CN110184223A - 一种能高效去除养殖污水中氨氮的开塞利节杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及畜禽养殖场污水好氧深度处理领域，具体公开了一种能高效去除养殖污水中氨氮的开塞利节杆菌及其应用。申请人自活性污泥中筛选到一株异养硝化‑好氧反硝化细菌开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)，该菌株在超高氨氮浓度（2000 mg/L）条件下存活并有一定的除氮能力，将其添加到猪场污水中，可大幅度降低污水中的氨氮值，COD、TP、TN、TSS各项指标均下降，该菌株可用于制备成商品化的污水处理菌剂，作为畜禽养殖场污水好氧处理工艺的外源添加菌种，降低污水处理成本，达到污水无害化处理目的。
Description
技术领域
本发明涉及畜禽养殖场污水好氧深度处理领域，具体而言，涉及一种能高效去除养殖污水中氨氮的开塞利节杆菌及其应用。
背景技术
养殖业污水属于富含大量病原体的高浓度有机污水，直接排放进入水体或存放地点不合适，受雨水冲洗进入水体，将可能造成地表水或地下水水质的严重恶化。由于畜禽粪尿的淋溶性很强，粪尿中的氮、磷及水溶性有机物等淋溶量很大，如不妥善处理，就会通过地表径流和渗滤进入地下水层污染地下水。对地表水的影响则主要表现为，大量有机物质进入水体后，有机物的分解将大量消耗水中的溶解氧，使水体发臭；当水体中的溶解氧大幅度下降后，大量有机物质可在厌氧条件下继续分解，分解中将会产生甲烷、硫化氢等有毒气体，导致水生生物大量死亡；污水中的大量悬浮物可使水体浑浊，降低水中藻类的光合作用，限制水生生物的正常活动，使对有机物污染敏感的水生生物逐渐死亡，从而进一步加剧水体底部缺氧，使水体同化能力降低；氮、磷可使水体富营养化，富营养化的结果会使水体中硝酸盐和亚硝酸盐浓度过高，人畜若长期饮用会引起中毒，而一些有毒藻类的生长与大量繁殖会排放大量毒素于水体中，导致水生动物的大量死亡，从而严重地破坏了水体生态平衡；粪尿中的一些病菌、病毒等随水流动可能导致某些流行病的传播等。
目前畜禽养殖场污水处理技术主要分为厌氧处理和好氧处理两大类，厌氧工艺有很多，其中较为常用的有以下几种：厌氧滤器(AF)、上流式厌氧污泥床(UASB)、复合厌氧反应器(UASB+AF)、两段厌氧消化法和升流式污泥床反应器(USR)等；好氧处理工艺又可分为天然好氧生物处理法(水体净化、土壤净化)和人工好氧处理的活性污泥法、生物滤池、生物转盘、生物接触氧化法、序批式活性污泥法(SBR)、厌氧/好氧(A/O)及氧化沟法等。
如果直接采用好氧工艺处理固液分离后的养殖业污水，虽然比厌氧处理工艺节省大量的基建成本，但由于曝气过程中消耗的动力大，需要巨额的能源成本仍会造成污水处理成本仍高居不下，对畜禽养殖企业来说是个沉重的负担，降低污水的处理成本这一问题亟待解决。
开塞利节杆菌属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)为一种革兰氏阳性化能异养菌。节杆菌属菌是一类普遍存在的具有较高遗传适应性的细菌，它广泛存在于环境中。目前已有节杆菌属类细菌对污染物降解的报道，如节杆菌(Arthrobacter sp.)YC-RLl(闫艳春,任磊,史延华,et al.一种节杆菌属细菌及其应用.)，但未见有关开塞利节杆菌可降解污染物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种能高效去除养殖污水中氨氮的开塞利节杆菌，所述菌株已于2019年1月21日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4，保藏编号：CCTCC NO:M2019065，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4在污水处理中的应用。
为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：
一种能高效去除养殖污水中氨氮的开塞利节杆菌的筛选：
