CN110437199B - 一种硒半胱氨酸近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种硒半胱氨酸近红外荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种硒半胱氨酸近红外荧光探针及其制备方法和应用，属于化学及分析检测领域。本发明提供的检测硒半胱氨酸的近红外荧光探针Fsec‑3，具有选择性好、灵敏度高、检测限低(20nM)及良好生物相容性的优点。在磷酸缓冲液中，荧光强度与硒半胱氨酸浓度(0‑100μM)呈现良好的线性关系，说明探针Fsec‑3适合定量检测硒半胱氨酸；探针Fsec‑3实现了人乳腺癌细胞MCF‑7中硒半胱氨酸的荧光成像；探针Fsec‑3也实现了活体水平内源性硒半胱氨酸的灵敏检测，且响应较快，荧光信号较稳定。由此可见，本发明制备的荧光探针Fsec‑3是可视化和定量检测细胞、活体及肿瘤组织中硒半胱氨酸含量的有效工具。
Description
技术领域
本发明属于化学及分析检测领域，具体涉及一种检测生物体内硒半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
硒元素是一把“双刃剑”，即是体内必需微量元素，也是化学毒物，这取决于硒在体内的存在形式及浓度。硒摄入不足会引起大骨节病、克山病等疾病，也会导致免疫功能低下、认知能力下降以及增加患癌几率。然而，硒的过度补充会导致硒中毒，并增加罹患2型糖尿病的风险。硒在生物体内有多种存在形式，主要包括无机物(亚硒酸盐，SeO3 2-；硒酸盐，SeO4 2-)和有机物(硒代氨基酸；硒蛋白)。硒半胱氨酸(Selenocysteine,Sec)是硒在体内的主要存在形式之一，其常位于硒蛋白的关键活性位点，从而参与多种重要的生理功能，包括甲状腺激素的产生、氧化还原调节及炎症调节等过程。硒蛋白的代谢失衡会引发多种疾病，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病、糖尿病、生育和炎症性疾病等。因此，建立准确可靠的方法检测硒半胱氨酸，对于研究硒化物参与的生理及病理过程是十分重要的。
基于荧光小分子探针的成像技术能够实现对细胞甚至活体中活性小分子的实时可视化示踪，开辟了硒半胱氨酸检测新的发展方向。荧光探针技术在研究信号转导、细胞生理病理功能方面具有灵敏度高、操作简便等优势。目前，选择性识别硒半胱氨酸的荧光探针已取得了一定的进展。但已报道的大多数硒半胱氨酸荧光探针多为紫外-可见光区间的探针。紫外-可见光在组织内穿透性弱，且易被组织中血红蛋白及黑色素等物质吸收；另一方面，在可见光的激发下，生物体有荧光背景，这些因素严重影响了其检测分析的灵敏度和准确性，不利于活体及深层组织中成像。近红外(Near-infrared,NIR)波长范围为650-900nm，组织在此区间内自发荧光较少，避免了生物背景对荧光信号的干扰；同时近红外光具有较强的穿透性，有利于深层组织成像；且具有较低的光损伤。因此，近红外荧光探针具有信噪比高、样本穿透性强和成像分辨率高的优势。
目前，适合于活体成像的硒半胱氨酸近红外荧光探针仅有少数报道。现有的探针仍然有许多需要改进提升的空间，硒半胱氨酸检测领域更加迫切需要具有如下性质的探针：(1)激发与发射光谱在NIR区域，有利于深层组织和活体检测；(2)能特异性识别硒半胱氨酸的荧光探针，因生物体内有诸多反应活性相似的含硫化合物和含硒化合物，干扰硒半胱氨酸的检测；(3)高灵敏度、低检测限的探针，尤其是能够检测nM级硒半胱氨酸的探针；(4)具有良好生物相容性的探针。尽管硒半胱氨酸荧光探针有了一些发展，但是仍然缺少检测活体水平内源性硒半胱氨酸的探针。此外，鉴于生物体内内源性硒半胱氨酸含量较低，尤其迫切需要进一步提高探针的检测灵敏度。因此，开发高灵敏度的近红外硒半胱氨酸荧光探针不仅能为生物体内硒半胱氨酸的生理与病理机制、信号转导研究提供新型的可视化检测方法，还对于揭示硒化合物的抗癌机制研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种近红外荧光探针，该探针能够定量的检测硒半胱氨酸，检测限可达20nM，表明该探针具有较高的检测灵敏度和选择性。
本发明的另一目的是提供一种上述近红外荧光探针的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述近红外荧光探针在细胞、活体及肿瘤组织中检测硒半胱氨酸的应用。
本发明的技术方案如下：
一种近红外荧光探针，其探针的结构式如下所示：
本发明近红外荧光探针Fsec-3的设计如下：(1)以NIR-MNH2为荧光母核，其发射波长在NIR光区，同时保留了调控荧光开关的氨基；(2)以2,4-二硝基苯磺酰胺基为硒半胱氨酸识别基团；(3)NIR-MNH2与2,4-二硝基苯磺酰胺基通过磺酰胺键连接构建识别硒半胱氨酸荧光探针Fsec-3。
荧光探针Fsec-3识别硒半胱氨酸原理为：Fsec-3结构的氨基被2,4-二硝基苯磺酰胺基保护后，由于2,4-二硝基苯磺酰胺基的强吸电子作用，使得荧光淬灭；当Sec与探针Fsec-3反应时，发生亲核取代反应，磺酰胺键发生断裂，荧光恢复。
为了验证探针Fsec-3与硒半胱氨酸的反应原理，Fsec-3与(Sec)2(硒代半胱氨酸二甲酯)的PBS缓冲液于37℃反应1h。结果显示，Fsec-3与硒半胱氨酸反应产生了红色荧光物质，通过HRMS和HNMR证实Fsec-3与硒半胱氨酸反应生成的红色荧光物质是NIR-MNH2。上述结果证明Fsec-3与Sec反应原理如下所示。
荧光探针Fsec-3的合成路线如下：
进一步荧光探针Fsec-3，包括以下步骤：
第一步：在浓硫酸和高氯酸存在的条件下，化合物Ⅰ与环己酮进行反应，制备化合物Ⅱ；
第二步：在哌啶存在的条件下，化合物Ⅱ与化合物Ⅲ进行反应，制备化合物NIR-MNH2；
第三步：在吡啶存在的条件下，化合物NIR-MNH2与化合物Ⅳ进行反应，制备化合物Fsec-3。
荧光探针Fsec-3更进一步详细的制备方法如下：以4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛(化合物Ⅰ)为原料，在浓硫酸和高氯酸作用下，与环己酮反应得到化合物Ⅱ；化合物Ⅱ在哌啶作用下，与N-(4-甲酰基苯基)乙酰胺(化合物Ⅲ)发生缩合反应，并在盐酸作用下脱去乙酰基，得到化合物NIR-MNH2；化合物NIR-MNH2与2,4-二硝基苯磺酰氯(化合物Ⅳ)在吡啶作用下，发生磺酰化反应得到探针Fsec-3。合成路线如下：
在一种优选方案中，在第一步中，化合物Ⅰ与环己酮的摩尔比为1:1～4，可以优选为1:1.5～2.5，例如1:1.9。
在一种更优选方案中，化合物Ⅰ与浓硫酸的摩尔比为1:20～80，可以更优选为1:35～55，例如1:48。
进一步地，化合物Ⅰ与高氯酸的摩尔比为1:2～10，可以再优选为1:3～5，例如1:4.2。
进一步地，反应的温度为70～120℃；可以再优选为80～100℃，例如90℃。
进一步地，反应时间为1～4h，可以再优选为1～2h，例如1.5h。
在第二步中，本发明采用化合物Ⅱ与化合物Ⅲ进行反应，制备化合物NIR-MNH2时，在一种优选方案中，化合物Ⅱ与化合物Ⅲ的摩尔比为1:1～4，可以再优选为1:1.5～2.5，例如1:2。
在一种更优选方案中，化合物Ⅱ与哌啶的摩尔比为1:0.05～0.5，可以再更优选为1:0.08～0.15，例如1:0.1。
进一步地，反应的温度为70～120℃；可以再优选为80～90℃，例如85℃。
进一步地，反应时间为6～24h，可以再优选为8～16h，例如12h。
在第三步中，在吡啶存在的条件下，本发明采用化合物NIR-MNH2与化合物Ⅳ进行反应，制备化合物Fsec-3。
在一种优选方案中，化合物NIR-MNH2与化合物Ⅳ的摩尔比为1:2.5～7.0，可以再优选为1:4.0～5.0，例如1:4.6。
进一步地，化合物NIR-MNH2与吡啶的摩尔比为1:3.5～7.5，可以再优选为1:4.5～5.5，例如1:4.9。
