CN110438056B

CN110438056B - 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

Info

Publication number: CN110438056B
Application number: CN201910738599.1A
Authority: CN
Inventors: 陈修来; 郭亮; 刘立明; 刁文文; 刘佳; 罗秋玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2039-08-12
Also published as: CN110438056A

Abstract

本发明公开了一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用，属于发酵工程技术领域。本发明以Escherichia coli ATCC 8739为出发菌株，利用代谢工程手段，通过构建丁酸的合成路径以及切断冗余代谢支路构建了生产丁酸的大肠杆菌基因工程菌。在发酵72h后丁酸的产量达到15g/L。该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接利用甘油发酵生产丁酸的报道。该方法采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用。

Description

一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

技术领域

本发明涉及一株产丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用，属于发酵工程技术领域。

背景技术

丁酸(Butyric acid)是一种短链脂肪酸，是合成其他香料物质和精细化工产品的重要原料。丁酸及其衍生物被广泛应用于化工、食品、医药、动物饲料和化妆品等行业。丁酸衍生物，如丁酸酯，用于饮料、食品和化妆品中作为芳香和增味剂。由丁酸和醋酸纤维素制备的聚合物可用于制造塑料和纺织纤维。丁酸盐的衍生物作为高活性化合物，显示出具有抗癌作用。此外，丁酸的商业价值因其作为生物燃料(如正丁醇)的前体而备受推崇。

目前，丁酸的生产方法主要有化学法和发酵法。化学法是采用源于石油化工的正丁醛氧化法。与化学法相比，生物发酵法具有原料广泛、环境友好和可持续等优点，发酵法主要以淀粉或糖为原料，用丁酸梭状芽孢杆菌发酵得丁酸。

丁酸梭状芽孢杆菌是严格厌氧的革兰氏阳性菌，长期以来一直被研究用于生产丁酸。然而，丁酸梭状芽孢杆菌发酵过程复杂，发酵条件难以控制，操作步骤繁琐，需要仔细优化影响丁酸产量的关键因素。此外，可用于丁酸梭状芽孢杆菌的遗传操作工具和其生理信息少也阻碍了其发展。而大肠杆菌由于其生长过程已于控制，遗传操作工具成熟，遗传背景清晰。但目前应用大肠杆菌生产丁酸，是以葡萄糖和乙酸为底物，发酵48h，产量为10g/L左右(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(19):4342-4348)。

甘油(glycerol)学名丙三醇，是一种三元醇。随着化石燃料日趋紧张，国际油价持续上涨，人们环保意识随之增强且越来越注重研究开发可再生的替代能源，生物柴油是一个有希望替代的可再生燃料，其生产的原料主要包括动植物的油脂和餐饮方面的垃圾油，在水解制备生物柴油的同时，将会生成一定量的甘油。近年来，生物柴油的发展速度加快，副产物甘油的产量也在迅速上升，这将使得甘油的价格大幅下降。此外，工业化制皂的过程中，闭合的皂胶经盐析后，下层溶液中也含有副产物甘油。如此大量的甘油生成将会给生物柴油行业带来严重负担，增加生产成本。相比于高额的处理成本，如果能够高效充分利用这些甘油转化成需要的高附加值化合物将带来巨大的效益，降低生物柴油制造的成本，减少资源的浪费、污染物排放以及环境污染等。若能采用微生物发酵直接利用甘油生产丁酸，则可以解决上述问题和不足。

丙酮酸是合成丁酸的前体物质，获得能够积累丙酮酸的菌株是发酵法生产丁酸的必要前提。

综上所述，提供一种以甘油为底物发酵生产正丁酸的低污染、低成本的方法，对于正丁酸的工业生产具有重要的应用价值。然而，目前该方法还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为不表达乙酸激酶基因(ackA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)和乳酸脱氢酶基因(ldhA)，并游离过表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(hbd)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(crt)、反式烯酰辅酶A还原酶基因(ter)和酰基辅酶A硫酯酶II基因(tesB)。所述不表达包括敲除或沉默。

在本发明的一种实施方式中，所述出发菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739。所述Escherichia coli ATCC 8739是在ATCC上购买的野生型大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB含有NCBI上accession number:P76461所示基因编码的氨基酸；所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶hbd含有NCBI上accession number:KHD37023.1所示基因编码的氨基酸；所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶crt含有NCBI上accession number:NP_349318.1所示基因编码的氨基酸；所述反式烯酰辅酶A还原酶ter含有NCBI上accession number:4EUF_A所示基因编码的氨基酸序列；所述酰基辅酶A硫酯酶II tesB含有NCBI上accession number:WP_085701399所示基因编码的氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，所述乙酸激酶基因ackA含有NCBI上accessionnumber:ACA77022.1所示基因的核苷酸序列；所述乙醇脱氢酶基因adhE含有NCBI上accession number:ACA78022.1所示基因的核苷酸序列；所述乳酸脱氢酶基因ldhA含有NCBI上accession number:ACA77911.1所示基因的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达atoB和tesB是将这两个基因连接到pEac载体进行游离表达；所述过表达crt，hbd和ter，是将这三个基因连接到pCloDF13载体上进行游离表达。

