替换)
·变体x16：xPro1.FL-x16：CRDhcd40_1-2(将人OX40 aa 29至107用人CD40 aa对应物替换)
·变体x17：xPro1.FL-x17：CRDhcd40_2-3(将人OX40 aa 66至146用人CD40 aa对应物替换)
·变体x18：xPro1.FL-x18：CRDhcd40_3-4(将人OX40 aa 108至214用人CD40 aa对应物替换)
·变体x19：xPro1.FL-x19：CRDhcd40_1-3(将人OX40 aa 29至146用人CD40 aa对应物替换)
·变体x20：xPro1.FL-x20：CRDhcd40_2-4(将人OX40 aa 66至214用人CD40 aa对应物替换)
·变体x21：xPro1.FL-x21：CRDhcd40_1,2,4(将人OX40 aa 29至107和147至214用人CD40 aa对应物替换)
·变体x22：xPro1.FL-x22：CRDhcd40_1,3,4(将人OX40 aa 29-65和108-214用人CD40 aa对应物替换)
将从“x1”到“x22”的二十二个变体克隆到pcDNA3.0载体中，并用于293F细胞转染。简而言之，用FreeStyle 293F培养基将293F细胞稀释至1x106个细胞/mL的密度，并将每孔3mL的等份加入到24孔板中。使用293fectin试剂(Life Technologies)进行转染。对于每次转染，将3μg DNA在150μL Opti-MEMI减少血清培养基(Life Technologies)中稀释，然后与在150μL Opti-MEMI减少血清培养基中预先稀释的6μL 293fectin试剂组合。将DNA/Lipofectamine混合物在25℃放置20分钟，然后加入到培养物中。转染48小时后通过流式细胞术分析转染的细胞。
通过流式细胞术分析抗体与嵌合OX40变体的结合。简言之，将1μg/mL抗体(但BMK10为2μg/mL)与表达嵌合OX40的转染293F细胞在4℃下孵育1小时，然后与3μg/mL山羊抗-人IgG Fc R-PE(Jackson ImmunoResearch Lab)在4℃下孵育40分钟。使用流式细胞仪分析细胞。
结果显示在下面的表7-9中。
表7.变体与OX40抗体的结合
表8.变体与基准抗体BMK1或BMK5的结合
表9.变体与基准抗体BMK7或BMK10的结合
表10显示了参与抗原结合的OX40的结构域(呈灰色着色的)。
表10.参与抗原结合的OX40的结构域(呈灰色着色的)
注：CRD表示富含半胱氨酸的结构域，其中“CRD1”是指人OX40的氨基酸29-65，“CRD2”是指人OX40的氨基酸66-107，“CRD3”是指人OX40的氨基酸108-146，“CRD4”是指人OX40的氨基酸147-214。
4.12 OX40抗体抑制人OX40转基因模型中MC38结肠癌的生长
该研究评估了抗体1.134.9-u1-IgG1L在OX40人源化B-hTNFRSF4小鼠中MC38结肠癌模型中的体内抗肿瘤功效。
OX40人源化B-hTNFRSF4小鼠购自Biocytogen Co.,Ltd。将小鼠饲养在恒定温度和湿度下的单独通气笼中，每笼5只动物。
将MC38细胞培养在37℃、5％CO2的条件下，培养基为含10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基。通过胰蛋白酶-EDTA处理将肿瘤细胞每周常规传代培养两次。收获处于指数生长期的细胞并计数以用于肿瘤接种。
每只小鼠在右侧腋下(侧面)用在0.1mL PBS中的MC38肿瘤细胞(3x105)皮下接种以形成肿瘤。当平均肿瘤体积达到65mm3时，将动物随机分组，然后开始治疗以进行效力研究。所有测试抗体和对照抗体通过腹腔内(IP)注射(每周两次(BIW)，持续三周(“BIW×3”))。表11中提供了详细信息。
表11
与研究中的动物处理、护理和治疗相关的所有程序均按照WuXi Apptec实验动物管理委员会(IACUC)批准的指导方针，遵循国际实验动物饲养评估及认证协会(AAALAC)来进行。在常规监测时，每天检查动物以评估肿瘤生长和治疗对正常行为诸如活动性、食物和水消耗(仅通过观看)、体重增加/减少(体重每天测量一次)、眼睛/毛发光泽消退的任何影响以及任何其它异常影响，如方案中所述的。根据每个亚组内的动物数量记录死亡和观察到的临床体征。
使用测径器以二维方式每周三次测量肿瘤尺寸，并且使用以下公式以mm3测量体积：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后将肿瘤尺寸用于计算T/C(％)值。使用下式计算相对肿瘤增殖率的T/C(％)：T/C％＝TRTV/CRTV x 100％(TRTV表示治疗组相对肿瘤体积；CRTV表示阴性对照相对肿瘤体积)。根据肿瘤测量值计算相对肿瘤体积，计算公式为：RTV＝Vt/V0，V0是治疗开始当天的平均肿瘤体积，Vt是一次测量的平均肿瘤体积，TRTV使用与CRTV同一天的数据。
使用公式：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100计算每个组的TGI；Ti是给定日的治疗组的平均肿瘤体积，T0是治疗第一天时治疗组的平均肿瘤体积，Vi是与Ti同一天时媒介物对照组的平均肿瘤体积，V0是治疗第一天时媒介物组的平均肿瘤体积。
提供了每个组在每个时间点的肿瘤体积的概括统计，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)。对在最佳治疗时间点获得的数据进行组间肿瘤体积差异的统计分析和药物相互作用分析。进行单因素ANOVA以比较三个或更多组之间的肿瘤体积。当获得显著的F统计量(治疗方差与误差方差的比率)时，使用Games-Howell检验进行组间比较；如果没有，则使用Dunnett-t(双侧)。所有数据均使用SPSS 17.0进行分析。p值小于0.05(p<0.05)被认为是统计学显著的。
实验数据示于表12和13以及图16和17中。
表12.在施用1.134.9-u1-IgG1L后具有MC38肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积随时间的变化
表13. 1.134.9-u1-IgG1L施用后第12天的肿瘤生长抑制率
可以看出，OX40抗体1.134.9-u1-IgG1L对携带MC38结肠癌的B-hTNFRSF4小鼠产生了显著的抗肿瘤活性，并且该荷瘤动物对本抗体有良好的耐受性。
4.13表位作图
为了检验OX40抗体的结合表位，对人OX40进行丙氨酸扫描实验，并且评价它们对抗体结合的影响。将人OX40上的丙氨酸残基突变为甘氨酸密码子，并将所有其他残基(除半胱氨酸残基外，并且基于OX40-OX40R复合物(PDB:2HEV)，溶剂可及表面积(solventaccessible surface area，SASA)<10(OX40氨基酸)(SASA>10设置为表面氨基酸))突变成丙氨酸密码子。对于人OX40细胞外结构域(ECD)的每个残基，使用两个连续的PCR步骤进行点氨基酸替换。使用编码人OX40的ECD和C端His标签的pcDNA3.3-OX40-ECD.His质粒作为模板，并使用一组诱变引物用于使用QuikChange闪电多位点定向诱变试剂盒(Agilenttechnologies,Palo Alto,CA)的第一步PCR。在突变链合成反应后，使用Dpn I内切酶消化亲本模板。在第二步PCR中，扩增由CMV启动子、OX40的胞外结构域(ECD)、His-标签和单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)聚腺苷酸化组成的线性DNA表达盒，并将其在293F细胞(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中在37℃瞬时表达，通过His标签定量ELISA进行量化。
将单克隆抗体1.134.9-u1-IgG1L(2μg/mL)包被在平板中用于ELISA结合测定。在与含有定量OX40突变体或人OX40-ECD.His蛋白质的上清液相互作用后，加入HRP缀合的抗His抗体(1:5000,GenScript-A00612,CHN)作为检测抗体。根据对照突变体的平均值将吸光度标准化。在设定了额外的结合倍数变化的临界值(<0.75)后，通过考虑结构域作图、表位作图和晶体结构(它们不包括起结构稳定性作用的氨基酸，如属于CRD3和CRD4的氨基酸)，鉴定了最终确定的表位残基。
OX40点突变对抗体结合的标准化变化倍数显示在表14中。通过考虑结构域作图、丙氨酸扫描(临界值：结合变化倍数<0.75，SASA>10)和晶体结构(PDB:2HEV)(它们不包括起结构稳定性作用的氨基酸，如属于CRD3和CRD4的氨基酸)，鉴定了热点残基。如表15所示，1.134.9-u1-IgG1L有8个热点位置。
表14.OX40点突变对抗体结合的标准化变化倍数
a结合的变化倍数是相对于一些沉默丙氨酸取代的结合。
表15. 1.134.9-u1-IgG1L的8个热点位置
变化倍数临界值<0.75,SASA>10。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
序列表
<110> 上海药明生物技术有限公司
<120> 抗人OX40的全人抗体及其制备方法和用途
<130> IDC196033
<150> PCT/CN2018/086574
