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CN110172462B - 一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的基因及其表达产物和应用 - Google Patents

一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的基因及其表达产物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Twa1基因及其表达产物和应用，首次发现并验证了Twa1基因在肿瘤发生发展中的作用，以及Twa1基因促进肿瘤细胞增殖和成瘤的能力，从而为恶性肿瘤的诊断和抑制多种恶性肿瘤的发生发展提供新的靶标。本发明提供了Twa1基因及其蛋白质；提供了含有Twa1基因的表达载体以及含有该表达载体的转基因细胞系和宿主菌；提供了靶向Twa1蛋白质的抗体；提供了多种靶向Twa1基因的材料和方法，可专一性地在细胞内抑制Twa1基因的表达；提供了针对Twa1基因及其蛋白质的抗肿瘤药物、肿瘤检测试剂盒和药物筛选模型；提供了Twa1基因及其蛋白质在制备抗肿瘤药物和肿瘤检测试剂盒和和药物筛选模型中的用途。

Description

一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的基因及其表达产物 和应用
技术领域
本发明属于肿瘤学和基因治疗技术领域。更具体地，本发明涉及一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的基因及其表达产物和应用。
背景技术
Twa1(Two hybrid associated protein No.1with RanBPM)是一个在进化上高度保守的基因，由687个碱基对组成，定位于人类20号染色体上，又名GID8、C20orf11，其蛋白质产物由228个氨基酸组成，在细胞质与细胞核中均有定位，能够与RanBPM(Ran-bindingprotein M)蛋白质相互作用。目前，关于Twa1的研究较少，仅有报道其蛋白质组成和初步研究Twa1可能在细胞迁移和胚胎发育过程中发挥作用的文献，但并未提及Twa1的分子作用机制，关于Twa1在肿瘤的发生和发展中的功能研究更是一片空白。
肿瘤是危害人类健康和生命的最重大的疾病之一。肿瘤(tumor，也称癌症，cancer)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。正常细胞转变为肿瘤细胞的过程称为肿瘤的发生和发展。肿瘤的发生和发展是一个渐进式的过程，涉及多级反应和突变的积累。在此过程中，癌变的细胞越来越不受体内调节机制的控制，并逐渐向正常组织侵染。在细胞发生恶性转变之后，肿瘤细胞继续积累突变，赋予突变细胞新的特性，使肿瘤细胞更具危险性。世界卫生组织最新的有关全球疾病情况的数据显示，恶性肿瘤的死亡率高居第二位。在我国，据卫生部疾控司统计每年约有220万新发肿瘤病例，死亡人数达到160万人，且近年来肿瘤的发病率和死亡率逐渐上升。虽然随着医疗技术的不断发展，以手术及放、化疗为主要方法的癌症治疗手段有了很大的进展；但是由于癌症发病作用机理复杂，治疗难度极大，因此寻找有效的靶点和分子，进而开发相关的治疗药物，具有重要的临床意义。
以结直肠癌为例，大量研究表明，大部分结直肠癌的发生与经典Wnt信号通路的异常激活密切相关。Wnt信号通路主要是细胞外Wnt配体与细胞膜上的受体结合，提高细胞质内β-catenin蛋白质的稳定性，促进其移位至细胞核，激活下游靶基因的表达。研究显示结直肠癌的发生主要是由Wnt通路中的APC(adenomatous polyposis coli)基因突变引起的，APC蛋白质功能异常导致细胞质中β-catenin不再被降解，β-catenin进入细胞核内，并在核内累积，使得下游靶基因(如cyclin D1和c-Myc等)持续表达，进而导致细胞过度增殖，促进结直肠癌的发生。此外，在结直肠癌组织中还存在Wnt信号通路中其他基因的突变，如Axin的功能缺失突变和β-catenin的功能激活突变等，这些突变最终也会导致细胞核内β-catenin水平升高，促进结直肠癌的发生和发展。这些研究表明β-catenin核内积累异常是结直肠癌发生和发展的重要原因之一。更重要的是，β-catenin的核内累积也是其他恶性肿瘤发生和发展的重要因素，如乳腺癌，肝癌，肺癌等。但是，关于β-catenin核内累积的分子机制至今仍知之甚少。
基因的表达受到转录因子的调控，转录因子是一群能与基因的特定序列专一性结合，保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。β-catenin作为一种转录共激活因子(transcriptional coactivator)，能够与转录因子(transcriptionalfactor)结合而激活转录因子的活性，从而促进基因表达，促进细胞增殖。在多数肿瘤中，β-catenin在肿瘤细胞的细胞核中高度表达，通过结合转录因子并激活转录因子的活性，促进基因的表达而导致肿瘤细胞过度增殖。目前的研究已筛选和制备出一些针对β-catenin与转录因子结合的小分子抑制剂，试图通过阻断β-catenin与转录因子的结合而抑制或干扰基因的表达和肿瘤细胞增殖。但是，这些针对β-catenin与转录因子结合的小分子抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制或干扰效果并不显著，而且在临床上也没有得到很好的应用，很大一部分原因是在于细胞核内仍然有大量的β-catenin存在，而且β-catenin在细胞核内能够结合多种转录因子促进肿瘤细胞增殖，这些小分子抑制或干扰剂无法阻断细胞核内所有的β-catenin与转录因子结合，也无法同时阻断β-catenin与多种转录因子的结合。这表明现有技术无法从根本上完全抑制β-catenin在细胞核内的功能，并且也没有专门针对β-catenin核内累积的抑制剂。若能阐明β-catenin核内累积的分子机制，筛选和制备能够抑制或干扰β-catenin核内累积的药物，使得β-catenin无法在细胞核内累积，将极有可能抑制或干扰肿瘤细胞增殖，进而抑制或干扰肿瘤的发生和发展。因此，深入了解β-catenin核内累积的分子机理，寻找新的有效的潜在分子靶标，具有重要的理论意义和应用价值。