在本发明的一种实施方式中，利用FLp/FRT系统敲除乙酸激酶基因(accessionnumber:ACA77022.1)，乙醇脱氢酶基因(accession number:ACA78022.1)和乳酸脱氢酶基因(accession number:ACA77911.1)。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌在发酵生产丁酸方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化后，于温度35-39℃、转速700-900rpm，通气量1-1.5vvm，7-9mM的KOH溶液调节pH至6.5-7.5进行发酵，发酵时间为60-90h。

进一步地，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化后，于温度37℃、转速800rpm,通气量1vvm，8mM的KOH调节pH至7.0进行发酵，发酵时间为72h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基含有：甘油40-60g/L，酵母膏20-25g/L，蛋白胨10-15g/L，KH₂PO₄ 2.0-2.5g/L，K₂HPO₄ 12-13g/L。

进一步地，所述发酵使用的发酵培养基含有：甘油50g/L，酵母膏24g/L，蛋白胨12g/L，KH₂PO₄ 2.13g/L，K₂HPO₄ 12.54g/L。

本发明的第三个目的是提供一种构建上述基因工程菌的方法，包括如下步骤：

(一)乙酸激酶基因(ackA)的敲除

(1)以pKD4质粒为模板，根据ATCC 8739中ackA基因3`和5`端45bp序列设计携带有ackA同源臂的引物，扩增出含有ackA同源臂的卡那霉素抗性基因敲除框；

(2)将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的出发菌株感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得ackA基因敲除菌；

(二)乙醇脱氢酶基因(adhE)的敲除

(1)以pKD4质粒为模板，根据ATCC 8739中adhE基因3`和5`端45bp序列设计携带有adhE同源臂的引物，扩增出含有ackA同源臂的卡那霉素抗性基因敲除框；

(2)将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ackA基因敲除感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得adhE、ackA基因敲除菌；

(三)乳酸脱氢酶基因的敲除

(1)以pKD4质粒为模板，根据ATCC8739中ldhA基因3`和5`端45bp序列设计携带有ldhA同源臂的引物，扩增出含有ldhA同源臂的卡那霉素抗性基因敲除框；

(2)将上述基因敲除片段导入含有pKD46质粒的adhE、ackA基因敲除感受态细胞中，获得阳性转化子，消除阳性转化子中的卡那霉素抗性基因后获得ldhA、adhE、ackA基因敲除菌；

(四)atoB和tesB基因的过表达

(1)采用PCR的技术以大肠杆菌ATCC 8739的基因组为模板，分别扩增出atoB、tesB基因片段，并采用一步同源重组的方式连接到质粒pEtac上得到重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB；

(五)ter、hbd和crt基因的过表达

(1)采用PCR的技术以丙酮丁醇梭菌ATCC 824的基因组为模板，分别扩增出ter、hbd、crt基因片段，并采用一步同源重组的方式连接到质粒pCloDF13上得到重组质粒pCloDF13/ter-hbd-crt；

(六)将上述得到的两个重组质粒，转化至上述ldhA、adhE、ackA基因敲除菌，涂布卡那霉素和奇霉素双抗性平板进行筛选，并通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌。

本发明的第四个目的是提供上述基因工程菌在化工、食品、医药、动物饲料或化妆品领域中的应用。

本发明的有益效果：

i)本发明可以将工业废弃物甘油转化为高价值产品丁酸，在发酵72h后丁酸的产量达到15g/L；

ii)本发明采用好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高；

iii)本发明采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产的推广和应用；

iv)本发明为高产丁酸菌株的构建提供了一种新的思路。

附图说明

图1为大肠杆菌工程菌中构建的丁酸合成途径，其中，atoB：乙酰乙酰辅酶A硫解酶；hbd：3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶；crt：3-羟基丁酰辅酶A脱水酶；ter：反式烯酰辅酶A还原酶；tesB：酰基辅酶A硫酯酶II。

图2为同源重组阳性重组子的电泳鉴定图(敲除ackA)，其中，M为2000bp marker，+为野生型大肠杆菌乙酸激酶基因，-为空白对照，17为乙酸激酶基因敲除后菌落PCR验证。

