CN110423281B

CN110423281B - 用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物

Info

Publication number: CN110423281B
Application number: CN201910705207.1A
Authority: CN
Inventors: 杨阳; 魏于全
Original assignee: Chengdu Jinweike Biological Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Jinweike Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: CN110423281A

Abstract

本发明公开了用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物，涉及基因治疗技术领域。本发明公开的用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白，其包括选自VEGFR1的结构域1和结构域2、选自VEGFR2的结构域3以及选自免疫球蛋白的Fc片段。该融合蛋白可以治疗老年性黄斑变性，具有用量少、作用持续、低免疫风险等特点。

Description

用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物

技术领域

本发明涉及基因治疗技术领域，具体而言，涉及用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物。

背景技术

老年性黄斑变性(AMD)是人类进入老龄化社会后，日益凸显的一种严重性眼部疾病，是50岁以上人群常见的眼部疾病，也是导致视力丧失的主要原因。根据是否有异常新生血管的存在，临床上分为萎缩性或称干性AMD，以及渗出性或称湿性AMD(wAMD)两种类型。干性AMD是逐渐的视力丧失，占90％，湿性AMD病程发展迅速，是引起视力丧失的最主要因素之一，仅占10％，但它所导致的失明占到了所有因AMD导致的失明的90％以上。数据显示，到2020年，全球黄斑变性患者人数约2亿人，预计到2040年，会增加至3亿人，成为老年人失明的主要罪魁祸首。中国45岁以上人群中的AMD患病率为2.44％-18.98％，而城市中脑力劳动者发生率较高，随着人口老年化进程的加快，到2050年，中国黄斑变性患者总数约5500万人。另一方面，电子世界的高能量蓝光穿透眼睛的角膜和晶状体到达视网膜，最先使大脑兴奋而不感觉疲劳，长时间视力衰减可诱发眼睛疲劳、干眼征、生物钟紊乱，直接穿透晶状体到达视网膜会加速对黄斑区造成伤害，导致了眼晴黄斑区损伤程度的加速，从而加大AMD病程的年青化和扩大化。AMD已成为第三大致盲性眼病，列为全球努力探索研究的疾病领域之一。

湿性AMD主要为异常的新生血管在黄斑部的视网膜下生长，称为脉络膜新生血管(CNV)，导致黄斑区局部水肿或出血引起黄斑区的隆起和局限性色素上皮脱离。最终导致疤痕形成，损伤视网膜感光细胞从而引起视力丧失。故通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)，阻断病变新生血管的生长，可有效治疗眼底病。

湿性AMD的公认的一线疗方式为玻璃体内注射蛋白类VEGF抑制剂。目前，用于治疗湿性AMD的蛋白类VEGF抑制剂主要产品有罗氏的贝伐单抗(bevacizumab)、罗氏/诺华的Fab抗体片段Lucentis、再生元的VEGFR-Fc(VEGF-trap)融合蛋白aflibercept以及四川康弘药业的VEGFR-Fc融合蛋白Conbercept。

已上市的VEGF靶点药物

尽管VEGF抑制剂的出现带给了湿性AMD领域革命性的进展，但是问题依然存在。首先，眼内注射VEGF中和蛋白可以减少渗漏，提高视力，然而，VEGF的产生是一个持续缓慢的过程，因此当VEGF中和蛋白在玻璃体中的浓度低于治疗水平时，渗漏和新生血管生长复发；其次，频繁玻璃腔体内的VEGF抑制剂注射，对于医生和患者都是巨大负担；再者，蛋白类药物价格昂贵，以阿柏西普为例，每年需注射8次，价格达到6万元/人/年；另外，临床上研究发现，抗VEGF药物进行治疗四年及以上的长期预后欠佳，VEGF抑制剂耐药也是一个巨大的问题。如何降低给药频次、开发新的给药途径以及减少耐药情况的发生，是目前湿性AMD治疗面临的主要瓶颈。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白。该融合蛋白可以治疗老年性黄斑变性，具有用量少、作用持续、低免疫风险等特点。

