CN110184334A

CN110184334A - 基于高分辨熔解曲线形状的多重pcr检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN110184334A
Application number: CN201910574965.4A
Authority: CN
Inventors: 徐秦峰; 马西亚; 贺晓玲
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明公开了一种基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒。本发明采用PCR饱和荧光染料，扩增完成后直接进行高分辨熔解，对采集的熔解曲线进行归一化、差异化或主成分分析，即可实现单管有效同时检测多个靶序列的目的。根据高分辨熔解曲线形状信息而非熔解温度来进行鉴别检测，显著降低了多重PCR分析引物的设计难度，使得具有微小Tm差异的多个PCR扩增产物能够同时检测；避免了开管操作造成目的DNA被污染的可能性，弥补了多色荧光标记或者空间分隔平行下的单重扩增反应成本较高的缺陷，提高了检测通量，降低了检测成本，具有较强的实际应用价值。

Description

基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学鉴定技术领域，具体涉及根据高分辨熔解曲线形状同时检测多个靶标目的基因的多重实时荧光PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

多重PCR(multiplex PCR)又称复合PCR，是在常规PCR基础上发展起来的一种PCR技术，其可在同一个PCR体系中通过加入两对或两对以上的引物同时扩增多个靶目标片段。相对于单重PCR技术，多重PCR具有检测效率高、节约成本的优点。

目前，同时检测多个靶目标片段(例如，来自不同物种)的方法包括电泳分析、测序分析以及空间分离法。电泳分析的原理是先通过PCR技术扩增待检测的片段，直接或者使用限制性内切酶剪切之后，通过电泳分析片段大小以及数量，进而达到区分不同靶目标片段的目的，该方法耗时、费力且无法进行大规模检测，此外，对于片段差异小于10bp的靶目标片段难以进行区分；测序分析对于大批量样品的检测价格相对比较昂贵，而且测序和电泳都需要开管后操作，增加了样品产生气溶胶的污染风险；空间分离法则是通过空间并行的多个单反应检测予以实现，其中，对于不用开管操作的方法，多色荧光检测能够在闭管中实现多个目标序列的特异性检测，但其需要进行多色荧光标记且对仪器的要求也相对较高，需要多通道光学元件。探针法则需要针对每一对引物设计特异性探针，要求较为严格且价格昂贵，提高了检测成本。

熔解温度分析为同时单管检测多个靶目标片段提供了一种简单、闭管、成本低的可行性方法。不同的靶目标片段由于长度以及GC含量的差异导致其产生不同的熔解温度，可以用于区分多个靶目标片段。但采用此方法有一定的局限性，一方面对引物设计要求较高，要求每一引物具有良好的特异性，无引物二聚体和非特异性扩增生成，且不同的靶目标片段Tm(熔解温度)值相差大于2℃，另一方面要求多对引物处在同一个反应体系，各引物具有相同或相近的退火温度，并且彼此之间没有相互干扰，使得反应体系和反应条件的优化困难，且往往满足这些要求之后，难以保证扩增产物之间的Tm差值能够有效区分Tm接近的靶目标片段，这些都使该技术的推广受到限制。因此，建立一种简单易行且可以同时检测多种动物源性成分的检测方法，从而提高检测效率，一直是有待解决的问题。

高分辨熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)分析属于荧光PCR检测技术，主要原理是：双链DNA的熔解行为决定于DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性的差异，通过在熔解过程中实时监测DNA饱和荧光染料信号的改变获得特征熔解曲线，同时，借助于专业性的分析软件就可以实现基于不同形状熔解曲线的检测样品基因分型或归类。例如，中国专利CN109868322A利用通用引物扩增不同动物源性成份的某段DNA片段，尽管避免了设计多对引物，但是，通过对高分辨熔解曲线的差异化等分析，即根据高分辨熔解曲线的形状(轮廓)，尚无法区分熔解温度相似性较高(Tm相差0.5±0.1℃以内)的扩增靶序列所对应的不同动物源性成份，并且由于使用的是通用引物，PCR扩增反应的特异性较低。

