CN110330484B

CN110330484B - 取代类苯基嘧啶衍生物作为jak激酶抑制剂或其可药用的盐、制备方法及用途

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Publication number: CN110330484B
Application number: CN201910653403.9A
Authority: CN
Inventors: 张大永; 张天泰; 舒蕾
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110330484A

Abstract

本发明公开了具有通式(I)的取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐、制备方法及用途。该化合物具有优良的JAK抑制作用，其用作预防、治疗或改善自身免疫疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等的药物。本发明化合物表现出高活性的JAK‑3抑制作用IC₅₀可达到1.7nM，本发明合成路线简单，实施性强。

Description

取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及激酶抑制剂、制备方法及应用，特别涉及取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐、制备方法及用途。

背景技术

JAK激酶(janus kinase)有四种亚型：JAK-1、JAK-2、JAK-3和TYK-2，其与下游的效应器、信号转导及转录激活蛋白(signal transducers and activators oftranscription proteins，STATs)形成了重要的细胞因子信号传导途径——JAK-STAT通路(Science，1994，264：1415-1421)。该通路的发现，大大提高了研究者对基因调控的认识，研究发现JAK-STAT通路可由多种细胞因子、生长因子以及受体激活，参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫调节等过程(World J Gastroenterol，2007，13：6478-6491)。JAK激酶介导细胞内大多数细胞因子的信号传导，如白介素(IL)类、干扰素(IFN)类、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、促生长素(GH)、催乳素(PRL)、促血小板生成素(TPO)、血小板衍生因子(PDGF)以及表皮细胞生长因子(EGF)等，而且不同受体可激活不同亚型的JAK激酶。

其中，JAK-3通过与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21等I型细胞因子受体复合物中的γ链(γc)相结合，调节细胞信号传导。当JAK-3缺陷或γc突变时，可导致重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)，表现为T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)细胞减少、B细胞功能丧失等免疫限制的症状。当存在合适数量的这些细胞素时，这些细胞素在免疫应答中起重要作用。然而，人们认为，它们的过度产生与许多自身免疫疾病有关，例如牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等等(Journal of Allergy andClinicalTmmurmlogy127，3，701-721.e70(2011)，Cytoki ne&Growth Factor Reviews19，41-52(2008)，Invest Ophthalmol Vis Sci.2008Jul；49(7)：3058-3064，Ann RheumDis.2010Jul；69(7)：1325-1328)。再者，JAK-1、JAK-2和TYK-2广泛存在于体内各种组织和细胞中，JAK3主要存在于骨髓细胞、胸腺细胞、NK细胞及活化的B淋巴细胞、T淋巴细胞中，JAK-3是公认的JAK-STAT通路中较为安全有效的抗自身免疫靶点。

如何抑制ATP与JAK上ATP结合位点的结合，阻断ATP的水解，干扰JAKs磷酸化，从而阻止JAKs的活化，切断其向STATs传递信号，导致其无法调控细胞核内基因的表达，由此阻断JAK-STAT信号通路，是研究的重点。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐。

本发明的另一目的是提供所述取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐的制备方法。

本发明的最后一个目的是提供所述取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐的用途。

技术方案：本发明提供一种具有通式(I)的取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐，

其中，

X是氮原子或-CH-；

Y是氮原子或-CH-；

Z是

被取代的或未被取代的C_3-8杂环烃基；

W是被取代的5元杂芳基；

R¹是

其中，

V为氢原子、卤素或氰基；

R⁴、R⁵、R⁶和R⁷分别为氢原子、被取代的或未被取代的C_1-6烃基、被取代的或未被取代的C_1-6杂烃基；

R²是氢原子、卤素原子、被取代的或未被取代的4、5、6、7-或8-元杂环；

R³是被取代的C_1-6烃基、被取代的或未被取代的C_1-6杂烃基。

进一步地，所述

Z是

进一步地，所述R²是氢原子、氟原子、取代或未被取代的4、5或6-元含氮杂环。所述W是含氮五元杂芳环。所述R³是甲基或被取代的C_1-6烷基，所述C_1-6烷基的取代基为卤素原子、羟基、C_1-6烷氧基、脂肪氨基、酰胺基。

进一步地，具有通式(I)的取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐，

N-(3-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(4-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(2-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(4-(2-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(6-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(4-(6-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(4-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(6-((1-(2-N，N-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(6-((1-(N-甲基乙酰胺)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(6-((1-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺、