本发明的另一目的在于提供一种核酸分子。该核酸分子可以表达上述的融合蛋白，具有表达效率高的特点。

本发明的另一目的在于提供一种表达盒。该表达盒可以表达出上述融合蛋白，具有表达效率高的特点。

本发明的另一目的在于提供一种载体。该载体可以表达出上述融合蛋白，具有表达效率高、表达持续、用量少的特点。

本发明的另一目的在于提供一种治疗老年性黄斑变性的药物。该药物可以治疗老年性黄斑变性，具有用量少、作用持续、低免疫风险等特点。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于老年性治疗黄斑变性的融合蛋白，其包括选自VEGFR1(VEGF受体1)的结构域1和结构域2、选自VEGFR2(VEGF受体2)的结构域3以及选自免疫球蛋白的Fc片段。

本发明提供的融合蛋白通过对功能蛋白的结构优化，其能够实现对老年性黄斑变性的治疗，具有用量少、作用持续、低免疫风险等特点。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，选自VEGFR1的所述结构域1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

优选的，所述结构域1位于所述融合蛋白的N端；

优选的，所述融合蛋白的N端至C端依次为所述结构域1、所述结构域2、所述结构域3以及所述Fc段；

优选的，选自VEGFR1的所述结构域2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

优选的，选自VEGFR2的所述结构域3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

优选的，所述免疫球蛋白为人IgG1；

优选的，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；

优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码如上所述的融合蛋白。

优选的，所述核酸分子的碱基序列SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的核酸分子通过对碱基序列的优化，其能够在高效率地表达上述融合蛋白，提高治疗效果，且有利于降低递送该核酸分子至体内的载体(例如病毒载体)的使用剂量，有助于降低免疫风险。

第三方面，本发明提供了一种表达盒，其含有如上所述的核酸分子以及驱动所述核酸分子表达的启动子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述启动子为CB7启动子；

优选的，所述CB7启动子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的，所述表达盒还含有Kozak序列，所述Kozak序列位于所述启动子的下游且位于所述核酸分子的上游；

优选的，所述表达盒还含有内含子序列；所述内含子序列位于所述启动子的下游且位于所述Kozak序列的上游；

优选的，所述表达盒含还有终止子；所述终止子位于所述核酸分子的下游；

优选的，所述终止子为SV40 polyA。

本发明提供的表达盒通过对各表达元件的优化，其能够在高效率地表达上述融合蛋白，提高治疗效果，且有利于降低递送该表达盒至体内的载体(例如病毒载体)的使用剂量，有助于降低免疫风险。

第四方面，本发明提供了一种载体，其含有如上所述的表达盒。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体为质粒载体或病毒载体。

优选的，所述病毒载体为重组腺相关病毒载体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述重组腺相关病毒载体选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10中的任意一种；

优选的，所述重组腺相关病毒载体为AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。

腺相关病毒(AAV)是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。重组腺相关病毒载体(rAAV)是将AAV中的cap和rep基因替换成目标基因，目标基因不插入细胞的染色体中，以独立的染色体外DNA附加体的形式保留在细胞核中。由于其安全性好、宿主细胞范围广，能感染分裂和非分裂细胞、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因治疗载体，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。也为眼内基因传递提供了一个有吸引力的工具。

鉴于VEGF-trap拮抗VEGF治疗湿性AMD的原理及AAV载体在单基因疾病中的临床应用，本发明利用AAV载体将上述核酸分子递送至视网膜层细胞并实现高效表达，且使用剂量更低、降低免疫风险，可以达到有效治疗AMD的目的。

第五方面，本发明提供了一种治疗老年性黄斑变性的药物，其含有如上所述的融合蛋白、或如上所述的载体；

优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述药物的剂型为注射剂；

优选的，所述药物的剂型为适用于采用玻璃体腔或视网膜下注射的注射剂。

该药物可以治疗老年性黄斑变性，具有用量少、作用持续、低免疫风险等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的表达载体的结构示意图。

图2为本发明实施例1的对照载体1的结构示意图。

图3为本发明实施例1的对照载体2的结构示意图。

图4为本发明实施例1的对照载体3的结构示意图。

图5为本发明实施例1的对照载体4的结构示意图。

图6为本发明实施例1中的各载体的蛋白表达效率的检测结果。图中：Untreated代表：未转染质粒组。

图7为本发明实施例2中的表达载体体外表达VEGF中和蛋白对HUVEC增殖的影响；图中：阴性对照代表未加VEGF-165刺激HUVEC增殖组，阳性对照代表仅加VEGF-165刺激HUVEC增殖组，Untreated代表加入VEGF-165刺激HUVEC增殖后，再加入未转染HEK293细胞的上清处理。各实施例中的Untreated组均代表是未转染HEK293细胞的上清。