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指内源性或外源性的双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的沉默表达，产生相应的功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默机制。siRNA通常是一段长21个核苷酸的dsRNA (double-stranded RNA，双链RNA)，由一条核苷酸正义链和一条核苷酸反义链相互结合构成。核苷酸正义链和核苷酸反义链是互补配对的。通过向肿瘤细胞中导入特定的的siRNA，在肿瘤细胞中专一性地抑制或干扰特定基因的表达，可作为一种癌症治疗手段，与传统的手术及放、化疗相比，具有很高的专一性，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。而在活体中输送siRNA的另一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当载体进入细胞时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(short hairpin RNA，shRNA)，并进一步被加工成siRNA。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由RNA聚合酶Ⅲ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。
CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。该系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白质在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA，引起细胞的DNA损伤修复。而细胞通过DNA修复会造成INDEL(insertion and deletion，插入和缺失)效应，进而造成基因的移码突变而达到基因敲除的目的。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single-guide RNA)，将其克隆到质粒载体中，当载体进入细胞时，可以表达出相应的sgRNA，通过与CRISPR/Cas9系统作用，可以准确地切割对应的基因靶点。通过向肿瘤细胞中导入特定的的sgRNA，在肿瘤细胞中专一性地敲除特定基因，也可作为一种重要的癌症精准治疗手段。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的Twa1基因及其表达产物和应用。申请人通过系统研究Twa1基因的生物学功能和分子作用机制，首次发现并验证了Twa1基因在肿瘤发生和发展中的独特作用，以及Twa1 基因具有促进肿瘤细胞增殖、迁移(migration)和侵袭(invasion)的能力，从而为恶性肿瘤的诊断和抑制或干扰多种恶性肿瘤的发生和发展提供了新的靶标和思路。申请人成功克隆 Twa1基因，即Twa1的cDNA序列(参见说明书核苷酸和氨基酸序列表 中的SEQ IDNO.1的DNA序列，也就是人源Twa1的基因序列)。申请人通过提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒转录出Twa1 cDNA序列，然后使用针对Twa1cDNA序列的特异性引物进行PCR扩增，将该序列构建至原核或真核表达载体(参见实施例4)，进而在原核或真核细胞中表达和纯化Twa1多肽或蛋白质(参见说明书序列表中的SEQ ID NO.2序列，也就是人源Twa1的氨基酸序列，和实施例6)。
进一步地，申请人还意外地发现了Twa1基因在β-catenin的核内累积的功能，为筛选和制备能够抑制或干扰β-catenin的核内累积的抗肿瘤药物，进而有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展，提供了新的靶标和思路。
进一步地，申请人发现了Twa1基因对于经典Wnt信号通路的分子调控机制，β-catenin 的核内累积是多种恶性肿瘤发生和发展的重要因素，如结直肠癌、乳腺癌、肝癌、神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤等。申请人发现Twa1基因通过促进β-catenin的核内累积而增强Wnt 信号通路，进而促进肿瘤的发生和发展。
进一步地，申请人还发现了Twa1对上皮间质转化(EMT)的调控，上皮间质转化不仅在发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。EMT可以促进多种恶性肿瘤的转移，如结直肠癌、膀胱癌、肝癌、黑色素瘤等。申请人发现Twa1基因通过促进上皮间质转化而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的发生和发展。
本发明所述的肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞由于基因突变失去了对其生长的正常调控，导致异常增生而形成的新事物。优选的，本发明所述的肿瘤可以是结直肠癌、乳腺癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、血癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、头癌、颈癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、胃肠道间质瘤、皮肤癌、多发性骨髓瘤、神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤。
为解决本发明的技术问题，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的分离的核酸，编码TWA1基因，包含至少具有下列特征之一的DNA序列：
1)序列表中的SEQ ID NO.1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID NO.2蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID NO.1的DNA序列由687个碱基对组成。
所述的TWA1也可以称为GID8或者C20orf11。