在一种更优选方案中，化合物NIR-MNH2与吡啶在-5～5℃(例如0℃)进行反应5～30min(例如10min)后，再与化合物Ⅳ在室温进行反应4～12h(例如7h)。
本发明制备的近红外荧光探针可以检测细胞、活体及肿瘤组织中硒半胱氨酸含量。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的识别硒半胱氨酸的近红外荧光探针Fsec-3，具有选择性好、灵敏度高、检测限低(20nM)及良好生物相容性等优点。
在磷酸缓冲液中，荧光强度与硒半胱氨酸浓度(0-100μM)呈现良好的线性关系，说明探针Fsec-3适合定量检测硒半胱氨酸，探针Fsec-3还实现了人乳腺癌细胞MCF-7中硒半胱氨酸的荧光成像；更重要的是，探针Fsec-3也实现了活体水平(昆明小鼠)内源性硒半胱氨酸的灵敏检测，且响应较快，荧光信号较稳定。
本发明又进一步应用该探针Fsec-3，检测了裸鼠移植瘤模型中肿瘤组织内的硒半胱氨酸水平。本发明制备的探针Fsec-3是可视化和定量检测细胞、活体及肿瘤组织中硒半胱氨酸含量的有效工具。
附图说明
图1是化合物NIR-MNH2的1H NMR；
图2是化合物NIR-MNH2的HRMS图谱；HRMS(ESI+):(M)+calcd.for C24H27N2O+,359.2118；found,359.2115；
图3是化合物Fsec-3的1H NMR；
图4是化合物Fsec-3的HRMS图谱；HRMS(ESI+):(M)+calcd.for C30H29N4O7S+,589.1751；found,589.1746；
图5是化合物Fsec-3与Sec反应产物的1H NMR；
图6是化合物Fsec-3与Sec反应产物的HRMS图谱；HRMS(ESI+):(M)+calcd.forC24H27N2O+,359.2117；found,359.2116；
图7是探针Fsec-3与Sec反应的荧光光谱和紫外光谱；其中，图7中A为Fsec-3,Fsec-3+Sec和NIR-MNH2在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中的荧光图谱；图7中B为Fsec-3,Fsec-3+Sec和NIR-MNH2在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中的紫外吸收光谱；
图8是探针Fsec-3与Sec反应的线性关系及检测限；其中，图8中A为Fsec-3(10μM)与Sec(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,30,40,50,60,70,80,90,100,200,300,400 and 500μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光图谱；图8中B为Fsec-3(10μM)与Sec(0-500μM)在PBS缓冲液孵育后的荧光强度变化，其中插入图：荧光强度与不同浓度Sec(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20)的线性关系；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图9是探针Fsec-3与Sec反应的时间；其中，图9中A为Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育(0,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,25and 30min)的荧光图谱；图9中B为Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)在PBS缓冲液孵育(0-30min)后在730nm处的荧光强度与时间的关系；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图10是探针Fsec-3与Sec反应的pH影响；其中，图10中A为Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)在不同pH缓冲液(20mM,pH＝4.0-9.0,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光图谱；图10中B为Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)在不同pH缓冲液(20mM,pH＝4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5 and 9.0,10％DMSO)中孵育20min后，在730nm处的荧光强度与pH变化的关系；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图11是探针Fsec-3对Sec的选择性；其中，图11中A为Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)、其它含硫化合物、硒化合物在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光光谱；图11中B为Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)、其它含硫化合物、硒化合物在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光响应；每组分别添加Sec(100μM)，1.Blank；2.Sec(100μM)；3.Hcy(100μM)+Sec(100μM)；4.Hcy(1mM)+Sec(100μM)；5.Cys(100μM)+Sec(100μM)；6.Cys(1mM)+Sec(100μM)；7.GSH(1mM)+Sec(100μM)；8.GSH(10mM)+Sec(100μM)；9.GSSG(1mM)+Sec(100μM)；10.S8(500μM)+Sec(100μM)；11.Na2S(100μM)+Sec(100μM)；12.NAC(100μM)+Sec(100μM)；13.Na2SeO3(100μM)+Sec(100μM)；14.Na2Se(100μM)+Sec(100μM)；15.Se-methylselenocysteine(100μM)+Sec(100μM)；16.Selenocystine(100μM)+Sec(100μM)；17.Selenomethionine(100μM)+Sec(100μM)；图中的短柱代表没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育Sec(100μM)产生的荧光强度；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图12是探针Fsec-3对Sec的选择性；Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)、其它氨基酸(1mM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光响应；1.Blank；2.Sec(100μM)；3.Ala+Sec(100μM)；4.Glu+Sec(100μM)；5.Trp+Sec(100μM)；6.Met+Sec(100μM)；7.Tyr+Sec(100μM)；8.Leu+Sec(100μM)；9.Val+Sec(100μM)；10.Ser+Sec(100μM)；11.Pro+Sec(100μM)；12.Arg+Sec(100μM)；13.Gly+Sec(100μM)；14.Phe+Sec(100μM)；15.His+Sec(100μM)；16.Gln+Sec(100μM)；17.Asn+Sec(100μM)；18.Ile+Sec(100μM)；19.Thr+Sec(