图8为本发明实施例3中的表达载体体外表达VEGF中和蛋白对HUVEC成管的影响。图中：EGM2代表：EGM2培养基处理的阳性对照组。

图9为本发明实施例4中的表达载体体外表达VEGF中和蛋白对HUVEC迁移的影响。图中：oh control代表：划痕0小时对照组；未加糖代表：未加糖诱导HUVEC迁移的阴性对照组，高糖代表：加入高糖诱导HUVEC迁移的阳性对照组；Untreated代表：加入未转染HEK293细胞的上清处理。

图10为本发明实施例5中的表达载体体外表达VEGF中和蛋白对VEGF的亲和力检测结果。

图11为本发明实施例7中的重组腺相关病毒载体的体内表达VEGF中和蛋白的检测结果。

图12为本发明实施例8中的给予重组腺相关病毒载体后在不同时间下检测猴子右眼中的VEGF中和蛋白的结果。

图13为本发明实施例8中对脉络膜新生血管模型猴子给予重组腺病毒载体治疗前后的荧光素眼底血管造影术检查结果。

图14为实施例1中的表达VEGF中和蛋白基因的AAV包装质粒的结构图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

(1)表达载体的结构

本实施例提供的表达载体含有表达用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白的核酸分子，其结构如图1所示，其从5’端至3’端含有：CB7启动子、内含子、Kozak序列(gccacc)、VEGFR1的结构域1、VEGFR1的结构域2、VEGFR2的结构域3、免疫球蛋白人IgG1的Fc片段以及SV40 polyA。其中，CB7启动子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，内含子的碱基序列如SEQ IDNO.3所示，VEGFR1的结构域1的编码序列如SEQ ID NO.4所示，VEGFR1的结构域2的编码序列如SEQ ID NO.5所示、VEGFR2的结构域3的编码序列如SEQ ID NO.6所示、免疫球蛋白IgG1的Fc片段的编码序列如SEQ ID NO.7所示。

上述表达载体所表达的可治疗老年性黄斑变性的融合蛋白的结构从N端至C端依次为：VEGFR1的结构域1和结构域2、VEGFR2的结构域3以及选自免疫球蛋白人IgG1的Fc片段；该融合蛋白(后文称为VEGF中和蛋白)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；VEGFR1的结构域1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、VEGFR1的结构域2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、VEGFR2的结构域3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示、免疫球蛋白人IgG1的Fc片段如SEQ ID NO.12所示。编码该融合蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。(2)表达载体的构建

构建表达盒，通过酶切、连接、转化和克隆筛选鉴定等常规分子生物学操作构建了表达VEGF中和蛋白基因的AAV包装质粒(见图14)，其依次包括：CB7启动子、内含子、Kozak序列、选自VEGFR1的结构域1、选自VEGFR1的结构域2、选自VEGFR2的结构域3、选自免疫球蛋白IgG1的Fc片段以及SV40 polyA，表达盒两侧是反向末端重复序列(ITR)，其结构图示意图见图1，SphI和AgeI为酶切位点。

(3)表达载体的体外表达效率

将120ng上述表达载体在96孔板中转染HEK293细胞，48h后收集细胞上清，用ELISA法检测VEGF中和蛋白含量，并设置对照载体(对照载体1-4)，比较这些载体的表达蛋白的效率；

对照载体1-4的结构分别如图2-5所示：

对照载体1相较于本实施例1的表达载体缺少表达VEGFR1的结构域1和VEGFR2的结构域3的核酸分子；对照载体1所表达的蛋白命名为融合蛋白A，其由VEGFR1的结构域2和免疫球蛋白人IgG1的Fc片段构成。

对照载体2相较于本实施例1的表达载体缺少表达VEGFR1的结构域1的核酸分子；对照载体2所表达的蛋白命名为融合蛋白B(即阿柏西普蛋白)，其由VEGFR1的结构域2、VEGFR2的结构域3和免疫球蛋白人IgG1的Fc片段构成。