所述的肿瘤的发生和发展是指正常细胞转变为肿瘤细胞的过程。肿瘤的发生和发展是一个渐进式的过程，涉及多级反应和突变的积累。在此过程中，癌变的细胞越来越不受体内调节机制的控制，并逐渐向正常组织侵染。在细胞发生恶性转变之后，肿瘤细胞继续积累突变，赋予突变细胞新的特性，使肿瘤细胞更具危险性。本发明所述的Twa1基因可用于促进肿瘤的发生和发展，也就是能够促进正常细胞转变为肿瘤细胞，并且能够调控正常细胞转变为肿瘤细胞的整个过程。当肿瘤缺失Twa1基因时，肿瘤的发生和发展将受到抑制或干扰。所述的抑制是指完全阻断肿瘤的发生和发展，所述的干扰是指在不同程度上影响肿瘤的发生和发展。
本发明还提供了一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的多肽或蛋白质，也称为Twa1 多肽或蛋白质，包含至少具有下列特征之一：
1)序列表中的SEQ ID NO.2序列；
2)将序列表中的SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质。
所述的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
3)与序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列具有90％以上同源性,且与肿瘤相关的多肽或蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO.2的氨基酸由228个氨基酸残基组成。
本发明所述的Twa1多肽或蛋白质是由所述Twa1的基因经细胞内的转录和翻译过程表达而来。所述的转录是指细胞以所述Twa1基因的DNA序列为模板，根据核苷酸互补配对原则，以核糖核苷酸为原料，合成出对应的Twa1mRNA的过程。所述的翻译是指，细胞进一步以所述的Twa1mRNA模板，以氨基酸为原料，合成出对应的Twa1多肽或蛋白质的过程。所述的Twa1多肽或蛋白质可用于促进对肿瘤的发生和发展，也就是能够促进正常细胞转变为肿瘤细胞，并且能够调控正常细胞转变为肿瘤细胞的整个过程。当肿瘤缺失Twa1多肽或蛋白质时，肿瘤的发生和发展将受到抑制或干扰。
本发明提供了一种对肿瘤的发生和发展具有促进作用的基因表达载体，所述的载体含有如前所述的Twa1基因的DNA序列。本发明所述的Twa1基因可插入到现有的原核或真核表达载体中，适宜的载体包括细菌质粒，慢病毒，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒等。所述的载体是一种小型环状DNA分子，能够在细胞内自主复制和转录表达，是基因工程中最常用的工具。本发明的所述的含有Twa1基因的表达载体可以用来转化适当细胞系或宿主菌，以使转基因细胞系或宿主菌表达Twa1多肽或蛋白质。以所述的Twa1多肽或蛋白质为抗原，制备出抗体。由于所述的抗体专一性地与Twa1多肽或蛋白质结合，可用于检测人体体液、血液、细胞、组织等临床样本中Twa1多肽或蛋白质的含量。所述检测的方法可以是现用的方法，如免疫组化、免疫印迹、免疫荧光、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)等。根据临床样本中Twa1多肽或蛋白质的含量高低，可表征提供该样本的患者是否患有肿瘤。若检测到临床样本中Twa1多肽或蛋白质含量高，表明该患者极大可能患有肿瘤。若检测到临床样本中Twa1多肽或蛋白质含量低，表明该患者极大可能未患有肿瘤。
本发明提供了一种转基因细胞系或宿主菌，所述的转基因细胞系或宿主菌含有如前所述的Twa1基因表达载体。本发明所述的含有Twa1基因的载体可以用来转化适当细胞系或宿主菌，所述的细胞系来自动物或植物细胞，例如昆虫细胞，哺乳动物细胞，所述的宿主菌可以是基因工程菌，例如大肠杆菌，酵母菌等，以使转基因细胞系或宿主菌表达Twa1多肽或蛋白质。
本发明提供了一种抗体，所述的抗体是由以下任意一种或几种多肽或蛋白质为抗原，或者根据以下任意一种或几种多肽或蛋白质的序列所制备出来的：
1)序列表中的SEQ ID NO.2的氨基酸序列；
2)将序列表中的SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和/或添加且与肿瘤相关的蛋白质；
所述的个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
3)与序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列具有90％以上同源性,且与肿瘤相关的多肽或蛋白质。
其中，如前所述的多肽或蛋白质是由人工合成或者是从如前所述的转基因细胞系或宿主菌中表达和纯化得到的。制备抗体的方法，可以是现有的方法，如免疫动物，培养杂交瘤等方法。所述的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，也可以是嵌合抗体、单链抗体、人源化的抗体、Fab片段，Fab表达文库的产物。所述的抗体可用于检测本发明所述的Twa1多肽或蛋白质的含量。由于所述抗体专一性地与Twa1多肽或蛋白质结合，可用于检测人体体液、血液、细胞、组织等临床样本中Twa1多肽或蛋白质的含量。所述检测的方法可以是现用的方法，如免疫组化、免疫印迹、免疫荧光、ELISA等。根据临床样本中Twa1多肽或蛋白质的含量，可表征提供该样本的患者是否患有肿瘤。若检测到临床样本中Twa1多肽或蛋白质的含量高，表明该患者极大可能患有肿瘤。若检测到临床样本中Twa1多肽或蛋白质含量低，表明该患者极大可能未患有肿瘤。
本发明提供了一种用于抑制或干扰基因表达的siRNA(small interfering RNA，小干扰 RNA)，所述的siRNA基于如前所述编码TWA1基因的DNA序列设计与合成，所述的siRNA 能够在细胞内抑制或干扰所述的Twa1基因的表达。siRNA通常是一段长21个核苷酸的 dsRNA(double-stranded RNA，双链RNA)，由一条核苷酸正义链和一条核苷酸反义链相互结合构成，主要参与细胞内的RNAi(RNA interfering，RNA干扰)过程。所述的核苷酸正义链和核苷酸反义链是互补配对的。RNAi是指在进化过程中高度保守的，由dsRNA诱发的同源mRNA(messenger RNA，信使RNA)特异性降解，最终抑制或干扰基因表达的现象。本发明所述的siRNA是基于所述Twa1基因的序列设计和合成的，所述的siRNA能够在细胞内以专一性的方式抑制或干扰所述的Twa1基因的表达。通过向肿瘤细胞中导入所述的siRNA，在肿瘤细胞中专一性地抑制或干扰所述的Twa1基因的表达，将有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展。作为主要的癌症治疗手段，传统的手术及放、化疗具有很强的非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时往往对正常细胞也具有损害作用，而以所述的siRNA为基础的基因治疗方法具有很高的专一性，仅针对肿瘤细胞中所述的Twa1基因进行干预，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。