<151> 2018-05-11
<150> CN201810529840.5
<151> 2018-05-29
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的HCDR1
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的LCDR1
<400> 2
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的HCDR2
<400> 3
Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的LCDR2
<400> 4
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的HCDR3
<400> 5
Glu Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的LCDR3
<400> 6
Gln Gln Val Asn Ser Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K的HCDR1
<400> 7
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K的LCDR1
<400> 8
Lys Ser Ser Gln Ser Val Val Phe Ser Ser Asn Asn Lys Ile Cys Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K 或 1.62.3-u1-3-IgG1K的HCDR2
<400> 9
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K 或 1.62.3-u1-3-IgG1K的LCDR2
<400> 10
Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K 或 1.62.3-u1-3-IgG1K的HCDR3
<400> 11
Asp Glu Trp Glu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K 或 1.62.3-u1-3-IgG1K的LCDR3
<400> 12
Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-3-IgG1K的HCDR1
<400> 13
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ala Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-3-IgG1K的LCDR1
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Ser Val Val Phe Ser Ser Asn Asn Lys Ile Ser Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的HCDR1
<400> 15
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的LCDR1
<400> 16
Gln Gly Asp Asn Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的HCDR2
<400> 17
Glu Ile Tyr His Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的LCDR2
<400> 18
Gly Arg Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的HCDR3
<400> 19
Ala Pro Gly Asp Trp Gly Gly Ser Pro Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 1.134.9-u1-IgG1L
<400> 20
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro Val Val
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的HCDR1
<400> 21
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的LCDR1
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的HCDR2
<400> 23
Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的LCDR2
<400> 24
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly
1 5
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的HCDR3
<400> 25
Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的LCDR3
<400> 26
Gln Gln Val Asn Ser Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的HCDR1
<400> 27
Gly Gly Ser Ile Ser Asn Arg Asn Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的LCDR1
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的HCDR2
<400> 29
Glu Ile Phe His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的LCDR2
<400> 30
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的HCDR3
<400> 31
Ser Phe Ala Val Ala Leu Asp Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的LCDR3
<400> 32
Gln Gln Leu Phe Ser Tyr Pro Ile Thr
1 5
<210> 33
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的VH
<400> 33
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的VL
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Asn Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K的VH
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Glu Trp Glu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K的VL
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Val Phe Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Ile Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-3-IgG1K的VH
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ala
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Glu Trp Glu Leu Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-3-IgG1K的VL
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Val Phe Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Ile Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 39
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的VH
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Gly Asp Trp Gly Gly Ser Pro Tyr Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的VL
<400> 40