对照载体3相较于本实施例1的表达载体在Fc片段下游增加了WPRE序列和bGH调控序列。

WPRE序列如SEQ ID NO.13所示，bGH调控序列如SEQ ID NO.14所示。

对照载体4相较于本实施例的表达载体用CMV启动子代替了CB7启动子；对照载体3和4所表达的蛋白与本实施例1表达载体所表达的融合蛋白结构一致。

结果如图6所示，结果显示本实施例的表达载体所表达VEGF中和蛋白的含量是对照载体1、2、3和4表达VEGF中和蛋白含量的2-2.4倍，该结果充分说明本发明实施例1所提供的表达载体能有效提高表达VEGF中和蛋白的效率。

实施例2

表达载体体外表达VEGF中和蛋白对HUVEC增殖的影响

使用EGM2完全培养基将细胞悬液稀释至1.5×10⁴个/ml，200μl/孔铺96孔板，细胞贴壁4h后，将孔内培养基更换为100μl M199+5％FBS培养基；37℃孵箱培养24h，换液24h后，吸弃M199+5％FBS培养基，加入100ul含10ng/ml VEGF165(VEGF165对HUVECS起到促进增殖的作用，购自上海普欣生物)和由实施例1表达载体于6孔板转染HEK293细胞48h的所收集的细胞上清(VEGF中和蛋白在100ul的细胞上清中的浓度是22000pM)，上清中含该载体表达的VEGF中和蛋白。37℃孵箱培养72h，检测细胞增殖情况，研究实施例1的表达载体所表达的VEGF中和蛋白对10ng/ml的VEGF-165刺激的HUVECs增殖的影响，以对照载体2表达的含融合蛋白B的细胞上清和阿柏西普(规格：40mg/ml，4mg，0.1ml；购自：拜耳)作为对照。

结果如图7所示，实施例1的表达载体表达的VEGF中和蛋白、对照载体2表达的融合蛋白B与阿柏西普处理组均能有效抑制VEGF-165刺激下的HUVECs增殖，各处理组间抑制效果无显著差异。说明，实施例1表达载体表达的VEGF中和蛋白可以达到与阿柏西普相同的效果。

实施例3

表达载体体外表达VEGF中和蛋白对HUVEC成管的影响

将Matrigel基质胶(50μl/孔)铺到96孔板中，37℃孵育1h后，将分别用500ng/ml的对照载体2表达的含融合蛋白B的细胞上清、实施例1表达载体表达的含VEGF中和蛋白的转染上清和阿柏西普处理的各组HUVECs细胞接种到底部铺有Matrigel的96孔板中，置于37℃、5％CO₂孵箱内孵育8h，观察各处理组的HUVECs细胞管状物的形成情况，并在显微镜下拍照，评价各自对经过VEGF-165刺激后的HUVECs细胞成管能力的影响。结果发现候实施例1的表达载体表达的VEGF中和蛋白、对照载体2表达的融合蛋白B和阿柏西普处理组均能有效抑制HUVECs管腔的形成(见图8)。

实施例4

表达载体体外表达VEGF中和蛋白对HUVEC迁移的影响

利用划痕实验研究、将对照载体2的转染上清、实施例1表达载体的转染上清和阿柏西普(三个处理的蛋白浓度均为500ng/ml)分别对高糖诱导的HUVECs细胞迁移能力的影响。划痕24h后，结果发现对照载体2的转染上清、实施例1表达载体的转染上清和阿柏西普处理组在500ng/ml蛋白浓度下，均能有效抑制高糖诱导的HUVECs迁移(见图9)。

实施例5

表达载体体外表达VEGF中和蛋白对VEGF的亲和力

通过在HEK293细胞中转染对照载体2和实施例1表达载体，收集细胞上清，以阿柏西普为阳性对照，用相同VEGF中和蛋白摩尔浓度的上清分别与等量的VEGF反应，检测反应液中剩余VEGF含量，绘制各蛋白浓度下对应剩余的VEGF含量曲线，从而评价VEGF中和蛋白与VEGF结合亲和性。结果显示对照载体2的融合蛋白B和实施例1表达载体表达的VEGF中和蛋白与阿柏西普在不同蛋白浓度下与VEGF165结合活性一致(见图10)。

实施例6

AAV病毒制备与纯化

参考Martin Lock等报道包装和纯化重组AAV病毒的方法，采用PEI将AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV2/2)、辅助质粒(pAdΔF6)和实施例1表达载体，共转染HEK293细胞包装制备出重组腺相关病毒，转染48h后，收获细胞和培养上清，使用碘克沙醇超速梯度离心纯化AAV病毒[Martin Lock,Mauricio Alvira,Luk H.Vandenberghe.Rapid,Simple,andVersatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors atScale.HUMAN GENE THERAPY,2010.21:1259–1271]，得到重组腺相关病毒载体，用探针法测定病毒滴度。