N-(3-(6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(3-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(4-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(4-(2-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(3-(6-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(3-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(4-(6-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(4-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(3-(6-((1-(2-N，N-二甲基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(3-(6-((1-(N-甲基乙酰胺)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

N-(3-(6-((1-1-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺、

2-氰基-N-(3-(6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(3-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(4-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(4-(2-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(3-(((6-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)氨基)甲基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(3-(((2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)氨基)甲基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(4-(((6-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)氨基)甲基)苯基)乙酰胺、

2-氰基-N-(4-(((2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)氨基)甲基)苯基)乙酰胺、

N-[2-氧代-2-((3-(6-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]丙烯酰胺、

N-[2-氧代-2-((3-(6-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]丁烯酰胺、

N-[2-氧代-2-((3-(6-(4-吗啉苯氨基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]丙烯酰胺、

N-[2-氧代-2-((3-(6-(4-吗啉苯氨基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]丁烯酰胺、

2-氰基-N-[2-氧代-2-((3-(6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]乙酰胺、

2-氰基-N-[2-氧代-2-((3-(6-(4-吗啉苯氨基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]乙酰胺、

2-氰基-N-[2-氧代-2-((3-(6-(1-(N-甲基乙酰胺)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]乙酰胺、

2-氰基-N-(4-(6-((1-1-(2-羟基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺。

一种药物组合物，其含有治疗有效量的一种或多种如权利要求1-6中任一项所述的具有通式(I)的的取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐，及药学上可接受的载体或辅料。

所述的具有通式(I)的取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐的制备方法，包括如下步骤：

其中，

步骤1：化合物III与双联频哪醇硼酸酯在四三苯基膦钯和碱性醋酸钾的条件下使化合物III转化为化合物IV；

步骤2：向步骤1的反应液中加入2，4-氯-嘧啶或4，6-氯-嘧啶，四三苯基膦钯和碳酸钾水溶液进行suziki反应，得到化合物V；

步骤3：化合物v与取代胺反应，获得化合物VI；

步骤4：化合物VI的还原反应，转化为化合物VII；

步骤5：化合物VII与R¹取代试剂进行成酰胺反应，获得本发明化合物。

所述的具有通式(I)的取代类苯基嘧啶衍生物作为JAK激酶抑制剂或其可药用的盐在制备治疗自身免疫疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮的药物中的用途。

进一步地，所述自身免疫疾病为牛皮癣、类风湿性关节炎或炎性肠疾病。

本发明开发的高活性和选择性的JAK抑制剂或其可药用的盐，竞争性抑制ATP与JAK上ATP结合位点的结合，阻断ATP的水解，干扰JAKs磷酸化过程，从而阻止JAKs的活化，切断了其向STATs传递信号，导致其无法调控细胞核内基因的表达，由此达到阻断JAK-STAT信号通路的目的。

有益效果：本发明化合物具有优良的JAK-1和/或JAK-3抑制作用，其用作预防、治疗或改善自身免疫疾病(例如，牛皮癣、类风湿性关节炎、炎性肠疾病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎等等)、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病、多发性硬化、系统性红斑狼疮等等)的药物，等等，实施例5化合物表现出高活性的JAK-3抑制作用(IC₅₀＝1.7nm)，中等强度的选择活性(JAK-1/JAK-3＝586，JAK-2/JAK-3＝60)，本发明合成路线简单，实施性强。

具体实施方式

以下实施例中，“室温”是指大约10℃至大约35℃。混合溶剂表示的比例是体积混合比例，除非另作说明。除非另作说明，否则，％是指wt％。

在硅胶柱色谱中，碱性硅胶是指使用氨基丙基硅烷结合的硅胶。在高效液相色谱(HP1C)中，C18是指使用十八烷基结合的硅胶。洗脱溶剂的比例是体积混合比例，除非另作说明。

在下面实施例和实验实施例中，使用下列缩写。

THF：四氢呋喃，

HATU：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯，

DIEA：N，N-二异丙基乙胺

M：摩尔浓度。

利用Fourier变换类型NMR，测定¹H-NMR(质子核磁共振波谱)。对于分析，使用ACD/SpecManager等。不描述很轻的质子(例如羟基、氨基等等)的峰。

利用1C/MS(液相色谱质谱仪)测定MS(质谱)。作为电离法，使用ESI(电喷射离子化)方法等。数据表示那些实测值。通常，观察分子离子峰。在盐的情况下，通常观察到游离形式的分子离子峰或碎片离子峰。