图3为同源重组阳性重组子的电泳鉴定图(敲除adhE)，其中，M为2000bp marker，+为野生型大肠杆菌乙醇脱氢酶基因，-为空白对照，5为乙醇脱氢酶基因敲除后菌落PCR验证。

图4为同源重组阳性重组子的电泳鉴定图(敲除ldhA)：M为2000bp marker，+为野生型大肠杆菌乳酸脱氢酶基因，-为空白对照，17为乳酸脱氢酶基因敲除后菌落PCR验证。

图5为重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB构建流程。

图6为重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB的图谱。

图7为重组质粒pEtac/Ptac-atoB-tesB构建流程。

图8为重组质粒pCloDF13/Ptac-ter-hbd-crt的图谱。

图9为基因工程菌BUT-1重组蛋白的SDS鉴定图，其中，Marker为蛋白marker，BUT-1为基因工程菌，Control为E.coli ATCC 8739。

具体实施方式

丁酸检测方法(高效液相色谱条件)：

色谱柱：

(5μm 4.6×250mm)

流动相：5mM H₂SO₄

柱温：45℃

检测波长：210

进样量：20μL

流速：0.6mL/min

实施例1E.coli ATCC8739乙酸激酶基因ackA的敲除

根据NCBI数据库中大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739中ackA(乙酸激酶基因)基因5`和3`端45bp序列设计上、下游同源臂扩增引物ackA-1、ackA-2，并以pKD4为模板扩增出含有同源臂的敲除框，命名为ackAK。

将ackAK电转化至含pKD46质粒的E.coli ATCC8739感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5mS)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素(30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物ackA-U和ackA-D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1708bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物ackA-U和ack-D进行验证，ackA被成功敲除的菌株扩增片段约295bp，构建过程如图1所示，图2为PCR验证。

验证正确的菌株，命名为E.coli ATCC8739A

引物序列见表1。

表1用于PCR扩增敲除片段及过表达基因的引物序列

实施例2E.coli ATCC8739A乙醇脱氢酶基因adhE的敲除

根据NCBI数据库中大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739中adhE(乙醇脱氢酶基因)基因5`和3`端45bp序列设计上、下游同源臂扩增引物adhE-1、adhE-2，并以pKD4为模板扩增出含有同源臂的敲除框，命名为adhEK。

将adhEK电转化至含pKD46质粒的E.coli ATCC8739A感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素(30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物adhE-U和adhE-D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约2236bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物adhE-U和adhE-D进行验证，adhE被成功敲除的菌株扩增片段约823bp，构建过程如图3所示，图4为PCR验证。

验证正确的菌株，命名为E.coli ATCC8739AA。

引物序列见表1。

实施例3E.coli ATCC8739AA乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除

根据NCBI数据库中大肠杆菌Escherichia coli ATCC8739中ldhA(乳酸脱氢酶基因)基因5`和3`端45bp序列设计上、下游同源臂扩增引物ldhA-1、ldhA-2，并以pKD4为模板扩增出含有同源臂的敲除框，命名为ldhAK。

将adhEK电转化至含pKD46质粒的E.coli ATCC 8739AA感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5ms)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素(30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物ldhA-U和ldhA-D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约2329bp。将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物ldhA-U和ldhA-D进行验证，ldhA被成功敲除的菌株扩增片段约916bp，构建过程如图3所示，图4为PCR验证。

验证正确的菌株，命名为E.coli ATCC8739AAL。

引物序列见表1。

实施例4atoB和tesB基因的过表达

根据NCBI数据库中E.coli ATCC8739的基因组为模板，利用引物atoB-A和atoB-S将来自于E.coli ATCC8739的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(NCBI accession number:P76461)进行PCR扩增，利用引物tesB-A和tesB-S扩增酰基辅酶A硫酯酶II基因(NCBIaccession number:WP_085701399)。

引物序列见表1。

将扩增得到的片段，采用一步同源重组的方式连接到，用EcoR I和Xho I双酶切的pEtac质粒上。

将上述的连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有卡那抗性的LB平板，挑取转化子，提取质粒，测序验证，得到质粒PEtac/Ptac-atoB-tesB。

实施例5ter，hbd和crt基因的过表达

根据NCBI数据库中Clostridium acetobutylicum ATCC824的基因组为模板，利用引物ter-A和ter-S将来自于Clostridium acetobutylicum ATCC824的反式烯酰辅酶A还原酶基因(NCBIaccession number:4EUF_A)进行PCR扩增，利用引物hbd-A和hbd-S扩增3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(NCBI accession number:KHD37023.1)，利用引物crt-A和crt-S扩增3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(NCBI accession number:NP_349318.1)。

