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CN110420316A - 参与金黄色葡萄球菌杀白细胞素的细胞毒性的细胞因素：新型治疗靶点 - Google Patents

参与金黄色葡萄球菌杀白细胞素的细胞毒性的细胞因素：新型治疗靶点 Download PDF

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CN110420316A
CN110420316A CN201910629216.7A CN201910629216A CN110420316A CN 110420316 A CN110420316 A CN 110420316A CN 201910629216 A CN201910629216 A CN 201910629216A CN 110420316 A CN110420316 A CN 110420316A
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V·J·托雷斯
T·雷耶斯-罗布莱斯
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New York University NYU
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Abstract

本发明涉及在对象中治疗和预防金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法，所述方法包括施用抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1/CXCR2和DARC细胞受体相互作用的组合物。本发明还涉及用于实现这些和其他方法的新型组合物。

Description

参与金黄色葡萄球菌杀白细胞素的细胞毒性的细胞因素：新 型治疗靶点
本申请是申请号为201480045457.2、申请日为2014年6月18日、发明名称为“参与金黄色葡萄球菌杀白细胞素的细胞毒性的细胞因素：新型治疗靶点”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/043021的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2013年6月18日，申请号为61/836,516的美国临时申请的优先权。
发明领域
本发明涉及治疗和预防金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染的方法，以及鉴定用于治疗和预防金黄色葡萄球菌感染的新疗法的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus(S.aureus))是共生地定植在25％以上人群中的细菌。一旦进入血液中，金黄色葡萄球菌的传播会导致众多疾病。金黄色葡萄球菌是导致院内感染的主要原因，是感染性心内膜炎以及皮肤和软组织感染最常见的病原体，并且是导致食源性疾病的四大因素之一。总之，估计在美国的医院中每年有超过120万名患者感染金黄色葡萄球菌。由于出现了抗生素耐药菌株(即MRSA株)金黄色葡萄球菌对人类健康的威胁进一步突显，包括对万古霉素耐药的菌株，这种抗生素被认为是抵抗金黄色葡萄球菌感染的最后防线。这些事实凸显了研发针对这种重要病原体的新型疗法的重要性。
金黄色葡萄球菌作为人类病原体的成功之处部分地在于这种细菌能够通过产生大量分泌进入细胞外环境中的毒力因子清除宿主的免疫系统(Foster,T.J.“ImmuneEvasion by Staphylococci,”Nat.Rev.Microbiol.3:948-58(2005))。其中，对双组分、形成孔的白细胞毒素尤其引人注目，因为其靶向并杀伤参与感染控制的多种免疫细胞(Vandenesch等，“Staphylococcus aureus Hemolysins,Bi-Component Leukocidins,andCytolytic Peptides:A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging VirulenceFactors？”Front.Cell.Infect.Microbiol.2:12(2012)；Alonzo&Torres,“BacterialSurvival Amidst an Immune Onslaught:TheContribution of the Staphylococcusaureus Leukotoxins.PLoS Pathog.9:e1003143(2013))。在这些免疫细胞中，白细胞毒素杀死称为“PMN”的多型核细胞，该细胞通过吞噬的方式杀灭入侵的微生物，因此其作为感染的初始屏障发挥作用(Rigby&DeLeo,“Neutrophils in Innate Host Defense AgainstStaphylococcus aureus Infections,”Semin.Immunopathol.34:237-59(2012))。
每个白细胞毒素由两个亚基组成，“S”和“F”型，其一起作用在靶细胞膜上形成八聚体孔(Yamashita等，“Crystal Structure of the Octameric Pore of StaphylococcalGamma-Hemolysin Reveals the Beta-Barrel Pore Formation Mechanism by TwoComponents,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.108:17314-9(2011))，最终导致细胞死亡。临床相关的金黄色葡萄球菌菌株能够产生多达五种不同的双组分白细胞毒素：Panton-Valentine杀白细胞素(PVL或LukFS-PV)、杀白细胞素E/D(LukED)、γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)和杀白细胞素A/B(LukAB；也称为LukGH)(Vandenesch等，“Staphylococcus aureusHemolysins,Bi-Component Leukocidins,and Cytolytic Peptides:A RedundantArsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors？”Front.Cell.Infect.Microbiol.2:12(2012)；Alonzo&Torres,“Bacterial SurvivalAmidst an Immune Onslaught:The Contribution of the Staphylococcus aureusLeukotoxins.PLoS Pathog.9:e1003143(2013))。这些毒素均能够靶向并杀死人PMN，但是其也对其他白细胞显示出趋向性(Alonzo&Torres,“Bacterial Survival Amidst anImmune Onslaught:The Contribution of the Staphylococcus aureusLeukotoxins.PLoS Pathog.9:e1003143(2013)；Gravet等，“Characterization of aNovel Structural Member,LukE-LukD,of the Bi-Component StaphylococcalLeucotoxins Family,”FEBS Lett.436:202-8(1998)；Morinaga等，“Purification,Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong LeukocidalActivity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family,”Microbiol.Immunol.47:81-90(2003)；Perret等，“Cross-Talk Between Staphylococcusaureus Leukocidins-Intoxicated Macrophages and Lung Epithelial Cells TriggersChemokine Secretion in an Inflammasome-Dependent Manner,”Cell.Microbiol.14:1019-36(2012))，这表明金黄色葡萄球菌利用白细胞毒素耗尽负责保护机体避免感染的免疫细胞。除了白细胞以外，HlgAB、HlgCB和LukED也能够裂解红细胞(RBC)(Morinaga等，“Purification,Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With StrongLeukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family,”Microbiol.Immunol.47:81-90(2003))，其能够利用从RBC中释放的血红蛋白作为铁源供金黄色葡萄球菌体内生长(Torres等，“Staphylococcus aureus Fur Regulates theExpression of Virulence Factors That Contribute to the Pathogenesis ofPneumonia,”Infect.Immun.78:1618-28(2010))。
尽管对金黄色葡萄球菌白细胞毒素的细胞毒活性已经有超过一百年的研究，但是控制白细胞毒素对免疫细胞和RBC趋向性的细胞受体仍未被完全确定。
本发明旨在攻克现有技术中的这些和其他限制。
发明概述
本发明的第一个方面涉及一种在对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法。这种方法涉及选定患有金黄色葡萄球菌感染或存在其风险的对象，和在有效地在所述对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的条件下，向所述选定的对象施用抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1和CXCR2相互作用的组合物。
本发明的另一个方面涉及一种在对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法。这种方法涉及选定患有金黄色葡萄球菌感染或存在其风险的对象，和在有效地在所述对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的条件下，向所述选定的对象施用抑制金黄色葡萄球菌与达菲(Duffy)抗原趋化因子受体(DARC)相互作用的组合物。
本发明的另一个方面涉及一种治疗患有金黄色葡萄球菌感染的对象的方法。这种方法涉及从金黄色葡萄球菌感染的所述对象获得样品和对所述样品中CXCR1、CXCR2、DARC或其组合的表达水平进行定量。所述方法进一步涉及基于所述定量表达水平向所述对象施用治疗。
本发明的另一个方面涉及一种分离的杀白细胞素E(LukE)抗体，或其抗体结合片段，其中所述抗体或其结合片段与SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196对应的表位结合。
本发明的另一个方面涉及一种分离的HlgA抗体，或其抗体结合片段，其中所述抗体或其结合片段与SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192对应的表位结合。
本发明的另一个方面涉及一种组合物，所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的杀白细胞素E(LukE)蛋白或其多肽和药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面涉及一种组合物，所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的HlgA蛋白或其多肽和药学上可接受的载体。
在美国的医院中每年有超过120万名患者感染金黄色葡萄球菌，在美国每年约有4万例死亡。这种细菌是导致院内和社区获得性感染的主要原因；其是感染性心内膜炎、皮肤和软组织感染最常见的病原物；并且是导致食源性疾病的四大因素之一。由于出现了抗生素耐药菌株(包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA))，金黄色葡萄球菌对人类健康的威胁更加复杂化。这些事实强调了鉴定用于开发新型疗法的新靶点的重要性。本发明涉及发现了CXCR1、CXCR2和DARC是金黄色葡萄球菌毒力因子杀白细胞素ED(LukED)和γ-溶血素AB(HlgAB)的人细胞受体。此信息对金黄色葡萄球菌感染的治疗具有巨大的治疗意义。CXCR1/CXCR2主要存在于PMN表面上，其是参与金黄色葡萄球菌感染控制的第一个应答者。在PMN功能存在遗传缺陷的人类中观察到对金黄色葡萄球菌高度易感，这是证明PMN在避免金黄色葡萄球菌感染中的重要性的最佳证据(Rigby&DeLeo,“Neutrophils in Innate HostDefense Against Staphylococcus aureus Infections,”Semin.Immunopathol.34:237-59(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。本发明阻断LukED和HlgAB与CXCR1/CXCR2相互作用的方法和组合物将阻止LukED和HlgAB介导的对这些细胞的杀灭，这反过来会增强宿主免疫系统打击金黄色葡萄球菌感染的能力。此外，在内皮的表面上也发现了CXCR1、CXCR2和DARC，并且LukED-和HlgAB-介导的内皮细胞损伤可能会促进导致感染性休克的内皮血管通透性增加，这是导致败血症的金黄色葡萄球菌血液感染常见后果。因此，使用本发明的方法和组合物阻断LukED和HlgAB-介导的对内皮细胞的作用可能有助于金黄色葡萄球菌感染的治疗和预防。
附图简述
图1A-1G显示了LukED靶向CXCR1和CXCR2以杀灭单核细胞和PMN。在图1A中，使用PBS或LukED(75nM)孵育从Δ32Ccr5供体中分离的外周血单核细胞(PBMC)，并且门控为CD14和CD3阳性。图1B显示了在存在LukE、LukD或LukED(75nM)的条件下从Ccr5+或Δ32Ccr5供体分离的原代人中性粒细胞(PMN)的活力。图1C显示了全身感染同基因型金黄色葡萄球菌WT(N＝14)、ΔlukED(N＝15)或ΔlukED::lukED(N＝15)菌株的Ccr5+/+小鼠，和全身感染金黄色葡萄球菌WT(N＝10)或ΔlukED(N＝11)的Ccr5-/-小鼠活体的细菌负荷(CFU)。图1D显示转染了指示的趋化因子受体并使用LukED或LukSF-PV(600nM)孵育的HEK293T细胞的活力。图1E-1F显示了由流式细胞术确定的PMN(图1E)或单核细胞(图1F)表面的CXCR1和CXCR2水平。图1G显示经LukED处理的使用非靶向或Cxcr2shRNA转导的THP-1细胞的活力。*P<0.05，经单因素方差分析(图1C)。以平均值±s.e.m表示(n＝3)。
图2显示了马拉韦罗(MVC)对由LukED介导的单核细胞死亡没有保护作用。在经PBS(无毒素)、LukED(75nM)或者LukED(75nM)加MVC(100ng/mL)处理的CCR5+-门控PBMC中存在CD14+和CD3+细胞。
图3显示了LukED靶向CCR5、CXCR1、CXCR2和DARC以杀死宿主细胞。使用空质粒(pcDNA)，或者使用含有编码所述指示的趋化因子受体cDNA的质粒转染HEK293T细胞。然后将细胞暴露于LukED 1小时，并且通过溴化乙锭渗透性测定毒素介导的孔。
图4A-4B显示了HlgAB使用CXCR1、CXCR2和DARC以靶向并杀灭哺乳动物细胞。使用含有编码所述指示的趋化因子受体cDNA的质粒转染HEK293T细胞。然后将细胞暴露于指示的20μg/ml HlgAB(图4A)或HlgCB(图4B),并且通过溴化乙锭渗透性测定毒素介导的孔。
图5A-5C显示了在瞬时转染的HEK293T和THP-1细胞上若干经检测的趋化因子受体的表面水平。图5A显示了由流式细胞术评估的在瞬时转染的HEK293T细胞上的CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4的表面水平。图5B显示了由流式细胞术评估的在THP-1细胞上的CXCR1和CXCR2的表面水平。图5C显示了由流式细胞术确定的在Cxcr2shRNA-转导的THP-1细胞上的CXCR2水平。
图6A-6E显示了LukED经由LukE与CXCR1和CXCR2结合靶向PMN。图6A显示了由流式细胞术评估的GFP-LukE或GFP-LukD与PMN表面结合。图6B显示了由流式细胞术确定的在存在未标记的LukE或LukS-PV的条件下GFP-LukE(300nM)与PMN结合。图6C显示了在存在CXCL8或CXCL1的条件下使用致死剂量LukED(75nM)攻击后PMN的活力。图6D显示了在存在CXCL8的条件下GFP-LukE(300nM)与PMN表面结合。图6E是显示His-LukE或His-LukD与含有带有HA标签的CXCR1或CXCR2细胞裂解物相互作用的免疫印迹。免疫印迹是至少三次独立实验的代表性结果。以平均值±s.e.m表示(n＝3)。
图7显示了LukE不激活PMN上的钙信号。该图显示了由流式细胞术检测的加入LukE(300nM)、CXCL8(0.3nM)或CXCL1(0.3nM)后在PMN上的钙流情况。
图8是LukE和LukS-PV的氨基酸序列比对。保守的氨基酸以红色表示(非保守的氨基酸残基以X表示)。Rim结构域的差异区域(“DR”)如下所示：DR1(黄框)、DR2(灰框)、DR3(橙色框)、DR4(蓝框)和DR5(红框)。对比使用ClustalW法通过DNASTAR MegAlign软件产生。
图9A-9H显示了在差异区域4中的LukE氨基酸残基182-196是LukED靶向CXCR1和CXCR2+细胞所需的。图9A显示了LukE和LukS-PV的结构差异主要在rim结构域表面，如颜色梯度所示，其中高度差异残基的颜色为深蓝色，相同残基的颜色为红色而保守性取代具有中间色。图9B是LukE(3ROH，亮蓝)和LukS(1T5R，亮绿)的结构比对，其DR 1-5的氨基酸按照如下所示高亮显示：DR1(黄色，57-75)、DR2(灰色，139-150)、DR3(橙色，164-178)、DR4(蓝色，182-196)和DR5(红色，237-271)。图9C显示了经WT和LukEDR杂交物(DR 1-5，300nM)处理的PMN的活力。插图是纯化的LukEDR杂交物的考马斯亮蓝染色凝胶。图9D显示了经指示毒素(300nM)处理的CCR5+细胞的活力。图9E显示了由流式细胞术确定的在存在非标记LukE或LukEDR4的条件下GFP-LukE(300nM)的结合情况。图9F描述了LukEDR4(蓝色)的结构，LukE和LukS-PV之间不同的残基以棒状表示。图9G和9H是显示使用指示的金黄色葡萄球菌菌株以感染复数10对PMN(图9G)或HUT-R5(图9H)离体感染的图。*P<0.05；**P≤0.0001，经单因素方差分析(d，g)。以平均值±s.e.m表示(n＝3)。
图10显示了LukED和LukEDR4D的离体和体内作用。由流式细胞术评估PBMC亚集对无毒素(PBS)、LukED或LukEDR4D处理的敏感性。
图11A-11B显示了不同金黄色葡萄球菌菌株的蛋白分析。图11A上面的免疫印迹显示了补充了编码lukED或lukEDR4D质粒的低毒金黄色葡萄球菌菌株胞外蛋白的性质。图11A下面的两个免疫印迹评估了LukD、LukE、LukEDR4的水平，以及在LukE构建体上His标签的存在情况。图11B显示了由免疫印迹评估的金黄色葡萄球菌ΔlukED整合株或补充了编码lukED或lukEDR4D质粒的菌株上LukE、LukEDR4和LukD的水平。使用缺乏lukED和hlgACB(ΔlukEDΔhlgACB)的菌株作为阴性对照。与由lukED产生的LukE水平相比，由lukEDR4D产生的LukE DR4水平似乎是降低的。然而，通过对图11A的免疫印迹进行考马斯亮蓝染色观察到LukE和LukEDR4具有相当的水平，这表明在蛋白水平的显著降低是由于与LukE相比LukEDR4未达到最佳的抗体识别导致的。
图12A-12C显示了LukED-介导的CXCR1+和CXCR2+细胞杀灭作用有助于金黄色葡萄球菌在小鼠全身感染模型中的致病作用。图12A显示了在存在PBS(无毒素)、LukED或LukEDR4D(300nM)的条件下腹腔激发的小鼠PMN(CXCR2+)或巨噬细胞(CCR5+)的活力。图12B显示了在从全身感染同基因型金黄色葡萄球菌ΔlukED、ΔlukED::lukED或ΔlukED::lukEDR4D菌株的小鼠肝脏(上图)和肾脏(下图)分离的小鼠PMN的细胞死亡情况。图12C显示了感染同基因型金黄色葡萄球菌ΔlukED(n＝10)、ΔlukED::lukED(+lukED,n＝16)或ΔlukED::lukEDR4D(+lukEDR4D,n＝16)菌株小鼠的“存活”情况。FACS曲线是每种治疗3只小鼠中一只(图12A)或每种菌株10只感染的小鼠中一只(图12B)的代表图。统计分析为ΔlukEDv+lukED,****p<0.0001；ΔlukED v+lukEDR4D,p＝0.0577；+lukED v+lukEDR4D,***p<0.0003，经单因素方差分析(Mantel-Cox检验)(图12C)。
图13A-13B显示了LukED和LukEDR4D的离体和体内作用。图13A显示了经过PBS(无毒素)、LukED或LukEDR4D处理后从小鼠PEC分离的PMN或巨噬细胞的活力。图13B显示了从经同基因型金黄色葡萄球菌ΔlukED、ΔlukED::lukED或ΔlukED::lukEDR4D感染的小鼠肝脏或肾脏分离的PMN的活力。
图14显示了在HlgAB靶向人中性粒细胞(hPMN)、CXCR1/CXCR2+细胞所需的差异区域4中的HlgA氨基酸残基180-192。该图显示了经WT和HlgADR杂交毒素处理的hPMN的活力。使用CellTiterAqueous单一溶液细胞增殖测定(Promega)监测细胞活力。结果以不同人供体的平均值和s.e.m.表示(n＝8)。
图15A-15B显示了LukED靶向CXCR1和CXCR2+细胞和在小鼠中观察到LukED的致死性所需的DR4结构域中的LukE的氨基酸P184、G186、P187和G189。图15A显示了经WT LukED(LukE/LukD)或LukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素处理的hPMN的活力。结果以来自不同人供体的平均值和s.e.m.表示(n＝8)。图15B显示了在血液施用10μg各LukE变体联合10μg LukD后的小鼠的“存活”情况。给予小鼠(n＝5)含指示毒素的静脉内注射，记录致死时间并且以Kaplan-Meier生存曲线表示。
图16A-16D显示了LukED-介导的人红细胞(RBC)裂解与存在DARC相关，并且LukED-介导的RBC裂解能够被纯化的DARC和抗-DARC抗体阻断。图16A显示了从9名独立的人供体中分离的RBC的易感性。图16B表示图16A中存在的数据，其中将所述供体分成DARC+和DARC-。结果以不同人供体的平均值和s.e.m.表示(DARC+n＝5和DARC-n＝4)。图16C显示了通过增加纯化的DARC的浓度抑制了LukED-介导的RBC的裂解。结果以不同人供体的平均值和s.e.m.表示(n＝3)。图16D显示了使用小鼠IgG2A抗-DARC单克隆抗体(clone#358307)抑制了LukED-介导的RBC裂解。结果以不同人供体的平均值和s.e.m.表示(n＝3)。由Student‘st检验确定统计学显著性。
发明详述
本发明的第一个方面涉及一种在对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法。该方法涉及选定患有金黄色葡萄球菌感染或处于其风险中的对象，并且在有效地在所述对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的条件下向所述选定的对象施用抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1和CXCR2相互作用的组合物(即通过抑制CXCR1/CXCR2与LukE和/或HlgA的相互作用)。