以下为部分Z取代基的结构式及制备方法：

(1)N-甲基-4-氨基咪唑

将4-硝基咪唑(1.41g)，碳酸钾(2.5g)，碘甲烷(1.9g)和20mL乙腈，回流反应12h。减压旋干，加入50mL水，分别用50mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，有机相加入无水Na₂SO₄干燥，减压干燥，得1-甲基-4-硝基咪唑(1.5g)。

将1-甲基-4-硝基咪唑(1g)，Pd/C(0.1g)和20ml乙醇，于氢气球置换空气，室温反应约24h。硅藻土减压抽滤，滤液减压干燥，得标题产物(0.75g)。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺98.0。

(2)1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-胺

利用与参考实施例1一样的方法，由4-硝基吡唑、2-溴甲基乙基醚、Pd/C获得标题化合物。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺142.0。

(3)2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)乙醇

利用与参考实施例1一样的方法，由4-硝基吡唑、2-溴乙醇、Pd/C获得标题化合物。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺128.0。

(4)N，N-二甲基-2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)乙氨

利用与参考实施例1一样的方法，由4-硝基吡唑、N，N-二甲基-2-溴-乙氨、Pd/C获得标题化合物。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺154.1。

(5)N-甲基-2-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)乙酰胺

利用与参考实施例1一样的方法，由4-硝基吡唑、N-甲基-2-溴-乙酰胺、Pd/C获得标题化合物。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺154.0。

(6)4-(4-吗啉基)苯胺

将4-氟硝基苯(1g)，K₂CO₃(1.1g)和5ml DMSO，于室温搅拌反应30min，滴加入吗啡啉(0.6g)，加热120℃搅拌反应2h混合物倒入醇和水混合液(1：1)20mL中，黄色沉淀过滤得4-(4-硝基苯基)吗啉1.4g。将4-(4-硝基苯基)吗啉(1g)，Pd/C(0.1g)和20ml乙醇，于氢气球置换空气，室温反应约24h。硅藻土减压抽滤，滤液减压干燥，得标题产物(0.85g)。MS(ESI⁺)：[M+H]⁺179.1。

以下为本申请部分化合物的制备方法：

实施例1

N-(3-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺

A)4-氯-6-(3-硝基苯)嘧啶

在室温下，向3-溴硝基苯(1g)和50mL无水1，4二氧六环中，加入双联频哪醇硼酸酯(1.34g)和KOAc(1.48g)在催化剂Pd(PPh₃)₄(3％)和无氧条件下100℃反应12h。冷却至室温，向混合液中加入4，6-二氯嘧啶(1.07g)，2M K₂CO₃水溶液和Pd(PPh₃)₄(3％)升温至100℃保证无氧条件继续反应12h。冷却至室温，硅藻土过滤，减压干燥，经硅胶柱色谱纯化，得标题化合物(0.93g)。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.11(s，1H)，8.95(s，1H)，8.45(d，J＝8.0Hz，1H)，8.41(d，J＝9.3Hz，1H)，7.85(s，1H)，7.74(t，J＝8.0Hz，1H).

B)6-(3-硝基苯)-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶

于室温下，向4-氯-6-(3-硝基苯)嘧啶(0.3g)和异丙醇10mL中，加入1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-胺(0.24g)和DIEA(0.41g)，于回流条件下反应6h，冷却至室温，析出沉淀，抽滤，洗涤，得标题化合物。

¹H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.74(s，1H)，8.70(s，1H)，8.34-8.22(m，2H)，7.78(s，1H)，7.61(t，J＝8.0Hz，1H)，7.56(s，1H)，7.50(s，1H)，6.93(s，1H)，4.31(t，J＝5.1Hz，2H)，3.77(t，J＝5.1Hz，2H)，3.35(s，3H).

C)6-(3-氨基苯)-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶

于反应瓶中加入4-氯-6-(3-硝基苯)-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶(0.2g)，0.02g Pd/C，和20mL EtOH，N₂保护下，加热至回流，在30min内缓慢滴加85％水合肼(0.32g)，滴加完毕反应，抽滤，滤液减压干燥得标题化合物。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺311.2

D)N-(3-(6-((1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)丙烯酰胺

于反应瓶中加入6-(3-氨基苯)-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶(0.04g)，10mL干燥DCM，0℃滴加1mL干燥DCM稀释的丙烯酰氯，搅拌30min，抽滤可得到标题化合物。

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ8.69(s，1H)，8.48(s，1H)，8.06(s，1H)，7.81(d，J＝7.7Hz，1H)，7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，7.59(s，1H)，7.47(t，J＝7.8Hz，1H)，7.10(s，1H)，6.49(dd，J＝16.9，10.0Hz，1H)，6.31(d，J＝16.7Hz，1H)，5.78(d，J＝10.6Hz，1H)，4.25(t，J＝4.9Hz，2H)，3.68(t，J＝4.9Hz，2H)，3.23(s，3H)

MS(ESI)m/z 365.2[M+H]+.