本发明的菌株筛选自华中农业大学精品育种场污水处理端的活性污泥中，保留氨氮(NH4+-N)去除率达70％以上菌株，经16SrDNA比对后，获得了一株开塞利节杆菌，该菌株已于2019年1月21日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4，保藏编号：CCTCC NO:M2019065，地址：中国武汉武汉大学。
该菌为革兰氏阳性菌，短杆棒状，菌落呈淡黄色不透明点状分布；可用常见培养基LB置于常温状态下震荡培养制成菌液加以利用。
开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4在污水处理中的应用，包括利用该菌株去除污水中的氨氮含量，或是制备成除氨氮的污水处理剂；还可以用于降低污水中的COD、TSS、TN、TP等。
本发明的有益效果：
本发明筛选的菌株可以在畜禽养殖过程中产生的高浓度有机污水存活；以相应的比例添加到经过固液分离工序的前端处理后的好氧废水处理段，提高好氧池中的异养硝化-好氧反硝化除氮菌的含量，加速除氮的过程，缩短水力停留时间，降低废水深度处理成本。
附图说明
图1为Arthrobacter Keyseri A-4菌株的生长形态及革兰染色图。
图2为添加菌液猪场污水反应前后形态示意图；
其中：O:原污水；CT:对照组；D：开塞利节杆菌组。
图3为猪场污水深度处理工艺流程简图。
具体实施方案
本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为
本领域的常规技术。
试验中污水各项指标检测方法：
COD：重铬酸碱法(GB 11914-89)
NH4 +-N：纳氏试剂分光光度法(GB 7479-87)
TN:碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(GB 11894-89)
TP:钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)
TSS：重量法(GB 11901-89)
菌体生长量：光密度法(OD600)
试验中所用到的培养基及成分配比:
1L硝化富集培养基：(NH4)2SO4 0.5g；柠檬酸三钠4.08g；KH2PO4 1.0g；氯化亚铁0.5g；硫酸镁1.0g；调节pH 7.0-7.5，其余为水。
1L溴百里酚蓝(BTB)筛选培养基：KNO3 1.0g；L-天冬酰胺1.0g；柠檬酸三钠8.5g；KH2PO4 1.0g；氯化亚铁0.05g；硫酸镁1.0g；氯化钙0.2g；琼脂20g；用酒精稀释0.1％的溴百里酚蓝(BTB)溶液5mL；调节pH7.0-7.5，其余为水。
1L异养氨氧化培养基：(NH4)2SO4 0.472g；柠檬酸三钠4.902g；K2HPO4 0.2g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.01g；硫酸锰0.01g；NaCl 0.12g；调节pH7.0-7.5，其余为水。
实施例1：
开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4的分离纯化与鉴定：
1、活性污泥的取样及富集驯化培养
华中农业大学精品育种场污水处理端的兼性塘的选择和活性污泥的取样，将活性污泥加入特制的曝气设备中，再添加两到三倍的硝化富集培养基进行人工间歇性(每曝气三小时停止一小时)曝气处理，保持水体溶氧量不低于3mg/L。连续培养两个月左右时间，期间每天在停止曝气时间段更换一次硝化富集培养液(更换培养液体积约占初始体积的1/50)，直至培养污泥由灰黑色转化为土黄色，停止曝气后静置一段时间水体澄清透明。
2、异养硝化-好氧反硝化菌的分离筛选
取曝气设备中的土黄色活性污泥1g至50mL离心管，添加30mL左右的无菌水，反复剧烈震荡，形成混合菌液。采用倍比稀释法稀释成10-1到10-7梯度的菌悬液，再用灭菌接种环蘸取菌液在BTB初筛选固体培养基上进行划线，倒置培养皿于30℃恒温培养箱每天观察菌落形态。