迄今为止，大多数金黄色葡萄球菌感染是由MRSA引起(Moran等，“Methicillin-Resistant S.aureus Infections Among Patients in the Emergency Department,”TheNew England Journal of Medicine 355:666-674(2006)，其全部内容通过引用并入本申请)。此前，认为大部分MRSA感染是院内来源的(HA-MRSA)，但是感染目前也发生在未曾暴露于医疗机构的其他健康个体中，即社区相关的MRSA(CA-MRSA)(Klevens等，“InvasiveMethicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections in the United States,”Jama298:1763-1771(2007)和Klevens等，“Changes in the Epidemiology ofMethicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Intensive Care Units in USHospitals,1992-2003,”Clin.Infect.Dis.42:389-391(2006)，其全部内容通过引用并入本申请)。与HA-MRSA感染相比，这些CA-MRSA相关的感染更加严重并且导致更高的死亡率(Deleo等，“Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,”Lancet 375:1557-1568(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)。最近的报告表明与同HA-MRSA感染相关的那些相比与CA-MRSA感染相关的菌株毒力增强，这主要是由于CA-MRSA-相关菌株逃避中性粒细胞(PMN)介导的杀灭作用的能力增强导致的(Voyich等，“Insightsinto Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by HumanNeutrophils,”J.Immunol.175:3907-3919(2005)；Wang等，“Identification of NovelCytolytic Peptides as Key Virulence Determinants for Community-AssociatedMRSA,”Nat.Med.13:1510-1514(2007)；Li等，“Evolution of Virulence in EpidemicCommunity-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,”Proc.Nat’lAcad.Sci.U.S.A.106:5883-5888(2009)；Dumont等，“Characterization of a NewCytotoxin That Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；和Alonzo III等，“Staphylococcus aureusLeucocidin ED Contributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils andPromoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。金黄色葡萄球菌通过使用一系列细胞毒素和细胞裂解肽靶向并杀灭PMN从而避免PMN介导的杀灭作用(Wang等，“Identification of Novel CytolyticPeptides as Key Virulence Determinants for Community-Associated MRSA,”Nat.Med.13:1510-1514(2007)；Dumont等，“Characterization of a New Cytotoxin ThatContributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；Alonzo III等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes toSystemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth inVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；Loffler等，“Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for HumanNeutrophils,”PLoS Pathog.6:e1000715(2010)；和Ventura等，“Identification of aNovel Staphylococcus aureus Two-Component Leukotoxin Using Cell SurfaceProteomics,”PLoS One 5:e11634(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)。临床相关的金黄色葡萄球菌菌株能够产生多达五种不同的双组分白细胞毒素：Panton-Valentine杀白细胞素(PVL或LukFS-PV)、杀白细胞素E/D(LukED)、γ-溶血素(HlgAB和HlgCB)和杀白细胞素A/B(LukAB；也称为LukGH)(Vandenesch等，“Staphylococcus aureus Hemolysins,Bi-Component Leukocidins,and Cytolytic Peptides:A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors？”Front.Cell.Infect.Microbiol.2:12(2012)，和Alonzo&Torres,“Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught:The Contribution of theStaphylococcus aureus Leukotoxins.PLoS Pathog.9:e1003143(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。这些毒素均能够靶向并杀死人PMN，但是其也对其他白细胞显示出趋向性(Alonzo&Torres,“Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught:TheContribution of the Staphylococcus aureus Leukotoxins.PLoS Pathog.9:e1003143(2013)；Gravet等，“Characterization of a Novel Structural Member,LukE-LukD,ofthe Bi-Component Staphylococcal Leucotoxins Family,”FEBS Lett.436:202-8(1998)；Morinaga等，“Purification,Cloning and Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-ComponentLeukotoxin Family,”Microbiol.Immunol.47:81-90(2003)；和Perret等，“Cross-TalkBetween Staphylococcus aureus Leukocidins-Intoxicated Macrophages and LungEpithelial Cells Triggers Chemokine Secretion in an Inflammasome-DependentManner,”Cell.Microbiol.14:1019-36(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)，这表明金黄色葡萄球菌利用白细胞毒素耗尽负责保护机体避免感染的免疫细胞。除了白细胞以外，HlgAB、HlgCB和LukED也能够裂解红细胞(RBC)(Morinaga等，“Purification,Cloningand Characterization of Variant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity ofStaphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family,”Microbiol.Immunol.47:81-90(2003)，其全部内容通过引用并入本申请)，其能够利用从RBC中释放的血红蛋白作为铁源供金黄色葡萄球菌体内生长(Torres等，“Staphylococcus aureus Fur Regulates theExpression of Virulence Factors That Contribute to the Pathogenesis ofPneumonia,”Infect.Immun.78:1618-28(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)。
鉴于每年接触MRSA的个体数量较大，很可能这些感染中相当大的比例都难以通过传统的抗生素治疗过程治愈。治疗此类感染的一种创新方法是抑制金黄色葡萄球菌毒力因子，如LukED和HlgAB，其杀死PMN(PMN是参与防御金黄色葡萄球菌感染的最关键的先天免疫细胞)并裂解红细胞(RBC)(其为细菌生长提供了关键的营养物质)。如本申请所述，申请人已鉴定发现CXCR1和CXCR2(也分别称为白介素8受体的α和β链)是人PMN上LukED和HlgAB的细胞受体。此外，申请人已鉴定发现达菲抗原趋化因子受体(DARC)是人RBC上LukED和HlgAB的细胞受体。LukED和HlgAB与这些细胞受体结合导致引起细胞死亡的白细胞毒素寡聚化和孔的形成。因而，抑制金黄色葡萄球菌的LukED和HlgAB与CXCR1/CXCR2和/或DARC相互作用的药剂和组合物能够在临床上用于阻断金黄色葡萄球菌的细胞毒性，这反过来会阻止PMN耗竭并且促进先天性免疫系统对金黄色葡萄球菌的自然清除。
根据本发明的这个方面，一种抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1和CXCR2相互作用的适宜组合物包含对CXCR1和CXCR2均抑制的药剂(称为CXCR1/CXCR2抑制剂或拮抗剂)。对CXCR1和CXCR2均抑制的适宜药剂包括本领域熟知和在下文中更加详细描述的抑制剂蛋白和肽、抗体以及小分子。
根据Li等，“CXCL8(3-74)K11R/G31P Antagonizes Ligand Binding to theNeutrophil CXCR1and CXCR2Receptors and Cellular Responses to CXCL8/IL-8,”Biochem.Biophys.Res.Comm.293(3):939-944(2002)；Gordon的美国专利号8,039,429以及Gordon等的美国专利号7,201,895(其全部内容通过引用并入本申请)的描述，适宜的CXCR1/CXCR2肽抑制剂包括来源于CXCR1和CXCR2受体配体，CXC趋化因子配体8(CXCL8；也称为白介素8)的那些。来源于CXCL8的示例性肽抑制剂包括但不限于具有如下所示的SEQ IDNO:1的氨基酸序列的CXCL8(3-74)K11R/G31P。
CXCL8(3-74)K11R/G31P的类似物，如具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G(如下所示)和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P(如下所示)也适用于本发明的方法。
SEQ ID NO:2；CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G
SEQ ID NO:3；CXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P
在Gordon的美国专利号8,039,429和Gordon等的美国专利号7,201,895(其全部内容通过引用并入本申请)中披露的其他与CXCR1/CXCR2抑制剂具有相似功能的来源于CXCL8的肽也适用于根据本发明的这个方面。
其他适宜的CXCR1/CXCR2肽抑制剂包括包含金黄色葡萄球菌CXCR1/CXCR2受体结合结构域序列的重组肽。如本申请所述，申请人已鉴定了金黄色葡萄球菌LukE和HlgA毒素与CXCR1和CXCR2结合的区域。因而，包含这些氨基酸残基的肽构成了适宜的CXCR1/CXCR2抑制性肽。因而，在本发明的一个实施方式中，适宜的CXCR1/CXCR2肽抑制剂包含与可溶性LukE蛋白的氨基酸残基182-196对应的氨基酸序列(金黄色葡萄球菌纽曼(Newman)菌株；SEQ ID NO:4，如下所示)。
CXCR1/CXCR2肽抑制剂至少包含QSPNGPTGSAREYFA的氨基酸序列(SEQ ID NO:5；即SEQ ID NO:4的残基182-196)，可以在其N-或C-末端含有附加的氨基酸残基，所述附加的氨基酸残基不会改变其与CXCR1或CXCR2结合的能力，但是具有增强所述抑制性肽的稳定性或靶向递送的功能。
在本发明的另一个实施方式中，适宜的CXCR1/CXCR2肽抑制剂包含与可溶性HlgA蛋白的氨基酸残基180-192对应的氨基酸序列(金黄色葡萄球菌纽曼(Newman)菌株；SEQ IDNO:6，如下所示)。
CXCR1/CXCR2肽抑制剂至少包含QDPTGPAARDYFV的氨基酸序列(SEQ ID NO:7；即SEQ ID NO:6的残基180-192)，可以在其N-或C-末端含有附加的氨基酸残基，所述附加的氨基酸残基不会改变其与CXCR1或CXCR2结合的能力，但是具有增强所述抑制性肽的稳定性或靶向递送的功能。
适于在本发明的方法中使用的化合物可以替代性的包含抑制CXCR1和CXCR2两者的小分子。多种CXCR1/CXCR2的小分子抑制剂或拮抗剂是本领域公知的并且适于在本发明的方法中使用的。
适于在本发明的方法中使用的第一类示例性小分子CXCR1/CXCR2抑制剂包括在苯基的4位具有4-磺酰氨基取代基的(2R)-2-苯基丙酰胺(参见Allegretti等的美国专利号7,652,169和7,868,046(Dompe S.P.A.)，其全部内容通过引用并入本申请)。此类化合物具有如下式I所示的通式：
其中
式(I)中的R选自
H、OH、C1-C5-烷基、C3-C6-环烷基、C2-C5-烯基、C1-C5-烷氧基和苯基；
杂芳基，其选自取代的和未取代的吡咯、噻吩、呋喃、吲哚、咪唑、噻唑、噁唑、吡啶和嘧啶(pyrimidine)；
式—CH2—CH2—O—(CH2—CH2O)nR″的残基，其中R″是H或C1-C5-烷基，n是0至2的整数；
或者式I的R连同与之偶联的NH基团是天然氨基酸伯酰胺的自由基团，天然氨基酸如(2S)-2-氨基丙酰胺、(2S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺、(2S)-2-氨基-3-羟基丙酰胺、(2S)-2-氨基-3-羧基丙酰胺、(2S)-2,6-二氨基己酰胺((2S)-2,6-diaminoexanamide)。上文所述的作为天然氨基酸伯酰胺自由基团一部分的NH基团代表天然氨基酸的氨基。
式I的R′选自
线性或支链C1-C5-烷基、C3-C6-环烷基、C2-C5-烯基和三氟甲基；
取代的或未取代的苯基；
取代的或未取代的苄基；
杂芳基，其选自取代的和未取代的吡啶、嘧啶(pyrimidine)、吡咯、噻吩、呋喃、吲哚、噻唑和噁唑。
在本发明的方法中适用的示例性(2R)-2-苯基丙酰胺化合物包括，但不限于：(2R)-2-{4-[(异丙基磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-{4[(异丙基磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺钠盐；(2R)-2-{4-{[(2-氯苯基)磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-{4-{[(2,6-二氯苯基)磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-{4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基}丙酰胺；(2R)-2-{4-[(苯基磺酰基)氨基]苯基}丙酰胺；(2R)-2-{4-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-{4-{[(4-甲氧基苯基)磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-(4-[(苄基磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-(4-{[(4-氯苯基)磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-(4-{[(4-(三氟甲基)苯基]磺酰基}氨基)苯基]丙酰胺；(2R)-2-{4-[(噻吩-2基磺酰基)氨基]苯基}丙酰胺；(2R)-2-{4-[(环戊基磺酰基)氨基]苯基}丙酰胺；(2R)-2-(4-{[(三氟甲基)磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-{4-[(异丙基磺酰基]氨基}苯基)-N-甲基丙酰胺；(2R)-N-[(1S)-2-氨基-1-甲基-2-氧代乙基]-2-{4-[(异丙基磺酰基]氨基}苯基)丙酰胺；(2R)-2-{4-[(异丙基磺酰基]氨基}苯基)-N-[4-(三氟甲基)-1,3-噻唑-2-基]丙酰胺；(2R)-2-{4-{[(2-氯苯基)磺酰基]氨基}苯基)-N-[4-(三氟甲基)-1,3-噻唑-2-基]丙酰胺；(2R)-2-{4-{[(2-氯苯基)磺酰基]氨基}苯基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]丙酰胺；(2R)-2-{4-{[(2-氯苯基)磺酰基]氨基}苯基)-N-环丙基丙酰胺。
适于在本发明的方法中使用的另一类示例性小分子CXCR1/CXCR2抑制剂包括在Piemonti等的美国专利公开号20120202884(Dompe S.P.A)中描述的那些，其全部内容通过引用并入本申请，其具有如下式II所示的通式：
其中式II中的R选自线性或支链4-(C1-C6)烷基、4-三氟甲磺酰氧基或3-苯甲酰基和式II中的R1是线性或支链(C1-C6)烷基。
适于在本发明的方法中使用的示例性的式II化合物包括，但不限于：R(-)-2-[(4-异丁基苯基)丙酰基]-甲磺酰胺(也称为Repertaxin或Reparixin)、R(-)-2-[(4′-三氟甲磺酰氧基)苯基]丙酰基-甲磺酰胺(也称为Meraxin)。
适于在本发明的方法中使用的另一类示例性小分子CXCR1/CXCR2抑制剂包括2-芳基苯基丙酸，如Bertini等，“Noncompetitive Allosteric Inhibitors of theInflammatory Chemokine Receptors CXCR1and CXCR2:Prevention of ReperfusionInjury,”Proc Natl Acad Sci USA.101:11791–11796(2004)；Bizzarri等，“ELR+CXCChemokines and Their Receptors(CXC Chemokine Receptor 1and CXC ChemokineReceptor 2)as New Therapeutic Targets,”Pharmacol Ther.112:139–149(2006)；和Souza等，“Repertaxin,A Novel Inhibitor of Rat CXCR2Function,InhibitsInflammatory Responses that Follow Intestinal Ischaemia and ReperfusionInjury,”Br J Pharmacol.143:132–142(2004)(其全部内容通过引用并入本申请)所描述的。在此类CXCR1/CXCR2抑制剂中的示例性化合物包括具有如下式III所示结构的4-[(1R)-2-氨基-1-甲基-2-氧代乙基]苯基三氟甲磺酸(DF 2162)及其衍生物。
另一类示例性小分子CXCR1/CXCR2抑制剂包括如在Maeda等的美国专利公开号2010/0210593(Syntrix Biosystems)(其全部内容通过引用并入本申请)中披露的吡啶-和嘧啶甲酰胺化合物，其具有如下式IV和V所示的结构式：
其中式IV和V的R1和R2独立地选自下组：氢、2-或3-或4-卤代-苯基、杂烷基、烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基；
其中式IV和V中的R3选自—B(R4R5)、—R6—B(R4R5)、R6、—C(O)—R6、—O—R6、—S(O)y—R6(其中y＝0、1或2)、—P(O)—(R4R5)和—N(R7R8)；
其中式IV和V中的R6选自烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；
其中式IV和V中的R4和R5独立地为氢、羟基、芳氧基或烷氧基，或者其中R4和R5在一起形成环酯，或酸酐(混合的或对称的)；
其中式IV和V中的R7和R8独立地选自氢、烷基、卤代烷基、芳基、环烷基、芳基烷基、杂烷基、杂环基和杂环基芳基；R7和R8均为氧以形成硝基；或者R7和R8通过与其连接的氮连接在一起形成杂环基；和
其中式IV和V的X1是碳或氮；式IV和V的X2是—S(O)y—(其中y＝0、1或2)、氮或氧；和式IV和V的n是0至8之间的整数。
其他熟知的小分子CXCR1/CXCR2抑制剂包括，但不限于：2-羟基-N,N,-二甲基-3-[[2-[[1(R)-(5-甲基-2-呋喃)丙基]氨基]-3,4-二氧代-1-环丁烯-1-基]氨基]苯甲酰胺(SCH-527123)(参见Kou等的美国专利号8,183,287，其全部内容通过引用并入本申请)，N-(2-羟基-3-二甲基磺酰胺基-4-氯苯基)-N’-(2-溴苯基)-N”-氰基胍(SCH468477)、SCH-479833及其衍生物(参见Singh等，“Small-Molecule Antagonists for CXCR2andCXCR1Inhibit Human Melanoma Growth by Decreasing Tumor Cell Proliferation,Survival,and Angiogenesis,”Clin.Cancer Res.15:2380(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)。适于在本发明中使用的其他小分子CXCR1/CXCR2抑制剂包括Chao等在美国专利号中描述的那些，其全部内容通过引用并入本申请。
在本发明这个方面的另一个实施方式中，适于抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1和CXCR2相互作用的组合物包括抑制CXCR1的药剂和抑制CXCR2的药剂。适宜的CXCR2抑制剂包括，但不限于：N-(2-羟基-4-硝基苯基)-N′-(2-溴苯基)脲(SB 225002)(White等，“Identification of a Potent,Selective Non-Peptide CXCR2Antagonists ThatInhibits Interleukin-8-Induced Neutrophil Migration,”J.Biol.Chem.273:10095-10098(1998)，其全部内容通过引用并入本申请)、N-(3-(氨基磺酰基)-4-氯-2-羟基苯基)-N′-(2,3-二氯苯基)脲(Podolin等，“A Potent and Selective Nonpeptide Antagonistof CXCR2Inhibits Acute and Chronic Models of Arthritis in the Rabbit,”J.Immunology 169(11):6435-6444(2002)，其全部内容通过引用并入本申请)、N-(2-羟基-3-氨磺酰基-4-氯苯基)-N’-(2,3二氯苯基)脲(SB-332235)、SB-656933、氨基吡啶和氨基嘧啶甲酰胺(如Maeda等在WO2012027289中所披露的，其全部内容通过引用并入本申请)、噻唑(4,5-D)嘧啶化合物(如Willis等在WO2001/025242中所披露的，其全部内容通过引用并入本申请)以及方酰胺衍生物(如Baettig等的美国专利公开号US 2010029670和Hunt等的US20100152205中所披露的，其全部内容通过引用并入本申请)。适于在本发明中使用的其他小分子CXCR2抑制剂包括在Bonnert等的美国专利号7,579,342和Brough等的美国专利公开号20050272750中描述的那些，其全部内容通过引用并入本申请。