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Asn Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Arg Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 41
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的VH
<400> 41
Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Val Asn Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的VH
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Phe His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Phe Ala Val Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的VL
<400> 44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Phe Ser Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的VH
<400> 45
caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtggta gtggtaacac catttactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggccgtat atttctgtgc gagagagaga 300
ggagcagctg gtacagggtg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.7.10-u1-IgG1K的VL
<400> 46
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gttaacagtt tcccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 47
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K的VH
<400> 47
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt aatggtggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaaac tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
gagtgggagc tacgggggtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 48
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-IgG1K的VL
<400> 48
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgttgta ttcagctcca acaataagat ctgcttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactggtc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagttct 300
ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-3-IgG1K的VH
<400> 49
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt aatgccggtt actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaaac tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagagat 300
gagtgggagc tacgggggtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 50
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.62.3-u1-3-IgG1K的VL
<400> 50
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgttgta ttcagctcca acaataagat cagcttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactggtc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagttct 300
ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 51
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的VH
<400> 51
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagt agttataact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga agggactgga gtggattggg gaaatctatc atggtgggaa caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccatg tcagtagaca actccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtat attactgtgc gagagccccc 300
ggggactggg gaggttcccc ctattttgac ttctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 52
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.134.9-u1-IgG1L的VL
<400> 52
ggttctgtgg tttcttctga actgactcag gaccctgctg tgtctgtggc cttgggacag 60
acagtcagga tcacatgcca gggagacaac ctcagaacct attatgcaag ctggtaccag 120
cagaagccag gacaggcccc tatacttctc atctatggta gaaacaagcg gccctcaggg 180
atcccagacc gattctctgg ctccagctcg ggaaacacag cttccttgac catcactggg 240
gctcaggcgg aagatgaggc tgcgtactac tgtaactccc gggacagcag tggtaatcct 300
gtggtattcg gcggagggac caagctgacc gtccta 336
<210> 53
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的VH
<400> 53
caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgggctggat ccgccaggct 120
ccagggcagg ggctggagtg ggtttcatac attagtggta gtggtaacac catttactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgacgac acggccgttt atttctgtgc gaaagagaga 300
ggagcagctg gtgcagggtg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 54
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.186.19-u1-IgG1K的VL
<400> 54
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaggtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacca ttgtcaacag gttaacagtt tcccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 55
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的VH
<400> 55
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60