实施例2至23

在实施例2至23中，利用与实施例1一样的方法。

其中实施例3、5、7、9、15、16、19和20在步骤A)中3-溴硝基苯(1g)对应换成4-溴硝基苯(1g)其他条件不变。

根据实施例结构式，其步骤B)对应不同的氨基烷基化的取代基，其具体是Z取代基(上述有说明)。

其中实施例13-23，对应步骤D)中0℃滴加1mL干燥DCM稀释的丙烯酰氯换成0℃滴加1mL干燥DCM稀释的丁烯酰氯，其他条件不变。

以上摩尔当量比与实施例1对应的反应当量相同。

继而可获得以下标题化合物，见表1。该表中的MS是指实测值。

表1部分化合物结构及核磁数据

实施例24

2-氰基-N-(3-(6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺

实验步骤A)、B)、C)利用与实施例1一样的方法，可获得6-(3-氨基苯)-N₄-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶。

E)2-氰基-N-(3-(6-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺

将6-(3-氨基苯)-N₄-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶(0.12g，)、氰乙酸(0.04g)、DIEA(0.13g)和15mL干燥THF，0℃搅拌下加入HATU(0.37g)搅拌反应30min，后转至室温下搅拌反应。反应结束，加入乙酸乙酯20mL，加入10％柠檬酸水溶液饱和NaHCO₃水溶液洗各两次，有机相拌样，经硅胶柱色谱分离纯化，可获得标题化合物。

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ8.66(s，1H)，8.33(s，1H)，8.02(s，1H)，7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，7.64(d，J＝7.1Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.47(t，J＝7.9Hz，1H)，7.07(s，1H)，3.94(s，2H)，3.83(s，2H)

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺334.2。

实施例25至32

在实施例25至32中，利用与实施例24一样的方法。

其中实施例26、27和30-32中在步骤A)中3-溴硝基苯(1g)对应换成4-溴硝基苯(1g)其他条件不变。

以上摩尔当量比与实施例1对应的反应当量相同。

继而可获得以下标题化合物，见表2。该表中的MS是指实测值。

表2部分化合物结构及核磁数据

实施例33

N-[2-氧代-2-((3-(6-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)氨基)嘧啶-4-基)-苯基-氨基)乙基]丙烯酰胺

实验步骤A)、B)、C)利用与实施例1一样的方法，可获得6-(3-氨基苯)-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶。

F)6-[3-(氨基甲酸，N-(2-氧代-2-(苯基氨基)乙基)-，1，1-二甲基乙基酯)]-N₄-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶

在室温下，6-(3-氨基苯)-N₄-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶(0.2g)溶于10mLDCM中，加入EDCI(0.36g)、HOBt(0.25g)、DIEA(0.34g)，0℃搅拌反应30min，加入6-(3-氨基苯)-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶，后转至室温下搅拌反应6h。反应结束，加入DCM 20mL，加入NaHCO₃水溶液洗两次，有机相拌样，经硅胶柱色谱分离纯化，可获得标题化合物。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ9.05(s，1H)，8.53(s，2H)，7.91(s，1H)，7.78(s，1H)，7.71-7.58(m，1H)，7.55(s，1H)，7.50-7.40(m，1H)，7.30-7.15(m，1H)，6.74(s，1H)，6.04(s，1H)，4.24(t，J＝5.0Hz，2H)，3.95(s，2H)，3.71(t，J＝4.9Hz，2H)，3.29(s，3H)，1.40(s，9H).

G)6-[3-(2-(氨基)乙酰苯胺)]-N₄-(1-(2-甲氧基乙基)-1H-吡唑-4-基)-4-嘧啶胺

6-[3-(氨基甲酸，N-(2-氧代-2-(苯基氨基)乙基)-，1，1-二甲基乙基酯)]-N₄-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-4-氨基嘧啶(0.5g)溶于2mLDCM中，冷却至0℃缓慢加入TFA(2mL)，室温搅拌反应5h。反应结束后，减压干燥，乙醚打浆抽滤得标题化合物。

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺368.2。

H)利用与实施例1中D)或者E)一样的方法对于得标题化合物。摩尔当量和其他反应条件不变。

¹H NMR(300MHz，DMSO)δ8.83(s，1H)，8.57(s，1H)，8.28(s，1H)，8.11(s，1H)，7.74(d，J＝15.0Hz，2H)，7.63-7.53(m，2H)，7.49(s，1H)，6.33(dd，J＝15.2，8.2Hz，1H)，6.12(d，J＝16.8Hz，1H)，5.63(d，J＝8.9Hz，1H)，4.28(s，2H)，4.04(s，2H).，3.68(s，2H)，3.23(s，3H).