实施例7

重组腺相关病毒载体的体内表达检测

分别在6周龄老鼠玻腔内注射9×10⁹GC/eye、3×10⁹GC/eye和1×10⁹GC/eye滴度的实施例6的重组腺相关病毒载体，于注射后6周处死老鼠，检测眼内VEGF中和蛋白的表达，结果显示表明在低至1×10⁹GC/eye的使用剂量下，眼内VEGF中和蛋白的表达量达到3.53ng/ml；3×10⁹GC/eye的使用剂量下为21.77ng/ml，9×10⁹GC/eye的使用剂量下为42.71ng/ml。现有技术报道以相同注射剂量相同方式注射，眼内VEGF中和蛋白表达量仅为0.65ng/ml(PPechan1,H Rubin.Novel anti-VEGF chimeric molecules delivered by AAV vectorsfor inhibition of retinal neovascularization.Gene Therapy(2009)16,10–16)。由此说明，本发明实施例6的重组腺相关病毒载体能够高效率地在体内表达VEGF中和蛋白(见图11)。

实施例8

重组腺相关病毒载体的体内治疗效果检测

对2只3-6岁恒河猴(分别命名为猴1和猴2)，每只恒河猴的左眼玻璃体注射注射表达EGFP的对照病毒载体(该对照病毒载体相较于实施例6的重组腺相关病毒载体的差异在于用EGFP代替了VEGF中和蛋白，表达EGFP的病毒载体起对照作用，消除无关序列及病毒对治疗效果的影响。)、右眼玻璃体注射实施例6的重组腺相关病毒载体，分别给予4×10¹⁰GC/eye剂量，给药前、给药后第2、4、9周取房水及血清，使用VEGF neutralizing protein-ELISA法检测每只猴子各时间点房水中VEGF中和蛋白含量，结果显示每只猴子注射实施例6的重组腺相关病毒载体的右眼均成功表达VEGF中和蛋白，VEGF中和蛋白表达量见表1，在第9周时表达量上升至1781.9ng/mL，左眼未检测到VEGF中和蛋白表达(见图12)。

表1给药后不同时间下的房水中VEGF中和蛋白表达量

	第2周	第4周	第9周
				猴1	179.67ng/mL	857.88ng/mL	1781.9ng/mL
猴2	128ng/mL	308.9ng/mL	1372.18ng/mL

于给药后第6周对每只眼睛进行激光光凝脉络膜新生血管(CNV)建模，建模后2天荧光造影检查建模情况，于第9周荧光造影评估检查荧光素渗漏面积改善率和荧光素渗漏面积减少量以评估实施例6的重组腺相关病毒载体对猴子CNV模型的治疗效果。结果显示(见图13)，注射对照病毒载体的猴子左眼荧光渗漏严重，渗漏率达33％，而注射实施例6的重组腺相关病毒载体的猴子右眼荧光渗漏正逐渐消失，渗漏率为0％。说明实施例6的重组腺相关病毒载体能有效阻止血管渗漏，达到治疗CNV的目的。

现有方案中使用阿柏西普编码序列，其最初被设计为体外生产阿柏西普蛋白注射剂，利用rAAV基因递送技术将阿柏西普蛋白的编码基因直接递送至眼内。目前通常都是通过各表达元件的优化来提升阿柏西普蛋白在眼内的表达，然而单纯通过表达元件的优化提升蛋白表达都很有限。Ruslan Grishanin等通过猴子眼内注射高达2×10¹²GC/eye剂量的AAV重组病毒来实现阿柏西普蛋白，在眼内的表达量达5800ng/mL(均值3400ng/mL，但其注射剂量为本发明注射剂量的50倍)，然而，注射高剂量病毒有增加机体发生免疫反应的风险；Michael Lukason等报道猴子注射2×10¹⁰GC/eye剂量的AAV2-sFLT01，结果猴子眼内sFLT01蛋白表达量极低。这说明目前在眼内通过AAV递送阿柏西普表达序列或sFLT01表达序列均存在目的蛋白表达效率低下的问题。