100μM)；图中的短柱代表没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育Sec(100μM)产生的荧光强度；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图13是探针Fsec-3对Sec的选择性；Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)、金属离子(1mM)及其它还原试剂(1mM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光响应；1.Blank；2.Sec(100μM)；3.Li++Sec(100μM)；4.Na++Sec(100μM)；5.K++Sec(100μM)；6.Mg2++Sec(100μM)；7.Al3++Sec(100μM)；8.Zn2++Sec(100μM)；9.Mn2++Sec(100μM)；10.Co2++Sec(100μM)；11.Cd2++Sec(100μM)；12.Ni2++Sec(100μM)；13.Ca2++Sec(100μM)；14.Hg2++Sec(100μM)；15.Cu2++Sec(100μM)；16.Fe2++Sec(100μM)；17.Fe3++Sec(100μM)；18.Ag++Sec(100μM)；19.DTT+Sec(100μM)；20.NADH+Sec(100μM)；21.glucose+Sec(100μM)；22.ascorbicacid+Sec(100μM)；图中的短柱代表没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育Sec(100μM)产生的荧光强度；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图14是探针Fsec-3对Sec的选择性；Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)、其它阴离子(1mM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光响应；1.Blank；2.Sec(100μM)；3.F-+Sec(100μM)；4.Cl-+Sec(100μM)；5.Br-+Sec(100μM)；6.I-+Sec(100μM)；7.AcO-+Sec(100μM)；8.HCO3 -+Sec(100μM)；9.N3 -+Sec(100μM)；10.NO3 -+Sec(100μM)；11.SO4 2-+Sec(100μM)；12.S2O3 2-+Sec(100μM)；13.SCN-+Sec(100μM)；14.C2O4 2-+Sec(100μM)；15.S2O7 2-+Sec(100μM)；16.HSO3 -+Sec(100μM)；17.CN-+Sec(100μM)；18.ClO-+Sec(100μM)；19.HPO4 2-+Sec(100μM).红条表示随后向混合物添加Sec(100μM)；图中的短柱代表没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育Sec(100μM)产生的荧光强度；结果以mean±SD表示(n＝3)；
图15是探针Fsec-3对Sec的选择性；Fsec-3(10μM)与Sec(100μM)、活性氧类和活性氮类(1mM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)中37℃孵育20min的荧光响应；1.Blank；2.Sec(100μM)；3.H2O2+Sec(100μM)；4.·OCl-+Sec(100μM)；5.O2-+Sec(100μM)；6.·OH+Sec(100μM)；7.tBuOOH+Sec(100μM)；8.NO+Sec(100μM)；9.NO2 -+Sec(100μM)；图中的短柱代表没有孵育Sec(100μM)产生的荧光强度，图中的长柱代表共同孵育Sec(100μM)产生的荧光强度；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图16是MCF-7细胞与Fsec-3(0,5,10,20,50,100μM)孵育24h细胞的存活率；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图17是MCF-7细胞与Fsec-3(20μM)孵育不同时间(0,6,12,18,24)细胞的存活率；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图18是Fsec-3对外源性Sec细胞荧光成像；其中，图18中1A为MCF-7细胞与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育1h；图18中1B为MCF-7细胞与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育6h；图18中2A为MCF-7细胞先与(Sec)2(终浓度5μM,溶剂为5μLsaline)孵育1h、图18中2B为MCF-7细胞先与(Sec)2(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育2h、图18中2C为MCF-7细胞先与(Sec)2(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h后，再分别与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育20min；图18中的1C中的1A’、1B’、2A’、2B’和2C’分别为图18中1A、1B、2A、2B和2C中细胞成像的平均荧光强度，Scale bars＝10μm，数据以mean±SD表示(n＝3)；与对照组相比#P<0.001；
图19是图18中外源性Sec细胞的明场成像；图19中1A,1B,2A,2B和2C分别对应图18中1A,1B,2A,2B和2C；
图20是Fsec-3对内源性Sec细胞荧光成像；其中，图20中1A为MCF-7细胞与Na2SeO3(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育1h、图20中1B为MCF-7细胞与Na2SeO3(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育2h、图20中1C为MCF-7细胞与Na2SeO3(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h后，再与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育20min；图20中2A为细胞与DBDS(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育1h、图20中2B为细胞与DBDS(终浓度5μM,溶剂为5μLsaline)孵育2h、图20中2C为细胞与DBDS(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h，再与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育20min；图20中的1D中的1A’、1B’和1C’分别为图20中1A、1B和1C中细胞成像的平均荧光强度；图20中的2D中的2A’、2B’和2C’分别为图20中2A、2B和2C中细胞成像的平均荧光强度；Scale bars＝10μm，数据以mean±SD表示(n＝3)，与对照组相比#P<0.001；
图21是图20中内源性Sec细胞的明场成像；图21中1A,1B,1C,2A,2B和2C分别对应图20中1A,1B,1C,2A,2B和2C；