而现有多重实时荧光PCR，例如，中国专利CN109868321A，针对山羊基因组中的靶序列的扩增产物的长度、GC含量，对引物进行了复杂的设计，以便通过观察熔解峰的位置实现同时鉴别熔解温度相似性较高(Tm相差0.5±0.1℃以内)的靶序列，但引物设计难度较大(增加整个扩增片段GC％的比值或者长度，将扩增片段Tm增加到期望值)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒，可以用于快速鉴别样品中的不同动物源性成分。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，该多重荧光PCR方法包括以下步骤：

1)根据不同待检样品中的DNA组成情况，确定需要鉴别的N种(N>1)目的DNA序列；

2)设计并合成用于扩增对应目的DNA序列中任意一部分具有特异性的序列片段(靶序列)的引物；

3)利用单重PCR扩增验证步骤2)中所设计的引物的有效性以及特异性(确认用于扩增的N对引物)；

4)分别分析目的DNA序列及其任意数量的组合方式(任意一种目的DNA序列，任意两种目的DNA序列的组合，任意三种目的DNA序列的组合，…，N种目的DNA序列的组合)，以对应目的DNA序列或包含目的DNA序列的基因组DNA为模板(模板中若含有多种目的DNA序列，可以采用任意比例混合，例如采用等摩尔比)，分别利用经过步骤3)验证的针对不同目的DNA序列的引物(所述N对引物)进行多重PCR扩增，并在扩增完成后对扩增产物立即(即闭管)进行高分辨熔解，采用归一化、差异化或者主成分分析对获得的高分辨熔解曲线进行特征提取，然后将提取得到的特征信息(例如，差异化熔解曲线图)合并，得到标准鉴别图谱；

5)提取某待检样品中的DNA作为模板，按照步骤4)进行多重PCR扩增以及对扩增产物立即(即闭管)进行高分辨熔解并获得高分辨熔解曲线，对该高分辨熔解曲线采用与获得所述标准鉴别图谱同样的特征提取方法(归一化、差异化或者主成分分析)进行分析，将分析结果与所述标准鉴别图谱比对，根据在所述标准鉴别图谱中经比对所匹配的特征信息确定所述某待检样品中的DNA组成情况(即一种或多种不同目的DNA的成份)。

优选的，所述步骤3)中，PCR扩增的片段位于不同目的DNA序列所对应动物种类的基因组DNA中。

优选的，所述步骤3)中，经过检验确定的引物选自扩增山羊线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P1、扩增绵羊线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P2、扩增牛线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P3、扩增水牛线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P4中的两对以上引物。

优选的，所述引物对P1的序列为：

上游引物：5'-CACCAAAATTCAACACAATACCACAT-3'

下游引物：5'-AGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'

引物对P2的序列为：

上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'

下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'

引物对P3的序列为：

上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'

下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'

引物对P4的序列为：

上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'

下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。

优选的，所述步骤4)、步骤5)中，多重PCR扩增的反应体系包括DNA模板、引物对P1、P2、P3和P4、PCR反应试剂(例如，2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix)、双蒸水以及用于PCR实时荧光扩增的饱和荧光染料(例如，EvaGreen)，P1:P2:P3:P4的引物摩尔比为5:7:4:10。

优选的，所述步骤4)、步骤5)中，多重PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

优选的，所述步骤4)、步骤5)中，高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始以0.05℃/s速率逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。

优选的，所述待检样品采集自乳制品、生乳或其他生物样品。

一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR试剂盒，该试剂盒包括用于构建多重PCR扩增的反应体系的试剂以及用于比对的针对多种目的DNA的靶序列扩增产物的标准高分辨熔解曲线形状特征图谱(即上述标准鉴别图谱)，所述标准高分辨熔解曲线形状特征图谱是通过对所述靶序列中的一种以及任意数量组合的扩增产物的高分辨熔解曲线进行归一化、差异化或者主成分分析而得到的；所述试剂包括用于扩增对应靶序列的标准PCR特异性引物(例如，上述引物对P1、P2、P3及P4)以及用于PCR实时荧光扩增的饱和荧光染料(例如，EvaGreen)。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用多重PCR扩增，可以以提取自待检样品的DNA为模板，在一次PCR反应中同时扩增不同目的DNA的靶序列，结合高分辨熔解曲线对扩增的片段进行鉴定，实现了闭管同时检测多个靶序列的目的。本发明在解决具有相似Tm(Tm相差0.5±0.1℃以内)的靶序列扩增产物的熔解峰，在多重PCR过程中积累为一个峰，从而无法通过分析Tm准确鉴别的问题时，不需要重新设计引物或调节引物设计(考虑扩增产物的长度、GC含量，使新的扩增产物的Tm值具有更明显差异)，并验证其扩增有效性和特异性。因此，本发明提高了检测效率，降低了检测成本。