acctgtgttg tctccggtgg ctccatcagc aatagaaact ggtggagttg ggtccgccag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctttc atagtgggaa caccaactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg cgtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaaggtga actctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gaaatccttt 300
gcagtggccc ttgactcctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.214.23-u1-IgG1K的VL
<400> 56
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca ggacattaac agttatttag cctggtgtca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcctctt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcactggatc tgggacagag ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag ctttttagtt acccgatcac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa a 321

Claims (45)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：
(i)与如选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的序列之一所示的CDRH1具有至少90％序列同一性的CDRH1；
(ii)与如选自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的序列之一所示的CDRH2具有至少90％序列同一性的CDRH2；和
(iii)与如选自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的序列之一所示的CDRH3具有至少90％序列同一性的CDRH3；
B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：
(i)与如选自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的序列之一所示的CDRL1具有至少90％序列同一性的CDRL1；
(ii)与如选自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的序列之一所示的CDRL2具有至少90％序列同一性的CDRL2；和
(iii)与如选自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的序列之一所示的CDRL3具有至少90％序列同一性的CDRL3；或
C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
A)一个或多个重链CDR(CDRH)，其选自以下的至少一个：
(i)选自SEQ ID NO：1、7、13、15、21和27的CDRH1，或与所述CDRH1在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH1；
(ii)选自SEQ ID NO：3、9、17、23和29的CDRH2，或与所述CDRH2在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH2；和
(iii)选自SEQ ID NO：5、11、19、25和31的CDRH3，或与所述CDRH3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRH3；
B)一个或多个轻链CDR(CDRL)，其选自以下的至少一个：
(i)选自SEQ ID NO：2、8、14、16、22和28的CDRL1，或与所述CDRL1在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL1；
(ii)选自SEQ ID NO：4、10、18、24和30的CDRL2，或与所述CDRL2在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL2；和
(iii)选自SEQ ID NO：6、12、20、26和32的CDRL3，或与所述CDRL3在氨基酸序列上相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的CDRL3；或
C)A)的一个或多个CDRH和B)的一个或多个CDRL。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：1或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：3或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：5或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：2或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：4或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：6或由其组成的CDRL3。
4.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：7或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：8或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。
5.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：13或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：9或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：11或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：14或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：10或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：12或由其组成的CDRL3。
6.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：15或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：17或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：19或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：16或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：18或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：20或由其组成的CDRL3。
7.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：21或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：23或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：25或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：22或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：24或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：26或由其组成的CDRL3。
8.根据权利要求1或2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：27或由其组成的CDRH1；
(b)包含SEQ ID NO：29或由其组成的CDRH2；
(c)包含SEQ ID NO：31或由其组成的CDRH3；
(d)包含SEQ ID NO：28或由其组成的CDRL1；
(e)包含SEQ ID NO：30或由其组成的CDRL2；和
(f)包含SEQ ID NO：32或由其组成的CDRL3。
9.根据权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(A)重链可变区，其：