图22是MCF-7细胞内源性Sec荧光成像随时间变化关系；其中，图22中A为MCF-7细胞与Na2SeO3(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h，再与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μLDMSO)孵育5min；图22中B为MCF-7细胞与Na2SeO3(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h，再与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育10min；图22中C为MCF-7细胞与Na2SeO3(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h，再与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育20min；正下方为相应的明场形态，Scale bars＝10μm；
图23是图22中细胞的平均荧光强度；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图24是外源性Sec的活体荧光成像；图24中A为小鼠腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μLDMSO)作为对照组；图24中C为鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)于1h、图24中D为鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)于2h和图24中E为鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)于6h后腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)；图24中B为定量表示各组小鼠腹部区域的荧光强度；在图24中的B中的A’、C’、D’和E’分别为图22中A、C、D和E中探针Fsec-3腹腔注射10min时的荧光成像；数据以mean±SD表示(n＝3)；与对照组相比#P<0.001；
图25是内源性Sec的活体荧光成像；图25中A为小鼠腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μLDMSO)作为对照组；图25中C为鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)于1h、图25中D为鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)于2h和图25中E为鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)于6h后腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)；图22中B为定量表示各组小鼠腹部区域的荧光强度；在图25中的B中的A’、C’、D’和E’分别为图25中A、C、D和E中探针Fsec-3腹腔注射10min时的荧光成像；数据以mean±SD表示(n＝3)；与对照组相比#P<0.001；
图26是内源性Sec的荧光成像随时间变化情况；小鼠腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)作为对照组(第一行)；小鼠腹腔注射0.25当量Na2SeO3(0.5mM,300μL saline)，6h后，腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)(第二行)；小鼠腹腔注射2.5当量Na2SeO3(5mM,300μL sline)，6h后，腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)(第三行)；上述各图为探针Fsec-3腹腔注射0min,1min,5min,10min,15min,20min,25min,30min时的荧光成像；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图27是定量表示图28中小鼠腹部区域的荧光强度；数据以mean±SD表示(n＝3)；
图28是肿瘤组织内Sec的荧光检测；其中，图28中A为裸鼠瘤内注射Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)作为对照组；图28中B为裸鼠瘤内Na2SeO3(5mM,100μLsaline),6h后，瘤内注射Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween80)；图28中的C中的A’、B’分别为图28中A、B的的荧光成像；数据以mean±SD表示(n＝3)；与对照组相比#P<0.001；
图29是肿瘤组织内Sec的荧光检测；图29中A为裸鼠尾静脉注射Fsec-3(5mM,100μLsaline,3％DMSO,1％Tween 80)作为对照组；图29中C为裸鼠瘤内Na2SeO3(5mM,100μLsaline)于1h、图29中D为裸鼠瘤内Na2SeO3(5mM,100μL saline)于2h和图29中E为裸鼠瘤内Na2SeO3(5mM,100μL saline)于6h后尾静脉注射Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)；图29中B为定量表示各组小鼠肿瘤组织的荧光强度；在图29中的B中的A’、C’、D’和E’分别为图29中A、C、D和E中探针Fsec-3腹腔注射10min时的荧光成像；数据以mean±SD表示(n＝3)；与对照组相比#P<0.001。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的识别硒半胱氨酸的荧光探针Fsec-3作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
1、材料与仪器
Gibco DMEM高糖培养基(美国Life Technologies公司)；Gibco胎牛血清(美国Life Technologies公司)；青霉素-链霉素溶液(100×)(上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(北京中杉金桥生物技术有限公司)；无水亚硒酸钠(Na2SeO3)(萨恩化学技术(上海)有限公司)；N-(4-甲酰基苯基)乙酰胺(上海毕得医药科技有限公司)；2,4-二硝基苯磺酰(上海泰坦科技股份有限公司)；其余试剂都是国产分析纯。
细胞：
(1)种属和品系：人乳腺癌MCF-7。来源：中国科学院细胞库。
实验动物：
(2)种属和品系：健康雄性昆明小鼠，体重20-25g。来源：徐州医科大学实验动物中心。
(3)种属和品系：健康雌性BALB/c Nude(SPF级别)，5-6周龄。来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。
仪器：
ECZ-400S核磁共振仪(日本JEOL公司)；ABI Q-star Elite高分辨质谱仪(美国应用生物系统公司)；F4600荧光分光光度计(日本Hitachi公司)；LB983 NightOWL II小动物活体成像仪(德国BERTHOLD公司)；FV1000激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；PB-21型pH计(德国Sartorius公司)；SHB-IIIS循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RTC basic磁力搅拌器(德国IKA公司)。
