CN110357981B - 一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体及其制备方法，最终制成的桦褐孔菌多糖铁络合物载体，能够很好的负载桦褐孔菌多糖，同时能够结合细胞表面的内化受体，触动细胞启动内吞功能实现多糖的跨膜转运，使得桦褐孔菌多糖更好的进入细胞内，实现其治疗和预防疾病的功能。
Description
技术领域
本发明属于多糖应用技术领域，具体涉及一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体及其制备方法。
背景技术
桦褐孔菌属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，非褐菌目，锈革孔菌科，褐卧孔菌属，目前桦褐孔菌的化学组成主要有羊毛脂烷型甾体类化合物、多糖类、多酚类、木质素类、黑色素、生物碱类、单宁化合物、叶酸衍生物以及芳香的香草酸和丁香酸等，桦褐孔菌是俄罗斯、波兰、日本等国的民间常用药物。目前，有关研究人员已对桦褐孔菌中的各类活性成分展开各项研究，希望将其逐渐的应用于恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肝病及艾滋病等预防和治疗中。
桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌中重要的一种天然活性物质，具有多种生理功能且对人体无毒无害，因此近年来受到极大关注。桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖具有显著的降血糖作用，并且几乎无副作用，是一种预防糖尿病和心血管疾病、增强免疫力的天然药物。目前，桦褐孔菌多糖的应用一般是通过提取后以添加剂的形式加入到药物中，制成药剂用于疾病的预防和治疗中，由于其添加的含量小以及其不具有靶向性，此时多糖物质在细胞内所起到的功效会被大大降低。
近年来，随着生物技术的不断发展，各种新型的药物载体层出不穷，其制备工艺逐步完善，作用机制进一步阐明、剂型逐步改善、毒性和免疫原性大幅降低，特别是大量实验数据证明大多数的药物载体可以提高药物治疗指数、降低药物毒性、减小剂量等优点。但是，目前，聚合物载体存在与生物体亲合性差、排斥反应大，并且不易被生物体内的酶降解，降解后的产物对生物体的毒副作用也较大的问题，同时载体的存在也会给机体增加额外的代谢负担。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体及其制备方法，最终制成的桦褐孔菌多糖铁络合物载体，能够很好的负载桦褐孔菌多糖，同时能够结合细胞表面的内化受体，触动细胞启动内吞功能实现多糖的跨膜转运，使得桦褐孔菌多糖更好的进入细胞内，实现其治疗和预防疾病的功能。
本发明的技术方案如下：
一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，由作为载体骨架的桦褐孔菌多糖铁络合物和触发细胞内吞作用的配体分子共价偶联得到的。
进一步的，所述多糖载体可作为载体药物应用于肿瘤、免疫调节、病毒感染疾病的治疗。
一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、利用醇沉的方法提取桦褐孔菌粗多糖；
S2、用蒸馏水将提取的粗多糖配成水溶液，经滤膜过滤后，溶液过磷酸盐缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用磷酸盐缓冲液和氯化钾溶液洗脱，合并多次的洗脱液，用超纯水透析后减压浓缩，冷冻干燥得纯化多糖；
S3、分别称取经过步骤（2）处理的纯化多糖和柠檬酸三钠，使它们混溶于去离子水中，搅拌均匀后逐滴加入三氯化铁溶液，同时滴加氢氧化钠溶液使混合溶液的pH保持在9~11；
S4、滴加氢氧化钠的混合溶液在30~40℃条件下反应6~8h后，取上清液加入70%的无水乙醇混合10~20min，弃去上清液，用去离子水将沉淀物溶解后透析，透析液浓缩后冷冻干燥，即得到桦褐孔菌多糖铁络合物；
S5、利用具有触发细胞内吞作用的配体分子修饰经过步骤（4）制得的桦褐孔菌多糖铁络合物以产生衍生物，以使衍生物保留了对细胞受体的亲和力。
进一步的，所述步骤（2）中氯化钾溶液的浓度为0.1~1.5mol/L，洗脱速率为40~50mL/h。
进一步的，所述步骤3中纯化多糖与柠檬酸三钠的质量比为2：1，三氯化铁溶液的浓度为2mol/L，滴加1~2mL，氢氧化钠浓度为20%。
进一步的，所述触发细胞内吞作用的配体分子为叶酸或叶酸类似物。
进一步的，所述叶酸类似物包括5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸。
进一步的，所述步骤（5）中触发细胞内吞作用的配体分子修饰桦褐孔菌多糖铁络合物的具体步骤如下：