本发明所提供的siRNA为人工合成，是由互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsRNA。所述的互补是指正义链和反应链中的核苷酸能够一一对应而结合的关系。在双链DNA或某些双链RNA分子结构中，由于核苷酸之间的氢键具有固定的数目和两条链之间的距离保持不变，使得核苷酸配对必须遵循一定的规律，这就是A(adenine，腺嘌呤) 一定与T(thymine，胸腺嘧啶)或RNA中的U(uracil，尿嘧啶)配对，G(guanine，鸟嘌呤)一定与C(cytosine，胞嘧啶)配对，反之亦然。
优选的，所述siRNA的序列是由以下任意一组互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsRNA：
1)正义链：5’-GGAGAAGUUUCGAAUGGAATT-3’；
反义链：5’-UUCCAUUCGAAACUUCUCCTT-3’。
2)正义链：5’-CAGCGGAGAAGUUUCGAAUTT-3’；
反义链：5’-AUUCGAAACUUCUCCGCUGTT-3’。
序列均由21个核苷酸组成，序列的方向从左至右为5’端至3’端，自5’端的1-19位为核糖核苷酸，5’端的20-21位为脱氧核糖核苷酸。
本发明所提供的siRNA能够在细胞内抑制或干扰Twa1基因的表达。通过向肿瘤细胞中导入所述的siRNA，在肿瘤细胞中专一性地抑制或干扰所述的Twa1基因的表达，将有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展。作为主要的癌症治疗手段，传统的手术及放、化疗具有很强的非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时往往对正常细胞也具有损害作用，而以所述的siRNA为基础的基因治疗方法具有很高的专一性，仅针对肿瘤细胞中所述的Twa1基因进行干预，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。
本发明提供了一种用于抑制或干扰基因表达的shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA) 表达载体，所述的表达载体能够在细胞内表达shRNA，所述的shRNA基于如前所述编码 TWA1基因的DNA序列设计与合成，所述的shRNA表达载体能够在细胞内抑制或干扰所述的Twa1基因的表达。所述的shRNA表达载体是将合成好的所述shRNA序列片段插入到现有的真核表达载体中，该表达载体能够在细胞内表达所述的shRNA，并在细胞内通过 RNAi抑制或干扰所述的Twa1基因的表达。所述的shRNA是基于所述Twa1基因的序列设计和合成的，所述的shRNA以专一性的方式抑制或干扰所述Twa1基因的表达。通过向肿瘤细胞中导入所述的shRNA表达载体，所述的shRNA表达载体能够在细胞内表达所述的 shRNA，专一性地抑制或干扰所述Twa1基因的表达，将有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展。作为主要的癌症治疗手段，传统的手术及放、化疗具有很强的非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时往往对正常细胞也具有损害作用，而以所述的shRNA表达载体为基础的基因治疗方法具有很高的专一性，仅针对肿瘤细胞中所述的Twa1基因进行干预，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。
本发明所提供的shRNA是由互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsRNA。所述的互补是指正义链和反应链中的核苷酸能够一一对应而结合的关系。在双链DNA或某些双链RNA分子结构中，由于核苷酸之间的氢键具有固定的数目和两条链之间的距离保持不变，使得核苷酸配对必须遵循一定的规律，这就是A(adenine，腺嘌呤)一定与T(thymine，胸腺嘧啶)或RNA中的U(uracil，尿嘧啶)配对，G(guanine，鸟嘌呤)一定与C(cytosine，胞嘧啶)配对，反之亦然。
优选的，所述shRNA的序列是由以下任意一组互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsDNA(double-stranded DNA，双链DNA)：
1)正义链：
5’-GGGAGAAGTTTCGAATGGAATTCAAGAGATTCCATTCGAAACTTCTCCCTTTTT-3’；
反义链：
5’-AAAAAAGGGAGAAGTTTCGAATGGAATCTCTTGAATTCCATTCGAAACTTCTCCC-3’；
2)正义链：
5’-GCAGCGGAGAAGTTTCGAATTTCAAGAGAATTCGAAACTTCTCCGCTGCTTTTT-3’；
反义链：
5’-AAAAAAGCAGCGGAGAAGTTTCGAATTCTCTTGAAATTCGAAACTTCTCCGCT GC-3’。
正义链序列由54个脱氧核糖核苷酸组成，反义链序列由55个脱氧核糖核苷酸组成，序列的方向从左至右为5’端至3’端。
所述的shRNA表达载体能够在细胞内抑制或干扰Twa1基因的表达。通过向肿瘤细胞中导入所述的shRNA表达载体，所述的shRNA表达载体能够在细胞内表达所述的shRNA，专一性地抑制或干扰所述Twa1基因的表达，将有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展。作为主要的癌症治疗手段，传统的手术及放、化疗具有很强的非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时往往对正常细胞也具有损害作用，而以所述的shRNA表达载体为基础的基因治疗方法具有很高的专一性，仅针对肿瘤细胞中所述的Twa1基因进行干预，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。