进一步的，本发明提供的引物序列提高了检测的特异性，避免了交叉反应的发生，更好的实现有效鉴定不同靶序列的目的。

附图说明

图1为四个目的DNA(牛、水牛、山羊、绵羊)的靶序列(位于线粒体DNA内)扩增产物区分效果图，其中：(a)理论拟合的归一化熔解曲线图；(b)实验得到的归一化熔解曲线图；

图2为四个目的DNA(牛、水牛、山羊、绵羊)的不同靶序列扩增产物区分效果图，其中：(a)、(b)单组分靶序列扩增产物的差异化熔解曲线图、主成分分析(PCA)图；(c)、(d)两组分靶序列扩增产物的差异化熔解曲线图、主成分分析(PCA)图；(e)、(f)三组分和四组分靶序列扩增产物的差异化熔解曲线图、主成分分析(PCA)图；(g)、(h)合并得到的不同组分靶序列扩增产物(15种)的差异化熔解曲线图、主成分分析(PCA)图；

图3为不同混合比例山羊、牛基因组DNA的对应区分效果图，其中：(a)差异化熔解曲线图；(b)主成分分析(PCA)图；

图4为不同混合比例绵羊、牛基因组DNA的对应区分效果图，其中：(a)差异化熔解曲线图；(b)主成分分析(PCA)图；

图中：B、W、G、S分别代表牛、水牛、山羊、绵羊。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围内的限制。

针对乳制品中山羊、绵羊、牛、水牛等不同动物源性成份的鉴别检测，首先获取了山羊、绵羊、牛、水牛的基因组DNA：鲜牛乳样品采自西安市未央区草滩奶牛场；鲜羊乳采自西安市未央区市场；鲜水牛乳和绵羊乳购买自淘宝网，生乳于-20℃保存备用；各生乳获取时间均为2018年6月。生乳中基因组DNA提取采用磁珠分离法基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)。

(一)待检测目的DNA的靶序列引物设计

依据NCBI上牛、水牛、山羊、绵羊的完整的线粒体DNA序列，利用软件设计特异性引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列例如为(引物设计完成时间为2018年8月)：

山羊引物序列(引物对P1，参考序列GU295658)：

上游引物：5'-CACCAAAATTCAACACAATACCACAT-3'

下游引物：5'-AGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'

绵羊引物序列(引物对P2，参考序列AF010406)：

上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'

下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'

牛引物序列(引物对P3，参考序列AF492351)：

上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'

下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'

水牛引物序列(引物对P4，参考序列NC-006295)：

上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'

下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。

对于待检测的靶序列，利用u-Melt软件拟合高分辨熔解曲线，预测不同目的DNA同时检测以及鉴别区分的可能性。拟合结果如图1(a)所示，图中显示各扩增靶序列都有自己独特特征的高分辨熔解曲线，且熔解温度差值最小的山羊和水牛DNA(Tm相差0.5±0.1℃)，根据熔解温度两者无法区分，而根据高分辨熔解曲线可以进行明显地区分，说明可以通过熔解曲线的形状特征来鉴别四个(牛、水牛、山羊、绵羊)不同的目的DNA。

单重PCR反应验证：

扩增采用的PCR反应体系为：1μL(20ng/μL)模板(牛、水牛、山羊或绵羊的基因组DNA)，10μM的上游引物和下游引物各0.25μL，5μL 2×Taq PCR Master Mix，0.5μL 20×EvaGreen染料，加水补足至10μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃再延伸5min。在退火阶段采集荧光，用于获得扩增曲线。