A1、将桦褐孔菌多糖铁络合物在还原剂的作用下进行碱水解后，经过透析和冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物；
A2、将桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与触发细胞内吞作用的配体分子发生共价偶联反应，反应完全后经纯化得到最终载体。
进一步的，所述步骤A1中反应溶液的pH大于8；所述还原剂为硼氢化钠。
进一步的，所述步骤A1的反应均在36~37℃条件；所述桦褐孔菌多糖铁络合物碱水解采用氢氧化钠溶液，其中，桦褐孔菌多糖铁络合物溶液与氢氧化钠溶液的体积比为1~1.2:10。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明制得的载体中桦褐孔菌多糖铁络合物作为骨架，桦褐孔菌多糖铁络合物在进入细胞后能够与负载的多糖一同被生物体内的酶降解克服了载体的存在给机体增加的额外的代谢负担。
2、本发明制得的多糖铁络合物载体本身具有羟基、羧基、氨基等基团，一方面能够通过基团中含有的孤对电子，与多糖中的孤对电子发生配位反应，最终对多糖实现负载，另一方面能够共价偶联触发细胞内吞作用的配体分子，使得载体具有较好的穿膜功能，能够携带多糖进入细胞内。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。
一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，由作为载体骨架的桦褐孔菌多糖铁络合物和触发细胞内吞作用的配体分子共价偶联得到的。
实施例1
一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、利用醇沉的方法提取桦褐孔菌粗多糖；桦褐孔菌干燥粉碎后，过60目筛，得到桦褐孔菌粉末，在桦褐孔菌粉末中加入去离子水，在恒温水浴锅中加热回流2次，每次3h，离心后合并多次滤液，用旋转蒸发仪浓缩，加浓缩液4倍量的体积分数为95%的乙醇溶液进行醇沉，静置过夜，离心后冷冻干燥得粗多糖；
S2、用蒸馏水将提取的粗多糖配成水溶液，经滤膜过滤后，溶液过磷酸盐缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用磷酸盐缓冲液和浓度为0.1mol/L的氯化钾溶液洗脱，洗脱速率为40mL/h，合并多次的洗脱液，用超纯水透析后减压浓缩，冷冻干燥等纯化多糖；
S3、分别称取经过步骤（2）处理的纯化多糖和柠檬酸三钠，其中纯化多糖与柠檬酸三钠的质量比为2:1，使其混溶于去离子水中，搅拌均匀后逐滴加入1mL的浓度为2mol/L的三氯化铁溶液，同时滴加20%的氢氧化钠溶液使混合溶液的pH保持在11；
S4、滴加氢氧化钠的混合溶液在30℃条件下反应6h后，取上清液加入70%的无水乙醇混合10min，弃去上清液，用去离子水将沉淀物溶解后透析，透透析液浓缩后冷冻干燥，即得到桦褐孔菌多糖铁络合物；
S5、利用叶酸修饰经过步骤（4）制得的桦褐孔菌多糖铁络合物以产生衍生物，以使延伸物保留了对细胞受体的亲和力。
进一步的，所述步骤（5）中叶酸修饰桦褐孔菌多糖铁络合物的具体步骤如下：
A1、将桦褐孔菌多糖铁络合物在还原剂的作用下进行碱水解；将桦褐孔菌多糖络合物溶于水中制成浓度为20%的溶液，并在另一容器中溶解氢氧化钠制得1mol/L的氢氧化钠溶液，将桦褐孔菌多糖溶液加入到氢氧化钠溶液中，褐孔菌多糖铁溶液与氢氧化钠溶液的体积比为1:10，然后，再加入硼氢化钠作为还原剂混合搅拌反应15min，反应温度为36℃，反应体系的pH利用氢氧化钠溶液或者盐酸溶液进行调整，使得反应液的pH大于8；反应完成后将混合进行透析得到透析液，透析液经过滤后冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物；
A2、将桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与叶酸发生共价偶联反应，反应完全后经纯化得到最终载体，具体步骤如下：取桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于无水二甲基亚砜中，其中桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.05:0.01；加入叶酸，桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与叶酸或叶酸类似物的质量比为1:0.1，在避光条件下，室温反应过夜，多糖的羧基和叶酸的氨基连接，分离纯化后，将溶液冷冻干燥，得到多糖铁络合物-叶酸偶联物作为桦褐孔菌多糖铁载体。
实施例2
一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、利用醇沉的方法提取桦褐孔菌粗多糖；桦褐孔菌干燥粉碎后，过60目筛，得到桦褐孔菌粉末，在桦褐孔菌粉末中加入去离子水，在恒温水浴锅中加热回流4次，每次2h，离心后合并多次滤液，用旋转蒸发仪浓缩，加浓缩液4倍量的体积分数为95%的乙醇溶液进行醇沉，静置过夜，离心后冷冻干燥得粗多糖；