本发明提供了一种用于敲除基因的sgRNA(small guide RNA，小向导RNA)表达载体，所述的sgRNA表达载体能够在细胞内表达sgRNA，所述的sgRNA基于如前所述编码TWA1基因的DNA序列设计与合成，所述的sgRNA表达载体能够在细胞内敲除所述的Twa1基因；优选的，所述的sgRNA表达载体在细胞内与基因编辑系统作用，敲除所述的Twa1基因；优选的，所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统。所述的sgRNA表达载体是将合成好的所述sgRNA序列片段插入到现有的真核表达载体中，该表达载体能够在细胞内表达所述的 sgRNA，并在细胞内与基因编辑系统作用，敲除所述的Twa1基因，从而完全抑制或干扰所述Twa1基因的表达。所述的基因编辑系统是指能够对所述的Twa1基因进行编辑，实现对所述Twa1基因的敲除、修改、或定点插入新的DNA片段的核酸或蛋白质工具。所述的敲除是指一种遗传工程技术，针对所述Twa1基因的DNA序列，将所述Twa1基因的部分DNA 去除，进而导致所述Twa1基因的功能丧失。所述的修改是指一种遗传工程技术，针对所述 Twa1基因的DNA序列，将所述Twa1基因的部分DNA用另一段DNA片段置换，进而导致所述Twa1基因的功能改变。所述的插入是指一种遗传工程技术，针对所述Twa1基因的 DNA序列，将另一段DNA片段插入到所述Twa1基因的DNA中，进而导致所述Twa1基因的功能改变。所述的sgRNA是基于所述Twa1基因的序列设计和合成的，所述的sgRNA 在细胞内与基因编辑系统作用，以专一性的方式敲除所述的Twa1基因。通过向肿瘤细胞中导入所述的sgRNA表达载体，所述的sgRNA表达载体能够在细胞内表达所述的sgRNA，所述的sgRNA在细胞内与基因编辑系统作用，专一性地敲除所述的Twa1基因，将有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展。作为主要的癌症治疗手段，传统的手术及放、化疗具有很强的非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时往往对正常细胞也具有损害作用，而以所述的sgRNA 表达载体为基础的基因治疗方法具有很高的专一性，仅针对肿瘤细胞中所述的Twa1基因进行干预，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。
本发明所提供的sgRNA是由互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsRNA。所述的互补是指正义链和反应链中的核苷酸能够一一对应而结合的关系。在双链DNA或某些双链RNA分子结构中，由于核苷酸之间的氢键具有固定的数目和两条链之间的距离保持不变，使得核苷酸配对必须遵循一定的规律，这就是A(adenine，腺嘌呤)一定与T(thymine，胸腺嘧啶)或RNA中的U(uracil，尿嘧啶)配对，G(guanine，鸟嘌呤)一定与C(cytosine，胞嘧啶)配对，反之亦然。
优选的，所述sgRNA的序列是由以下互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的 dsDNA：
正义链：5’-GAGAGCAGACATGAACCGCC-3’；
反义链：5’-GGCGGTTCATGTCTGCTCTC-3’。
序列均由20个脱氧核糖核苷酸组成，序列的方向从左至右为5’端至3’端。
所述的sgRNA表达载体能够敲除Twa1基因；优选的，所述的sgRNA表达载体在细胞内与基因编辑系统作用，敲除Twa1基因；优选的，所述的基因编辑系统选自CRISPR/Cas9 系统或其他能够对目标基因或基因组位点进行编辑，实现对特定DNA片段的敲除、修改、或定点插入新的DNA片段的核酸或蛋白质工具。通过向肿瘤细胞中导入所述的sgRNA表达载体，所述的sgRNA表达载体能够在细胞内表达所述的sgRNA，所述的sgRNA在细胞内与基因编辑系统作用，专一性地敲除所述的Twa1基因，将有效地抑制或干扰肿瘤的发生和发展。作为主要的癌症治疗手段，传统的手术及放、化疗具有很强的非特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时往往对正常细胞也具有损害作用，而以所述的sgRNA表达载体为基础的基因治疗方法具有很高的专一性，仅针对肿瘤细胞中所述的Twa1基因进行干预，极大地降低了对正常细胞的伤害，提高了基因治疗的精准性。
本发明提供了一种蛋白质复合物。蛋白质复合物是指有两个以上功能相关的蛋白质通过相互作用所形成的复合体。本发明所述的蛋白质复合物包含β-catenin蛋白质和Twa1多肽或蛋白质，所述的Twa1多肽或蛋白质促进β-catenin蛋白质在细胞核中累积，从而进一步促进肿瘤细胞增殖。所述细胞增殖是细胞的重要生命特征，指一个细胞通过细胞分裂的方式，将复制后的遗传物质，平均地分配到两个子细胞，并形成两个子细胞的过程。正常细胞的增殖是受到机体严格调控的。而肿瘤细胞增殖是指肿瘤细胞由于基因突变，逃离了机体的正常调控，自主地不断分裂形成子细胞的过程。
本发明提供了一种抑制或干扰肿瘤细胞生长的方法。本发明所述的方法是向肿瘤细胞中导入特定的核酸，从而抑制或干扰肿瘤细胞生长。所述肿瘤细胞生长是肿瘤细胞由于基因突变，逃离了机体的正常调控，不断增殖形成肿瘤，或者转移至其他器官，继续增殖形成肿瘤的过程。如实施例8所示，以结直肠癌细胞为例，在结直肠癌细胞中敲低Twa1会抑制或干扰结直肠癌细胞的增殖和成瘤能力。如实施例11和实施例12所示，以胃癌细胞为例，在胃癌细胞中过表达Twa1会促进细胞的迁移和侵袭，在胃癌细胞中敲除Twa1会抑制或干扰细胞的迁移和侵袭。
进一步地，所述特定的核酸选自如前所述的siRNA、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体。
进一步地，所述特定的核酸在细胞内抑制或干扰如前所述的Twa1基因的表达或敲除如前所述的Twa1基因，进而抑制或干扰肿瘤细胞生长。
进一步地，所述特定的核酸在细胞内抑制或干扰如前所述的Twa1基因的表达或敲除如前所述的Twa1基因，进而抑制或干扰如前所述的蛋白质复合物的形成，最终抑制或干扰肿瘤细胞生长。
本发明提供了一种抑制或干扰肿瘤细胞增殖的方法。本发明所述的方法是向肿瘤细胞中导入特定的核酸，从而抑制或干扰肿瘤细胞增殖。如实施例8所示，以结直肠癌细胞为例，在结直肠癌细胞中敲低Twa1会抑制或干扰结直肠癌细胞的增殖和成瘤能力。
进一步地，所述特定的核酸选自如前所述的siRNA、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体。