在本发明这个方面的另一个实施方式中，所述组合物包含抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1和CXCR2相互作用的一种或多种抗体。适宜的抗体包括CXCR1阻断抗体或其抗体结合部分(参见例如Ginestier等，“CXCR1Blockade Selectively Targets Human BreastCancer Stem Cells In Vitro and In Xenografts,”J.Clin.Invest.120(2):485-497(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)、CXCR2阻断抗体或其抗体结合部分(参见例如Nemzek等，“Functional Contribution of CXCR2to Lung Injury After Aspiration ofAcid and Gastric Particulates,”Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.298(3):L382-L391(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)或CXCR1和CXCR2抗体的组合。适宜的替代性抗体包括与金黄色葡萄球菌LukE和HlgA蛋白同CXCR1和CXCR2相互作用的区域结合的那些。这种类型的示例性抗体包括识别和结合金黄色葡萄球菌LukE的表位的抗体或其抗体结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(QSPNGPTGSAREYFA)，其对应于SEQID NO:4的氨基酸残基182-196。这种类型的示例性抗体包括识别和结合金黄色葡萄球菌HlgA的表位的抗体或其抗体结合部分，所述表位包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(QDPTGPAARDYFV)，其对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192。在下文中将更加详细的描述与LukE和HlgA的CXCR1/CXCR2受体结合区结合的抗体。
本发明的另一个方面涉及一种在对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法。这种方法涉及选定患有金黄色葡萄球菌感染或处于其风险中的对象并且在有效地在所述对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的条件下向所述选定的对象施用抑制金黄色葡萄球菌与达菲抗原趋化因子受体(DARC)相互作用的组合物(即通过抑制DARC与LukE和/或HlgA相互作用)。
用于抑制金黄色葡萄球菌与DARC相互作用的适宜组合物包括DARC抑制剂或拮抗剂。在本发明的方法中使用的示例性DARC抑制剂是DARC阻断抗体(参见例如Patterson等，“Expression of the Duffy Antigen/Receptor for Chemokines(DARC)by the InflamedSynovial Endothelium,”J.Pathol.197(1):108-116(2002)，其全部内容通过引用并入本申请)。
适于采用根据本发明的方法治疗的对象包括但不限于任何动物，优选哺乳动物，更优选人。适宜的对象包括免疫功能低下和非免疫功能低下的婴儿、青少年和成人。在本发明的一个实施方式中，所述对象患有耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染或处于其风险中。在本发明的另一个实施方式中，所述对象患有甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)感染或处于其风险中。其他适宜的对象包括可能患有由金黄色葡萄球菌感染导致的状况或处于发展成其状况的风险中的那些对象，即与金黄色葡萄球菌相关的状况，例如皮肤创伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血症、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征。
在本发明的一个实施方式中，预防性地施用本发明的组合物以便在处于患有金黄色葡萄球菌感染或其相关状况风险中的对象中阻止、推迟或抑制金黄色葡萄球菌感染的发展。在本发明的一些实施方式中，预防性地施用本发明的一个或多个组合物在个体中有效地完全阻止金黄色葡萄球菌感染。在其他实施方式中，预防性施用有效地阻止感染的完全程度，如果不进行此类施用则感染将发展成完全程度，即在个体中基本上阻止、抑制或最小化金黄色葡萄球菌感染。
在本发明的另一个实施方式中，向患有金黄色葡萄球菌感染的个体治疗性的施用本发明的组合物以抑制感染的进展和进一步发展，即抑制和/或阻止所述感染向个体中其他细胞的播散、减少感染、和治疗或缓解感染的一种或多种症状。
本发明的治疗组合物可以作为联用疗法的一部分与一种或多种其他活性剂联用，其取决于正在治疗的金黄色葡萄球菌感染的性质。此类附加的活性剂包括抗感染剂、抗生素剂和抗微生物剂。
可以在本发明中使用的典型抗感染剂包括万古霉素和溶葡球菌酶。其他抗感染剂包括LukAB抑制剂，如Torres等在美国专利公开号2011/0274693中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请；LukED抑制剂或抗体，如Torres等在美国专利公开号2013/0017203中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请；CCR5抑制剂，如Torres等在美国专利公开号2013/0039885中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请；和CD11b抑制剂，如Torres等在国际专利申请序列号PCT/US2013/032436中所描述的，其全部内容通过引用并入本申请。
可以在本发明中使用的典型抗生素剂和抗微生物剂包括耐青霉素酶的青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类，包括万古霉素、溶葡球菌酶、青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、奈夫西林、邻氯青霉素、双氯青霉素、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定、头孢孟多、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、替考拉宁、林可霉素和克林霉素。这些抗生素的剂量是本领域熟知的(参见例如Merck Manual of Diagnosis and Therapy(Beers&Berkoweds.,2004)，其全部内容通过引用并入本申请)。抗感染剂、抗生素剂和/或抗微生物剂可以在本发明的组合物之前施用，或者与其同时(作为同一组合物中的一部分或以不同组合物的方式)或顺序联合施用。在某些实施方式中，所述施用是重复的。
本发明的治疗组合物可以单剂量，或者按照多剂量方案施用。例如，在本发明的一个实施方式中，施用相对较少剂量的治疗组合物，如一个或两个剂量。在本发明的另一个实施方式中，以更高的频率使用所述治疗组合物，例如每日一次直至感染水平降低或消除。在包括常规抗生素疗法的实施方式中，其通常涉及在数日或数周的一段时间内的多个剂量，所述抗生素可以在一段时间内(如至少10天或甚至14天或者更多天)每日使用1次、2次或3次或者更多次，而本发明的所述组合物仅施用1次或2次。然而，本领域的普通技术人员可以并应该根据正在治疗的对象和感染对所述治疗组合物和抗生素的不同剂量、给药时机和相对量进行选择和调整。
在使用抑制LukE和/或HlgA与CXCR1/CXCR2和/或DARC结合以阻止金黄色葡萄球菌感染的组合物的背景下，这些组合物的浓度必须足以达到阻止或基本上阻止金黄色葡萄球菌感染，特别是在易感性人群(即婴儿、青少年、成人，或者免疫功能受损的婴儿、青少年或成人)中阻止金黄色葡萄球菌。在使用治疗组合物治疗金黄色葡萄球菌感染的背景下，抑制性组合物的剂量是足以抑制LukE和/或HlgA介导的细胞毒性并且能够达到减少症状的数量、降低至少一种症状的严重程度、或推迟至少一种症状的进一步进展或者甚至是总体缓解所述感染或其症状的剂量。
本发明药剂或组合物的治疗有效量是根据标准程序确定的，其考虑了多种因素，包括例如这些活性剂在所述组合物中的浓度、施用的方式和频率、待治疗或预防的金黄色葡萄球菌感染的严重程度和对象的详细情况，如年龄、体重和总体健康情况以及免疫状况。一般性指导原则可以参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany 1990)，其全部内容通过引用并入本申请。临床医师可以施用抑制LukE和/或HlgA的组合物直至达到提供所需的或所要求的预防或治疗效果的某一剂量。能够通过常规检测容易地监测这种疗法的进程。
可以以胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、腹腔内、鼻内或肌内方式施用用于预防性和/或治疗性治疗的本发明的药剂和组合物。
可以将本发明的药剂和组合物制成用于胃肠外施用。可以在适宜地混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备所述药剂的溶液或混悬液。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散剂。示例性的油是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油或矿物油。在通常情况下，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液以及二醇类(如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别适用于可注射溶液。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以阻止微生物生长。
适于注射使用的药物制剂包括无菌水溶液或分散剂和用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，所述剂型必须是无菌的并且必须是以易于注射的程度存在的流体。其在生产和贮存条件下必须是稳定的并且必须能够对抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适宜的混合物和植物油的溶剂或分散液。
当需要全身递送本发明的药剂和组合物时，可以将其制成通过注射进行胃肠外施用，例如通过推注注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，其中添加了防腐剂。所述组合物可以是此类形式，如在油或水性载剂中的混悬剂、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂如混悬、稳定和/或分散剂。
还可以使用输液泵装置(如Medtronic,Northridge,CA描述的那些)实现本发明药剂的腹腔内或鞘内施用。此类装置能够连续输注所需的化合物，其避免了多次注射和多次处置。
除了前述制剂之外，还可以将所述药剂制成储库制剂。可以使用适宜的聚合或疏水材料(例如在可接受的油中作为乳剂)或离子交换树脂，或者作为微溶的衍生物，例如作为微溶盐制备此类长效制剂。
本发明的其他方面涉及一种治疗患有金黄色葡萄球菌感染的对象的方法。这种方法涉及从患有金黄色葡萄球菌感染的所述对象中获得样品并对所述样品中CXCR1、CXCR2、DARC或其组合的表达水平进行定量。所述方法还涉及基于所述定量的表达水平向所述对象施用治疗。
根据本发明的这个方面，来自所述对象的所述样品可以包含血液、组织、细胞或血清样品。
在发明这个方面的一个实施方式中，对CXCR1、CXCR2、DARC的表达水平进行定量涉并测定来自所述对象的所述样品中CXCR1、CXCR2和/或DARC mRNA的表达情况。对样品中的mRNA表达水平进行检测和定量的方法是本领域熟知的并且通常如下文所述。
可以使用本领域公知的方法从组织或细胞样品中分离和制备对象的mRNA。该RNA的制备必须产生酶促可操作的mRNA或可分析的RNA。可以使用本领域公知的方法分离总RNA和mRNA，包括但不限于异硫氰酸胍-超离心、胍和酚-氯仿提取、氯化锂-SDS尿素提取或者通过寡聚(dT)纤维素法。可以使用本领域任意已知的程序利用分离得到的总RNA产生第一链复制DNA(cDNA)，例如使用随机引物、寡聚-dT引物或随机-寡聚-dT引物。然后使用cDNA作为模板进行第一轮扩增反应或进行定量PCR反应，其取决于靶点或样品的丰度。使用引物集合进行第一轮PCR扩增，包括特异性针对目标靶基因(即CXCR1、CXCR2或DARC)的正向和反向引物。在第一轮扩增之后，使用反应产物的清洁部分进行定量分析。定量实时PCR方案通常依赖于对反应循环延伸期后形成的产物进行荧光检测。用于定量PCR的典型荧光方法基于荧光报告染料如SYBR绿、FAM、荧光素、HEX、TET、TAMRA等和淬灭染料如DABSYL、Black Hole等。系统如Molecular Beacons(Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)、探针(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)、LNA或MGB探针、引物(DxSLtd.,Manchester,UK)、AmpliFluor、Plexor或Lux引物也是本领域熟知的定量基因分析系统。与实时探针相关的方法和试剂的示例可以参见Tyagi等的美国专利号5,925,517、6,103,476、6,150,097和6,037,130，其全部内容通过引用并入本申请。
可以以绝对拷贝数或相对基因表达情况表示定量基因表达。这两种方法均利用标准曲线，从其中可以获得准确的定量数据。通常将在所述样品中测定的mRNA表达水平与在参考或对照样品中测定的mRNA表达水平进行比较，例如在对照人群中的平均表达水平、在已知对金黄色葡萄球菌感染具有易感性的临床患者人群中的平均表达水平，和/或在已知对金黄色葡萄球菌感染具有抗性的临床患者人群中的平均表达水平。
在发明这个方面的另一个实施方式中，CXCR1、CXCR2、DARC的定量表达水平涉及测定在来自所述对象的样品中CXCR1、CXCR2和/或DARC蛋白的表达情况。对样品中的蛋白表达水平进行检测和定量的方法是本领域熟知的并且通常如下文所述。
可以使用本领域公知的标准制备方法从样品中分离和制备来自所述对象的样品蛋白。例如，可以在含有去垢剂如十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中裂解细胞。可以使用Bradford检测或本领域公知的该方法的任意变化形式确定蛋白收率。可以采用本领域公知的不同技术评估样品中靶蛋白的表达水平。例如，评估表达水平可以涉及通过二维凝胶电泳、质谱、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱、多维液相色谱后接串联质谱或蛋白芯片表达分析来分析一种或多种蛋白。其他技术包括将所述样品与适于测定蛋白表达的一种或多种检测试剂接触，例如对CXCR1、CXCR2或DARC具有结合特异性的标记抗体，或者与二抗结合使用的，对CXCR1、CXCR2或DARC具有结合特异性的一抗，在归一化至样品中的总蛋白后根据检测试剂的水平测定蛋白表达水平。在本领域中常规使用的检测样品(例如血液或血清样品)中蛋白表达水平的适宜方法包括例如并且不限于western印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或荧光活化细胞分选(FACS)。通过将在所述样品中测定的蛋白表达水平与在参考或对照样品中测定的蛋白表达水平进行比较，例如在对照人群中的平均表达水平、在已知对金黄色葡萄球菌感染具有易感性的临床患者人群中的平均表达水平，和/或在已知对金黄色葡萄球菌感染具有抗性的临床患者人群中的平均表达水平。
根据本发明的这个方面，与正常参考人群的表达水平相比具有增加的或较高水平的CXCR1、CXCR2或DARC表达或者与在已知对金黄色葡萄球菌感染具有易感性的参考人群中的表达水平相比具有相似水平的CXCR1、CXCR2或DARC表达，将通常表明所述对象可能对金黄色葡萄球菌感染具有增加的易感性或较高的敏感性。因此，应使用更加积极的治疗方案并且包括一种或多种抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1、CXCR2或DARC相互作用的本发明的药剂或组合物。与正常对照或参考人群相比具有降低或较低水平的CXCR1、CXCR2或DARC表达将表明所述对象对金黄色葡萄球菌感染具有较高的抗性。适宜的治疗仍将包括一种或多种本发明的药剂或组合物以预防或最小化感染。然而，所述剂量方案与在对感染具有更高易感性的对象中的剂量方案相比较为缓和。
本发明的另一个方面涉及一种分离的杀白细胞素E(LukE)抗体，或其抗体结合片段，其中所述抗体或其结合片段与对应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196的表位结合。
本发明的另一个方面涉及一种分离的HlgA抗体，或其抗体结合片段，其中所述抗体或其结合片段与对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192的表位结合。
根据本发明的目的，术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、抗体经基因工程改造的形式及其组合。更具体地，所述“抗体”，其与术语“免疫球蛋白”互换使用，包括全长的(即天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)及其免疫活性片段(即包括全长免疫球蛋白分子的特异性结合部分)，其在性质上可以是天然存在的或合成的。因此，所述“抗体片段”包括抗体的一部分如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、sdAb(纳米抗体)等。不管结构如何，抗体片段与被全长抗体识别的相同抗原结合，并且，在本发明的背景下，与LukE和HlgA的CXCR1/CXCR2或DARC受体结合区特异性结合。制备和筛选抗体片段的方法是本领域熟知的。
在本发明中，抗-LukE和抗-HlgA抗体可以与其他葡萄球菌杀白细胞素S-亚基(如HlgC、LukS-PVL、LukS-I、LukA和LukM)具有某种程度的交叉反应。治疗有效的抗-LukE和/或抗-HlgA抗体抑制或减少LukE和/或HlgA与CXCR1/CXCR2或DARC的结合。在一些实施方式中，抗-LukE和/或抗-HlgA抗体分别中和(例如基本上消除)LukE和HlgA的活性。
天然存在的抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，各轻链通过链间二硫键与重链共价连接，多个二硫键进一步将两条重链彼此之间连接。各链会折叠成具有相似尺寸(110-125个氨基酸)和结构，但具有不同功能的结构域。轻链可以包含一个可变结构域(VL)和/或一个恒定结构域(CL)。重链还可以包含一个可变结构域(VH)和/或，根据抗体的分类或同种型，三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人体内，所述同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中IgA和IgG进一步分成亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。
在通常情况下，可变结构域在不同抗体之间显示出相当大的氨基酸序列变异性，特别是在抗原结合位点的位置。在各VL和VH中可见三个称为高变区或互补性决定区(CDR)的区域，其被称为框架可变区的较低可变区所支持。本发明的抗体包括IgG单克隆抗体以及抗体片段或工程化形式。这些例如是，Fv片段，或其中将示例性抗体的CDR和/或可变结构域工程化改造为单链抗原结合蛋白的蛋白。
将由VL和VH结构域组成的抗体的部分称为Fv(可变片段)并且其构成抗原结合位点。单链Fv(scFv或SCA)是在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N末端和另一个结构域的C末端通过柔性接头连接在一起。用于生产单链抗体的肽接头通常是柔性肽，对其进行选择以确保VL和VH结构域具有正确的三维折叠。所述接头通常为3至50个氨基酸残基，并且在一些情况下更短，例如约3至30个氨基酸残基，或3至25个氨基酸残基，或者甚至3至15个氨基酸残基。此类接头肽的示例包括四个甘氨酸残基重复后接一个丝氨酸残基。
单链抗体缺乏作为其来源的完整抗体的一些或全部的恒定区。因此，其能够克服与使用完整抗体相关的一些问题。例如，单链抗体趋向于在重链恒定区与其他生物分子之间不存在某些不需要的相互作用。此外，认为单链抗体比完整抗体更小并且与完整抗体相比可以具有更高的渗透性，这使得单链抗体能够更有效地定位至靶抗原结合位点并与其结合。而且，与完整抗体相比，单链抗体相对较小的尺寸使其在接受体中不容易激发不需要的免疫应答。
单结构域抗体(sdAb；纳米抗体)是由单一单体可变抗体结构域(～12-15kDa)组成的抗体片段。sdAb来源于重链(VH)的可变结构域或轻链(VL)的可变结构域。sdAb可以是天然产生的，即通过免疫单峰骆驼、骆驼、马驼、羊驼或鲨鱼(Ghahroudi等，“Selection andIdentification of Single Domain Antibody Fragments from Camel Heavy-ChainAntibodies,”FEBS Letters 414(3):521-526(1997)，其全部内容通过引用并入本申请)。或者，所述抗体可以在微生物中产生或者来源于常规的完整抗体(Harmsen等，“Properties,Production,and Applications of Camelid Single-Domain AntibodyFragments,”Appl.Microbiol.Biotechnology77:13-22(2007)，Holt等，“DomainAntibodies:Proteins for Therapy,”Trends Biotech.21(11):484-490(2003)，其全部内容通过引用并入本申请)。
Fab(片段，抗原结合)指由VL、CL、VH和CH1结构域组成的抗体的片段。将经木瓜蛋白酶消化产生的那些简单称为Fab并且其不保留重链铰链区。经胃蛋白酶消化后，产生保留重链铰链的不同Fab。将具有完整的链间二硫键的那些片段称为F(ab')2，而当不保留二硫键时得到单一的Fab'。与单价Fab片段相比F(ab')2片段对抗原具有更高的亲和力。
Fc(片段结晶)指包含成对重链恒定结构域的抗体的部分或片段。在IgG抗体中，例如，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc还包含CH4结构域。Fc与Fc受体的结合、补体介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)的活化相关。对于抗体如IgA和IgM而言，其为多个IgG样蛋白的复合物，复合物的形成需要Fc恒定结构域。