S2、用蒸馏水将提取的粗多糖配成水溶液，经滤膜过滤后，溶液过磷酸盐缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用磷酸盐缓冲液和浓度为1.5mol/L的氯化钾溶液洗脱，洗脱速率为40mL/h，合并多次的洗脱液，用超纯水透析后减压浓缩，冷冻干燥等纯化多糖；
S3、分别称取经过步骤（2）处理的纯化多糖和柠檬酸三钠，其中纯化多糖与柠檬酸三钠的质量比为2:1，使其混溶于去离子水中，搅拌均匀后逐滴加入2mL的浓度为2mol/L的三氯化铁溶液，同时滴加20%的氢氧化钠溶液使混合溶液的pH保持在11；
S4、滴加氢氧化钠的混合溶液在40℃条件下反应8h后，取上清液加入70%的无水乙醇混合20min，弃去上清液，用去离子水将沉淀物溶解后透析，透透析液浓缩后冷冻干燥，即得到桦褐孔菌多糖铁络合物；
S5、利用叶酸类似物修饰经过步骤（4）制得的桦褐孔菌多糖铁络合物以产生衍生物，以使延伸物保留了对细胞受体的亲和力。
进一步的，所述叶酸类似物为5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤或5,10-亚甲基四氢叶酸中的一种。
进一步的，所述步骤（5）中触发细胞内吞作用的配体分子修饰桦褐孔菌多糖铁络合物的具体步骤如下：
A1、将桦褐孔菌多糖铁络合物在还原剂的作用下进行碱水解；将桦褐孔菌多糖络合物溶于水中制成浓度为25%的溶液，并在另一容器中溶解氢氧化钠制得1mol/L的氢氧化钠溶液，将桦褐孔菌多糖溶液加入到氢氧化钠溶液中，褐孔菌多糖铁溶液与氢氧化钠溶液的体积比为1.2:10，然后，再加入硼氢化钠作为还原剂混合搅拌反应25min，反应温度为37℃，反应体系的pH利用氢氧化钠溶液或者盐酸溶液进行调整，使得反应液的pH大于8；反应完成后将混合进行透析得到透析液，透析液经过滤后冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物；
A2、将桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物依次与官能基团、触发细胞内吞作用的配体分子发生共价偶联反应，反应完全后经纯化得到最终载体，具体步骤如下：取桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于无水二甲基亚砜中，其中桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5:0.2；加入叶酸和叶酸类似物，桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与叶酸或叶酸类似物的质量比为1:0.8，在避光条件下，室温反应过夜，多糖的羧基和叶酸的氨基连接，分离纯化后，将溶液冷冻干燥，得到多糖铁络合物-叶酸偶联物作为桦褐孔菌多糖铁载体。
实施例3
一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、利用醇沉的方法提取桦褐孔菌粗多糖；桦褐孔菌干燥粉碎后，过60目筛，得到桦褐孔菌粉末，在桦褐孔菌粉末中加入去离子水，在恒温水浴锅中加热回流3次，每次3h，离心后合并多次滤液，用旋转蒸发仪浓缩，加浓缩液4倍量的体积分数为95%的乙醇溶液进行醇沉，静置过夜，离心后冷冻干燥得粗多糖；
S2、用蒸馏水将提取的粗多糖配成水溶液，经滤膜过滤后，溶液过磷酸盐缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用磷酸盐缓冲液和浓度为1.0mol/L的氯化钾溶液洗脱，洗脱速率为45mL/h，合并多次的洗脱液，用超纯水透析后减压浓缩，冷冻干燥等纯化多糖；
S3、分别称取经过步骤（2）处理的纯化多糖和柠檬酸三钠，其中纯化多糖与柠檬酸三钠的质量比为2:1，使其混溶于去离子水中，搅拌均匀后逐滴加入2mL的浓度为2mol/L的三氯化铁溶液，同时滴加20%的氢氧化钠溶液使混合溶的pH保持在10；
S4、滴加氢氧化钠的混合溶液在35℃条件下反应7h后，取上清液加入70%的无水乙醇混合15min，弃去上清液，用去离子水将沉淀物溶解后透析，透透析液浓缩后冷冻干燥，即得到桦褐孔菌多糖铁络合物；
S5、利用叶酸类似物修饰经过步骤（4）制得的桦褐孔菌多糖铁络合物以产生衍生物，以使延伸物保留了对细胞受体的亲和力。
进一步的，所述叶酸类似物包括5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亚甲基四氢叶酸。
进一步的，所述步骤（5）中触发细胞内吞作用的配体分子修饰桦褐孔菌多糖铁络合物的具体步骤如下：