进一步地，所述特定的核酸在细胞内抑制或干扰如前所述的Twa1基因的表达或敲除如前所述的Twa1基因，进而抑制或干扰肿瘤细胞增殖。
进一步地，所述特定的核酸在细胞内抑制或干扰如前所述的Twa1基因的表达或敲除如前所述的Twa1基因，进而抑制或干扰如前所述的蛋白质复合物的形成，最终抑制或干扰肿瘤细胞增殖。
本发明提供了一种抑制或干扰肿瘤细胞迁移或侵袭的方法。本发明所述的方法是向肿瘤细胞中导入特定的核酸，从而抑制或干扰肿瘤细胞迁移和侵袭。所述的肿瘤细胞迁移是指肿瘤细胞由其原发部位侵入淋巴管、血管或体腔部位，肿瘤细胞被血流、淋巴流带到另一部位或器官继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。所述的肿瘤细胞的侵袭是指恶性肿瘤从原发瘤或继发瘤向邻近的宿主组织侵犯或占领。如实施例11和实施例12所示，以胃癌细胞为例，在胃癌细胞中过表达Twa1会促进细胞的迁移和侵袭，在胃癌细胞中敲除Twa1会抑制细胞的迁移和侵袭。
进一步地，所述特定的核酸选自如前所述的siRNA、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体。
进一步地，所述特定的核酸在细胞内抑制或干扰如前所述的Twa1基因的表达或敲除如前所述的Twa1基因，进而抑制或干扰肿瘤细胞的迁移和侵袭。
进一步地，所述特定的核酸在细胞内抑制或干扰如前所述的Twa1基因的表达或敲除如前所述的Twa1基因，进而抑制或干扰如前所述的蛋白质复合物的形成，最终抑制或干扰肿瘤细胞迁移和侵袭。
如下述实施例13所示，以胃癌细胞为例，在胃癌细胞中敲除Twa1会使细胞发生间质上皮转化，因此Twa1能促进细胞上皮间质转化(EMT)，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。所述的EMT是指上皮到间质细胞的转化，它赋予细胞转移和入侵的能力，包括干细胞特征、减少凋亡与衰老，和促进免疫抑制，不仅在发育过程中起着关键的作用，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。
本发明提供了如前所述任何一种抑制或干扰肿瘤细胞生长的方法在制备或筛选抗肿瘤药物的用途。
本发明提供了如前所述任何一种抑制或干扰肿瘤细胞增殖的方法在制备或筛选抗肿瘤药物的用途。
本发明提供了如前所述任何一种抑制或干扰肿瘤细胞迁移或侵袭的方法在制备或筛选抗肿瘤药物的用途。
所述的抗肿瘤药物可以是细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、抗体药物、细胞分化诱导剂、细胞凋亡诱导剂、新生血管生成抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、基因治疗药物、瘤苗等。优选的，所述的抗肿瘤药物选自抗肿瘤小分子药物、抗肿瘤小分子药物组合物。
本发明还提供了如前所述编码TWA1基因的DNA序列、如前所述的Twa1多肽或蛋白质、如前所述的siRNA、如前所述的抗体、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA 表达载体、如前所述的蛋白质复合物在制备或筛选抗肿瘤药物的用途。优选的，所述的用途包括将如前所述的siRNA、如前所述的shRNA表达载体、或如前所述的sgRNA表达载体制备成抗肿瘤药物，导入至肿瘤细胞中，专一性地抑制或干扰肿瘤细胞中的Twa1基因、Twa1 多肽或蛋白质、或如前所述的蛋白质复合物，进而抑制或干扰肿瘤细胞生长、增殖、迁移或侵袭；优选的，所述的用途包括以如前所述的蛋白质复合物为靶标，制备和筛选出能够抑制或干扰所述蛋白质复合物形成的小分子药物或小分子药物组合物，导入至肿瘤细胞中，专一性地抑制或干扰肿瘤细胞中的所述蛋白质复合物的形成，进而抑制或干扰肿瘤细胞生长、增殖、迁移或侵袭。优选的，所述的用途包括以如前所述的Twa1基因、Twa1多肽或蛋白质为靶标，制备和筛选出能够抑制或干扰所述Twa1基因、Twa1多肽或蛋白质形成的小分子药物或小分子药物组合物，导入至肿瘤细胞中，专一性地抑制或干扰肿瘤细胞中的所述Twa1 基因、Twa1多肽或蛋白质的形成，进而抑制或干扰肿瘤细胞生长、增殖、迁移或侵袭。
本发明提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物包含选自本发明提供了如前所述编码 TWA1基因的DNA序列、如前所述的Twa1多肽或蛋白质、如前所述的siRNA、如前所述的抗体、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体、如前所述的蛋白质复合物中的任意一种或任意多种，以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。所述载体包括药学领域的常规稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂等，必要时还可以加入香味剂，甜味剂等。本发明药物可以制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液及注射用药等多种形式，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。优选的，所述的抗肿瘤药物选自细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、抗体药物、细胞分化诱导剂、细胞凋亡诱导剂、新生血管生成抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、基因治疗药物、瘤苗；更优选的，所述的抗肿瘤药物选自抗肿瘤小分子药物、抗肿瘤小分子药物组合物。
本发明提供了本发明提供了如前所述的编码TWA1基因的DNA序列、如前所述的Twa1 多肽或蛋白质、如前所述的siRNA、如前所述的抗体、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体、如前所述的蛋白质复合物在制备肿瘤检测试剂盒中的用途。所述的肿瘤检测试剂盒是指根据人体体液、血液、细胞、组织等反映人体健康状况的物质作出是否患有肿瘤的定性、定量检测的工具。所述的试剂盒包括但不限于PCR(polymerase chainreaction，聚合酶链式反应)试剂盒，ELISA试剂盒，基因芯片和蛋白质芯片等。