抗体“特异性”指抗体对抗原特定表位的选择性识别。术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或者以其他方式与分子相互作用的任意蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或碳水化合物或糖侧链)组成并且通常具有特定的三维结构性质，以及特定的电荷性质。表位可以是“线性”或“具有构象的”。在线性表位中，蛋白和相互作用分子(如抗体)之间所有相互作用的点均线性地沿着所述蛋白的一级氨基酸序列出现。在具有构象的表位中，相互作用的点跨蛋白上彼此间隔的氨基酸残基，即不连续的氨基酸是由蛋白的三级折叠并置的。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于去垢溶剂后暴露，而由三级折叠形成的表位通常在使用变性溶剂处理后丧失。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个，和更通常地，至少5或8-10个氨基酸。可以在显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合能力的简单的免疫测定中对识别相同表位的抗体进行验证。
本发明的单克隆抗体可以是鼠源的、人源的、人源化的或嵌合的。人源化的抗体是重组蛋白，其中将来自于一种物种(例如啮齿类、家兔、犬、山羊、马或鸡抗体(或任意其他适宜的动物抗体))的抗体CDR转移至人重链和轻链可变结构域。抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的那些。制备人源化抗体的方法是本领域熟知的。嵌合抗体优选具有基本上或仅仅来源于人抗体恒定区的恒定区和基本上或仅仅来源于人以外哺乳动物可变区序列的可变区。还可以通过使用相应的人序列取代鼠源(或其他非人哺乳动物)抗体高变区或互补性决定区(CDR)以外的可变区更加高效地进行嵌合过程。CDR以外的可变区也称为可变框架区(FR)。然而，本发明的其他单克隆抗体是双特异性的，因为其针对两个不同的表位具有特异性。双特异性抗体优选是人的或人源化的。
可以采用标准技术获得上文所述的抗体。例如，可以给予对象(例如哺乳动物如人或小鼠，或者在纳米抗体的情况下单峰骆驼、骆驼、美洲驼或鲨鱼)LukE、HlgA或者含有所需受体结合表位的LukE或HlgA的免疫活性片段。可以将杀白细胞素本身作为免疫原使用或者可以将其连接至运载体蛋白或其他运载体材料，如琼脂糖小珠。在动物产生抗体以后，分离抗体产生细胞(如脾细胞)的混合物，从其中可以获得多克隆抗体。可以通过从混合物中分离单个的抗体产生细胞并且通过例如将其与肿瘤细胞(如骨髓瘤细胞)融合使其永生化生产单克隆抗体。将所得到的杂交瘤培养保存并且从培养基中收获单克隆抗体。
本发明的另一个方面涉及包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的杀白细胞素E(LukE)蛋白或其多肽和药学上可接受的运载体的组合物。
如本申请所述的，申请人已鉴定了LukE的CXCR1/CXCR2受体结合区，其包含可溶性LukE蛋白(SEQ ID NO:4)的氨基酸残基182-196。因此，具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的LukE蛋白在该已鉴定的区域中(即SEQ ID NO:4的182-196)含有破坏受体结合的一个或多个氨基酸残基的取代或缺失。在本发明的一个实施方式中，具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的LukE蛋白(“LukELukS-DR4”)具有如下述SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
含有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的适宜的LukE多肽的长度为约50至约100个氨基酸，更优选长度在约100-200个氨基酸之间或者长度在约200-250个氨基酸之间。一个示例性的分离的LukE多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸残基1-273、SEQ ID NO:4的氨基酸残基20-263或者SEQ ID NO:4的氨基酸残基20-273，并且在CXCR1/CXCR2受体结合区内(即氨基酸残基182-196)含有一个或多个氨基酸残基的取代或缺失。在本发明的一个实施方式中，所述分离的LukE多肽包含如下述SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，含有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的LukE多肽具有例如氨基酸P184、G186、P187、G189或其任意组合的一个或多个取代或缺失(即单突变、双突变、三突变和四突变均包含在其中)。适宜的示例包括但不限于LukELukS-DR4(即SEQ IDNO:8)、LukE20-263 LukS-DR4(即SEQ ID NO:9)、LukEP184A,G186A,P187A(即SEQ ID NO:10，如下所示)和LukEP184A,G186A,P187A,G189A(即SEQ ID NO:11，如下所示)。SEQ ID NO:10；LukEP184A,G186A,P187A
SEQ ID NO:11；LukEP184A,G186A,P187A,G189A
本发明的组合物还可以包含分离的杀白细胞素(LukD)蛋白或其多肽。所述分离的LukD蛋白可以包含如下述SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12(LukD的氨基酸序列)具有至少70％序列相似性的氨基酸序列。
适宜的LukD多肽在长度上具有约50至约100个氨基酸，更优选长度约100-200个氨基酸之间或长度约200-250个氨基酸之间。示例性分离的LukD多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸残基1-286、SEQ ID NO:12的氨基酸残基20-281或SEQ ID NO:12的氨基酸残基20-286。适宜的LukD多肽还包括包含与SEQ ID NO:12的氨基酸残基1-286、SEQ ID NO:12的氨基酸残基20-281或SEQ ID NO:12的氨基酸残基20-286具有约70-80％的序列相似性、优选80-90％的序列相似性、更优选90-95％的序列相似性和最优选95-99％的序列相似性的氨基酸序列的那些多肽。
本发明的另一个方面涉及包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的HlgA蛋白或其多肽和药学上可接受的运载体的组合物。
如本申请所述的，申请人已鉴定了HlgA的CXCR1/CXCR2受体结合区，其包含可溶性HlgA蛋白(SEQ ID NO:6)的氨基酸残基180-192。因此，具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的HlgA蛋白在该已鉴定的区域中(即SEQ ID NO:6的180-192)含有破坏受体结合的一个或多个氨基酸残基的取代或缺失。在本发明的一个实施方式中，具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的HlgA蛋白(“HlgALukS-DR4”)具有如下述SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
含有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的适宜的HlgA多肽的长度为约50至约100个氨基酸，更优选长度在约100-200个氨基酸之间或长度在约200-250个氨基酸之间。示例性分离的HlgA多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸残基1-268、SEQ ID NO:6的氨基酸残基20-258或SEQ ID NO:6的氨基酸残基20-268，并且在CXCR1/CXCR2受体结合区域中(即氨基酸残基180-192)含有一个或多个氨基酸残基的取代或缺失。在本发明的一个实施方式中，所述分离的HlgA多肽包含如下述SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在至少一个实施方式中，含有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的HlgA多肽具有例如氨基酸P182、G184、P185或其任意组合的一个或多个取代或缺失(即单突变、双突变、三突变和四突变均包含在其中)。适宜的示例包括但不限于HlgALukS-DR4(即SEQ ID NO:13)、HlgA20-258 LukS-DR4(即SEQ ID NO:14)和HlgAP182A,G184A,P185A(即SEQ ID NO:15，如下所示)。
本发明的组合物还可以包含分离的HlgB蛋白或其多肽。所述分离的HlgB蛋白可以包含如下述SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16(HlgB的氨基酸序列)具有至少70％序列相似性的氨基酸序列。
适宜的HlgB多肽在长度上具有约50至约100个氨基酸，更优选长度在约100-200个氨基酸之间或长度在约200-250个氨基酸之间。适宜的HlgB多肽还包括包含与SEQ ID NO:16的氨基酸残基1-286具有约70-80％的序列相似性、优选80-90％的序列相似性、更优选90-95％的序列相似性和最优选95-99％的序列相似性的氨基酸序列的那些多肽。
本发明的另一个方面涉及一种在对象中预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法。该方法涉及选定处于其风险中或患有HIV感染的对象并且在有效地在所述对象中预防或治疗HIV的条件下向所述选定的对象施用本发明的组合物，所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的LukE蛋白或其多肽。所述组合物还可以含有如上文所述的分离的LukD蛋白或其多肽。所述组合物还可以包含如上所述的在LukE蛋白或多肽存在的氨基酸P184、G186、P187和/或G189的一个或多个取代或缺失。
如本申请和其他地方所描述的(参见Torres等的美国专利申请公开号20130039885，其全部内容通过引用并入本申请)，CCR5也是金黄色葡萄球菌LukE毒素的细胞受体。LukED与CCR5阳性细胞结合导致孔形成并且引起细胞死亡。已知CCR5受体介导HIV进入细胞并感染；因而，使用包含LukE和LukD蛋白或多肽的组合物治疗患有HIV的对象将导致所有HIV阳性细胞的细胞死亡。这种治疗方法优于现行的HIV治疗策略，因为LukED治疗将选择性和特异性地耗竭所有CCR5阳性，并且因而是对象中的所有HIV阳性细胞。本发明包含“修饰的LukE蛋白或多肽”(即具有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的LukE蛋白或多肽)的组合物对于治疗本申请所述的HIV和其他适应征具有增强的特异性，因为其避免了包括PMN的CXCR1/CXCR2阳性细胞的非特异性靶向和细胞死亡，即本发明包含经修饰的LukE蛋白或多肽的组合物对CCR5+细胞具有较高的选择性。
本发明的治疗组合物可以作为与另一种抗-HIV剂联合的联用疗法的一部分施用。因此，包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的LukE蛋白或其多肽，和分离的LukD蛋白或其多肽的组合物还可以包含或与一种或多种在HIV治疗中使用的抗病毒或其他药剂联合施用。适宜的抗病毒剂包括核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。更具体地，适宜的抗病毒剂包括但不限于齐多夫定、拉米夫定、扎西他滨、地达诺新、司他夫定、阿巴卡韦、阿德福韦酯、洛布卡韦、BC H-10652、恩曲他滨、β-L-FD4、DAPD、洛德腺苷、奈韦拉平、地拉韦啶、依非韦伦、PNU-142721、AG-1549、MKC-442、(+)-绵毛胡桐内酯A和B、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、拉西那韦、DMP-450、BMS-2322623、ABT-378、安泼那韦、羟基脲、利巴韦林、IL-2、IL-12、喷他夫西、伊萨姆(Yissum)1 1607号和AG-1549。
对于发明这一方面的目的而言，靶“对象”包含任意动物，优选哺乳动物，更优选人。在施用本发明的组合物用于在对象中预防HIV感染的目的的背景下，所述靶对象包含处于HIV感染风险中的任何对象。在施用本发明的组合物用于在对象中治疗HIV感染的目的的背景下，所述靶对象包含被HIV感染的任何对象。
在使用本发明的治疗组合物治疗HIV感染的背景下，经修饰的LukE和LukD的治疗有效量是能够达到减轻与感染相关的症状、降低至少一种症状的严重程度、减少所述对象的病毒载量和优选从所述对象中完全清除病毒的量。
含有经修饰的LukE和LukD的组合物的治疗有效量可以根据标准程序确定，其考虑了多种因素，包括例如这些活性剂在所述组合物中的浓度、施用的方式和频率、待治疗(或预防)的HIV感染的严重程度和对象的详细情况，如年龄、体重和总体健康情况以及免疫状况。一般性指导原则可以参见例如国际(药品注册)协调会议(International Conferenceon Harmonization)的出版物和Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPublishing Company1990)，其全部内容通过引用并入本申请。临床医师可以施用包含经修饰的LukE和LukD蛋白或多肽的组合物直至达到提供所需的或所要求的预防或治疗效果的某一剂量。能够通过常规检测容易地监测这种疗法的进程(例如病毒载量)。
本发明的治疗组合物可以单剂量施用，或者按照多剂量方案施用。例如，在多剂量方案中，所述治疗组合物可以每日、每周或每月一次或两次施用，这取决于其用途和正在治疗的状况的严重程度。可以由本领域的普通技术人员对治疗组合物的不同剂量、给药时机和相对量进行选择和调整。本发明治疗组合物的施用方式如上文所述。
本发明的另一个方面涉及一种预防对象HIV感染的方法。该方法涉及提供包含具有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的分离的LukE蛋白或多肽，和任选地分离的LukD蛋白或多肽的组合物，并且在有效地在组织中阻止细胞HIV感染的条件下将所述对象的组织与所述组合物接触，从而抑制所述对象的HIV感染。
根据本发明的这个方面，在HIV感染发生前包含经修饰的LukE和LukD蛋白或多肽的组合物作为抗-HIV杀微生物剂选择性地仅杀灭对HIV感染易感的CCR5+细胞，而不是非特异性地靶向CXCR1/CXCR2+细胞。可以向处于暴露于HIV风险中的任意雌性或雄性对象施用所述组合物作为防止HIV感染的预防性方式。
根据本发明的这个方面，包含经修饰的LukE和LukD蛋白或多肽的组合物还可以包含一种或多种附加剂。所述一种或多种附加剂包括例如并且不限于润滑剂、抗微生物剂、抗氧化剂、保湿剂、乳化剂、杀精剂或其两种或多种的混合物。
适宜的润滑剂包括但不限于十六烷基酯蜡、氢化植物油、硬脂酸镁、硬脂酸甲酯、矿物油、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠或白蜡，或其两种或多种的混合物。适宜的抗微生物剂包括但不限于丙二醇、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯，或其两种或多种的混合物。适宜的抗氧化剂包括但不限于丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、乙二胺四乙酸二钠，或其两种或多种的混合物。适宜的湿润剂包括但不限于乙二醇、甘油、山梨醇或其两种或多种的混合物。适宜的乳化剂包括但不限于卡波姆、聚氧乙烯-10-硬脂基醚、聚氧乙烯-20-硬脂基醚，十六十八醇、鲸蜡醇、胆固醇、二甘醇硬脂酸酯(diglycolstearate)、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，羊毛脂、聚氧乙烯月桂基醚、甲基纤维素、聚氧乙烯硬脂酸、聚山梨醇酯、丙二醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇酯或硬脂酸，或其两种或多种的混合物。
在本发明这个方面的一个实施方式中，将所述杀微生物剂制成供局部应用。根据本发明供局部施用的组合物可以制成溶液剂、软膏、霜剂、泡沫剂、混悬剂、洗剂、粉剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、或用于阴道、肛门或者口腔施用的油。在本发明的另一个实施方式中，将所述组合物制成供阴道和/或直肠施用。在本发明的另一个实施方式中，将所述组合物制成供从阴道装置中缓释，如阴道环、IUD、或海绵或者其他避孕装置(例如避孕套)。在本发明的又一个实施方式中，将所述组合物制成作为含漱液应用。在本发明一个优选的实施方式中，将所述组合物应用于或直接与处于暴露于HIV感染风险中的对象的皮肤或粘膜接触。
本发明的另一个方面涉及一种在对象中治疗炎症状况的方法。这种方法涉及选择患有炎症状况的对象和以在所述对象中治疗所述炎症状况的有效量施用本发明的组合物，所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的分离的LukE蛋白或多肽，和任选地分离的LukD蛋白或多肽。
申请人已发现LukED靶向并杀死人CCR5-阳性白细胞。包含具有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的LukE蛋白或多肽的组合物选择性并特异性地向CCR5+细胞(而非其他有核哺乳动物细胞)施加LukED介导的细胞毒性。由于CCR5在炎症过程中富集于局部的产生促炎性细胞因子的效应T细胞亚类中表达，因而包含经修饰的LukE和LukD蛋白和多肽的本发明的组合物通过选择性地耗竭CCR5阳性细胞群而用于治疗炎症状况。无论导致炎症的原因是什么(例如任意细菌或病毒感染)，可以根据本发明的这个方面对任意对象(优选哺乳动物，更优选人)进行治疗。含有经修饰的LukE和LukD蛋白和/或多肽的适宜组合物如上文所述。
本发明的治疗组合物可以用于治疗多种炎症状况，包括但不限于急性炎症状况、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、动脉粥样硬化、银屑病、溃疡性结肠炎、银屑病关节炎、多发性硬化、狼疮、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、结核病，皮肤创伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤皮肤综合征、败血症、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎、中毒性休克综合征、过敏性接触性皮炎、急性超敏反应和急性神经性炎性损伤(例如由急性感染导致的)。
急性炎症状况包括机体对侵入刺激的初始应答，并且涉及血浆和白血细胞(白细胞)向创伤或感染组织局部区域的募集。急性炎症状况迅速发病并患有严重的症状。从患者的正常状态到产生严重的炎症症状的发作过程时间通常持续达约72小时。适于使用本发明的治疗组合物治疗的急性炎症状况包括结膜炎、虹膜炎、葡萄膜炎、中心性视网膜炎、外耳炎、急性化脓性中耳炎、乳突炎、迷路炎、慢性鼻炎、急性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎、接触性皮炎、皮肤坏死、糖尿病性多神经炎、多肌炎、骨化性肌炎、退化性关节炎、类风湿关节炎、肩周炎和变形性骨炎。在本发明的一个实施方式中，所述急性炎症状况是在皮肤或软组织中的感染性创伤。
在治疗炎症状况的背景下，经修饰的LukE/lukD组合物的有效量从治疗能够达到减轻炎症、降低炎症的严重程度或甚至总体上缓解炎症状况的意义上说是治疗有效的量。
本发明的抗炎组合物可以通过如上文所述的任意给药途径施用。在治疗局部急性炎症状况的情况下，可能优选非全身性施用，在这种情况下将所述治疗组合物施用在所述急性炎症部位或其周围。就这一点而言，优选供局部施用的组合物。除了上文所述的局部制剂以外，所述局部制剂还可以是使用活性剂浸渍过的贴片或敷料形式，其可以任选地包含一种或多种赋形剂或稀释剂。在一些实施方式中，所述局部制剂包括增强所述活性剂吸收或渗透进入皮肤或其他受累区域的材料。
根据本发明这个或其他方面的经修饰的LukE/LukD组合物的治疗有效量是获得有益的或所需的结果所必须的量。可以在一个或多个施用、应用或剂量中施用治疗有效量，但不希望限定特定剂型或施用途径。
还是根据本发明的这个方面，所述经修饰的LukE/LukD组合物可以与其他抗炎组合物、TNFα抑制剂或其组合物联用(即，之前、同时或之后)。示例性抗炎药物包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛剂、糖皮质激素、改善病情的抗风湿药、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤)、生物反应调节剂及其任意组合。
适宜的NSAID是选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂。示例性COX-2抑制剂包括但不限于尼美舒利、4-羟基尼美舒利、氟舒胺、美洛昔康、塞来昔布和罗非昔布(万络)。或者，将非选择性NSAID抑制剂与本发明的LukE/D组合物联用。示例性的非选择性NSAIDS抑制剂包括但不限于双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、双水杨酯、舒林酸和托美丁。
优选的镇痛剂包括但不限于对乙酰氨基酚、羟考酮、曲马多和盐酸右丙氧芬。
优选的糖皮质激素包括但不限于可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。
优选的生物反应调节剂包括B-细胞抑制剂(如利妥昔单抗)或T细胞活化抑制剂(如来氟米特、依那西普(Enbrel)或英夫利昔单抗(Remicade))。
适宜的TNFα抑制剂包括TNF-α抗体、基质金属蛋白酶抑制剂、皮质类固醇、四环素TNFα拮抗剂、氟喹诺酮TNFα拮抗剂和喹诺酮TNFα拮抗剂。示例性TNFα拮抗剂抗体包括但不限于英夫利昔单抗、依那西普、CytoFAb、AGT-1、阿非莫单抗、PassTNF和CDP-870。示例性皮质类固醇包括但不限于莫米松、氟替卡松、环索奈德、布地奈德、倍氯米松、伯克纳、氟尼缩松、地夫可特、倍他米松、甲基强的松龙、地塞米松、泼尼松龙、氢化可的松、皮质醇、曲安西龙、可的松、皮质酮、二羟基可的松、二丙酸倍氯米松和泼尼松。示例性四环素TNF-α拮抗剂包括但不限于多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、赖甲环素和4-羟基-4-二甲基氨基四环素。
本发明的另一个方面涉及一种在对象中预防移植物抗宿主病(GVHD)的方法。这种方法涉及选定患有GVHD或处于其风险中的对象，并且以在所述对象中预防移植物抗宿主病(GVHD)的有效量施用组合物，所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的分离的LukE蛋白或多肽，和任选地分离的LukD蛋白或多肽。
移植物抗宿主病(GVHD)仍是临床骨髓移植(BMT)的主要并发症并且是限制这种重要治疗方式广泛应用的主要障碍。GVHD的标志是供体T淋巴细胞浸润进入宿主皮肤、小肠和胆道的上皮部分。当包含在移植物骨髓中的成熟T细胞移植进入免疫抑制的宿主时发生GVHD。移植后，宿主抗原提呈细胞(APC)通过将宿主组织相容性抗原提呈至移植物T细胞活化移植物的T细胞(供体T细胞)。供体来源的APC还可以通过交叉提呈宿主同种异体抗原活化供体T细胞。新产生的宿主特异性T效应器(hsTeff)群随后迁移至宿主外周器官并且导致靶器官损伤。
GVHD通常以急性和慢性形式发生。急性GVHD将在BMT后的约前100天内观察到，而慢性GVHD发生在该初始的100天以后。与慢性GVHD相比，除了时间表以外，急性GVHD还会产生不同的临床症状。急性GVHD的一般特征为在宿主对象中损害宿主肝脏、皮肤、粘膜和小肠上皮，但是也有报道会出现一些形式的特发性肺炎。另一方面，慢性GVHD与宿主对象中的结缔组织损伤以及在急性GVHD期间的器官和组织损伤相关。在通常情况下，本发明的方法涉及针对在宿主对象中已经存在的GVHD或在宿主对象中预防GVHD出现的疗法。在一个实施方式中，本发明涉及治疗或预防急性GVHD的方法。特别地，本发明的方法适于治疗急性GVHD，其中所述GVHD损伤宿主小肠上皮。本发明的方法还适于治疗急性GVHD，其中所述GVHD损伤至少一种选自下述的组织：宿主肝脏、宿主皮肤、宿主肺脏和宿主粘膜。当然，所述方法可以用于治疗急性GVHD，其中所述GVHD损伤一种以上的组织。