A1、将桦褐孔菌多糖铁络合物在还原剂的作用下进行碱水解；将桦褐孔菌多糖络合物溶于水中制成浓度为22%的溶液，并在另一容器中溶解氢氧化钠制得1mol/L的氢氧化钠溶液，将桦褐孔菌多糖溶液加入到氢氧化钠溶液中，褐孔菌多糖铁溶液与氢氧化钠溶液的体积比为1.1:10，然后，再加入硼氢化钠作为还原剂混合搅拌反应20min，反应温度为37℃，反应体系的pH利用氢氧化钠溶液或者盐酸溶液进行调整，使得反应液的pH大于8；反应完成后将混合进行透析得到透析液，透析液经过滤后冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物；
A2、将桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物依次与官能基团、触发细胞内吞作用的配体分子发生共价偶联反应，反应完全后经纯化得到最终载体，具体步骤如下：取桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于无水二甲基亚砜中，其中桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.1:0.1；加入叶酸和叶酸类似物，桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与叶酸或叶酸类似物的质量比为1:0.5，在避光条件下，室温反应过夜，多糖的羧基和叶酸的氨基连接，分离纯化后，将溶液冷冻干燥，得到多糖铁络合物-叶酸偶联物作为桦褐孔菌多糖铁载体。
根据实施例1-3的方法制得的载体，并利用桦褐孔菌多糖铁载体负载多糖：取本发明制得桦褐孔菌多糖铁络合物载体，按固液比1:2溶于去离子水中，并加入桦褐孔菌多糖粉末，然后在37℃下振荡60h，振荡后放入透析袋中用去离子水透析70h，透析后冷冻干燥即得负载了桦褐孔菌多糖的载体药物，该载体可以结合细胞表面的内化受体，只要和内化受体结合，细胞就会启动内吞功能，从而将这种桦褐孔菌多糖物质带入细胞内，用于肿瘤、免疫调节、病毒感染疾病的治疗。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，其特征在于：由作为载体骨架的桦褐孔菌多糖铁络合物和触发细胞内吞作用的配体分子共价偶联得到的，所述具有细胞内吞介导功能的多糖载体的制备方法包括如下步骤：
S1、利用醇沉的方法提取桦褐孔菌粗多糖；
S2、用蒸馏水将提取的粗多糖配成水溶液，经滤膜过滤后，溶液过磷酸盐缓冲液充分平衡的DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用磷酸盐缓冲液和氯化钾溶液洗脱，合并多次的洗脱液，用超纯水透析后减压浓缩，冷冻干燥得纯化多糖；
S3、分别称取经过步骤（2）处理的纯化多糖和柠檬酸三钠，使它们混溶于去离子水中，搅拌均匀后逐滴加入三氯化铁溶液，同时滴加氢氧化钠溶液使混合溶液的pH保持在9~11；
S4、滴加氢氧化钠的混合溶液在30~40℃条件下反应6~8h后，取上清液加入70%的无水乙醇混合10~20min，弃去上清液，用去离子水将沉淀物溶解后透析，透析液浓缩后冷冻干燥，即得到桦褐孔菌多糖铁络合物；
S5、利用具有触发细胞内吞作用的配体分子修饰经过步骤（4）制得的桦褐孔菌多糖铁络合物以产生衍生物，以使衍生物保留了对细胞受体的亲和力；
其中，触发细胞内吞作用的配体分子修饰桦褐孔菌多糖铁络合物的具体步骤如下：
A1、将桦褐孔菌多糖铁络合物在还原剂的作用下进行碱水解后，经过透析和冷冻干燥得到桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物；
A2、将桦褐孔菌多糖铁络合物水解产物与触发细胞内吞作用的配体分子发生共价偶联反应，反应完全后经纯化得到最终载体；
其中，所述触发细胞内吞作用的配体分子为叶酸、5-甲基四氢叶酸，5-甲酰基四氢叶酸、甲氨蝶呤或5,10-亚甲基四氢叶酸中的一种。
2.如权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，其特征在于：所述步骤S2中氯化钾溶液的浓度为0.1~1.5mol/L，洗脱速率为40~50mL/h。
3.如权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，其特征在于：所述步骤S3中纯化多糖与柠檬酸三钠的质量比为2：1，三氯化铁溶液的浓度为2mol/L，滴加1~2mL，氢氧化钠浓度为20%。
4.如权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，其特征在于：所述步骤A1中反应溶液的pH大于8；所述还原剂为硼氢化钠。
5.如权利要求1所述的一种具有细胞内吞介导功能的多糖载体，其特征在于：所述步骤A1的反应均在36~37℃条件；所述桦褐孔菌多糖铁络合物碱水解采用氢氧化钠溶液，其中，桦褐孔菌多糖铁络合物溶液与氢氧化钠溶液的体积比为1~1.2:10。
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