CN110452837B

CN110452837B - 一株降解氨氮的漳州芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110452837B
Application number: CN201910640354.5A
Authority: CN
Inventors: 刘金波; 孙欣; 于志刚
Original assignee: Weihai Coni Lihe Environmental Protection Technology Co ltd
Current assignee: Weihai Coni Lihe Environmental Protection Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110452837A

Abstract

本申请提供了一株降解氨氮的微生物菌株，所述菌株为漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z‑XWW 77，所述漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z‑XWW 77保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17516。本申请还提供了上述菌株以及包含上述菌株的复合微生物在降解氨氮中的应用。

Description

一株降解氨氮的漳州芽孢杆菌及其应用

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及可以降解氨氮的微生物及其应用。

背景技术

随着我国人口的不断增长与经济水平的进步，人们对肉、奶制品的需求量不断增加，畜牧养殖规模不断扩大。在满足肉制品输出的同时，大量家畜粪便也随之产生，这些粪便在未得到合理处理的情况下，会在陆地上堆积，或随生活垃圾一同进入海洋，其释放的恶臭气体对陆地和海洋的环境均产生了极大污染。

来自全国环保管理平台的数据显示，全国恶臭/异味投诉的比例逐年升高，恶臭污染问题日益凸显。恶臭化合物种类较多，超过168种，而H₂S与NH₃作为恶臭气体中最主要的成分，已经成为主要的防治对象。

微生物除臭技术依靠其低廉，高效，环境友好等优点成为当今迅速发展的一项环境治理技术。利用微生物除臭技术治理环境，不仅可以将污染物转化为无污染的稳定物质，还可以满足对营养物质的合理分析。另外，除臭微生物还可以用来制作脱臭材料，在合理使用的前提下，可以较长时间维持较好的除臭效果，提高对环境的可持续治理。

海洋氨氮硝化菌凭借其高耐盐性，不仅可以实现对陆地上恶臭气体的降解利用，更是治理海洋恶臭污染的首选。从海洋中筛选出高效，稳定的氨氮硝化菌株是满足陆地和海洋环境治理和可持续发展的迫切要求。

发明内容

本发明以氨氮含量为检测指标，对来自海洋的196种菌株进行了氨氮降解能力的评估，提供了一种能够降解氨氮的微生物菌株。

一方面，本发明提供了一株降解氨氮的微生物菌株，所述菌株为养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)Z-XWW G或者漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z-XWW77。

其中，所述养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)Z-XWW G保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17515。

所述漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z-XWW 77保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17516。

如无特殊说明，本发明中保藏编号为CGMCC No.17515的养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)Z-XWW G可以以“菌株G”代替；保藏编号为CGMCC No.17516的漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z-XWW 77可以以“菌株77”代替。

另一方面，本发明提供了一种降解氨氮的复合微生物菌株。

在一个实施方式中，所述复合微生物菌株包括养料嗜冷杆菌(Psychrobactercibarius)Z-XWW G以及其他的氨氮降解微生物；优选的，所述其他的氨氮降解微生物选自漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z-XWW 77。

在其他的实施方式中，所述复合微生物菌株包括漳州芽孢杆菌(Bacilluszhangzhouensis)Z-XWW 77以及其他的氨氮降解微生物；优选的，所述其他的氨氮降解微生物选自养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)Z-XWW G。

另一方面，本发明提供了一种降解氨氮的材料，所述材料包含上述微生物菌株。在一个实施方式中，所述材料可以为粉剂或液体制剂。

另一方面，本发明还提供了上述微生物或上述材料在氨氮降解中的应用。

另一方面，本发明还提供了上述微生物菌株或上述材料在处理含氨的待处理样本中的应用。

所述含氨的待处理样本优选为含氨的污染物，例如，污水、废水、生活垃圾、动物粪便，所述动物粪便可以为人的粪便。

另一方面，本发明还提供了一种降解待处理样本中氨氮的方法，所述方法包括利用上述微生物或上述材料对样本进行处理的步骤。

进一步的，所述待处理样本为含氨的待处理样本，优选为含氨的污染物，例如，污水、废水、生活垃圾、动物粪便，所述动物粪便可以为人的粪便。

在一个实施方式中，利用养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)Z-XWW G对样本进行处理时，处理条件为温度为25-40℃，优选，28-37℃，更优选，32℃；pH为6.5-8，优选，7-7.5，更优选，7。