在本发明的实施例中我们对VEGF中和蛋白基因进行优化改造，结合对基因表达盒的优化，利用rAAV作为基因递送载体，在视网膜或视神经节细胞中，实现VEGF中和蛋白高效持续表达，从而持续抑制新生血管，达到治疗wAMD的目的。通过提高目的基因VEGF中和蛋白的表达，并持续表达VEGF中和蛋白(在注射后的第2周以后有表达且表达量随时间推移升高，见图12)，减少rAAV载体用量，进而降低免疫的风险。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都金唯科生物科技有限公司

<120> 用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtttctt actgggatac cggcgtgctg ctgtgtgccc tgctgtcttg tctgctgctg 60

accggctcta gcagcggcag caagctgaag gatcccgagc tgagcctgaa gggcacccag 120

catattatgc aggccggcca gacactgcac ctccagtgta gaggcgaagc cgctcacaaa 180

tggtccctgc ctgagatggt gtccaaagag agcgagcggc tgagcatcac caagagcgcc 240

tgtggcagaa acggcaagca gttctgcagc accctgacac tgaatactgc ccaggccaac 300

cacaccggct tctacagctg caagtatctg gccgtgccta ccagcaagaa gaaagaaacc 360

gagagcgcca tctacatctt catctctgat accggcagac ccttcgtgga aatgtacagc 420

gagatccccg agatcatcca catgaccgag ggcagagagc tggtcatccc ctgcagagtg 480

acaagcccca acatcaccgt gactctgaag aagttccctc tggacacact gatccccgac 540

ggcaagagaa tcatctggga cagccggaag ggcttcatca tcagcaacgc cacctacaaa 600

gagatcggcc tgctgacctg tgaagccacc gtgaatggcc acctgtacaa gaccaactac 660

ctgacacaca gacagaccaa caccatcatc gacgtggtgc tgagccctag ccacggcatt 720

gaactgtctg tgggcgagaa gctggtgctg aactgtaccg ccagaaccga gctgaacgtg 780

ggcatcgact tcaactggga gtaccccagc agcaagcacc agcacaagaa actggtcaac 840

cgggacctga aaacccagag cggcagcgag atgaagaaat tcctgagcac cctgaccatc 900

gacggcgtga ccagatctga ccagggcctg tatacttgtg ccgccagctc tggcctgatg 960

accaagaaaa acagcacctt cgtgcgggtg cacgagaagg acaagaccca cacctgtcct 1020

ccatgtcctg ctccagaact gctcggcgga ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 1080

aaggacaccc tgatgatcag cagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc 1140

cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 1200

aagaccaagc ctagagagga acagtacaat agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1260

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 1320

ctgcctgctc ctatcgagaa aaccatctcc aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag 1380

gtttacacac tgcctccaag cagggacgag ctgacaaaga accaggtgtc cctgacctgc 1440

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct 1500

gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac 1560

agcaagctga cagtggacaa gagcagatgg cagcagggaa acgtgttcag ctgcagcgtg 1620

atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgagcctgtc tcctggcaaa 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360

acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 420

ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 480

cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 540

ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 600

agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc 660

gggcgg 666

<210> 3

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 60

cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc 120

cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 180

gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 240

tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 300

gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg 360

gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 420

gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc 480

cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg 540

gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg 600

ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg 660

gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc 720

agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 780

cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg 840

gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc 900

ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 960

ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 1020

tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaag 1065

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggtttctt actgggatac cggcgtgctg ctgtgtgccc tgctgtcttg tctgctgctg 60

accggctcta gcagcggcag caagctgaag gatcccgagc tgagcctgaa gggcacccag 120

catattatgc aggccggcca gacactgcac ctccagtgta gaggcgaagc cgctcacaaa 180

tggtccctgc ctgagatggt gtccaaagag agcgagcggc tgagcatcac caagagcgcc 240

tgtggcagaa acggcaagca gttctgcagc accctgacac tgaatactgc ccaggccaac 300

cacaccggct tctacagctg caagtatctg gccgtgccta ccagcaagaa gaaagaaacc 360

gagagcgcca tctacatctt catc 384

<210> 5

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctgataccg gcagaccctt cgtggaaatg tacagcgaga tccccgagat catccacatg 60