高分辨熔解的程序为：扩增产物在闭管条件下，熔解温度从65℃以0.05℃/s逐渐升温到95℃，从65℃开始收集荧光信号。

经验证，参见图1(b)，实验获得的熔解曲线与理论拟合的曲线类似，因此确证了利用高分辨熔解曲线对牛、水牛、山羊、绵羊4个物种DNA鉴别分析的可行性。

(二)多重PCR反应

1.引物设计

采用P1、P2、P3及P4作为四重PCR扩增的引物。

2.PCR反应

扩增采用的PCR反应体系为：5μL 2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix，0.5μL20×Eva Green染料，1μL(20ng/μL)DNA模板，引物配比(摩尔比)为P1:P2:P3:P4＝5:7:4:10，加水补足至10μL。最终反应体系中山羊、绵羊、牛和水牛的上下游引物浓度分别为0.25μM，0.35μM，0.4μM和1μM。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃再延伸5min。在退火阶段采集荧光，用于获得扩增曲线。

3.同时检测多个目的DNA

3.1 15种不同DNA组分的检测

以4个物种(山羊、绵羊、牛和水牛)可能存在的15种不同基因组DNA组分为模板(单组分4种，双组分6种，三组分4种、四组分1种)，分别进行PCR扩增，扩增完成后，立即进行高分辨熔解，熔解结束后，为获得区分效果更加显著的分析结果，分析实验得到的差异化熔解曲线和PCA分析图，结果如图2(a)-图2(h)所示，差异化熔解曲线分析图中，各熔解曲线位置之间区分明显且稳定、Tm值相差较近的山羊和水牛也区分显著。PCA分析图中不同的目的DNA被划在各自对应的独立聚类中，相互区分效果明显。以上结果证明通过对扩增产物进行高分辨熔解曲线分析(例如，差异化分析、PCA分析)，可有效鉴别不同的目的DNA及其混合物。

3.2两种目的DNA不同混合比例样品的检测

(1)区分不同比例的山羊/牛样品：

以牛基因组DNA及山羊基因组DNA分别作为对照组，将牛和山羊的基因组DNA(20ng/μL)，按照0:100、50:50、40:60、30:70、10:90、5:95、1:99、100:0的比例(V/V)混合作为模板，做8组扩增实验，每组实验分别做三个复孔(重复)，扩增结束后分别进行高分辨熔解，获得对应的差异化熔解曲线和主成分分析图(https://www.metaboanalyst.ca//faces/ModuleView.xhtml)，图3(a)显示，不同混合比例下分别产生不同的特异性曲线，且各曲线之间区分明显，图3(b)显示，虽然含有不同的动物源性成分(牛和山羊的基因组DNA)，但由于混合比例不同，可划分为不同的组，且每个混合比例下的三个重复被划为主成分相同的一类。

(2)区分不同比例的绵羊/牛样品：

以牛基因组DNA及绵羊基因组DNA分别作为对照组，将绵羊和牛的基因组DNA(20ng/μL)，按照0:100、50:50、60:40、70:30、90:10、95:5、99:1、100:0的比例(V/V)混合作为模板，做8组扩增实验，每组实验分别做三个复孔(重复)，扩增结束后分别进行高分辨熔解，获得对应的差异化熔解曲线和主成分分析图(https://www.metaboanalyst.ca//faces/ModuleView.xhtml)，图4(a)显示，不同混合比例下分别产生不同的特异性曲线，且各曲线之间区分明显，图4(b)显示，虽然含有不同的动物源性成分(牛和绵羊的基因组DNA)，但由于混合比例不同，可划分为不同的组，且每个混合比例下的三个重复被划为主成分相同的一类。

(三)模拟样品的盲测

通过对模拟样本进行盲测，以评估多重PCR结合高分辨熔解曲线分析方法的检测性能。分析显示其识别准确率为100％，表明该方法具有良好的重现性。

(四)同时检测不同目的DNA的四重荧光PCR试剂盒及使用方法

(1)试剂盒组成

该试剂盒内有：2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix、特异性引物(P1、P2、P3、P4)、20×Eva Green及双蒸水；靶标目的DNA(用于构建标准鉴别图谱)。