在另一个实施方式中，利用漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z-XWW 77对样本进行处理时，处理条件为温度为25-45℃，优选，32-42℃，更优选，37℃；pH为6-7.5，优选，6.5-7，更优选，7。

生物材料保藏说明

生物材料(株)：Z-XWW G；

分类命名：养料嗜冷杆菌(Psychrobacter cibarius)；

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101；

保藏日期：2019年4月2日；

保藏编号：CGMCC No.17515；

生物材料(株)：Z-XWW 77；

分类命名：漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏日期：2019年4月2日；

保藏编号：CGMCC No.17516。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1.温度对菌株的氨氮转化率的影响。

图2.pH对菌株的氨氮转化率的影响。

图3.菌株77形态扫描电镜。

图4.菌株G形态扫描电镜。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以示例的方式进行详细说明。

了能够更清楚地理解本申请的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本申请进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是，本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例一、材料和方法

1、微生物来源：由山东省海洋微生物资源中心实验室保藏的196株海洋微生物菌株。

2、培养基

2216E固体培养基：陈海水1L，蛋白胨5g，酵母浸粉1g，磷酸高铁0.01g，琼脂粉20g。

种子液培养基：陈海水1L，蛋白胨5g，酵母浸粉1g，磷酸高铁0.01g。

尿素培养基：蛋白胨1g氯化钠5g，磷酸二氢钾2g，葡萄糖1g，蒸馏水1000ml，0.4％酚红3ml，20％尿素100ml，20g；制法:将尿素与其他培养基成分分开除菌，调节其他培养基成分Ph，在高压灭菌锅内以121℃灭菌20min，待其冷至50℃左，加入经滤膜过滤尿素溶液，使培养基内尿素的浓度为2％，pH在7.2左右。

氨氮发酵液：蔗糖10.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.12g，蒸馏水1000ml。

3、氨氮降解菌菌株初筛试验

将活化得到的菌种，以划线的方式接种在尿素培养基上，在生化培养箱中以28℃恒温培养48h，并设置空白对照，48h后观察平板颜色变化。

尿素中在脲酶的作用下分解为氨和碳酸钙，导致培养基pH升高，实验结果可以由培养基pH值变化而引起的颜色变化来判断。

4、检测方法

取25ml比色管5支，按照表1和表2吸取氨标准使用液配制系列标准溶液，按照相应步骤分别绘制次氯酸钠-水杨酸分光光度法与纳氏试剂法分别绘制标准曲线。

表1次氯酸钠-水杨酸分光光度法氨标准使用液配制表

向比色管内分别加入1.0ml水杨酸-酒石酸钾钠溶液，0.4ml亚硝基铁氰化钠，0.4ml次氯酸钠使用液，稀释至25ml摇匀，静置1h。调整分光光度计波长为697nm，测量吸光度，绘制标准曲线。

表2纳氏试剂法氨标准使用液配制表

向比色管内分别加入1.0ml酒石酸钾钠溶液和1.0ml纳氏试剂，摇匀，加水定容至25ml。调整分光光度计波长为420nm，测量吸光度，绘制标准曲线

5、氨氮硝化菌菌株复筛试验

按1％的接种量用接种环挑取初筛获得的菌株接入100ml的液体2216E培养基，在28℃振荡培养48h，转速150r/min。分光光度计测量种子液在600nm处的吸光度，控制OD₆₀₀＝0.5。以5％接种量接入200ml氨氮发酵液中，置于28℃，150r/min的振荡培养24h，多次重复。24h后以纳氏试剂比色法检测氨氮发酵液内的氨氮含量，对数据方差分析，建立柱状图表示各菌株氨氮转化率。