比较挑取生长良好且使菌落周边培养基变蓝的菌落于BTB复筛固体培养基进行划线分离纯化，倒置培养皿于30℃恒温培养箱每天观察菌落形态直至得到特征一致的菌落，而后挑取菌落重复上一步骤划线分离纯化培养，直至每次得到的菌落形态特征一致，不会出现其他的杂菌菌落。
3、筛选菌株性能初步测定
将所得菌株用灭菌接种环挑出接种至已灭菌的硝化培养基，震荡培养一段时间至硝化培养基完全浑浊(有效菌含量均为108-109cfu/mL)；按一定的体积比(1：100)将培养菌液添加至异养氨氧化培养基震荡培养48h后测定培养液的TN，氨氮(NH4 +-N)值，保留氨氮(NH4 +-N)去除率达70％以上菌株。
4、菌株的鉴定
最终获得了一株具有氨氮去除功能的细菌，提取该菌株的DNA，通过PCR扩增16SrDNA片段，测序后在将DNA序列在GeneBank进行BLAST比对即可，该菌株DNA序列比对与开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)相似度达99％。
该菌为革兰氏阳性菌，短杆棒状，菌落呈淡黄色不透明点状分布(图1所示)，具有产碱能力。根据细菌生长形态特征参照《伯杰氏系统细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》符合杆菌属细菌的生理生化特征，确定为开塞利节杆菌。
上述菌株已于2019年1月21日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4，保藏编号：CCTCC NO:M2019065，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4的培养或发酵方式：
配置常规LB培养基(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L
调节pH至7.0)高压蒸汽灭菌后，在超净工作台内接种开塞利节杆菌，置于25℃，120r/min条件下震荡培养48h后至培养液完全浑浊，此时培养液有效菌含量达到108cfu/mL。
实施例3：
反应条件对开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4的生长影响：
1、常见因素对菌生长及除氮性能影响
考虑到菌株实际应用中可能会受到天气温度，曝气量及进水的pH值等对开塞利节杆菌的生长性能及除氮效果的影响，特设置本组试验来测试菌的最佳生长条件，为开塞利节杆菌在猪场废水好氧深度处理工艺更好的应用提供相应的参考范围。本试验设置影响因子如下：温度(20℃、30℃、40℃)和转速(60r/min、120r/min、240r/min)以及pH(5、6、7、8、9)值，通过控制变量法设计相应的试验组生长条件；试验所用培养基测定初始氨氮(NH4 +-N)浓度约为110.00mg/L，总氮(TN)浓度约为120.0mg/L，pH值在7.00左右。
表1温度、转速、pH对菌生长及性能影响
注：氨氮、总氮单位为mg/L，T、R、P分别代表温度、转速、pH三种因素对菌的生长性能影响，下角标数字代表各因素的不同水平；上角标字母代表同一列不同因子相互比较，不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。
T1～T3，R1～R3，P1～P5分别代表温度(20℃、30℃、40℃)和转速(60r/min、120r/min、240r/min)以及pH(5、6、7、8、9)三种因素不同水平
通过试验数据检测分析我们得到以下结果：开塞利节杆菌除氮性能最佳生长条件分别为温度为30℃，转速120r/min，pH为7，此时震荡处理36h氨氮浓度由110.0mg/L下降至6.4mg/L，去除率可达94.2％。
2、高氨氮浓度废水对菌生长性能影响
猪场废水为高浓度有机污水，未经前端固液分离的猪场废水，具有有机物浓度高、悬浮物多、氨氮含量高的典型的“三高”特征，即COD 3000～12000mg·L-1,氨氮800～2200mg·L-1，TSS超标数十倍等特点。其中氨氮对菌生长存在巨大影响。本试验主要测试开塞利节杆菌对氨氮浓度的耐受能力，为开塞利节杆菌更好的应用提供相应的参考范围。