根据本发明的这个实施方式，在同种异体移植介导的GVHD过程中，CCR5-阳性供体T细胞移植进入受体宿主。因此，在本发明的一个实施方式中，移植前使用含有经修饰的LukE/Luke D组合物处理供体骨髓细胞能够导致所有CCR5+细胞的细胞死亡，从而防止GVDH。
在本发明的另一个实施方式中，通过处理移植物实现供体骨髓细胞的处理。“处理移植物”旨在指向移植物材料施用组合物或对其进行某种程序，其中所述处理并非旨在直接影响宿主生物体。当然，对移植物的成功处理将间接影响宿主生物体，因为GVHD的严重程度可能减轻，或者甚至完全消除。本发明的方法不限于在移植物被处理时所述移植物的位置。因此，在一个实施方式中，在从供体生物体取出前处理所述移植物。在另一个实施方式中，在从供体生物体取出后处理所述移植物。在又一个实施方式中，在从供体生物体取出后，但是在移植进入宿主对象前处理所述移植物。在又一个实施方式中，在移植进入宿主生物体后处理所述移植物。
根据本发明的这个方面，包含经修饰的LukE和LukD的所述组合物可以作为联用疗法的一部分施用。例如，可以将LukE/LukD组合物与另一种药物活性物质联合施用，例如但不限于甲氨蝶呤和环孢菌素。可以共同施用的附加剂包括但不限于针对不同靶点的抗体、他克莫司、西罗莫司、干扰素、阿片类、TNFα(肿瘤坏死因子α)、结合蛋白、霉酚酸酯和肌苷单磷酸脱氢酶的其他抑制剂(IMPDH)、糖皮质激素、硫唑嘌呤和其他细胞生长抑制剂，例如但不限于抗代谢物和烷化剂。在一个实施方式中，可以在移植前通过施用免疫抑制药物如环孢菌素(单独或与类固醇联用)和甲氨蝶呤预处理移植物或供体。对于预防而言，免疫抑制疗法通常由甲氨蝶呤(MTX)、环孢菌素(CsA)、他克莫司(FK 506)和/或皮质类固醇组成的联用方案组成。静脉内预防性施用γ–球蛋白制剂也显示出预防GVHD的益处。此外，可以将己酮可可碱(能够下调TNFα产生的黄嘌呤衍生物)与环孢菌素加甲氨蝶呤或甲泼尼龙施用以进一步降低GVHD的发生率。可以使用类固醇(如强的松、硫唑嘌呤和环孢菌素)治疗慢性GVHD。而且，可以使用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和/或熊去氧胆酸。具有免疫抑制性质的沙利度胺在慢性GVHD的治疗中显示出有前景的结果。与沙利度胺类似，氯法齐明也可以与包含LukE和LukD的本发明的组合物共同施用。共同施用抗体的抗体靶点包括但不限于T细胞受体(TCR)、白介素-2(IL-2)和IL-2受体。此外，CD(25)单克隆抗体、抗-CD8单克隆抗体或抗-CD103抗体可以用于GVHD预防的共给药。
本发明的另一个方面涉及在对象中预防或治疗癌症的方法。这种方法涉及选定患有癌症或处于其风险中的对象并且以在所述对象中治疗或预防癌症的有效量向所选定的对象施用组合物，所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2受体结合结构域的分离的LukE蛋白或多肽，和任选地分离的LukD蛋白或多肽。
根据本发明的这个方面适于治疗的癌症包括原发性和转移性形式的那些癌症，其中CCR5在介导癌症的发展或进展中具有作用并且其中拮抗CCR5具有有益的治疗作用。例如，适宜的癌症包括但不限于肝癌(Ochoa-Callejero等，“Maraviroc,a CCR5Antagonist,Prevents Development of Hepatocellular Carcinoma in a Mouse Model,”PLOS One 8(1):e53992(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)、乳腺癌(Velasco-Velazquez等，“The CCL5/CCR5Axis Promotes Metastasis in Basal Breast Cancer,”Oncoimmunology2(4):e23660(2013)和Velasco-Velazquez等，“CCR5Antagonist Blocks Metastasis ofBasal Breast Cancer Cells,”Cancer Res.72:3839(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)、肺癌(Lee等，“Deficiency of C-C Chemokine Receptor 5Suppresses TumorDevelopment Via Inactivation of NF-κB and Inhibition of MonocyteChemoattractant Protein-1in Urethane-Induced Lung Tumor Model,”Carcinogenesis33(12):2520-2528(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)和前列腺癌(Zhang等，“Structure Activity Relationship Studies of Natural Product ChemokineReceptor CCR5Antagonist Anibamine Toward the Development of Novel Anti-Prostate Cancer Agents,”Eur.J.Medicinal Chem.55:395-408(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。
根据本发明的这个方面，向对象施用包含经修饰的LukE和LukD的组合物以靶向CCR5+癌细胞可以与其他抗癌治疗方法同时实施，即将所述组合物作为联用疗法的一部分施用。因此，在发明的一个实施方式中，将药剂与一种或多种附加癌症疗法联合施用，如化疗、放疗(例如外照射放疗或近距离照射疗法)或抗血管生成疗法。
用于联用疗法的适宜的化疗剂包括但不限于烷化剂(例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、CCNU、美法仑、丙卡巴肼、塞替派、BCNU和白消安)、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤和5-氟尿嘧啶)、蒽环类抗生素(柔红霉素、阿霉素、伊达比星、表柔比星和米托蒽醌)、抗肿瘤抗生素(例如、博莱霉素、单克隆抗体(例如阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉姆单抗、替伊莫单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗)、铂类(例如顺铂和奥沙利铂)或植物生物碱(例如拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类和表鬼臼毒素)。
适于与本发明的组合物在联用治疗方法中使用的抗血管生成疗法包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抑制剂，血管内皮生长因子受体(VEGFR)拮抗剂、来源于血小板的生长因子受体(PDGFR)拮抗剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)拮抗剂、血管生成素受体(Tie-2)拮抗剂，表皮生长因子受体(EGFR，ErbB)拮抗剂或其任意组合。多种适宜的小分子血管生成抑制剂是本领域公知的或者处于临床研究中(参见例如Wu等，“Anti-Angiogenic Therapeutic Drugs for the Treatment ofHuman Cancer,”J Cancer Molecules 4(2):37–45(2008)，其全部内容通过引用并入本申请)。这些血管生成抑制剂包括但不限于吉非替尼(ErbB抑制剂)、拉帕替尼(ErbB1/ErbB2双抑制剂)、厄洛替尼、卡奈替尼(泛ErbB抑制剂)、瓦他拉尼(VEGF受体抑制剂)、伊马替尼(Bcr-Abl、c-kit和PDGF-R抑制剂的多靶点抑制剂)、舒尼替尼(VEGFR、PDGFR Kit、Flt3、Tet和CSF1R抑制剂的多靶点抑制剂)、索拉非尼(VEGFR和PDGFR的多靶点抑制剂)、帕唑帕尼(VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF-α、PDGFR-β和c-kit的多靶点抑制剂)。或者，所述抗血管生成治疗是单克隆抗体。适宜的抗体治疗包括但不限于贝伐单抗(VEGF抗体)、IMC-1C11(VEGFR-2抗体)、mF4-31C1(VEGFR-3抗体)和Vitaxin(整合素αvβ3抗体)。
本发明的另一个方面涉及一种鉴定能够预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的化合物的方法。这种方法通常在体外进行，即在细胞培养中。这种方法涉及提供一系列候选化合物并且提供表达人CXCR1、CXCR2和/或DARC的细胞群。所述方法还涉及使用能够诱导LukED或HlgAB介导的细胞毒性的药剂处理细胞群，并且将经处理的细胞群与来自所述集合的一种或多种候选化合物接触。所述方法还涉及测定在存在和不存在一种或多种候选化合物的条件下经处理的细胞群中LukED或HlgAB介导的细胞毒水平并且比较在存在或不存在一种或多种候选化合物的条件下LukED或HlgAB介导的细胞毒的测定水平。与不存在一种或多种候选化合物的条件下相比，在存在一种或多种候选化合物的条件下LukED或HlgAB介导的细胞毒水平降低鉴定出了能够预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的化合物。
适用于根据本发明的这个方面的表达人CXCR1/CXCR2的细胞包括人PMN、单核细胞、天然杀伤细胞、CD8+T细胞亚群、上皮细胞和内皮细胞。适用于根据本发明的这个方面的表达人DARC的细胞包括人内皮细胞和人红细胞。其他适宜的细胞包括经工程化改造的表达CXCR1/CXCR2或DARC的任何有核细胞，例如稳定或瞬时转染含有人CXCR1、CXCR2和/或DARC多核苷酸序列的表达构建体的细胞。
如本申请所述，设计本发明的这个方法以鉴定抑制导致LukED或HlgAB-介导的细胞毒性和人CXCR1/CXCR2+或DARC+细胞裂解的事件级联的一些方面的药剂。作为所述级联一部分的目标事件包括例如LukE或HlgA与CXCR1/CXCR2或DARC结合、LukED或HlgAB寡聚化以及LukED或HlgAB寡聚物的膜孔形成。该测定利用表达包含LukE和HlgA结合结构域的人CXCR1/CXCR2或DARC的任意哺乳动物或非哺乳动物细胞，适宜的培养基以及分离的或重组的LukE/LukD和HlgA/HlgB或金黄色葡萄球菌。该测定还包括细胞毒性标记物，在表达人CXCR1/CXCR2或DARC的细胞与能够诱导LukED或HlgAB细胞毒性的药剂接触之前、期间或之后将其暴露于所述细胞。所述细胞毒性标记物可以包括细胞活力染料、细胞不渗透染料和/或细胞裂解指示剂。在Torres等的国际专利申请序列号PCT/US2013/032436中详细描述了适用于本发明这个方面的示例性筛选方案，其全部内容通过引用并入本申请。
本发明还提供的以下实施方式。
实施方式1.一种在对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法，所述方法包括：
选定患有金黄色葡萄球菌感染或存在其风险的对象，和
在有效地在所述对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的条件下，向所述选定的对象施用抑制金黄色葡萄球菌与CXCR1和CXCR2相互作用的组合物。
实施方式2.根据实施方式1所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染或甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)感染。
实施方式3.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物包含抑制CXCR1和CXCR2两者的药剂。
实施方式4.根据实施方式3所述的方法，其中所述药剂是CXCR1和CXCR2的蛋白或肽抑制剂。
实施方式5.根据实施方式4所述的方法，其中所述蛋白或肽抑制剂来源于CXC趋化因子配体8(CXCL8)并且选自下组：CXCL8(3-74)K11R/G31P(SEQ ID NO:1)、CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G(SEQ ID NO:2)和CXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P(SEQ ID NO:3)。
实施方式6.根据实施方式4所述的方法，其中所述蛋白或肽抑制剂是包含金黄色葡萄球菌CXCR1/CXCR2受体结合结构域序列的重组肽。
实施方式7.根据实施方式6所述的方法，其中所述重组肽包含与SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196对应的氨基酸序列。
实施方式8.根据实施方式6所述的方法，其中所述重组肽包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192对应的氨基酸序列。
实施方式9.根据实施方式3所述的方法，其中所述药剂是CXCR1和CXCR2的小分子抑制剂。
实施方式10.根据实施方式9所述的方法，其中所述小分子抑制剂选自下组：2-羟基-N,N,-二甲基-3-[[2-[[1(R)-(5-甲基-2-呋喃基)丙基]氨基]-3,4-二氧代-1-环丁烯-1-基]氨基]苯甲酰胺(SCH-527123)、N-(2-羟基-3-二甲基磺酰胺基-4-氯苯基)-N’-(2-溴苯基)-N”-氰基胍(SCH468477)、SCH-479833及其衍生物。
实施方式11.根据实施方式9所述的方法，其中所述小分子抑制剂选自下组：R(-)-2-[(4-异丁基苯基)丙酰基]-甲基磺酰胺(Reparixin)、R(-)-2-[(4′-三氟甲磺酰氧基)苯基]丙酰基-甲基磺酰胺(Meraxin)、4-[(1R)-2-氨基-1-甲基-2-氧乙基]三氟甲磺酸苯酯(DF 2162)及其衍生物。
实施方式12.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物包含CXCR2抑制剂，所述CXCR2抑制剂选自下组：SB-656933、N-(2-羟基-3-氨磺酰基-4-氯苯基)-N’-(2,3二氯苯基)脲(SB-332235)、N-(2-羟基-4-硝基苯基)-N′-(2-溴苯基)脲(SB 225002)及其衍生物。
实施方式13.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物包含CXCR1阻断抗体或其抗体结合部分、CXCR2阻断抗体或其抗体结合部分或其组合。
实施方式14.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物包含抗体，或其抗体结合部分，其与金黄色葡萄球菌杀白细胞素E(LukE)的表位结合，所述表位包含与SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196对应的氨基酸序列。
实施方式15.根据实施方式1所述的方法，其中所述组合物包含抗体，或其抗体结合部分，其与金黄色葡萄球菌γ-溶血素A(HlgA)的表位结合，所述表位包含与SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192对应的氨基酸序列。
实施方式16.根据实施方式1所述的方法，其还包括：
与所述组合物联合施用选自下组的药剂：抗感染剂、抗生素剂和抗微生物剂。
实施方式17.根据实施方式1所述的方法，其中由金黄色葡萄球菌导致的状况被治疗或预防，所述状况选自下组：皮肤创伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血病、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征。
实施方式18.根据实施方式1所述的方法，其还包括：
重复所述施用。
实施方式19.根据实施方式1所述的方法，其中所述对象是婴儿、青少年或成人。
实施方式20.根据实施方式1所述的方法，其中所述对象是免疫功能低下的婴儿、青少年或成人。
实施方式21.根据实施方式1所述的方法，其中金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况被预防。
实施方式22.根据实施方式1所述的方法，其中金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况被治疗。
实施方式23.根据实施方式1所述的方法，其中CXCR1和CXCR2与LukE的相互作用被抑制。
实施方式24.根据实施方式1所述的方法，其中CXCR1和CXCR2与HlgA的相互作用被抑制。
实施方式25.一种在对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的方法，所述方法包括：
选定患有金黄色葡萄球菌感染或存在其风险的对象，和
在有效地在所述对象中预防或治疗金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况的条件下，向所述选定的对象施用抑制金黄色葡萄球菌与趋化因子的达菲(Duffy)抗原受体(DARC)相互作用的组合物。
实施方式26.根据实施方式25所述的方法，其中所述金黄色葡萄球菌感染是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染或甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)感染。
实施方式27.根据实施方式25所述的方法，其中所述组合物包含DARC抑制剂。
实施方式28.根据实施方式27所述的方法，其中所述DARC抑制剂是DARC阻断抗体。实施方式29.根据实施方式25所述的方法，其还包括：
与所述组合物联合施用选自下组的药剂：抗感染剂、抗生素剂和抗微生物剂。
实施方式30.根据实施方式25所述的方法，其中由金黄色葡萄球菌导致的状况被治疗或预防，所述状况选自下组：皮肤创伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤样皮肤综合征、败血症、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎和中毒性休克综合征。
实施方式31.根据实施方式25所述的方法，其还包括：
重复所述施用。
实施方式32.根据实施方式25所述的方法，其中所述对象是婴儿、青少年或成人。
实施方式33.根据实施方式25所述的方法，其中所述对象是低下的婴儿、青少年或成人。
实施方式34.根据实施方式25所述的方法，其中金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况被预防。
实施方式35.根据实施方式25所述的方法，其中金黄色葡萄球菌感染和/或由金黄色葡萄球菌感染导致的状况被治疗。
实施方式36.根据实施方式25所述的方法，其中DARC与LukE的相互作用被抑制。
实施方式37.根据实施方式25所述的方法，其中DARC与HlgA的相互作用被抑制。
实施方式38.一种治疗金黄色葡萄球菌感染的对象的方法，所述方法包括：
从金黄色葡萄球菌感染的所述对象获得样品；
对所述样品中CXCR1、CXCR2、DARC或其组合的表达水平进行定量；和基于所述定量向所述对象施用治疗。
实施方式39.根据实施方式38所述的方法，其中所述定量包括：
在来自所述对象的样品中测定CXCR1、CXCR2和/或DARC的蛋白表达。
实施方式40.根据实施方式38所述的方法，其中所述定量包括：
在来自所述对象的样品中测定CXCR1、CXCR2和/或DARC的mRNA表达。
实施方式41.根据实施方式38所述的方法，其还包括：
将来自所述对象的样品中CXCR1、CXCR2和/或DARC的定量表达水平与CXCR1、CXCR2和/或DARC的对照表达水平进行比较，其中所述适宜的治疗是基于所述比较确定的。
实施方式42.一种分离的LukE抗体，或其抗体结合片段，其中所述抗体或其结合片段与SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196对应的表位结合。
实施方式43.根据实施方式42所述的分离的抗体，其中所述抗体结合片段包含单一可变VH结构域、单一可变VL结构域、Fab片段或单链抗体片段。
实施方式44.一种分离的HlgA抗体，或其抗体结合片段，其中所述抗体或其结合片段与SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192对应的表位结合。
实施方式45.根据实施方式44所述的分离的抗体，其中所述抗体结合片段包含单一可变VH结构域、单一可变VL结构域、Fab片段或单链抗体片段。
实施方式46.一种组合物，所述组合物包含：
具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的LukE蛋白或其多肽，和药学上可接受的载体。
实施方式47.根据实施方式46所述的组合物，其中所述分离的LukE多肽包含SEQID NO:4的氨基酸残基20-263，其中与SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196对应的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失。
实施方式48.根据实施方式47所述的组合物，其中选自下组P184、G186、P187和G189的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失。
实施方式49.根据实施方式47所述的组合物，其中所述分离的LukE蛋白包含SEQID NO:4的氨基酸序列。
实施方式50.根据实施方式47所述的组合物，其中所述分离的LukE蛋白包含SEQID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
实施方式51.根据实施方式57所述的组合物，其中所述分离的LukE多肽包含SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
实施方式52.根据实施方式46所述的组合物，其还包含：
分离的杀白细胞素D(LukD)蛋白或其多肽。
实施方式53.根据实施方式52所述的组合物，其中所述组合物包含分离的LukD蛋白，所述蛋白包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少70％序列相似性的氨基酸序列。
实施方式54.根据实施方式52所述的组合物，其中所述组合物包含分离的LukD多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸残基20-281。
实施方式55.一种组合物，所述组合物包含：
具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的HlgA蛋白或其多肽，和药学上可接受的载体。
实施方式56.根据实施方式55所述的组合物，其中所述分离的HlgA蛋白包含SEQID NO:6的氨基酸残基20-258，其中与SEQ ID NO:6的氨基酸残基180-192对应的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失。
实施方式57.根据实施方式56所述的组合物，其中选自下组P182、G184和P185的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失。
实施方式58.根据实施方式56所述的组合物，其中所述分离的HlgA蛋白包含SEQID NO:6的氨基酸序列。
实施方式59.根据实施方式56所述的组合物，其中所述分离的HlgA蛋白包含SEQID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
实施方式60.根据实施方式55所述的组合物，其还包含：
分离的γ-溶血素B(HlgB)蛋白或其多肽。
实施方式61.根据实施方式60所述的组合物，其中所述组合物包含分离的HlgB蛋白，所述蛋白包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少70％序列相似性的氨基酸序列。
实施方式62.一种在对象中预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，所述方法包括：