accgagggca gagagctggt catcccctgc agagtgacaa gccccaacat caccgtgact 120

ctgaagaagt tccctctgga cacactgatc cccgacggca agagaatcat ctgggacagc 180

cggaagggct tcatcatcag caacgccacc tacaaagaga tcggcctgct gacctgtgaa 240

gccaccgtga atggccacct gtacaagacc aactacctga cacacagaca gaccaacacc 300

<210> 6

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcattgaac tgtctgtggg cgagaagctg 60

gtgctgaact gtaccgccag aaccgagctg aacgtgggca tcgacttcaa ctgggagtac 120

cccagcagca agcaccagca caagaaactg gtcaaccggg acctgaaaac ccagagcggc 180

agcgagatga agaaattcct gagcaccctg accatcgacg gcgtgaccag atctgaccag 240

ggcctgtata cttgtgccgc cagctctggc ctgatgacca agaaaaacag caccttcgtg 300

cgggtgcacg agaag 315

<210> 7

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacaagaccc acacctgtcc tccatgtcct gctccagaac tgctcggcgg accttccgtg 60

ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc 120

tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac 180

ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa tagcacctac 240

agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 300

tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct cctatcgaga aaaccatctc caaggccaag 360

ggccagccta gggaacccca ggtttacaca ctgcctccaa gcagggacga gctgacaaag 420

aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa 480

tgggagagca atggccagcc tgagaacaac tacaagacaa cccctcctgt gctggacagc 540

gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg acagtggaca agagcagatg gcagcaggga 600

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 660

ctgagcctgt ctcctggcaa ataa 684

<210> 8

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr

35 40 45

Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro

50 55 60

Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala

65 70 75 80

Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr

85 90 95

Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val

100 105 110

Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile

115 120 125

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

130 135 140

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

145 150 155 160

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

165 170 175

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

180 185 190

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

195 200 205

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

210 215 220

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

225 230 235 240

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

245 250 255

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

260 265 270

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

275 280 285

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

290 295 300

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

305 310 315 320

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

325 330 335

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

340 345 350

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

355 360 365

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

370 375 380

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

385 390 395 400

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

405 410 415

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

420 425 430

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

435 440 445

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

450 455 460

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

465 470 475 480

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

485 490 495

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

500 505 510

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

515 520 525

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

530 535 540

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550 555 560

<210> 9

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr

35 40 45

Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro

50 55 60

Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala

65 70 75 80

Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr

85 90 95

Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val

100 105 110

Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile

115 120 125

<210> 10

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr

100

<210> 11

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val

1 5 10 15

Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val

20 25 30

Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys

35 40 45

Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys

50 55 60

Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln

65 70 75 80

Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn

85 90 95

Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys

100 105

<210> 12

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 13

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 60

tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 120

ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 180

gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 240

cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 300

ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 360

gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct 420

gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 480

cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 540

tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcat 595

<210> 14

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 60

tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 120

attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 180

aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gc 232

Claims

1.一种表达盒，其特征在于，其含有核酸分子以及位于所述核酸分子上游驱动所述核酸分子表达的启动子，所述核酸分子编码融合蛋白；所述融合蛋白由选自VEGFR1的结构域1和结构域2、选自VEGFR2的结构域3以及选自免疫球蛋白的Fc片段组成；所述融合蛋白的N端至C端依次为所述结构域1、所述结构域2、所述结构域3以及所述Fc片段；选自VEGFR1的所述结构域1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，选自VEGFR1的所述结构域2的氨基酸序列如SEQID NO.10所示，选自VEGFR2的所述结构域3的氨基酸序列为如SEQ ID NO.11所示，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述启动子为CB7启动子；

所述表达盒还含有Kozak序列、内含子序列和终止子；

所述Kozak序列位于所述启动子的下游且位于所述核酸分子的上游；所述内含子序列位于所述启动子的下游且位于所述Kozak序列的上游；所述终止子位于所述核酸分子的下游；所述终止子为SV40 polyA；

其中，所述CB7启动子的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述内含子的碱基序列如SEQID NO.3所示，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的表达盒。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为质粒载体或病毒载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述病毒载体为重组腺相关病毒载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体选自AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体为AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。

7.一种治疗老年性黄斑变性的药物，其特征在于，其含有权利要求2-6任一项所述的载体。

8.根据权利要求7所述的治疗老年性黄斑变性的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求7或8所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为适用于采用玻璃体腔或视网膜下注射的注射剂。