计算公式：氨氮转化率＝(空白对照组氨氮含量-试验组氨氮含量)/空白对照组氨氮含量。

6、菌株最适发酵条件

将待测菌株制备为种子液待用。将菌株接种于氨氮发酵液中分别进行温度、pH、接种量试验。最适发酵温度试验，在pH＝7.5,接种量为5％条件下，温度设置为28℃、32℃、37℃、42℃。最适发酵pH试验，在温度为28℃,接种量为5％条件下，发酵培养基pH设置为6、6.5、7、7.5、8。最适发酵接种量试验，在pH＝7.5,温度为28℃条件下，接种量设置1％、3％、5％。考察接种量对于氨氮转化率的影响。

7、菌株的鉴定、生理生化及形态

16SrDNA序列分析，对待测菌株进行菌落PCR,将DNA扩增产物测序送往北京六合华大基因科技有限公司得到基因序列，并进行同源序列比对，构建系统发育进化树。并对氨氮转化能力较强的菌种保藏。海洋氨氮降解菌生理生化分析，对待测菌株使用API20E试剂盒进行B-半乳糖苷酶、精氨酸双水解介酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酶脱羧、锌檬酸利用、H2S产生、脲酶、色氨酸脱氨酶、吲哚产生、3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇、碳源氧化生理生化性能检测。

菌落形态特征观察，将菌株以戊二醛固定，由青岛大学扫描电镜观察。

实施例二、氨氮降解菌株初筛试验结果

待筛选的196种实验菌株分别为鱼类附生菌共90株，天鹅肠道菌株共54株，海葵附生菌株52株。

试验初筛分为三个等级，平板未变色为2级，平板颜色浅红为1级，平板颜色深红为0级，初筛实验结果如表3。

表3尿素平板变色等级

由表3可知，初筛共筛选出23株具有预期效果的菌株。其中从鱼类附生菌筛选得13株；天鹅肠道菌群中筛选得9株；海葵附生菌筛选得1株。

以次氯酸钠-水杨酸分光光度法测得标准曲线：R²＝0.9402，回归方程：y＝0.0812x-0.0952；用纳氏试剂法测得标准曲线：R²＝0.9997，回归方程：y＝0.0151x+0.006。通过对比发现，纳氏试剂法的R²值极接近1，回归直线对观测值的拟合程度较好，而次氯酸钠-水杨酸分光光度法R²相对较小，回归直线对观测值的拟合程度一般。

纳氏试剂法的测量上限为2mg/l，次氯酸钠-水杨酸分光光度法测量上限为10mg/l,而实验预期测量上限为1.5-1.8mg/l范围，选取纳氏试剂法以期获得更高精度；纳氏试剂法的显色时间为10min，次氯酸钠-水杨酸分光光度法显色时间为1h，因此纳氏试剂具有更高效率。

实施例三、氨氮降解菌株复筛试验结果

以28℃、150r/min恒温振荡培养24h，制备23种初筛得到的菌株种子液，接入氨氮发酵液，24h后测定氨氮转化率，计算氨氮转化率，结果以平均值±标准差为准。

复筛结果显示，初筛得到的23株菌株通过复筛得到的具有氨氮转化能力菌株20株，有3株没有显示出氨氮降解能力。其中，编号为G和77的菌株在初筛和复筛中的效果较好，氨氮转化率在45％以上。

对菌株77和菌株G进行最适发酵条件的试验。

如图1所示，菌株77在温度37℃-42℃范围内氨氮转化率较好，37℃时菌株氨氮转化率最高，为57.63％；菌株G在温度28℃-42℃范围内氨氮转化率良好，在32℃时菌株氨氮转化率最高，为51.27％；菌株77和菌株G最适温度分别为37℃,和32℃。