选定患有HIV感染或存在其风险的对象，和
在有效地在所述对象中预防或治疗HIV的条件下，向所述选定的对象施用实施方式46或实施方式52所述的组合物。
实施方式63.根据实施方式62所述的方法，其还包括：
将一种或多种用于治疗HIV的抗病毒剂或其他药剂与所述组合物联合施用，所述组合物包含所述分离的LukE蛋白，或其多肽，和所述分离的LukD蛋白，或其多肽。
实施方式64.根据实施方式63所述的方法，其中所述抗病毒剂选自下组：核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。
实施方式65.根据实施方式63所述的方法，其中所述抗病毒剂选自下组：齐多夫定、拉米夫定、扎西他滨、地达诺新、司他夫定、阿巴卡韦、阿德福韦酯、洛布卡韦、BC H-10652、恩曲他滨、β-L-FD4、DAPD、洛德腺苷、奈韦拉平、地拉韦啶、依非韦伦、PNU-142721、AG-1549、MKC-442、(+)-绵毛胡桐内酯A和B、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、拉西那韦、DMP-450、BMS-2322623、ABT-378、安泼那韦、羟基脲、利巴韦林、IL-2、IL-12、喷他夫西、伊萨姆(Yissum)1 1607号和AG-1549。
实施方式66.根据实施方式46、实施方式52、实施方式55或实施方式60所述的组合物，其还包含：
一种或多种选自下组的添加剂：润滑剂、抗微生物剂、湿润剂、乳化剂及其两种或多种的混合物。
实施方式67.根据实施方式66所述的组合物，其中所述组合物包含润滑剂，所述润滑剂选自下组：十六醇酯蜡、氢化植物油、硬脂酸镁、硬脂酸甲酯、矿物油、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠或白蜡及其两种或多种的混合物。
实施方式68.根据实施方式66所述的组合物，其中所述组合物包含抗微生物剂，所述抗微生物剂选自下组：丙二醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯及其两种或多种的混合物。
实施方式69.根据实施方式66所述的组合物，其中所述组合物包含抗氧剂，所述抗氧剂选自下组：丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、乙二胺四乙酸二钠及其两种或多种的混合物。
实施方式70.根据实施方式66所述的组合物，其中所述组合物包含湿润剂，所述湿润剂选自下组：乙二醇、甘油、山梨醇或其两种或多种的混合物。
实施方式71.根据实施方式66所述的组合物，其中所述组合物包含乳化剂，所述乳化剂选自下组：卡波姆、聚氧乙烯-10-硬脂基醚、聚氧乙烯-20-硬脂基醚，十六十八醇、鲸蜡醇、胆固醇、二甘醇硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，羊毛脂、聚氧乙烯月桂基醚、甲基纤维素、聚氧乙烯硬脂酸、聚山梨醇酯、丙二醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇酯、硬脂酸及其两种或多种的混合物。
实施方式72.根据实施方式66所述的组合物，其中将所述组合物制成供局部施用的制剂。
实施方式73.根据实施方式66所述的组合物，其中将所述组合物制成供阴道和/或直肠施用的制剂。
实施方式74.根据实施方式66所述的组合物，其中将所述组合物制成漱口液。
实施方式75.一种在对象中预防HIV感染的方法，所述方法包括：
选定处于暴露于HIV感染风险中的对象；
提供实施方式46、实施方式52或实施方式66所述的组合物，其中所述组合物包含具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域的分离的LukE蛋白或其多肽；和
在有效抑制在组织中的HIV细胞感染性的条件下，将所述对象的组织与所述组合物接触，从而在所述对象中预防HIV感染。
实施方式76.一种在对象中治疗炎症状况的方法，所述方法包括：
选定患有炎症状况的对象，和
在有效治疗所述炎症状况的条件下，向所述选定的对象施用实施方式46或实施方式52所述的组合物。
实施方式77.根据实施方式76所述的方法，其中所述炎症状况是急性炎症状况。
实施方式78.根据实施方式77所述的方法，其中所述急性炎症状况是局部的。
实施方式79.根据实施方式77所述的方法，其中所述急性炎症状况是皮肤或软组织中感染的伤口。
实施方式80.根据实施方式76所述的方法，其中所述炎症状况选自下组：类风湿性关节炎、克罗恩氏病、动脉粥样硬化、银屑病、溃疡性结肠炎、银屑病关节炎、多发性硬化、狼疮、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、结核病，皮肤创伤和感染、组织脓肿、毛囊炎、骨髓炎、肺炎、烫伤皮肤综合征、败血症、脓毒性关节炎、心肌炎、心内膜炎、中毒性休克综合征、过敏性接触性皮炎、急性超敏反应和急性神经性炎性损伤。
实施方式81.一种在对象中预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括：
选定患有GVHD或存在其风险的对象，和
向所述选定的对象施用有效量的实施方式46或实施方式52所述的组合物以便在所述对象中预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
实施方式82.一种在对象中预防或治疗癌症的方法，所述方法包括：
选定患有癌症或存在其风险的对象，和
向所述选定的对象施用有效量的实施方式46或实施方式52所述的组合物以便在所述对象中预防或治疗癌症。
实施方式83.根据实施方式82所述的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌。
实施方式84.根据实施方式82所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
实施例
下述实施例是对本发明的实施方式进行说明，但是其绝不是旨在限制其范围。
实施例1-8的材料和方法
细胞培养条件和病毒转导。除非另有说明，在37℃、5％CO2条件下在添加了10％胎牛血清(FBS；Atlanta Biologicals)以及青霉素(100U ml-1)和链霉素(0.1mg ml-1)(Mediatech)的RPMI中培养原代人细胞和THP-1。根据此前的描述进行Cxcr2或非靶向shRNA的过表达和基于慢病毒的敲除(Wan等，“Cytokine Signals Through PI-3Kinase PathwayModulate Th17Cytokine Production by CCR6+Human Memory T Cells,”J.Exp.Med.208:1875-1887(2011)，其全部内容通过引用并入本申请)并且维持在1.3μg ml-1嘌呤霉素中。在37℃、5％CO2条件下在DMEM(Cellgro)中并按照如上文所述添加后培养HEK293T细胞。
PMBC的分离。获得血沉棕黄色层形式的血液，其得到了来自纽约血液中心的隐去身份识别信息供体的知情同意。使用Ficoll-Paque PLUS梯度(GE Amersham)从血液中分离PBMC并且以CCR5+细胞进行门控，随后针对淋巴细胞和单核细胞群进行抗-CD3和CD14细胞表面染色。然后在存在或不存在马拉韦罗(MVC,100ng ml-1)的条件下使用LukED(75nM)孵育细胞。
CCR5抑制剂和配体。从AIDS研究和对照试剂项目AIDS部(NIAID,NIH)获得马拉韦罗并且以终浓度100ng ml-1使用。从BioLegend获得CXCL8和CXCL1并且以文中所示的浓度使用。
FACS分析。如此前所述进行细胞染色(Alonzo等，“CCR5is a Receptor forStaphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。使用FACSDiva软件在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上获得FACS数据。使用FlowJo软件(Treestar)分析数据。
抗体和染料。用于原代人细胞表面染色的抗体包括下述：CXCR1-APC(克隆8F1/CXCR1)、CXCR2-PE(克隆5E8/CXCR2)、CD3-PE-Cy7(克隆UCHT1)、CD8-Pacific Blue(克隆HIT8a)、CD14-Alexa Fluor 700(克隆HCD14)、CD16-Alexa Fluor 488(克隆3G8)、CD56-PerCP-Cy5.5(克隆HCD56)、CD19-Brilliant Violet 650(克隆HIB19)、HLA-DR-BrilliantViolet 605(克隆L243)、CD14-FITC(克隆M5E2)、CD18-PE-Cy5(克隆TS1/18)(BioLegend)和CCR5-PE(克隆2D7)(BD Pharmingen)。
用于原代小鼠细胞表面染色的抗体包括下述：CXCR2-AF647(克隆TG11/CXCR2)(BioLegend)、CCR5-PerCP-Cy5.5(BD Pharmingen)、链霉亲和素-PerCP-Cy5.5(BioLegend)、CD11b-PE(克隆M1/70)(BD Pharmingen)、B220-Alexa700(克隆RA3-6B2)(BioLegend)、Ly6G-FITC(克隆1A8)(BD Biosciences)、F480-PECy7(克隆BM8)(BioLegend)和CD16/CD32Fc Block(克隆2.4G2)(BD Biosciences)。可固定活力染料eFluor-450和eFluor 780来自eBioscience。
lukEDR构建体的产生。通过重叠PCR产生同基因DR突变株(引物和菌株的详细信息见下表1-3)。为产生lukEDR1，使用含有lukE的VJT8.87质粒作为模板并使用引物VJT296和VJT891；VJT297和VJT894；或者VJT892和VJT893扩增。对于lukEDR2而言，使用含有lukE的VJT8.87质粒作为模板并使用引物VJT296和VJT895；VJT898和VJT297；或者VJT896和VJT897扩增。对于lukEDR3而言，使用含有lukE的VJT8.87质粒作为模板并使用引物VJT296和VJT899；VJT902和VJT297；或者VJT900和VJT901扩增。对于lukEDR4而言，使用含有lukE的VJT8.87质粒作为模板并使用引物VJT296和VJT903；VJT914和VJT297；或者VJT904和VJT905扩增。对于lukEDR5而言，使用含有lukE的VJT8.87质粒作为模板并使用引物VJT296和VJT911；或者VJT906和VJT297扩增。使用含有lukS-PV的VJT8.89质粒并且使用引物VJT912和VJT913扩增以使lukEDR5基因座完整。为获得最终的PCR产物，将各DNA片段包括在含有翼侧引物VJT296和VJT297的PCR反应中。使用XhoI和BamHI限制性酶切位点将扩增子克隆进入pET14b-6xHis(Novagen)，以获得在N-末端具有6x组蛋白(His)标签的lukEDR嵌合序列。
lukEDR大肠杆菌表达菌株的产生。将pET14b-6xHis-lukEDR质粒转化进入大肠杆菌(E.coli)DH5α并且使用氨苄西林(Fisher)抗性选择转化子。按照此前的描述将阳性克隆转化进入E.coli T7LysY/LacQ(New England BioLabs)用于纯化重组蛋白(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection byTargeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；DuMont等，“Characterization of a New CytotoxinThat Contributes to Staphylococcus aureus Pathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)，其全部内容通过引用并入本申请)。使用Thermo Scientific Pierce BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。
杂交/突变蛋白的产生。为产生HlgA/DDR4，(使用LukE的相应氨基酸取代HlgA的氨基酸182-196)：使用Newman基因组DNA作为模板和引物VJT635和VJT1267；以及VJT1209和VJT1266进行扩增(引物和菌株的详细信息如下表1-3所示)。为了产生完全突变的基因座，使用所得到的DNA产物作为模板使用翼侧引物VJT635和VJT1209进行最终缝纫重叠延伸PCR反应。使用BamHI和PstI限制性酶切位点将最终的扩增子克隆进入pOS1-PlukAB-lukAs.s.-6xHis载体，获得了在N-末端具有6x组蛋白标签的HlgA/EDR4。
为产生HlgA/SDR4(使用LukS-PV的相应氨基酸取代HlgA的氨基酸182-196)：使用Newman基因组DNA作为模板和引物VJT635和VJT1263；以及VJT1209和VJT1262进行扩增(引物和菌株的详细信息如下表1-3所示)。为了产生完全突变的基因座，使用所得到的DNA产物作为模板使用翼侧引物VJT635和VJT1209进行最终缝纫重叠延伸PCR反应。使用BamHI和PstI限制性酶切位点将最终的扩增子克隆进入pOS1-PlukAB-lukAs.s.-6xHis载体，获得了在N-末端具有6x组蛋白标签的HlgA/SDR4。
为产生LukEP184A,G186A,P187A,G189A：使用Newman基因组DNA作为模板和引物VJT629和VJT1179；以及VJT1114和VJT1180进行扩增(引物和菌株的详细信息如下表1-3所示)。为了产生完全突变的基因座，使用所得到的DNA产物作为模板使用翼侧引物VJT629和VJT1114进行最终缝纫重叠延伸PCR反应。使用BamHI和PstI限制性酶切位点将最终的扩增子克隆进入pOS1-PlukAB-lukAs.s.-6xHis载体，获得了在N-末端具有6x组蛋白标签的LukEP184A ,G186A,P187A,G189A。
蛋白生产。将所有质粒转化进入E.coli DH5α并使用氨苄西林抗性进行选择。然后将阳性质粒电穿孔进入金黄色葡萄球菌抗性阴性的RN4220感受态细胞，随后电穿孔进入金黄色葡萄球菌Newman减毒感受态细胞(Newman delta lukED,hlg::tet,lukAB::spec,hla::ermC)用于蛋白生产。通过氯霉素抗性在金黄色葡萄球菌中进行突变选择。
白细胞毒素处理。如此前的描述使用LukE、LukD或LukED处理HEK293T细胞、THP-1、原代人PBMC和原代小鼠腹腔渗出液细胞(Alonzo等，“CCR5is a Receptor forStaphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。在所有实验中，将1-2x 105个细胞接种于96孔板中。对于使用原代人或小鼠细胞的实验而言，在冰上进行30分钟的中毒，然后使用可固定活力染料对细胞进行染色并使用抗体作为细胞表面标记物，随后进行流式细胞术分析。对于其他所有的细胞毒性测定而言，在37℃、5％CO2以及存在毒素的条件下将细胞孵育1小时，然后使用代谢染料(CellTiter,Promega)再孵育1-2小时。
结合和竞争测定。对于结合测定而言，将增加浓度的GFP-LukE或GFP-LukD加入5x104个人PMN中并且在冰上孵育30分钟，然后在FACS缓冲液中洗涤一次并且在室温下固定15分钟，随后进行流式细胞术分析。检测GFP+细胞的平均荧光强度(MFI)以确定达到饱和结合所需的毒素浓度。对于其余的竞争测定而言，将增加浓度的LukE或LukS-PV与恒定饱和浓度的LukE-GFP(300nM)共同孵育30分钟。在FACS缓冲液中洗涤细胞一次，在FACS固定缓冲液中固定15分钟，在FACS缓冲液中再次洗涤，并且采用流式细胞术对结合进行评估。平均GFP荧光强度以％GFP+表示，其基于在使用300nM GFP-LukE孵育后观察到的最大荧光。对于使用CXCL8或CXCL1的竞争测定而言，将剂量响应量的各趋化因子加入人PMN中，在冰上放置30分钟，随后加入300nM GFP-LukE。在FACS缓冲液中洗涤细胞一次，在FACS固定缓冲液中固定15分钟，在FACS缓冲液中再次洗涤，并且如上文所述采用流式细胞术对结合进行评估。使用GraphPad PRISM软件(5.0f版，GraphPad PRISM Software,Inc.)对这些测定的结果作图。
金黄色葡萄球菌染色体整合菌株的产生。为了与WT LukED互补，如此前所述使用下述引物VJT605和VJT299从金黄色葡萄球菌Newman基因组DNA扩增整个lukED基因座，并且进行染色体整合(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes toSystemic Infection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth inVivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。为产生lukEDR4D整合构建体，使用引物VJT605和VJT1019从金黄色葡萄球菌Newman基因组DNA扩增lukED启动子区域。使用来自含有lukEDR4的菌株VJT34.58的纯化质粒作为模板并使用引物VJT1020和VJT1021扩增lukEDR4编码区。使用金黄色葡萄球菌Newman基因组DNA并使用引物VJT1022和VJT1299，扩增lukD以及lukE和lukD之间的基因间区。使用所得到的DNA片段以及引物VJT605和VJT299进行最终的重叠PCR反应。将lukED和lukEDR4D构建体转化进入大肠杆菌DH5α并利用氨苄西林抗性对克隆进行选择。使用BamHI和PstI限制性位点将纯化的质粒克隆进入pJC1112并转化进入DH5α。如此前所述，通过电穿孔将所得到的重组质粒引入含有质粒pRN7023的菌株RN9011，所述质粒pRN7023编码SaPI-1噬菌体整合酶以促进单个拷贝染色体整合进入SaPI-1位点，并且基于氯霉素和红霉素抗性进行选择(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection byTargeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。然后使用此前描述的方法，将SaPI-1整合构建体转导进入菌株VJT8.16,NewmanΔlukED(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection byTargeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。
为了产生含有空载体的ΔlukED菌株，如上所述将pJC1112载体电穿孔进入RN9011。使用此前描述的方法，然后使用细菌噬菌体介导的转导将整合的互补载体引入金黄色葡萄球菌菌株NewmanΔlukED(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin EDContributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and PromotingBacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。
细菌菌株和生长条件。在30℃、180RPM振荡条件下在添加了氨苄西林的LuriaBertani(LB)肉汤培养基中常规培养大肠杆菌菌株。为了从大肠杆菌中纯化蛋白，按照1:100的比例将细菌传代至添加了氨苄西林的LB中并且在37℃、200RPM振荡条件下孵育，然后使用终浓度0.1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷在16℃、220RPM条件下诱导过夜。在37℃、180RPM振荡条件下在存在或不存在所示抗生素的添加了10％酪蛋白氨基酸或胰蛋白酶大豆肉汤的RPMI中使金黄色葡萄球菌菌株常规生长。为了产生金黄色葡萄球菌Newman减毒菌株，将编码hlgACB::tet，随后是lukAB::spec，然后是hla::erm的噬菌体转导进入此前已描述的NewmanΔlukED母菌株中(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin EDContributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and PromotingBacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)。
含有lukED和lukEDR4D的金黄色葡萄球菌Newman减毒菌株的产生。因为在体外生长条件下毒素的低表达水平(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin EDContributes to Systemic Infection by Targeting Neutrophils and PromotingBacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)以及与在离体测定中使用的靶向相似细胞类型的其他白细胞毒素具有更高的体外丰度，所以对LukED及其衍生物LuEDR4D在离体条件下作用的研究变得更加复杂。为了克服这些困难，通过使用上文所述的减毒Newman菌株ΔΔΔΔ(ΔlukED,Δhlg::tet,ΔlukAB::spec,Δhla::erm)以及基于质粒的LukED及其衍生物LuEDR4D表达，实现了独立评估白细胞毒素活性的系统。使用具有BamHI和PstI限制性酶切位点的引物VJT629和VJT630从上文所述的pJC1112染色体整合菌株扩增lukED和lukEDR4D基因座。将扩增子亚克隆进入经修饰的pOS1载体，对该载体进行设计以便在如此前所述的lukA启动子的控制下表达具有6xHis标签的白细胞毒素(pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis)(Dumont等，“The Staphylococcusaureus LukAB Cytotoxin Kills Human Neutrophils by Targeting the CD11b Subunitof the Integrin Mac-1,”PNAS(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)，随后转化进入减毒金黄色葡萄球菌菌株NewmanΔΔΔΔ(ΔlukED,Δhlg::tet,ΔlukAB::spec,Δhla::erm)。
离体感染实验。将分别含有无毒素(空)、lukED或lukEDR4D的pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis载体构建体的金黄色葡萄球菌菌株传代培养4.5小时，随后在RPMI+10％FBS中归一化至1x 109CFU每ml。将细胞按照1:10稀释并将20μl加入80μl含接种于96孔板中的2x 105个PMN的培养基中。在37℃、180RPM振荡条件下感染3.5小时。在37℃、180RPM振荡条件下将2μg ml-1溶葡球菌酶加入20分钟以杀死所有细菌。在1,500RPM和4℃条件下将细胞离心5分钟，随后在FACS固定缓冲液(PBS+2％FBS+2％多聚甲醛+0.05％叠氮钠)中固定。为了通过流式细胞术对毒素介导的杀死进行分析，对来自门控活细胞的细胞耗竭进行评估。通过对存活门控中剩余的细胞与含有空pOS1-plukA修饰的空载体(无毒素)的NewmanΔΔΔΔ菌株(将其设为0％死亡)进行比较计算细胞死亡百分率。