2、溶液的配制
(1)Fsec-3溶液的配制：Fsec-3(5.9mg,0.01mmol)溶解于DMSO(10mL)中得到1mM的探针溶液。探针溶液需要低温避光保存。
(2)硒半胱氨酸储备液的配制：(Sec)2(Selenocystine dimethyl ester)(3.4mg,0.01mmol)与DTT(1.5mg,0.01mmol)溶解于去离子水(20mL)中得到1mM的Sec溶液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。Sec储备液需要现用现配。
(3)含MgCl2(10mM)的Tris-HCl缓冲液的配制：MgCl2(9.5mg,0.1mmol)溶解于Tris-HCl缓冲液(10mL,50.0mM)中得到含MgCl2(10mM)的Tris-HCl缓冲液。
(4)Cys(L-半胱氨酸)储备液的配制：Cys(12.1mg,0.1mmol)溶解于去离子(10mL)中得到10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
(5)Hcy(同型半胱氨酸)储备液的配制：Hcy(13.5mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10mL)中得到10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
(6)GSH(谷胱甘肽)储备液的配制:GSH(30.7mg，0.1mmol)溶解于去离子水(10mL)中得到10.0mM储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
(7)Na2S·9H2O(九水硫化钠)储备液的配制：5mg EDTA溶于25mL Schlenk管中的10mL去离子水中，向溶液中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S·9H2O(24.0mg，0.1mmol)溶于溶液中，得到10mM Na2S储备液，将其稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。Na2S储备液需要现用现配。
(8)NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)储备液的配制：NAC(16.3mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10mL)中得到10.0mM储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
(9)其他生物分析物的储备溶液，包括Ala,Glu,Trp,Met,Tyr,Leu,Val,Ser,Pro,Arg,Gly,Phe,His,Gln,Asn,Ile,Thr等氨基酸；LiCl,NaCl,KCl,MgCl2,AlCl3,Zn(NO3)2,Mn(NO3)2,Co(NO3)2,Cd(NO3)2,Ni(NO3)2,CaCl2,HgCl2,Cu(NO3)2,FeCl2,FeCl3,AgNO3等金属盐；NaF,NaCl,KBr,KI,NaAcO,NaHCO3,NaN3,NaNO3,Na2SO4,NaSCN,Na2C2O4,Na2S2O7,NaHSO3,KCN,NaClO,Na2HPO4等阴离子；还原剂(DTT,NADH)，葡萄糖，抗坏血酸；硒化合物如Na2SeO3,Na2Se,Se-甲基硒半胱氨酸，硒代胱氨酸，硒代蛋氨酸；活性氧类如H2O2,·OCl-,O2-,·OH,tBuOOH；活性氮如NO2 -,NO，都在DI H2O中制备。
(10)超氧自由基(O2-)根据文献报道的方法制备：·OH通过FeII(EDTA)与等当量的H2O2之间的Fenton反应产生。NO从3-(氨基丙基)-1-3-羟基-3-异丙基-2-氧代-1-三氮烯(NOC-5,50μmol/mL)产生。NO2 -由NaNO2产生。
3、荧光探针Fsec-3识别Sec原理
Fsec-3(5.9mg,0.01mmol)溶于DMSO(1mL)中，加入溶有(Sec)2(3.4mg,0.01mmol)和DTT(1.5mg,0.01mmol)的PBS缓冲液(1mL,20.0mM,pH＝7.4)，在37℃下反应1h。乙酸乙酯(3×10mL)萃取，浓缩，通过HRMS和HNMR确认反应产物，从而确认探针Fsec-3识别Sec的反应原理。
4、荧光探针Fsec-3对Sec的检测性能研究
溶液配制：DMSO作溶剂的Fsec-3探针溶液占测试液总体积的10％；氨基酸、金属离子、阴离子、活性氧和活性氮等识别物溶液按所需浓度加入后，用Tris-HCl缓冲液稀释至测试液总体积的90％，37℃避光孵育1h，将待测液加入石英比色皿中进行测量。测量荧光强度，每个数据至少平行测定3次，数据以mean±SD表示。
测试条件：荧光测量实验均在室温下用日立F4600荧光分光光度计测定。激发波长为630nm，激发的狭缝宽度设为5nm，发射的狭缝宽度设为10nm，扫描速度为1200nm/min，发射光谱的范围从600nm到900nm。光电倍增管的电压设为1000V。
5、检测限的测定
最低检测限按文献报道方法计算。探针Fsec-3自身的荧光强度测定10次，计算10次测定的荧光强度的标准偏差，再将探针与Sec(0-20μM)反应，得到Sec浓度与荧光强度的线性方程。检测限的计算公式为：3σ/k。k代表荧光强度与Sec浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。
6、UV分析
溶液配制：DMSO作溶剂的Fsec-3探针溶液或NIR-MNH2溶液占测试液总体积的10％，(Sec)2溶液与PBS缓冲液占测试液总体积90％，37℃避光孵育1h，将待测液加入石英比色皿中进行测量其紫外吸收光谱。
7、细胞培养和细胞毒性测试(MTT法)
细胞培养：人乳腺癌细胞MCF-7，在细胞培养箱中以37℃、5％CO2条件进行培养。细胞培养基是DMEM高糖，含10％胎牛血清、青霉素-链霉素100μg/mL。
细胞毒性测试：MTT法测定Fsec-3的细胞毒性，采用Huber and Koella方法计算IC50值。细胞在37℃，5％CO2条件下培养，接种于96孔板上，密度为5×104个/孔。细胞与不同浓度的Fsec-3(0,5,10,20,50,100μM)孵育24h，24h后，向每个孔中加入20μL的MTT染料(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,5mg/mL inphosphate buffered saline)，继续孵育，4h后将剩余的MTT溶液除去，每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒晶体，摇床震荡10min后，用酶标仪测定570nm处的吸光度。每个样本至少有三个复孔，至少测定三次。再选取Fsec-3(20μM)与细胞孵育(0,6,12,18,24h)后，重复操作。
8、细胞水平荧光成像
细胞生长到对数生长期时，用胰酶消化，制成细胞悬液接种到Nest 801001共聚焦细胞培养皿中。36h后，细胞贴壁张开。将细胞与探针Fsec-3(终浓度10μM，溶剂为10μLDMSO)孵育1h和6h，作为对照组；对于外源性硒半胱氨酸成像：将细胞与(Sec)2(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育，分别于1h,2h和6h后，继续与探针Fsec-3(终浓度10μM，溶剂为10μL DMSO)孵育20min；对于内源性硒半胱氨酸成像：将细胞与Na2SeO3或DBDS(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育，分别于1h,2h和6h后，继续与探针Fsec-3(终浓度10μM，溶剂为10μLDMSO)孵育20min。在成像前，用磷酸盐缓冲液温和的洗涤三次。用FV1000激光共聚焦显微镜进行成像(60×油镜)。激发波长630nm，发射波长730nm。采用Olympus软件(FV10-ASW)进行图像和数据分析。