MS(ESI⁺)：[M+H]⁺422.2。

实施例34至39

在实施例34至39中，利用与实施例33一样的方法，可获得标题化合物，见表3。该表中的MS是指实测值。

表3部分化合物结构及核磁数据

实施例40：实验实施例(JAK-1和JAK-3酶抑制试验)

实验目的：

评价化合物对JAK-1和JAK-3激酶的抑制作用。

实验原理：

基于荧光共振能量转移技术(FRET)偶联蛋白水解酶对特定磷酸化与非磷酸化多肽底物不同的蛋白水解作用。多肽底物两端分别标记为FRET能量供体香豆素和能量受体荧光素，此时供、受体距离较近激发供体可以发生能量转移。

激酶反应(Kinase Reaction)中，JAK-1或JAK-3可以将ATP中的γ-磷酸转移到多肽底物的单个酪氨酸残基上，如果体系中存在JAK-1或JAK-3抑制剂，则ATP上的γ-磷酸基团不会被转移到底物多肽上，磷酸化反应不能发生。基于此原理设计了激酶抑制剂的评价实验，底物多肽设计有激酶磷酸化位点，同时也是蛋白酶切位点，两端分别接2种荧光基团，分别为供体和受体，反应体系中如果激酶活性保持，γ-磷酸基团则被转移到底物的酶切位点，从而不会被蛋白酶切割而分离成两段，在特定波长激光激发下，一段荧光的能量会被转移到另一端的荧光基团而发射能量。否则，及酶活性被抑制后，磷酸基团不能被转移，底物酶切位点会被体系中的酶切割，底物分离成两段，则不会发生荧光的能量转移。基于此评价激酶的活性。

实验步骤：

本实验选择10μl激酶反应体系，JAK1抑制剂筛选中，体系含JAK1激酶浓度为1ng/μl，ATP 3.92μM；JAK2抑制剂筛选中，JAK2激酶0.004ng/μl，ATP 3.96μM；JAK3抑制剂筛选中，每体系含JAK3激酶0.012ng/μl，ATP 1.43μM。TK Substrate-biotin底物为1μM，化合物初筛浓度10μM。

(1)激酶反应缓冲液的准备

将1ml 5×Kinase Buffer加入4ml双蒸水中稀释至1×，加入5μl 1M DTT及25μl1M MgCl2命名为Kinase Buffer室温储存。

(2)待筛选化合物配置

样品化合物按质量，溶于DMSO，配成浓度为100mM的母液，用激酶反应缓冲液稀释和配置化合物，化合物的反应终浓度为10μM。

(3)反应体系

本实验载板为黑色384孔微量板，反应体系为10μl。

荧光检测

在330nm激发下，检测665nm和620nm的发射强度。

酶标仪自动计算Ratio＝665/620*10000

(5)数据分析

按下式计算每个样品的抑制率

抑制率＝(Ratio MAX-Ratio sample)/(Ratio MAX-Ratio NEG)*100

表4实验结果

结果显示：多个化合物对JAK激酶表现出一定的抑制作用

IC₅₀评价

对显示有较好活性的化合物浓度倍比稀释后评价其IC₅₀值，结果发现实施例5化合物表现出高活性的JAK-3抑制作用(IC₅₀＝1.7nm)，中等强度的选择活性(JAK-1/JAK-3＝586，JAK-2/JAK-3＝60)。

Claims

1.N-(3-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺，结构式如下：

2.一种药物组合物，其含有治疗有效量的N-(3-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺，及药学上可接受的载体或辅料。

3.N-(3-(2-(4-吗啉苯氨基)嘧啶-4-基)苯基)-2-丁烯酰胺在制备治疗自身免疫疾病、斯耶格伦氏综合征、白塞氏病的药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，所述自身免疫疾病为牛皮癣、类风湿性关节炎或炎性肠疾病。

5.根据权利要求3所述的用途，所述自身免疫疾病为多发性硬化、系统性红斑狼疮。