引物序列见表1。

将扩增得到的片段，采用一步同源重组的方式连接到，用Hind III和Xho I双酶切的pCloDF13质粒上。

将上述的连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有齐霉素抗性的LB平板，挑取转化子，提取质粒，测序验证，得到质粒pCloDF13/Ptac-ter-hbd-crt。

实施例6

将上述得到的质粒PEtac/Ptac-atoB-tesB和pCloDF13/Ptac-ter-hbd-crt转化至E.coliATCC8739AAL的感受态细胞，涂布卡那霉素和奇霉素双抗性平板进行筛选，并通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌，命名为BUT-1。

实施例7利用大肠杆菌基因工程菌BUT-1生产丁酸

将保存于甘油管中的工程菌株接种于LB培养基斜面，取一环至种子培养基(20ml/100ml三角瓶)，37℃，200rpm培养12h后，以10％接种量(V/V)接种发酵培养基(50mL/250mL三角烧瓶)，温度为37℃，转速800rpm，通气量1vvm，8mM的KOH调节至7.0，发酵时间为72h。采用高效液相色谱(HPLC)测得：本发明的基因工程菌(BUT-1)丁酸的产量为15g/L(见表2)，而出发菌株(WT)积累少量丁酸。丁酸相对甘油的得率为0.3g/g。

表2产物产量(单位:g/L)

	丁酸
		WT	0.5
BUT-1	15

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

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atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcagtgta ggctggagct 60

gcttc 65

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcaggcagtc aggcggctcg cgtcttgcgc gataaccagt tcttccatat gaatatcctc 60

cttag 65

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cgggacacgg tttatcctct 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cgctacgctc tatggctccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtgta ggctggagct 60

gcttc 65

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cttag 65

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<213> 人工序列

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atgaactcgc cgttttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacgtgta ggctggagct 60

gcttc 65

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<213> 人工序列

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ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctcatat gaatatcctc 60

cttag 65

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ctttggctgt cagttcacca 20

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ttcacacagg aaacagaatt catgaaaaat tgtgtcatcg tcag 44

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ctgcagatta aagaggagaa aggtaccatg atagtaaaag caaagtttgt 50

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cacacagtcg acaagcttat taaagaggag aaaatcgata tgatagtaaa agcaaagttt 60

g 61

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ggaatcttcc tcctgctaga attcttaagg ttctaatttt cttaataat 49

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aagcttatta aagaggagaa aggtaccatg gaactaaaca atgtcatcc 49

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<213> 人工序列

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gtggtggtgg tgctcgagct atctattttt gaagccttc 39

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，是对出发菌株大肠杆菌（Escherichia coli） ATCC8739进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为不表达乙酸激酶基因ackA、乙醇脱氢酶基因adhE和乳酸脱氢酶基因ldhA，并游离过表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因hbd、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因crt、反式烯酰辅酶A还原酶基因ter和酰基辅酶A硫酯酶II基因tesB；

所述乙酸激酶基因ackA表达的乙酸激酶的氨基酸序列如NCBI上 accession number:ACA77022.1所示；所述乙醇脱氢酶基因adhE表达的乙醇脱氢酶的氨基酸序列如NCBI上accession number: ACA78022.1所示；所述乳酸脱氢酶基因ldhA表达的乳酸脱氢酶的氨基酸序列如NCBI上 accession number: ACA77911.1所示；

所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因atoB表达的乙酰乙酰辅酶A硫解酶的氨基酸序列如NCBI上accession number: P76461所示；所述3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因hbd表达的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶的氨基酸序列如NCBI上accession number: KHD37023.1所示；所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因crt表达的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶的氨基酸序列如NCBI上accession number: NP_349318.1所示；所述反式烯酰辅酶A还原酶基因ter表达的反式烯酰辅酶A还原酶的氨基酸序列如NCBI上accession number: 4EUF_A所示；所述酰基辅酶A硫酯酶II基因tesB表达的酰基辅酶A硫酯酶II的氨基酸序列如NCBI上accession number:WP_085701399所示。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，利用FLp/FRT系统敲除了乙酸激酶基因、乙醇脱氢酶基因和乳酸脱氢酶基因。

3.一种产丁酸的方法，其特征在于，应用权利要求1-2任一所述的基因工程菌进行发酵。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将权利要求1-2任一所述的基因工程菌活化后，于温度35-39℃、转速700-900 rpm、通气量1-1.5 vvm和pH6.5-7.5的条件下进行发酵，发酵时间为60-90 h。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基含有：甘油40-60 g/L，酵母膏 20-25 g/L，蛋白胨 10-15 g/L，KH₂PO₄ 2.0-2.5 g/L和K₂HPO₄ 12-13g/L。

6.权利要求1-2任一所述的基因工程菌在生产丁酸或生产含有丁酸的产品中的应用。