9、动物饲养
健康昆明种成年雄性小鼠，体重20-25g，由徐州医科大学实验动物中心提供(动物许可证号：SCXK(苏)2015-0009)。BALB/c Nude雌性裸鼠，体重20-25g，5-6周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。昆明小鼠用于活体水平的硒半胱氨酸成像。雌性裸鼠来监测MCF-7荷瘤小鼠中的硒半胱氨酸。所有动物协议由徐州医科大学动物保护与使用委员会批准，进行的动物实验符合中国法律在保护和使用实验动物的规定。昆明小鼠安置在12h光照/黑暗循环，温度(22±2℃)和湿度(50±10％)的房间中，动物自由进食标准的商业动物饲料和纯净水。BALB/c Nude鼠饲养在特定的无病原体环境中。实验前使动物适应实验环境至少一周。
10、活体水平荧光成像
昆明小鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.04mL/10g)麻醉，并清理腹部毛皮。将小鼠随机分组，小鼠腹腔注射探针Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)作为对照组；对于外源性硒半胱氨酸成像，小鼠腹腔注射2.5倍当量(Sec)2(5mM,300μL saline)，分别于1h，2h和6h后，腹腔注射探针Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)，10min后，进行成像。对于内源性硒半胱氨酸成像，小鼠腹腔注射Na2SeO3(0.5mM和5mM,300μL saline)，分别于1h，2h和6h后，腹腔注射探针Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)，分别在0,1,5,10,15,20,25,30min，用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像，拍摄条件为激发光630nm，发射光700nm。采用IndiGo软件进行图像和数据分析。
11、裸鼠移植瘤模型的制备
收集人乳腺癌细胞MCF-7，制成1×108个/mL的细胞悬液，以体积比1:1加入基质胶，混匀，每只BALB/c Nude雌性裸鼠(5-6周龄，20-25g，北京维通利华实验动物技术有限公司)在腋下注射200μL。约4周后，肿瘤体积达300mm3的裸鼠可用于成像实验。
12、裸鼠水平荧光成像
成像前，将BALB/c Nude雌性裸鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.04mL/10g)麻醉。将裸鼠随机分组，瘤内注射探针Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)作为对照组；其它组瘤内注射Na2SeO3(5mM,100μL saline)6h后，再瘤内注射探针Fsec-3(5mM,100μLsaline,3％DMSO,1％Tween 80)；另外，尾静脉注射探针Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)作为对照组；其它组瘤内注射Na2SeO3(5mM,100μL saline)分别于1h,2h和6h后，再尾静脉注射探针Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)，用LB983NightOWL II小动物活体成像仪进行成像，拍摄条件为激发光630nm，发射光700nm。采用IndiGo软件进行图像和数据分析。
13、数据处理
数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS 16.0软件进行统计分析。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。
二、实施例
实施例1：
化合物Ⅱ的制备：新鲜蒸馏的环己酮(508μL,4.9mmol)滴加到浓H2SO4(6.7mL,125.0mmol)中，并冷却至0℃，然后加入4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛(500mg,2.6mmol)，90℃剧烈搅拌反应1.5h。反应完毕后，冷却并倒入冰水中。然后加入高氯酸(620μL,10.8mmol)，静至析出红色沉淀，用冷水(40mL×3)洗涤，干燥。得到红色固体600mg，产率65％。TLC(silica,DCM:MeOH,20:1v/v):Rf＝0.55.
实施例2：
NIR-MNH2的制备：化合物Ⅱ(100mg,0.28mmol)和N-(4-甲酰基苯基)乙酰胺(91.3mg,0.56mmol)溶于乙醇(20mL)中，再滴入哌啶(2.8μL,0.03mmol)。将反应混合物加热至85℃反应12h。反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂。在乙醇和盐酸(15mL,2:1v/v)混合溶液中回流2h，减压除去乙醇，Na2CO3调pH至中性，析出墨绿色固体。粗产物通过使用硅胶柱色谱纯化(silica,DCM:MeOH,100:1v/v)，获得蓝绿色固体40mg，产率40％。TLC(silica,DCM:MeOH,20:1v/v):Rf＝0.45；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.36(s,1H),8.07(s,1H),7.82(d,J＝9.6Hz,1H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),7.33(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),7.22(d,J＝2.0Hz,1H),6.71(d,J＝8.8Hz,2H),6.51(s,2H),3.64-3.69(m,4H),2.93(t,J＝5.6Hz,2H),2.84(t,J＝5.6Hz,2H),1.87(t,J＝6.0Hz,2H),1.25(t,J＝6.8Hz,6H)；HRMS(ESI+):(M)+calcd.forC24H27N2O+,359.2118；found,359.2115.
实施例3：
Fsec-3的制备：将NIR-MNH2(146mg,0.41mmol)和吡啶(163.7μL,2.0mmol)加入DCM(5mL)溶液中，在0℃反应10min。然后将2,4-二硝基苯磺酰氯(500mg,1.88mmol)溶于10mL无水DCM中，并滴加至上述反应液中。氮气保护下在室温反应7h，减压蒸馏除去溶剂，得到蓝黑色固体。粗品通过柱层析(silica,DCM:MeOH,100:1v/v)纯化得到蓝绿色化合物72mg,产率30％。TLC(silica,DCM:MeOH,20:1v/v):Rf＝0.40；1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.64(s,1H),8.40(t,J＝8.0Hz,2H),8.16-8.13(m,1H),8.02(d,J＝0.8Hz,1H),7.82(d,J＝8,4Hz,1H),7.47(d,J＝6.0Hz,2H),7.35(d,J＝10.8Hz,1H),7.22(s,1H),6.92(d,J＝9.2Hz,2H),3.67(q,J＝13.2Hz,J＝6.4Hz,4H),2.90(t,J＝5.2Hz,2H),2.82(t,J＝8.4Hz,2H),1.83(t,J＝9.6Hz,2H),1.23(t,J＝6.8Hz,6H)；HRMS(ESI+):(M)+calcd.for C30H29N4O7S+,589.1751；found,589.1746.