如图2所示，菌株77在pH6.5-7范围内氨氮转化率良好，在Ph＝7时，菌株氨氮转化率达到最高，为55.09％；菌株G在pH7-8范围内氨氮转化率良好，在pH＝7时，菌株氨氮转化率达到最高，为56.78％。菌株77和菌株G的最适pH为7。

对于接种量试验结果显示，菌株77和菌株G在1％-5％的接种量时，氨氮降解率在50％以上。其中，菌株77在接种量为3％时氨氮转化率最高，达到55.93％；菌株G在接种量为3％时氨氮转化率最高，可以达到55.09％。菌株77和菌株G的最适接种量为3％。

实施例四、氨氮降解菌株鉴定

4.1菌落特征观察

通过观察菌株77和菌株G菌落的颜色，边缘等形态特征，并进行革兰氏染色，记录如表4。

表4菌株形态特征记录

对菌株77和菌株G进行电镜拍照观察，结果如图3-4所示。

由图3-4可知：菌株77菌体呈现杆状，细胞壁完整，菌体边缘清晰，周身具有鞭毛，细胞质密度均匀；菌株G菌体呈现杆状，细胞壁完整，菌体边缘较模糊，细胞质密度较均匀。

4.2生理生化检测

对菌株77和菌株G进行生理生化性能测定，结果见表5。

表5菌株77和菌株G的生理生化性能测定结果

4.3 16SrDNA序列分析

提取菌株77和菌株G的基因组DNA，以此为模板，扩增16SrDNA序列，将得到的16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性分析，并与GenBank中的相近序列使用Mega 6.0的ClustalW做多序列联配分析。通过构建初步系统发育进化树，确定菌株77和菌株G分别为漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)和养料嗜冷杆菌(Psychrobactercibarius)。

将菌株77和菌株G分别保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号分别为CGMCC No.17516和CGMCC No.17515。

菌株77和菌株G在初筛和复筛中对于氨氮的降解效果均较好，氨氮转化率可以达到45％以上。经过菌种鉴定，确定菌株77为漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)，其氨氮转化能力高于现有技术的其他芽孢杆菌。菌株G为养料嗜冷杆菌(Psychrobactercibarius)，目前对嗜冷杆菌属较多的报道指出其可分泌低温脂肪酶，广泛应用于医疗、制药等领域，但对于氨氮转化能力并未提及，该项发现可以提高嗜冷杆菌属的应用范围。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims

1.一株降解氨氮的微生物菌株，所述菌株为漳州芽孢杆菌(Bacilluszhangzhouensis)Z-XWW 77，其特征在于，所述漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis)Z-XWW 77保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17516。

2.一种降解氨氮的复合微生物，其特征在于，所述复合微生物包括权利要求1所述的微生物菌株以及其他的降解氨氮的微生物。

3.一种用于降解氨氮的材料，所述材料包含权利要求1所述的微生物菌株或权利要求2所述的复合微生物。

4.根据权利要求3所述的材料，其特征在于，所述材料为粉剂或液体制剂。

5.权利要求1所述的微生物菌株，权利要求2所述的复合物微生物或权利要求3-4任一所述的材料在氨氮降解或在处理含氨的待处理样本中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含氨的待处理样本为含氨的污染物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含氨的污染物为污水、废水、生活垃圾或动物粪便。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物粪便为人的粪便。

9.一种降解待处理样本中氨氮的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的微生物菌株，权利要求2所述的复合物微生物或权利要求3-4任一所述的材料对待处理样本进行处理的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待处理样本为含氨的待处理样本。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述含氨的待处理样本为含氨的污染物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述含氨的污染物为污水、废水、生活垃圾或动物粪便。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述动物粪便为人的粪便。

14.根据权利要求9-13任一所述的方法，其特征在于，所述处理条件如下：温度为25-45℃；pH为6-7.5。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述处理条件如下：温度为32-42℃；pH为6.5-7。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述处理条件如下：温度为37℃；pH为7。