本发明提供了一种肿瘤检测试剂盒，所述的试剂盒包含选自本发明提供了如前所述的 Twa1基因、如前所述的Twa1多肽或蛋白质、如前所述的siRNA、如前所述的抗体、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体、如前所述的蛋白质复合物在制备或筛选抗肿瘤药物的用途中的任意一种或任意多种。
本发明提供了如前所述编码TWA1基因的DNA序列、如前所述的Twa1多肽或蛋白质、如前所述的siRNA、如前所述的抗体、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体、如前所述的蛋白质复合物在药物筛选模型中的用途。
本发明提供了一种药物筛选模型，以如前所述编码TWA1基因的DNA序列、如前所述的Twa1多肽或蛋白质、如前所述的siRNA、如前所述的抗体、如前所述的shRNA表达载体、如前所述的sgRNA表达载体、如前所述的蛋白质复合物中的任意一种或任意多种作为靶标建立的药物筛选模型，筛选出可以抑制或干扰Twa1表达的药物。所述的药物筛选指的是采用适当的方法，对可能作为药物使用的物质进行生物活性、药理作用及药用价值的评估过程。药物筛选可以是分子水平，也可以是细胞水平。所述的抑制或干扰表达的药物可以是细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、抗体药物、细胞分化诱导剂、细胞凋亡诱导剂、新生血管生成抑制剂、表皮生长因子受体抑制剂、基因治疗药物、瘤苗等。
本发明还提供一种诊断肿瘤的方法，其特征在于，测量所述的TWA1基因或如前所述的 Twa1多肽或蛋白质在人体组织的表达，表达上调意味着肿瘤机率的增加。
附图说明
图1显示了Twa1在人类结直肠癌组织中表达上调的结果。图1中的A图显示了在70例结直肠癌组织(T)和12例正常对照(N)组织中的差异表达的基因，源数据来自癌症公共数据库Oncomine的Hong芯片数据集。图1中的B图显示了Twa1基因在结直肠癌组织及其配对的癌旁对照组织中的表达情况，源数据来自癌症公共数据库TCGA(The Cancer GenomeAtlas，癌症全基因组图谱)的结直肠癌RNA测序数据集。图1中的C图显示了Twa1 的在结直肠癌组织中及其配对的癌旁对照组织中的相对表达情况，源数据来自浙江大学第二附属医院收集的临床组织样本。图1中的D图为利用免疫印迹实验检测Twa1多肽或蛋白质在结直肠癌组织和相应的癌旁对照组织中的表达情况。图1中的E图为图1中的D图的统计图。
图2显示了利用两种不同靶点的Twa1的shRNA(sh-Twa1和sh-Twa1-2)均可有效下调HEK-293细胞中Twa1多肽或蛋白质的结果。
图3显示了Twa1特异性参与调控Wnt信号通路的结果。图3中的A图为利用Twa1的shRNA在HEK-293细胞中下调Twa1多肽或蛋白质的效率。图3中的B图为应用双荧光素酶报告基因实验检测下调Twa1对经典Wnt信号通路的影响。图3中的C图为检测下调Twa1 对Hedgehog信号通路的影响。图3中的D图为检测下调Twa1对TNF-α信号通路的影响。图3中的E图为检测下调Twa1对钙信号通路的影响。图3中的F图为检测下调Twa1对TGF-β通路的影响。图3中的G图为检测下调Twa1对MAPK信号通路的影响。图3中的H图为检测下调Twa1对JAK/STAT信号通路的影响。图3中的I图为检测下调Twa1对Hippo信号通路的影响。
图4显示了Twa1促进β-catenin核内积累和Wnt靶基因的表达的结果。图4中的A图为下调Twa1对Wnt3a条件型培养基诱导的双荧光素酶报告基因活性的影响。图4中的B 图为下调Twa1对Wnt靶基因的表达的影响。图4中的C图为下调Twa1对双荧光素酶报告基因活性的影响。图4中的D图为下调Twa1对Wnt靶基因的表达的影响。图4中的E图为分别提取各组细胞的细胞质与细胞核组分，并应用免疫印迹实验检测β-catenin和Twa1 在各组分中的蛋白质表达水平的结果。图4中的F图为利用免疫荧光实验检测β-catenin在细胞核中的定位。图4中的G图为图4中的F图的统计图。图4中的H图为利用免疫共沉淀实验检测β-catenin与TCF4的相互作用。图4中的I图为利用免疫印迹实验检测β-catenin 下调对Wnt3a诱导的Twa1核内累积的影响。
图5为敲除Twa1抑制β-catenin核内积累和Wnt信号通路的结果。图5中的A图为CRISPR/Cas9系统引起的Twa1基因的插入/缺失序列图。图5中的B图显示了提取野生型细胞(WT)和Twa1基因敲除的HEK-293细胞(KO-1和KO-2)的基因组DNA，并进行 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的结果。图5中的C图显示了对野生型细胞和Twa1基因敲除的 HEK-293细胞进行免疫印迹分析的结果。图5中的D图为检测敲除Twa1对双荧光素酶报告活性的影响。图5中的E图为检测敲除Twa1对Wnt靶基因表达的影响。图5中的F图为利用免疫印迹实验检测敲除Twa1对β-catenin的核内积累的影响。图5中的G图为应用免疫荧光实验检测敲除Twa1对β-catenin的核内定位的影响。图5中的H图为应用免疫共沉淀实验检测敲除Twa1对β-catenin与TCF4相互作用的影响。
图6显示了Twa1通过结合β-catenin进而促进β-catenin核内累积的结果。图6中的A 图显示了利用GST沉降实验分析纯化后的His-β-catenin蛋白质与野生型GST-Twa1或GST-Twa1突变体蛋白质之间的相互作用的结果。图6中的B图显示了在HEK-293细胞中转染图中所示的各个质粒，随后进行免疫共沉淀和免疫印迹实验的结果。图6中的C图为免疫荧光实验结果。图6中的D图为免疫印迹实验结果。图6中的E图为双荧光素酶报告基因实验结果。图6中的F图为检测Wnt靶基因表达的结果。图6中的G图为应用免疫荧光实验检测转染带有核定位信号序列(NLS)的野生型Twa1或Twa1突变体对β-catenin的核内累积的影响的结果。图6中的H图为免疫荧光实验结果。图6中的I图为双荧光素酶报告基因实验的结果。图6中的J图为检测Wnt靶基因表达的实验结果。
图7显示了Twa1促进结直肠癌细胞的β-catenin核内累积和Wnt信号通路的结果。图7 中的A图为利用免疫印迹实验，检测DLD-1细胞中的β-catenin核内水平的结果。图7中的 B图为检测DLD-1细胞中的双荧光素酶报告基因活性的实验结果。图7中的C图为检测DLD-1细胞中的Wnt靶基因表达的实验结果。图7中的D图为利用免疫印迹实验，检测 SW480细胞中的β-catenin核内水平的结果。图7中的E图为检测SW480细胞中的双荧光素酶报告基因活性的实验结果。图7中的F图为检测SW480细胞中的Wnt靶基因表达的实验结果。