三、效果验证
1、荧光探针Fsec-3与硒半胱氨酸反应的荧光光谱
1.1探针Fsec-3与硒半胱氨酸反应的荧光光谱与紫外光谱
由图7可见，探针Fsec-3自身无荧光，与硒半胱氨酸(100μM)反应后，荧光强度显著增加，其最大发射波长730nm，与NIR-MNH2的荧光光谱一致。探针Fsec-3最大吸收峰在349nm，与Sec(100μM)反应后的最大吸收峰在630nm，这与荧光母核NIR-MNH2的吸收峰一致。
1.2探针Fsec-3与Sec反应的线性关系及检测限
将Fsec-3与不同浓度的Sec(0-500μM)孵育，观察荧光强度与硒半胱氨酸浓度之间的关系，由图8中A可见，随着Sec浓度的增加，在730nm处产生的荧光强度逐渐增强，Fsec-3与硒半胱氨酸的反应比例为1:20时，荧光强度达到峰值(55倍)，反应趋于完全。如图8中B所示，在PBS缓冲液中，荧光强度与Sec(0-100μM)浓度范围内呈现良好的线性关系，Fsec-3检测Sec的检测限为20nM。上述结果说明Fsec-3的检测灵敏度高，适合于复杂生物样本中nM级Sec的定量检测。化合物Fsec-3与Sec反应产物的HRMS和1HNMR谱图如图5和图6所示。
1.3探针Fsec-3与Sec反应的时间
将Fsec-3与硒半胱氨酸(100μM)孵育，探讨荧光强度与反应时间之间的关系。由图9可见，随着孵育时间的增加，在730nm处产生的荧光强度逐渐增强，20min时，荧光强度达到峰值(55倍)，反应趋于完全。
1.4探针Fsec-3与硒半胱氨酸反应的pH影响
将Fsec-3与硒半胱氨酸(100μM)的反应在不同pH PBS缓冲液中进行。Fsec-3本身几乎无荧光，且不受pH变化的影响。加入硒半胱氨酸后，pH在4-7.5范围内荧光响应值较高，在pH 7.5-9.0范围内荧光强度逐渐下降(如图10所示)，这种荧光下降可通过降低pH恢复，可以推测这种荧光随pH可逆调节的现象与强碱性条件下氧桥键的断裂有关。尽管如此，在pH 4和8之间，NIR-MNH2荧光强度仍然很高，能够满足检测的需要。上述结果表明Fsec-3可以在生理条件下(pH 7.4)检测硒半胱氨酸。
1.5探针Fsec-3对硒半胱氨酸反应的选择性研究
在复杂生物背景下，有多种物质可能干扰硒半胱氨酸的检测，因此，探针对硒半胱氨酸的选择性是准确检测的重要前提。在生物硫醇和硒化合物中，只有硒半胱氨酸引起了显著的荧光响应，含巯基的氨基酸和硫醇(Cys,Hcy,GSH,GSSG,S8,Na2S,NAC),含硒化合物(Na2SeO3,Na2Se,Se-methylselenocysteine,Selenocystine,Selenomethionine)均不与Fsec-3产生荧光响应。在Cys(1mM),Hcy(1mM),GSH(10mM),GSSG(1mM),S8(500μM),Na2S(100μM),NAC(100μM),Na2SeO3(100μM),Na2Se(100μM),Se-methylselenocysteine(100μM),Selenocystine(100μM),Selenomethionine(100μM)存在条件下，不影响探针Fsec-3与硒半胱氨酸产生的荧光响应(如图11所示)。不含巯基的氨基酸(Ala,Glu,Trp,Met,Tyr,Leu,Val,Ser,Pro,Arg,Gly,Phe,His,Gln,Asn,Ile,Thr)(如图12所示)；金属盐(LiCl,NaCl,KCl,MgCl2,AlCl3,Zn(NO3)2,Mn(NO3)2,Co(NO3))2,Cd(NO3)2,Ni(NO3)2,CaCl2,HgCl2,Cu(NO3)2,FeCl2,FeCl3,AgNO3)；还原剂(DTT,NADH)，葡萄糖，抗坏血酸(如图13所示)；阴离子(NaF,NaCl,KBr,KI,NaAcO,NaHCO3,NaN3,NaNO3,Na2SO4,NaSCN,Na2C2O4,Na2S2O7,NaHSO3,KCN,NaClO,Na2HPO4)(如图14所示)；活性氧类(H2O2,·OCl-,O2-,·OH,tBuOOH)；活性氮物质(NO2 -,NO)(如图15所示)均不引起荧光响应。因此，Fsec-3可以不受其他物质干扰，选择性地检测生物体内硒半胱氨酸。
2、细胞水平荧光成像
2.1外源性硒半胱氨酸的细胞荧光成像
在荧光成像前，首先检测了探针Fsec-3的细胞毒性，MCF-7细胞与Fsec-3(0,5,10,20,50,100μM)孵育24h后，在Fsec-3浓度低于20μM时，细胞的存活率在90％以上(如图16所示)。MCF-7细胞与Fsec-3(20μM)孵育6h、12h、18h以及24h后，细胞存活率仍在90％以上(如图17所示)，说明Fsec-3毒性很低，而且在20μM浓度下，不会影响细胞的正常形态。
MCF-7细胞与探针Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育(1h,6h)，几乎未观察到荧光(图18中1A和1B)。细胞与(Sec)2(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h后，再加入探针Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μM DMSO)孵育20min，观察到较明亮红色荧光(图18中2C)；而且随着(Sec)2孵育时间延长，观察到的荧光强度也逐渐增加(图18中2A，2B，2C)。图19是图18中外源性Sec细胞的明场成像；图19中1A,1B,2A,2B和2C分别对应图20中1A,1B,2A,2B和2C。说明探针Fsec-3可以检测细胞中外源性硒半胱氨酸。
2.2内源性硒半胱氨酸的细胞荧光成像
在Fsec-3能够识别细胞中外源性硒半胱氨酸的基础上，继续考察Fsec-3能否实现细胞内源性硒半胱氨酸的荧光成像。细胞与Na2SeO3或DBDS(终浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h后，再加入Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育20min，可观察到较明亮的红色荧光(图20中1C，2C)，并且，随Na2SeO3或DBDS孵育时间延长，细胞荧光强度逐渐增强(图20中1A，1B，1C，2A，2B，2C)。图21是图20中内源性硒半胱氨酸细胞的明场成像；图21中1A,1B,1C,2A,2B和2C分别对应图20中1A,1B,1C,2A,2B和2C。此外，细胞与Na2SeO3(浓度5μM,溶剂为5μL saline)孵育6h，再与Fsec-3(终浓度10μM,溶剂为10μL DMSO)孵育5min,10min,20min，随反应时间的延长，荧光强度逐渐增强(图22，23)。综上所述，探针Fsec-3可以检测到细胞中内源性的Sec。
3、活体水平荧光成像
3.1外源性硒半胱氨酸的活体荧光成像
昆明小鼠腹腔注射探针Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)作对照组；另外三组，小鼠腹腔注射(Sec)2(5mM,300μL saline)，分别于1h,2h,6h后，再腹腔注射探针Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)。由图24可知，只注射探针时，几乎没有荧光信号(如图24中A所示)。小鼠腹腔注射(Sec)2后，可见有较强的荧光信号(12.5倍，如图24中E所示)。此外，也考察了(Sec)2注射后的时间对荧光强度的影响，发现随着(Sec)2注射后时间的延长，产生的荧光信号逐渐增强(2.5,3.6,12.5倍)(如图24中B所示)。上述结果说明，Fsec-3能够实现活体中外源性硒半胱氨酸的荧光成像。