(i)包含选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列；
(ii)包含与选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：33、35、37、39、41和43的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或
(B)轻链可变区，其：
(i)包含选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列；
(ii)包含与选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：34、36、38、40、42和44的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的轻链可变区；或
(b)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的轻链可变区；或
(c)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的轻链可变区；或
(d)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的轻链可变区；或
(e)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的轻链可变区；或
(f)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的轻链可变区。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其具有一个或多个以下性质：
(a)以1×10-8M或更低的KD结合人OX40；
(b)在CD4+T细胞中诱导细胞因子(例如，IL-2或IFN-γ)产生；
(c)增强原代人CD4+T细胞的增殖；
(d)在Treg细胞存在的情况下增强原代人CD4+T效应细胞的增殖；
(e)分别结合人或猕猴OX40；或
(f)对人CD40、CD137和CD271没有交叉反应性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是全人单克隆抗体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是由转基因哺乳动物产生的全人单克隆抗体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是由转基因大鼠产生的全人单克隆抗体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是由具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠产生的全人单克隆抗体。
17.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体融合至IgG的恒定区。
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体融合至人IgG的恒定区。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体融合至人IgG1或人IgG4的恒定区。
20.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合OX40的CRD2和/或CRD3结构域。
21.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其与前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合部分竞争结合相同的表位。
22.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1-21的任一项中所定义的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。
23.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其编码如权利要求1-21的任一项中所定义的分离的抗体的重链可变区，并且包含选自以下的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO：33、35、37、39、41或43所示的重链可变区的核酸序列；
(B)如SEQ ID NO：45、47、49、51、53或55所示的核酸序列；或
(C)在高度严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
24.根据权利要求22所述的分离的核酸分子，其编码如权利要求1-21的任一项中所定义的分离的抗体的轻链可变区，并且包含选自以下的核酸序列：
(A)编码如SEQ ID NO：34、36、38、40、42或44所示的轻链可变区的核酸序列；
(B)如SEQ ID NO：46、48、50、52、54或56所示的核酸序列；或
(C)在高度严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
25.一种载体，其包含权利要求22-24的任一项的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其包含权利要求25的载体。
27.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-21的任一项中所定义的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
28.一种制备如权利要求1-21的任一项中所定义的抗体或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：
-在权利要求26的宿主细胞中表达如权利要求1-21的任一项中所定义的抗体或其抗原结合部分；和
-从所述宿主细胞分离抗体或其抗原结合部分。
29.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于调节受试者内免疫应答的药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中T细胞增殖在施用所述药物的受试者中得以增强。
31.根据权利要求29所述的用途，其中抗CD3诱导的原代人CD4+T细胞增殖在施用所述药物的受试者中得以增强。
32.根据权利要求29所述的用途，其中在Treg细胞存在的情况下原代人CD4+T效应细胞的增殖在施用所述药物的受试者中得以增强。
33.根据权利要求29所述的用途，其中在施用所述药物的受试者中细胞因子IFN-γ产量增加。
34.根据权利要求29所述的用途，其中在施用所述药物的受试者中细胞因子IL-2产量增加。
35.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗受试者内异常细胞生长的药物中的用途。
36.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于削弱受试者中Treg细胞的抑制性功能的的药物中的用途。
37.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于抑制受试者内肿瘤细胞生长的药物中的用途。
38.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于减少受试者的肿瘤细胞转移的药物中的用途。
39.根据权利要求1-21的任一项中所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病的药物中的用途。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述癌症是实体癌。
41.根据权利要求39或40所述的用途，其中所述癌症是结肠癌。
42.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病的诊断剂中的用途。
43.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分，其用于治疗或预防增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病。
44.根据权利要求1-21中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分，其用于诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病。
45.一种用于治疗或诊断增殖性病症(例如癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或感染性疾病的试剂盒，其包含容器，所述容器包含权利要求1-21的任一项中所定义的至少一种抗体或其抗原结合部分。
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