试验设置氨氮浓度分别为：200mg/L、400mg/L、800mg/L、1600mg/L、2000mg/L五组，取开塞利节杆菌的培养液(有效菌含量均为108cfu/mL)按一定的体积比(1：100)添加到猪场废水中，常温震荡培养36h，检测菌生长的密度(OD600)值以及其他各项指标。
表2不同浓度的氨氮含量对菌生长及性能影响
注：氨氮、总氮单位为mg/L；N代表氨氮浓度对菌的生长性能影响，N1～N5分别对应氨氮浓度为200mg/L、400mg/L、800mg/L、1600mg/L、2000mg/L的猪场废水，下角标数字代表各因素的不同水平；上角标字母代表同一列不同因子相互比较，不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。
从以上数据可知，开塞利节杆菌具有很强的耐高氨氮浓度能力，可以在氨氮浓度达2000mg/L的环境中生长，且有一定氨氮出去率，在氨氮浓度为200mg/L-800mg/L的环境条件下，氨氮去除率均超过70％。实施例3：
开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)A-4对猪场废水实际处理效果测定：
1、实验室小试
取开塞利节杆菌的培养液(有效菌含量均为108cfu/mL)按一定的体积比(1：100)添加到猪场废水中，常温(25-30℃)震荡(转速是120转/min)培养36h，测定废水的各项指标；以不添加菌液的相同废水为对照组。
猪场废水取自华中农业大学育种场污水处理设施的进水端，处理前后肉眼观察形态如下：
对比反应前后的猪场污水形态，从图2中可以明显看出反应前的猪场污水(O)呈灰青色不透明状，表层有泡沫，静置后底层有杂质沉淀；接种开塞利节杆菌经过36h震荡培养后，可以很明显看出猪场污水由灰青色不透明状变成清澈透明状，表层无泡末，底层有大量的灰青色絮状沉淀形成，具体指标变化请见表3。
表3
注：表中数据单位为mg/L，国标是指《畜禽养殖业污染物排放标准(GB 18596-2001)》；将试验组与起始浓度进行对比，不同字母标注表示差异显著(P<0.05)。
从试验数据分析可得，加入开塞利节杆菌菌液猪场废水各项指标的去除率均高于不添加菌液对照组，经过36h振荡处理，试验组的氨氮(NH4 +-N)值由225.8mg/L左右下降至55.2mg/L，下降率高达约75％，由于开塞利节杆菌还有一定的絮凝能力，废水中总悬浮物(TSS)浓度下降率约为69％，两项指标均可达畜禽养殖业国家污染物排放标准(GB18567-2001)。
2、猪场污水A2/O处理系统中试
本次试验地点在湖北省武汉市某一大型猪场，该场污水处理工艺方案涵盖前处理系统(干湿分离系统)、厌氧沼气系统、深度A2/O生物处理系统和氧化塘水生植物净化系统，四者相辅，构建能源生态统一利用循环模式，其反应流程如图3所示。
通过外缘添加开塞利节杆细菌菌液(按体积比1：10000添加)至二级厌氧池(微曝)和好氧池中，经过48h的反应，检测进水端和出水端的水质(COD、NH4 +-N、TP、TN)。
表4外源添加菌液前污水处理系统进出水端水质结果
注：表中数据单位为mg/L。
表5外源添加菌液后污水处理系统进出水端水质结果
注：表中数据单位为mg/L。
通过对比表3-2和3-3中数据可发现，通过外源添加开塞利节杆菌菌液出水端污水的COD、NH4 +-N、TP、TN各项指标下降率均高于添加前，其中NH4 +-N去除率添加菌液组高于未添加组近10％。
Claims (5)
1.一种分离的开塞利节杆菌(Arthrobacter Keyseri)，所述菌株的命名为开塞利节杆菌A-4，保藏编号为：CCTCC NO: M2019065。
2.权利要求1所述的开塞利节杆菌在污水处理中的应用。
3.权利要求1所述的开塞利节杆菌在制备污水处理剂中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，所述的开塞利节杆菌用于降低污水中的氨氮含量。
5.根据权利要求2或3所述的应用，所述的开塞利节杆菌用于降低污水中的总氮、总磷、化学需氧量或总悬浮物含量。
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