3.2内源性硒半胱氨酸的活体荧光成像
昆明小鼠腹腔注射Fsec-3(2.0mM,300μL DMSO)作对照组；另外三组，腹腔注射Na2SeO3(5mM,300μL saline)，分别于1h,2h,6h后，再腹腔注射探针Fsec-3(2.0mM,300μLDMSO)，考察了Na2SeO3注射后的时间对荧光强度的影响，发现随着Na2SeO3注射后时间的延长，产生的荧光信号逐渐增强(2.9,4.9,11倍)(如图25所示)。由图26可知，只注射探针时，从0-30min几乎未见荧光信号，小鼠腹腔注射Na2SeO3(2.5倍当量)6h后，1min即可见明亮的荧光信号，10min左右荧光强度达到峰值(11倍)，30min时仍有较强的荧光信号(如图27所示)。小鼠腹腔注射Na2SeO3(0.25倍当量)6h后，也可见荧光，且其强度的变化趋势与2.5当量Na2SeO3基本一致。此外，产生的荧光强度与Na2SeO3浓度呈正比(如图27所示)。上述结果说明，探针Fsec-3与硒半胱氨酸响应较快，产生的荧光信号较强且比较稳定，而且能够实现活体中内源性硒半胱氨酸的荧光成像。
4、肿瘤组织内Sec的荧光检测
流行病学和临床研究显示硒的摄入不足会增加罹患癌症的风险。硒具有抗肿瘤活性，这可能与抗炎、抗氧化有关，但是硒化物的抗癌机制尚未阐明。有研究表明，硒的抗肿瘤活性与亚硒酸盐的活性代谢产物密切相关。Sec是Na2SeO3的重要代谢产物，在抗肿瘤活性中发挥重要作用。因此，为了探索硒化物的抗癌机制，监测肿瘤组织中Sec水平的动态变化是至关重要的。构建裸鼠移植瘤模型，裸鼠瘤内注射Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)作对照组；瘤内注射Na2SeO3(5mM,100μL saline)，6h后再瘤内注射探针Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)，用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。结果表明(如图28所示)，对照组的肿瘤组织中未见荧光信号；当瘤内注射Na2SeO3于6h后再瘤内注射探针，在肿瘤组织内可见较强的荧光(15倍)，这说明Sec是Na2SeO3在体内的代谢产物。
裸鼠尾静脉注射Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)作对照组；另外三组，瘤内注射Na2SeO3(5mM,100μL saline)，分别于1h,2h,6h后，再尾静脉注射探针Fsec-3(5mM,100μL saline,3％DMSO,1％Tween 80)，用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。发现对照组的肿瘤组织中未见荧光信号；瘤内注射Na2SeO3以及尾静脉注射Fsec-3的裸鼠肿瘤组织内可见明显的荧光信号，且随着Na2SeO3注射后时间的延长，产生的荧光信号逐渐增强(4,6.4,12.4倍)(如图29所示)。上述结果表明Fsec-3探针可以作为监测肿瘤内硒半胱氨酸的有效分析工具。
本发明制备了能特异性识别硒半胱氨酸的近红外荧光探针Fsec-3。在磷酸缓冲液中，荧光强度与硒半胱氨酸浓度(0-100μM)呈现良好的线性关系，说明探针适合定量检测硒半胱氨酸；该探针具有较高的检测灵敏度(检测限20nM)和较好的选择性。探针Fsec-3还实现了人乳腺癌细胞MCF-7中硒半胱氨酸的荧光成像；在进一步的实验中，Fsec-3成功检测了小鼠体内内源性硒半胱氨酸。本发明还应用该探针检测了裸鼠移植瘤模型中肿瘤组织内的硒半胱氨酸水平。由此可见，Fsec-3是可视化和定量检测细胞、活体及肿瘤组织中硒半胱氨酸含量的有效工具。
Claims (14)
1.一种近红外荧光探针，其探针的结构式如下所示：
2.一种权利要求1所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
第一步：在浓硫酸和高氯酸存在的条件下，化合物Ⅰ与环己酮进行反应，制备化合物Ⅱ；
第二步：在哌啶存在的条件下，化合物Ⅱ与化合物Ⅲ进行反应，制备化合物NIR-MNH2；
第三步：在吡啶存在的条件下，化合物NIR-MNH2与化合物Ⅳ进行反应，制备化合物Fsec-3。
4.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第一步中，化合物Ⅰ与环己酮的摩尔比为1:1～4；反应的温度为70～120℃；反应时间为1～4h。
5.根据权利要求4所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第一步中，化合物Ⅰ与环己酮的摩尔比为1:1.5～2.5；反应的温度为80～100℃；反应时间1～2h。
6.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第一步中，化合物Ⅰ与浓硫酸的摩尔比为1:20～80；化合物Ⅰ与高氯酸的摩尔比为1:2～10。
7.根据权利要求6所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第一步中，化合物Ⅰ与浓硫酸的摩尔比为1:35～55；化合物Ⅰ与高氯酸的摩尔比为1:3～5。
8.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第二步中，化合物Ⅱ与化合物Ⅲ的摩尔比为1:1～4；化合物Ⅱ与哌啶的摩尔比为1:0.05～0.5；反应的温度为70～120℃；反应时间为6～24h。
9.根据权利要求8所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第二步中，化合物Ⅱ与化合物Ⅲ的摩尔比为1:1.5～2.5；化合物Ⅱ与哌啶的摩尔比为1:0.08～0.15；反应的温度为80～90℃；反应时间为8～16h。
10.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第三步中，化合物NIR-MNH2与化合物Ⅳ的摩尔比为1:2.5～7.0；化合物NIR-MNH2与吡啶的摩尔比为1:3.5～7.5。
11.根据权利要求10所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第三步中，化合物NIR-MNH2与化合物Ⅳ的摩尔比为1:4.0～5.0；化合物NIR-MNH2与吡啶的摩尔比为1:4.5～5.5。
12.根据权利要求3所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，在第三步中，化合物NIR-MNH2与吡啶在-5～5℃进行反应5～30min后，再与化合物Ⅳ在室温进行反应4～12h。
13.权利要求1所述的近红外荧光探针作为制备检测硒半胱氨酸的试剂中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述的近红外荧光探针在制备检测细胞、活体及肿瘤组织中硒半胱氨酸的试剂中的应用。
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