(2)试剂盒使用方法

将2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 5μL、20×EvaGreen 0.5μL、10μM的目的基因对应的特异性引物以及双蒸水混合，得到四重荧光PCR扩增反应液。使用时根据实验样品需要加入模板DNA即可，最终反应体系为10μL。根据建立的PCR反应条件，通过四重PCR扩增(可以在同一个反应体系中同时对多个靶序列进行扩增)，结合对扩增产物的高分辨熔解曲线分析(根据熔解曲线的形状)，可以对待检测样品中是否含有目的DNA进行判断。

总之，本发明公开了一种基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒。本发明采用PCR饱和荧光染料，扩增完成后直接进行高分辨熔解，对采集的熔解曲线进行归一化、差异化或主成分分析，即可实现单管有效同时检测多个靶序列的目的。根据高分辨熔解曲线形状信息而非熔解温度来进行鉴别检测，显著降低了多重PCR分析引物的设计难度，使得具有微小Tm差异的多个PCR扩增产物能够同时检测；避免了开管操作造成目的DNA被污染的可能性，弥补了多色荧光标记或者空间分隔平行下的单重扩增反应成本较高的缺陷，提高了检测通量，降低了检测成本，具有较强的实际应用价值。

<110> 陕西科技大学

<120> 基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒

<160> 8

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caccaaaatt caacacaata ccacat 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agcgttatct ttgtaatagg ttttgt 46

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

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cgtagatgta gtatgacttt tcct 24

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtgaagttag ttaggagagt aattata 27

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

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gttaacagct aaacacccta gct 23

<210> 6

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<212> DNA

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aggtttgact cctcttttta ccaa 24

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccaaaattta acacaatccc gcaa 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cattggtcgt ggttgaattc ca 22

Claims

1.一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：该多重荧光PCR方法包括以下步骤：

1)根据不同待检样品中的DNA组成情况，确定需要鉴别的不同目的DNA序列；

2)设计并合成用于扩增对应目的DNA序列中任意一部分具有特异性的序列片段的引物；

3)利用单重PCR扩增验证步骤2)中所设计的引物的有效性以及特异性；

4)分别分析目的DNA序列及其任意数量的组合方式，以对应目的DNA序列或包含目的DNA序列的基因组DNA为模板，分别利用经过步骤3)验证的针对不同目的DNA序列的引物进行多重PCR扩增，并在扩增完成后对扩增产物进行高分辨熔解，采用归一化、差异化或者主成分分析对获得的高分辨熔解曲线进行特征提取，然后将提取得到的特征信息合并，得到标准鉴别图谱；

5)提取某待检样品中的DNA作为模板，按照步骤4)进行多重PCR扩增以及对扩增产物进行高分辨熔解并获得高分辨熔解曲线，对该高分辨熔解曲线采用与获得所述标准鉴别图谱同样的特征提取方法进行分析，将分析结果与所述标准鉴别图谱比对，根据在所述标准鉴别图谱中经比对所匹配的特征信息确定所述某待检样品中的DNA组成情况。

2.根据权利要求1所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，PCR扩增的片段位于对应动物种类的基因组DNA中。

3.根据权利要求1或2所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，经过检验确定的引物选自扩增山羊线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P1、扩增绵羊线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P2、扩增牛线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P3、扩增水牛线粒体DNA中的特异性保守区域的引物对P4中的两对以上引物。

4.根据权利要求3所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述引物对P1的序列为：

上游引物：5'-CACCAAAATTCAACACAATACCACAT-3'

下游引物：5'-AGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'

引物对P2的序列为：

上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'

下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'

引物对P3的序列为：

上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'

下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'

引物对P4的序列为：

上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'

下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。

5.根据权利要求1所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤4)、步骤5)中，高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始以0.05℃/s速率逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。

6.根据权利要求1所述一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述待检样品采集自乳制品、生乳或其他生物样品。

7.一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于构建多重PCR扩增的反应体系的试剂以及用于比对的针对多种目的DNA的靶序列扩增产物的标准高分辨熔解曲线形状特征图谱，所述标准高分辨熔解曲线形状特征图谱是通过对所述靶序列中的一种以及任意数量组合的扩增产物的高分辨熔解曲线进行归一化、差异化或者主成分分析而得到的；所述试剂包括用于扩增对应靶序列的PCR引物以及用于PCR实时荧光扩增的饱和荧光染料。