考察LukED与CXCR1或CXCR2之间相互作用的生化测定。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)使用编码具有N-末端HA-标签的CXCR1或CXCR2(Missouri S&T cDNAResource Center)的cDNA瞬时转染HEK293T细胞。转染48小时后，使用含5mM EDTA的PBS分离细胞并使用裂解缓冲液(PBS+10mM咪唑(Fisher)+1％Brij O10(Sigma)+1mM PMSF(Thermo Scientific)+2x蛋白酶抑制剂团块(Roche))溶解膜蛋白1小时(每个条件约1x106个细胞)。使用经过平衡的Ni-NTA树脂(Qiagen)孵育具有His-标签的LukE和LukD 2小时，随后在裂解缓冲液中洗涤3次。然后将裂解物和树脂在一起孵育2小时，随后在裂解缓冲液中洗涤三次并且最后在45μl的4x SDS上样缓冲液中重悬树脂。在80V条件下在10％SDS-PAGE凝胶上电泳蛋白样品，随后在1Amp下转移至硝酸纤维素膜(GE)1小时。使用PBS+0.01％吐温-20+5％脱脂奶粉封闭膜1小时，并且在4℃下针对毒素使用在PBS+0.01％吐温-20中以1:3,000稀释的抗-His抗体(Cell Sciences)或者针对受体使用在PBS+0.01％吐温-20+5％脱脂奶粉中以1:1,000稀释的抗-HA抗体(Covance)孵育过夜。次日，将在PBS+0.01％吐温-20+5％脱脂奶粉中的山羊抗-小鼠HRP抗体二抗(Bio-Rad)加于膜上孵育1小时，随后使用Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific)孵育以检测放射自显影膜(LabScientific,Inc)。
钙流的测定。如此前所述，使用荧光钙指示剂Fluo4-AM(Invitrogen)评估人PMN上CXCR1和CXCR2的活化情况(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureusLeukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。简言之，在室温下使用3μM在Hank平衡盐溶液(HBSS)中的Fluo4-AM孵育细胞30分钟，随后在HBSS中洗涤三次并且在37℃下平衡30分钟。在流式细胞仪上分析60秒基线钙水平随时间的变化情况。在这时，将CXCL8、CXCL1或LukE(300nM)加入细胞并且额外评估平均荧光强度随时间的变化情况4分钟。以5秒间隔作图显示平均荧光强度。
小鼠体外和体内实验。为了在体外评估LukED-介导的小鼠细胞的杀伤作用，腹腔注射给予C57BL/6WT小鼠(Taconic)1x 107CFU热灭活的金黄色葡萄球菌NewmanΔlukED。注射24小时后，如此前一样再次注射1x 107CFU热灭活的金黄色葡萄球菌NewmanΔlukED。再经过24小时后，处死小鼠并使用8ml PBS通过腹腔灌洗收集免疫细胞。使用2ml ACK裂解缓冲液(Gibco)裂解红细胞，随后在RPMI+10％FBS中重悬剩余的腹腔渗出细胞。使用PBS、LukED或LukEDR4D(300nM)孵育细胞并且在冰上孵育30分钟。孵育后，使用PBS洗涤细胞3次，然后使用可固定活力染料eFluor-450染色，接下来使用CD11b、B220、F480、CD3、Ly6G、CCR5和CXCR2抗体进行细胞表面染色。随后在LSRII流式细胞仪(BD)上分析特定免疫细胞群的细胞活力。FACS图是从至少3只分别的动物中分离的细胞获得的代表性结果。对细胞死亡情况进行定量并且以eFluor-450+细胞百分率作图显示。
对于体内实验而言，使用250μl阿佛丁(将2,2,2-三溴乙醇溶于叔戊醇中并在无菌盐水中稀释至终浓度2.5％v/v)麻醉8-周龄雌性C57BL/6小鼠(Taconic)，随后后眼窝注射1x 107CFU同基因型NewmanΔlukED、ΔlukED::lukED和ΔlukED::lukEDR4D。注射96小时后，处死小鼠，收集器官并进行匀浆以评估细菌负荷(集落形成单位，CFU)。为确定在免疫细胞上感染这些菌株的影响，使用40/80Percoll(GE Healthcare)密度梯度离心纯化器官免疫细胞悬液并且随后对其进行如此前所述的处理和染色(Alonzo等，“CCR5is a Receptorfor Staphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。通过在LSRII(BD)流式细胞仪上进行流式细胞分析确定特定免疫细胞群的细胞活力。FACS图是来自每组至少9只感染动物的代表性结果。对细胞死亡情况进行定量并且以eFluor-450+细胞百分率作图显示。
对于存活实验而言，使用PBS将同基因型菌株NewmanΔlukED、ΔlukED::lukED和ΔlukED::lukEDR4D 3小时的传代产物归一化至5x 108CFU每毫升。腹腔注射250μl阿佛丁对5至6周龄雌性ND4小鼠(Harlan)进行麻醉，随后眼窝后注射100μl归一化的细菌，其最终的CFU计数为5x 107CFU。监测小鼠随时间的变化的存活情况直至出现发病迹象，如弓背姿势、皱毛、体重减轻、无力获取食物和水、出现共济失调和后肢瘫痪，在这时将小鼠立即处死并绘制随时间(小时)变化的存活曲线。
金黄色葡萄球菌蛋白分泌的胞外蛋白性质和免疫印迹分析。在37℃下、180RPM振荡5小时使金黄色葡萄球菌菌株NewmanΔΔΔΔ+pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukED、NewmanΔΔΔΔ+pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukEDR4D、NewmanΔlukED+pJC1112-、NewmanΔlukED+pJC1112-lukED、NewmanΔlukED+pJC1112-lukE DR4D和NewmanΔlukEDΔhlgACB生长至对数晚期。然后4,000RPM将细菌培养物离心15分钟，随后除去1.3ml细菌上清液并加入三氯乙酸(终浓度10％)。在4℃下过夜以沉淀蛋白。次日15,000RPM离心30分钟将沉淀的蛋白成团，使用100％乙醇洗涤，并重悬于60μl 1x上样缓冲液中。在进行SDS-PAGE前将样品涡旋混合并煮沸5分钟。对于抗-His、抗-LukE和抗-LukD免疫印迹而言，在10％SDS-PAGE凝胶上对金黄色葡萄球菌胞外蛋白进行电泳，随后以1Amp 1小时将其转移至硝酸纤维素膜。使用PBS+0.01％吐温-20+5％脱脂奶粉封闭膜1小时；使用按照如下稀释的一抗结合：抗-His(1:3,000)、抗-LukE(1:5,000)和抗-LukD(1:5,000)；使用PBST洗涤3次；使用山羊抗-小鼠(抗-His抗体)或抗-家兔(抗-LukE和抗-LukD抗体)Alexafluor-680缀合抗体二抗结合1小时；随后在Odyssey成像仪(LI-COR)上成像。对于过表达LukED或LukEDR4D(NewmanΔΔΔΔ+pOS1-plukA-lukAs.s.-6xHis-lukED、NewmanΔΔΔΔ+pOS1-plukAlukAs.s.-6xHis-lukEDR4D)的菌株而言，考马斯亮蓝染色凝胶显示LukE抗体对LukEDR4突变具有降低的亲和性。对于产生内源性水平的LukED和LukEDR4D(NewmanΔlukED+pJC1112-、NewmanΔlukED+pJC1112-lukED、NewmanΔlukED+pJC1112-lukEDR4D)的菌株而言，其包括ΔlukEDΔhlgACB双突变，因为抗-LukE抗体与HlgC3交叉反应。所有图像均为至少3次独立实验的代表性结果。如此前所述产生α-LukE和α-LukD抗体。
LukE/LukS-PV结构多样性的结构模型。使用ClustalW对LukE和LukS-PV的氨基酸序列进行比对并且根据使用ESPript的序列变化程度使用Risler矩阵进行评分。使用颜色渐变(红、橙、黄、绿、浅蓝、深蓝)显示在LukE结构表面上的评分，其中严格保守的残基以红色表示而变化最大的残基以深蓝表示。保守性取代以中间色表示。所有结构图使用PyMOL绘制。
实施例1-LukED靶向CXCR1和CXCR2以杀灭单核细胞和PMN
金黄色葡萄球菌是一种在世界范围内具有较高发病率和致死率的革兰氏阳性细菌(DeLeo&Chambers,“Reemergence of Antibiotic-Resistant Staphylococcus aureusin the Genomics Era,”J.Clin.Invest.119:2464-2474(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)。这种生物体的致病机制取决于其产生的大量毒力因子，这些毒力因子被认为能够帮助免疫逃避和随后的疾病发生(Vandenesch等，“Staphylococcus aureus Hemolysins,Bi-Component Leukocidins,and Cytolytic Peptides:A Redundant Arsenal ofMembrane-Damaging Virulence Factors？”Front.Cell.Infect.Microbiol.2:12(2012)；Nizet,V.,“Understanding How Leading Bacterial Pathogens Subvert InnateImmunity to Reveal Novel Therapeutic Targets,”J.Allergy Clin.Immunol.120:13-22(2007)，其全部内容通过引用并入本申请)。与人感染相关的菌株能够产生多达五种不同的双组分白细胞毒素(LukSF-PV/PVL、HlgAB、HlgCB、LukED和LukAB/HG)(Alonzo&Torres,“Bacterial Survival Amidst an Immune Onslaught:The Contribution of theStaphylococcus aureus Leukotoxins,”PLoS Pathog 9:e1003143(2013)；Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection byTargeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcusaureus Leukotoxin ED,”Nature493:51-55(2013)；Vandenesch等，“Staphylococcusaureus Hemolysins,Bi-Component Leukocidins,and Cytolytic Peptides:A RedundantArsenal of Membrane-Damaging Virulence Factors？”Front.Cell.Infect.Microbiol.2:12(2012)；Panton&Valentine,“StaphylococcalToxin,”The Lancet 506-508(1932)；Loffler等，“Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin is a Very Potent Cytotoxic Factor for HumanNeutrophils,”PLoS Pathog.6:e1000715(2010)；Labandeira-Rey等，“Staphylococcusaureus Panton-Valentine Leukocidin Causes Necrotizing Pneumonia,”Science 315:1130-1133(2007)；Yamashita等，“Crystal Structure of the Octameric Pore ofStaphylococcal Gamma-Hemolysin Reveals the Beta-Barrel Pore FormationMechanism by Two Components,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.108:17314-17319(2011)；Dalla Serra等，“Staphylococcus aureus Bicomponent Gamma-Hemolysins,HlgA,HlgB,and HlgC,Can Form Mixed Pores Containing All Components,”J.Chem.Inf.Model.45:1539-1545(2005)；Morinaga等，“Purification,Cloning and Characterization ofVariant LukE-LukD With Strong Leukocidal Activity of Staphylococcal Bi-Component Leukotoxin Family,”Microbiol.Immunol.47:81-90(2003)；Gravet等，“Characterization of a Novel Structural Member,LukE-LukD,of the Bi-ComponentStaphylococcal Leucotoxins Family,”FEBS Lett.436:202-208(1998)；DuMont等，“Characterization of a New Cytotoxin That Contributes to Staphylococcusaureus Pathogenesis,”Mol.Microbiol.79:814-825(2011)；Dumont等，“Staphylococcusaureus Elaborates Leukocidin AB to Mediate Escape From Within HumanNeutrophils,”Infect.Immun.81:1830-1841(2013)；Ventura等，“Identification of aNovel Staphylococcus aureus Two-Component Leukotoxin Using Cell SurfaceProteomics,”PLoS One 5:e11634(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)。这些毒素强效地靶向并杀灭人中性粒细胞(多形核细胞；PMN)，而中性粒细胞是对防御细菌感染重要的先天免疫细胞(Loffler等，“Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin isa Very Potent Cytotoxic Factor for Human Neutrophils,”PLoS Pathog.6:e1000715(2010)，其全部内容通过引用并入本申请)。多年来这些毒素被认为是多余的，但是最近对细胞因素的鉴定已证明了其促进独特的细胞趋向性(Alonzo等，“CCR5is a Receptor forStaphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)；Spaan等，“TheStaphylococcal Toxin Panton-Valentine Leukocidin Targets Human C5aReceptors,”Cell Host&Microbe 13:584-594(2013)；Dumont等，“The Staphylococcusaureus LukAB Cytotoxin Kills Human Neutrophils by Targeting the CD11b Subunitof the Integrin Mac-1,”PNAS(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。然而，在对LukED对原代人外周血单核细胞(PBMC)的作用进行研究时，观察到在从Δ32Ccr5个体分离的PBMC中的单核细胞以由LukED介导、不依赖于CCR5的方式被靶向(图1A)，在所述细胞表面上天然地缺乏CCR5(Oswald-Richter等，“Identification of a CCR5-Expressing T CellSubset That is Resistant to R5-Tropic HIV Infection,”PLoS Pathog.3:e58(2007)，其全部内容通过引用并入本申请)。类似地，来自从Ccr5+/+个体分离的PMBC的单核细胞即使在存在马拉韦罗的条件下也对LukED敏感，马拉韦罗是已知阻断LukED介导的CCR5+细胞杀伤作用的CCR5拮抗剂(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureusLeukotoxin ED,”Nature493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)(图2)。而且，来自Ccr5+/+和Δ32Ccr5供体的PMN对LukED的敏感性相同(图1B)，表明LukED以不依赖于CCR-5的方式靶向人单核细胞和PMN。
为了评估LukED在金黄色葡萄球菌体内毒力中不依赖于CCR5的作用，使用同基因型金黄色葡萄球菌野生型(WT)和ΔlukED菌株全身感染Ccr5+/+和Ccr5-/-小鼠，并且在感染96小时后对感染肝脏中的细菌负荷进行评估。与感染WT或互补菌株(ΔlukED::lukED)的那些相比，感染ΔlukED的Ccr5+/+小鼠CFU降低2-log(图1C)。与此前的研究一致，与感染WT金黄色葡萄球菌的Ccr5+/+小鼠相比，在感染WT金黄色葡萄球菌的Ccr5-/-小鼠中细菌负荷降低1-log(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。而相反的是，与感染WT金黄色葡萄球菌的Ccr5+/+小鼠相比，感染ΔlukED菌株的Ccr5-/-小鼠的细菌负荷降低3-log，这表明LukED对金黄色葡萄球菌的致病作用具有较强的不依赖于CCR5的作用(图1C)。综合这些数据表明在PMN和单核细胞表面上存在替代的LukED细胞受体，对其的靶向有助于建立全身性金黄色葡萄球菌感染。
为鉴定这些靶点，在人胚肾293T细胞(HEK293T)上异位表达巨噬细胞表面上存在的趋化因子受体，随后加入LukED。使用这种方法，确定了趋化因子受体CXCR1、CXCR2和DARC足以使得HEK293T细胞对LukED敏感，而不对同源性的LukSF-PV敏感(图1D、图3和图5A)，其不靶向CXCR2(Spaan等，“The Staphylococcal Toxin Panton-Valentine LeukocidinTargets Human C5a Receptors,”Cell Host&Microbe 13:584-594(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。
CXCR1和CXCR2也分别称为白介素8受体的α和β链(Stillie等，“The FunctionalSignificance Behind Expressing Two IL-8Receptor Types on PMN,”J.Leukoc.Biol.86:529-43(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)。这些趋化因子受体相互作用以便在PMN表面上形成异源二聚体和同源二聚体复合物以促进CXCL8(也称为IL8)的高亲和性结合，其促进免疫细胞向感染部位的募集(Stillie等，“The FunctionalSignificance Behind Expressing Two IL-8Receptor Types on PMN,”J.Leukoc.Biol.86:529-43(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)。CXCR1和CXCR2是显示出77％氨基酸一致性的同源性蛋白，其在髓系中表达，主要是在PMN和单核细胞中(Stillie等，“The Functional Significance Behind Expressing Two IL-8ReceptorTypes on PMN,”J.Leukoc.Biol.86:529-43(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)以及在天然杀伤细胞、CD8+T细胞亚群以及上皮和内皮细胞中。而相反的是，达菲抗原趋化因子受体(DARC)，也称为Fy糖蛋白(FY)或CD234，主要存在于红细胞(RBC)和内皮细胞表面上。DARC是CC和CXC趋化因子“下沉”，其被认为从血液中除去过量的趋化因子。DARC也是人疟疾寄生虫间日疟原虫和诺氏疟原虫的受体。总的来说，LukED与CXCR1/CXCR2和DARC结合的发现为LukED是如何分别靶向PMN和RBC提供了解释。
与其对LukED的易感性一致，大部分PMN和外周血单核细胞对CXCR1和/或CXCR2两者是阳性的(图1E和1F)。而且，在人单核细胞系THP-1中用基于慢病毒的CXCR2敲低Cxcr2shRNA显示了与非靶向性shRNA对照相比(图1G)仅CXCR2使细胞具有抵抗LukED杀伤的能力(Liu-Bryan等，“The CXCR1Tail Mediates Beta1Integrin-Dependent CellMigration Via MAP Kinase Signaling,”Biochem.Biophys.Res.Commun.332:117-125(2005)，其全部内容通过引用并入本申请)(图5B-5C)。这些数据表明CXCR1或CXCR2对于LukED介导的宿主细胞杀伤是必要的和足够的。
实施例2-CXCR1、CXCR2和DARC也使细胞对HlgA易感
金黄色葡萄球菌白细胞毒素的一个共同特征是其均能够靶向和杀灭PMN(Vandenesch等，“Staphylococcus aureus Hemolysins,Bi-Component Leukocidins,andCytolytic Peptides:A Redundant Arsenal of Membrane-Damaging VirulenceFactors？”Front.Cell.Infect.Microbiol.2:12(2012)和Alonzo&Torres,“BacterialSurvival Amidst an Immune Onslaught:The Contribution of the Staphylococcusaureus Leukotoxins.PLoS Pathog.9:e1003143(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。本申请所述的发现表明LukED通过靶向CXCR1/CXCR2杀灭PMN。由于LukED与LukSF-PV、HlgAB和HlgCB显示出显著的氨基酸一致性(超过70％)，因而还对这些受体是否使得宿主细胞对这些白细胞毒素易感进行了评估。CXCR1、CXCR2和DARC而非CCR5使得细胞对HlgAB而非HlgCB或LukSF-PV易感(图4A-4B)。HlgAB而非HlgCB靶向这些受体的观察结果表明HlgA是负责这种毒素趋向性的亚基。DARC支持HlgAB细胞毒性的发现也与这种毒素显示出溶血活性的观察结果一致。
实施例3-LukED通过LukE与CXCR1和CXCR2结合靶向PMN
由于其在防御金黄色葡萄球菌中的主要作用(Rigby&DeLeo,“Neutrophils inInnate Host Defense Against Staphylococcus aureus Infections,”Semin.Immunopathol.34:237-259(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)，本申请所述的其余研究集中在LukED介导的对原代PMN上的CXCR1/CXCR2的靶向作用上。采用结合测定，其中PMN与绿色荧光蛋白融合的LukE或LukD(GFP-LukE或GFP-LukD)孵育(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。仅GFP-LukE与PMN以剂量依赖性的和可饱和的方式结合，而GFP-LukD显示出非可饱和的表面结合(图6A)。GFP-LukE的结合与LukE而非等效亚基PVL、LukS-PV竞争(图6B)，表明其与CXCR1/CXCR2具有特异性的相互作用。
CXCR1/CXCR2主要对趋化因子配体CXCL8产生应答，CXCL8由宿主在相应损伤和感染时产生(Nasser等，“Differential Activation and Regulation of CXCR1and CXCR2byCXCL8Monomer and Dimer,”J.Immunol.183:3425-3432(2009)；Stillie等，“TheFunctional Significance Behind Expressing Two IL-8Receptor Types on PMN,”J.Leukoc.Biol.86:529-543(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)。除了CXCL8以外，CXCR2也对趋化因子CXCL1产生应答(Nasser等，“Differential Activation andRegulation of CXCR1and CXCR2by CXCL8Monomer and Dimer,”J.Immunol.183:3425-3432(2009)；Allen等，“Chemokine:Receptor Structure,Interactions,andAntagonism,”Annu.Rev.Immunol.25:787-820(2007)，其全部内容通过引用并入本申请)。为了检测是否这些趋化因子能够抑制LukED介导的细胞毒性，在存在CXCL8或CXCL1的条件下使用LukED处理PMN。CXCL8而非CXCL1阻止了LukED介导的PMN死亡(图6C)，表明保护PMN不受LukED介导的杀伤需要这两种受体的阻断。CXCL8通过阻止LukE与细胞表面结合(这是产生细胞毒性的先决条件)保护PMN不受LukED的杀伤(图6D)。尽管LukE和CXCL8均靶向CXCR1/CXCR2，但是其似乎具有不同的受体容量，因为在与PMN孵育时LukE不能激发钙流(图7)。与LukED PMN结合研究一致，pulldown实验显示LukE而非LukD与CXCR1和CXCR2两者形成复合物(图6E)。
实施例4-在差异区域4的LukE氨基酸残基182-196是LukED靶向CXCR1和CXCR2+细胞所需的
LukE与具有高度同源性的白细胞毒素LukS-PV具有71％的氨基酸一致性，但是LukS-PV不使用CXCR1/CXCR2受体靶向和杀死PMN(Spaan等，“The Staphylococcal ToxinPanton-Valentine Leukocidin Targets Human C5a Receptors,”Cell Host&Microbe13:584-594(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)(图1D)。对LukE和LukS-PV的氨基酸序列比对显示了含有显著序列差异的五个区域(差异区域1-5；DR1-5)(图8)。这些DR主要位于LukE和LukS-PV结构的rim结构域(图9A-9B)，已假设其在受体识别中具有重要作用(Menestrina等，“Ion Channels and Bacterial Infection:The Case of Beta-BarrelPore-Forming Protein Toxins of Staphylococcus aureus,”FEBS Lett.552:54-60(2003)，其全部内容通过引用并入本申请)。产生杂交的LukE/S-PV毒素以检测是否是这五种DR中的任意一种赋予了LukE对人PMN的特异性。将LukE/S-PV杂交蛋白纯化，以等摩尔的比例与LukD混合，并且与PMN孵育以评估其细胞毒性活性。与WT LukED相比，仅LukEDR4D和LukEDR5D毒素对PMN的细胞毒性减弱(图9C)。
为了评估LukEDR4和LukEDR5杂交物显示出的缺乏细胞毒性是否是特异性针对CXCR1/CXCR2表达细胞的，还检测了其针对CCR5+细胞的活性。LukEDR5D的杀伤CCR5+细胞的能力也受损，表明DR5是毒素活性而非受体靶向所需的(图9C、9D)。值得注意的是，LukEDR4D能够同WT LukED类似的效能靶向CCR5+细胞，这表明仅DR4参与CXCR1和CXCR2的识别(图9D)。对PBMC进一步的分析表明LukED对大部分NK细胞和CD8+T细胞亚群也具有细胞毒性，其专门地通过CXCR1的表达(图10)。此外，尽管其表达CCR5，但是LukEDR4D突变体在杀灭单核细胞方面的效能降低(图10)，表明CXCR1/CXCR2可能是LukED介导的这些髓系细胞靶向性优选的受体。
与野生型LukE不同，LukEDR4不能与GFP-LukE竞争性地同PMN的质膜结合，这验证了该结构域是CXCR1/CXCR2+细胞识别所需的(图9E)。LukE DR4的15个氨基酸的序列(残基182-196)形成了含有两个甘氨酸残基(G186和G189)和两个脯氨酸残基(P184和P187)的环，其表现出不同于LukSPV的极性表面，其能够决定LukE对CXCR1/CXCR2的趋向性。
还研究了在离体感染过程中经由LukED对CXCR1和CXCR2的靶向作用对金黄色葡萄球菌介导的PMN杀灭作用的贡献。由于金黄色葡萄球菌产生一系列能够杀灭PMN的毒素，因而工程化产生了缺乏所有主要毒素的金黄色葡萄球菌菌株，其中由质粒反式表达lukED或lukEDR4D(图11A)。与预期一致，减毒金黄色葡萄球菌菌株不能杀灭PMN，而与lukED反式互补的减毒菌株能够杀死这些细胞(图9G)。产生LukED的金黄色葡萄球菌的细胞毒性活性被CXCL8抑制和与产生WT LukED的菌株相比产生LukEDR4D的菌株显示出显著降低的PMN杀灭作用(图9G)。重要的是，产生LukEDR4D的菌株显示出的细胞杀灭作用的缺乏是特异性针对CXCR1/CXCR2+细胞的，因为CCR5+细胞对产生LukED和LukEDR4D的菌株具有相同的易感性(图9H)。
实施例5-在小鼠全身感染模型中LukED介导的CXCR1和CXCR2+细胞的杀灭作用对金黄色葡萄球菌致病作用的贡献
为评估是否LukED也是以依赖于CXCR1/CXCR2的方式杀灭小鼠白细胞，使用LukED或LukEDR4D处理小鼠腹腔渗出细胞(PEC)。LukED杀死～79％的PMN，而LukEDR4D显著受损并且仅杀死～8％的这些细胞。与对PMN的作用不同，来自PEC群的CCR5+巨噬细胞对LukED和LukEDR4D具有相同的易感性(图12A和13A)，这与LukED严格地以依赖于CCR5的方式杀死这些细胞的发现一致(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureusLeukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。此外，评估了来自同基因型金黄色葡萄球菌ΔlukED、ΔlukED::lukED或ΔlukED::lukEDR4D菌株感染组织的PMN的活力(图11B)。与经ΔlukED::lukED感染的小鼠相比，与经ΔlukED感染的小鼠类似，来自经金黄色葡萄球菌ΔlukED::lukEDR4D感染小鼠的PMN受到大量的保护避免了毒素介导的死亡。值得注意的，来自经ΔlukED::lukEDR4D感染小鼠的PMN与来自经ΔlukED感染小鼠的PMN一样健康(图12B和13B)，表明DR4结构域与CXCR1/CXCR2的相互作用是PMN的体内靶向所需的。
LukED在出现金黄色葡萄球菌血液感染小鼠中观察到的死亡中起了作用(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection byTargeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcusaureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。为了评估LukED介导的CXCR1/CXCR2靶向在这种表型发生中的作用，对经同基因型金黄色葡萄球菌ΔlukED、ΔlukED::lukED或ΔlukED::lukEDR4D菌株全身感染的动物存活情况进行监测(图11B)。与预期一致，感染ΔlukED菌株的小鼠从感染中存活，而感染ΔlukED::lukED互补菌株的小鼠死于感染(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureusLeukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。而相反的是，与ΔlukED::lukED互补菌株相比，感染ΔlukED::lukEDR4D的小鼠明显的受到了保护(图12C)。这些发现表明LukED介导的CXCR1或CXCR2靶向在体内促进了金黄色葡萄球菌的致病作用。
鉴定了CXCR1和CXCR2作为LukED细胞受体，这为这种毒素能够杀死缺乏CCR5的白细胞提供了解释(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureusLeukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。因为PMN是感染的第一个应答者并且PMN功能缺陷会导致其对金黄色葡萄球菌感染具有超乎寻常的易感性(Rigby&DeLeo,“Neutrophils in Innate Host Defense Against StaphylococcusaureusInfections,”Semin.Immunopathol.34:237-259(2012)，其全部内容通过引用并入本申请)，因而像金黄色葡萄球菌一样的病原物将发挥毒力因子(如LukED)以杀死这些细胞是合乎逻辑的。然而，PMN持续的功能还依赖于其连续募集和通过在感染部位分泌的炎性介质增强效能或寿命。事实上，对中性粒细胞或T细胞，特别是分泌IL-17或IFΝγ的效应亚群定性和定量的破坏会极大地增加对金黄色葡萄球菌感染的易感性(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to Systemic Infection byTargeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth in Vivo,”Mol.Microbiol.83:423-435(2012)；Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcusaureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)；Cho等，“IL-17is Essential forHost Defense Against Cutaneous Staphylococcus aureus Infection in Mice,”J.Clin.Invest.120:1762-1773(2010)；Lin等，“Th1-Th17Cells Mediate ProtectiveAdaptive Immunity Against Staphylococcus aureus and Candida AlbicansInfection in Mice,”PLoS Pathog.5:e1000703(2009)，其全部内容通过引用并入本申请)。因此，LukED通过其识别不同的宿主趋化因子受体独特地靶向免疫防御的双臂。通过使用CXCR1/CXCR2，LukED在很大程度上靶向先天防御、中性粒细胞、单核细胞和NK细胞。然而通过靶向CCR5+细胞，LukED消除了T细胞亚群(Th1和Th17细胞)和专门的抗原提呈细胞(Alonzo等，“CCR5is a Receptor for Staphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)，这些均在抗-Staph免疫中是关键的。由于宿主免疫应答的时间性质和在感染解决中涉及不同的细胞类型，因而阻断LukED对CXCR1/CXCR2或CCR5的靶向作用(Alonzo等，“CCR5is a Receptor forStaphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature 493:51-55(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)导致体内存活能力增强。因而，本申请所述的发现表明阻断LukED的策略将是对抗威胁人类生命的金黄色葡萄球菌感染的有效治疗或预防方法。
实施例6-在差异区域4中的HlgA氨基酸残基180-192是HlgAB靶向人中性粒细胞(hPMN)，CXCR1/CXCR2+细胞所需的
LukE和HlgA具有70％以上的氨基酸一致性并且其均靶向CXCR1和CXCR2受体以杀死hPMN。为了评估是否在HlgA中对应于LukE DR4结构域(即HlgA氨基酸180-192)的氨基酸也参与靶向CXCR1/CXCR2，工程化产生了若干杂交的HlgA蛋白。使用LukE(HlgALukE-DR4)或LukS-PV(HlgALukS-DR4)DR4替换HlgA DR4结构域。将HlgALukE-DR4和HlgALukS-DR4杂交蛋白纯化，以等摩尔的比例与HlgB混合，并且与hPMN孵育以评估其细胞毒性活性。在差异区域4中的HlgA氨基酸残基180-192是HlgAB靶向人中性粒细胞(hPMN)、CXCR1/CXCR2+细胞所需的(图14)。HlgA/HlgB和HlgALukE-DR4/HlgB的组合显示出针对hPMN高效的细胞毒性活性，而HlgALukS-DR4/HlgB的组合则没有。这些数据表明与LukED一样HlgA的DR4结构域参与靶向CXCR1和CXCR2。
实施例7-在DR4结构域中的LukE的氨基酸P184、G186、P187和G189是靶向和杀死hPMN以及LukED介导的血液中毒的致死性所需的
据证实LukE与CXCR1/CXCR2+细胞通过DR4结构域结合并且将该结构域转变为LukS-PV DR4使得LukED针对包括人中性粒细胞的CXCR1/CXCR2+细胞失活(图9A-9H)。还发现在HlgA中的DR4结构域是HlgAB靶向和杀死人中心粒细胞所需的(图14)。LukE DR4形成含有两个甘氨酸残基(G186和G189)和两个脯氨酸残基(P184和P187)的环，其具有足以与LukS-PV的DR4相区分的极性表面，其可能决定了LukE对CXCR1和CXCR2的趋向性。有趣的是，在HlgA中这四个氨基酸中的三个也是保守的。为了直接评估在LukED介导的hPMN杀伤中P184、G186、P187和G189的参与情况，将全部四个氨基酸突变成丙氨酸结果得到LukEP184AG186A,P187A,G189A蛋白(LukEP184,G186,P187)。将WT LukE和LukEP184,G186,P187,G189蛋白纯化，以等摩尔的比例与LukD混合，并且与人hPMN孵育以评估其细胞毒性活性。尽管WT LukED毒素靶向和杀死hPMN，但是未观察到LukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素的可检测的活性(图15A)。该数据表明P184、G186、P187和G189氨基酸形成的极性表面对LukED介导的CXCR1/CXCR2+细胞杀灭具有重要作用。据预测与LukE P184、G186和P187对应的HlgA残基在HlgA与CXCR1/CXCR2结合中具有相似作用。
LukED是与在静脉内感染金黄色葡萄球菌的小鼠中观察到的死亡相关的白细胞毒素(Alonzo等，“Staphylococcus aureus Leucocidin ED Contributes to SystemicInfection by Targeting Neutrophils and Promoting Bacterial Growth In Vivo,”Mol.Microbiol.83(2):423-35(2012)；Alonzo等，“CCR5Is a Receptor forStaphylococcus aureus Leukotoxin ED,”Nature493(7430):51-5(2013)；Reyes-Robles等，“Staphylococcus aureus Leukotoxin ED Targets the Chemokine ReceptorsCXCR1and CXCR2to Kill Leukocytes and Promote Infection,”Cell Host Microbe.14(4):453-9(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)。为了进一步研究这种毒素在体内的直接作用，静脉内注射给予小鼠纯化的LukED。可以观察到，每次给予20g的小鼠浓度高于10μg的WT毒素结果导致“中毒”动物的迅速死亡(图15B)。为了考察CXCR1/CXCR2的靶向作用对这种LukED介导的致死性的贡献，还检测了LukELukS-DR4/LukD和LukEP184,G186,P187,G189/LukD毒素的体内作用。与LukED经由CXCR1/CXCR2的靶向作用对金黄色葡萄球菌血液感染所观察到的致死性的重要作用一致，(Reyes-Robles等，“Staphylococcus aureus Leukotoxin EDTargets the Chemokine Receptors CXCR1and CXCR2 to Kill Leukocytes and PromoteInfection,”Cell Host Microbe.14(4):453-9(2013)，其全部内容通过引用并入本申请)，影响LukED靶向CXCR1/CXCR2+细胞的突变消除了所述毒素的致死作用(图15B)。
实施例8-LukED介导的人红细胞裂解依赖于DARC并且能够被纯化的DARC和抗-DARC抗体阻断
使用表达DARC的质粒转染HEK293T细胞足以使这些细胞对LukED和HlgAB易感(图3和4A)。检测LukED对人红细胞(RBC)的溶血活性时，观察到一些供体对LukED的溶血作用易感，而其他不易感(图16A和16B)。通过荧光活化细胞分选(FACS)评估RBC表面上DARC的水平显示了对LukED的抗性与这些RBC表面上无可检测的DARC相关，这表明DARC是LukED介导的RBC裂解所需的。
已假设RBC的裂解是金黄色葡萄球菌的致病作用所需的，因为其释放的血红蛋白是铁的丰富来源，铁是金黄色葡萄球菌生长的关键金属。因而，阻断金黄色葡萄球菌裂解RBC的能力将抑制血红蛋白的释放以逐渐减少细菌的生长。将DARC鉴定为作为LukED和HlgAB介导的溶血所需的细胞因素表明阻断毒素与受体之间的相互作用可能能够保护RBC免受这些毒素作用。为了检验这一假设，在与人RBC孵育以前使用缓冲液或增加浓度的纯化DARC(OriGene Technologies Inc.)孵育LukED。发现DARC能够完全中和LukED介导的RBC裂解(图16C)。而且，使用抗人DARC单克隆抗体(克隆#358307；R&D SystemsTM)处理人RBC也能够保护人RBC不受LukED介导的裂解(图16D)。总之，这些发现表明能够保护人RBC不受LukED作用，并且最可能是通过纯化的DRAC或直接针对这种受体的抗体保护人RBC不受HlgAB介导的裂解。
尽管出于说明的目的已对本发明进行了详细描述，应理解这样的细节仅用于该目的，并且本领域技术人员在不脱离由权利要求所定义的本发明的主旨和范围的前提下可以对本发明做出改变。
序列表
<110> 纽约大学
V·J·托雷斯
F·阿朗佐三世
T·雷耶斯-罗布莱斯
<120> 参与金黄色葡萄球菌杀白细胞素的细胞毒性的细胞因素：新型治疗靶点
<130> 29527.1501 (TOR01-05PCT)
<150> 61836516
<151> 2013-06-18
<160> 56
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> CXCL8(3-74)K11R/G31P
<400> 1
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<211> 72
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> CXCL8(3-74)K11R/G31P/P32G
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<211> 72
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> CXCL8(3-74)K11R/T12S/H13F/G31P
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<213> 金黄色葡萄球菌
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<210> 13
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HlgALukS-DR4
<400> 13
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<213> 人工的
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<223> HlgA20-258 LukS-DR
<400> 14
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Lys Ile Lys Ser Ile Thr Pro Lys
275 280
<210> 16
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> HlgB
<400> 16
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Thr Leu Tyr Lys Thr Thr Ala Thr Ala Asp Ser Asp Lys Phe Lys Ile
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100 105 110
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260 265 270
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ccccctgcag gataggtgag atgcatacac aac 33
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ccccggatcc ttatactcca ggattagttt ctttag 36
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atatgc 66
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cctcc 65
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<400> 56
agcaaaatat tctcttgctg aacctgttgg accatttgga ctttgtgcaa ataagtattg 60
atcatatgc 69

Claims (8)

1.一种组合物，所述组合物包含：
分离的杀白细胞素E(LukE)蛋白或其多肽，所述LukE蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、具有非功能性CXCR1/CXCR2结合结构域，其中在SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失；和
药学上可接受的运载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述分离的LukE多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸残基20-263，其中在SEQ ID NO:4的氨基酸残基182-196的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中选自下组的SEQ ID NO:4的一个或多个氨基酸残基被取代或缺失：P184、G186、P187和G189。
4.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述分离的LukE多肽的长度在50至100个氨基酸之间。
5.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述分离的LukE多肽的长度在100至200个氨基酸之间。
6.根据权利要求1至3任一项所述的组合物，其中所述分离的LukE多肽的长度在200至250个氨基酸之间。
7.根据权利要求2所述的组合物，其中所述分离的LukE蛋白包含SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或所述分离的LukE多肽包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的组合物，其还包含分离的杀白细胞素D(LukD)蛋白或其多肽。
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