图8显示了Twa1促进结直肠癌细胞的生长和成瘤能力的结果。图8中的A图为利用MTT实验检测DLD1细胞增殖的结果。图8中的B图为DLD1细胞克隆形成实验的结果。图8中的C图为利用MTT实验检测SW480细胞增殖的结果。图8中的D图为SW480细胞克隆形成实验的结果。图8中的E图为小鼠皮下接种肿瘤细胞第28天后，解剖出的肿瘤拍照图。图8中的F图为肿瘤生长曲线图。
图9显示了Twa1的核内表达水平与结直肠癌细胞增殖以及结直肠癌患者的预后之间的相关性分析。图9中的A图显示了利用免疫印迹实验检测Twa1和β-catenin在结直肠癌组织及其匹配的癌旁对照组织中的表达水平的结果。图9中的B图为图9中的A图中Twa1 的核内表达水平的定量分析图。图9中的C图显示了应用线性回归法分析核内Twa1表达水平和β-catenin表达水平之间的相关性的结果。图9中的D图为Kaplan-Meier生存曲线图，显示了Twa1的表达水平与患者五年生存率的相关性的结果。
图10显示了Twa1在人类胃癌组织中表达上调的结果。图10中的A图显示了在39例结直肠癌组织(T)和30例正常对照(N)组织中的差异表达的基因，源数据来自癌症公共数据库Oncomine数据库。图10中的B图显示了388例结直肠癌组织(T)和35例正常对照(N)组织中的差异表达的基因，源数据来自癌症公共数据库TCGA数据库。图10中的 C图显示了胃癌组织中Twa1的mRNA表达量与胃癌病人预后的相关性，源数据来自癌症公共数据库Oncomine的GSE57303数据集。图10中的D图为利用免疫印迹实验检测Twa1 多肽或蛋白质在胃癌组织和相应的癌旁对照组织中的表达情况，源数据来自于浙江省肿瘤医院收集的临床组织样本。图10中的E图为利用qRT-PCR检测Twa1的mRNA在胃癌组织和相应的癌旁对照组中的表达情况的统计图，源数据来自于浙江省肿瘤医院收集的临床组织样本。图10中的F图为图10中的D图的统计图。
图11显示的是敲除Twa1抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力的结果。图11的A图为利用免疫印迹实验检测六株胃癌细胞系中Twa1多肽或蛋白质的表达情况，并与胃癌组织样本的表达情况比较。图11的B图为CRISPR/Cas9系统引起的BGC细胞株中Twa1基因的插入/ 缺失序列图。图11中的C图显示了对野生型和Twa1基因敲除型的BGC细胞进行免疫印迹分析的结果。图1中的D图为利用Transwell实验检测Twa1敲除对BGC细胞株迁移和侵袭能力的影响。图11中的E图为图11中D图的统计图。
图12显示的是过表达Twa1增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力的结果。图12的A图显示了对野生型和Twa1过表达型的AGS细胞和SGC细胞进行免疫印记分析的结果。图12中的B图为利用Transwell实验检测Twa1过表达对AGS细胞株迁移和侵袭能力的影响。图 12中的C图为利用Transwell实验检测Twa1过表达对SGC细胞株迁移和侵袭能力的影响。图12中的D图为图12中的B图的统计图。图12中的E图为图12中的C图的统计图。
图13显示的是敲除Twa1使胃癌细胞发生间质上皮转换(MET)的结果。图13中的A图显示的是对野生型和Twa1基因敲除型的BGC细胞进行免疫印迹分析的结果，E-cadherin和Cytokeratin 8是上皮细胞的标志蛋白质，N-cadherin和Vimentin是间质细胞的标志蛋白质。图13中的B图是野生型和Twa1基因敲除型的BGC细胞的细胞形态。
图14显示的是Twa1在人类膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、支气管腺瘤和甲状腺癌组织中表达上调的结果，源数据来自癌症公共数据库TCGA的10种肿瘤RNA测序数据集。
图15显示的是Twa1的表达水平与人类胸膜癌、食管癌和肾癌患者临床病理特征的相关性分析的结果。结果显示Twa1的高表达与肿瘤转移密切相关(P<0.05),源数据来自癌症公共数据库TCGA的胸膜癌、食管癌和肾癌病理信息数据集。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了系统说明本发明所述Twa1基因的生物学功能，以结直肠癌和胃癌为例，详细说明所述Twa1基因在肿瘤的发生和发展中的作用。
本发明所用的共106对经临床手术取出的结直肠癌组织及其配对的癌旁对照组织来自于浙江省肿瘤医院和浙江大学第二附属医院。其中，60对来自于浙江省肿瘤医院，46对来自于浙江大学第二附属医院。本发明所用的共80对经临床手术取出的胃癌组织及其配对的的癌旁对照组织来自于浙江省肿瘤医院。所有结直肠癌组织样本和胃癌组织样本的取材和实验均获得浙江大学医学院伦理委员会的批准。临床病理资料由上述医院提供，由至少两名专业病理学家对患者的临床病理特征进行独立评估。
实施例1，Twa1在人类结直肠癌组织中的表达显著上调。
1.1为了筛查结直肠癌组织中差异表达的基因，选取癌症公共数据库Oncomine中的 Hong结直肠癌组织基因表达芯片数据集(GSE9348，http://www.oncomine.org)进行生物信息学分析。该数据使用Affymetrix U133Plus 2.0基因芯片(Affymetrix公司，美国)，共检测了70例结直肠癌组织和12例正常对照组织的基因表达情况，并使用强健多阵列平均算法进行标准化数据。利用R语言的Limma软件包筛查差异表达的基因。应用线性模型和Empirical Bayes(经验贝叶斯)算法分析数据，使用Benjiamini和Hochberg提出的FDR(假阳性率)算法评判概率P值的准确性。将被认为是差异表达的基因的阈值设定为：倍数>2， P<0.01，FDR<0.01。结果如图1中的A图显示，许多已知与结直肠癌发生和发展相关的基因在结直肠癌组织中表达上调，分别为CXCL1,chemokine(C-X-C motif)ligand 1；DNMT1, DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 1；FOXQ1,fork-head box Q1；LGR5,leucine-richrepeat containing G protein-coupled receptor 5，这表明该基因筛选方法是合理有效的。意外的是，结果如图1中的A图显示，一个之前功能未知的基因Twa1在结直肠癌组织中高表达。同时，进一步分析了TCGA(The Cancer Genome Atlas，癌症全基因组图谱)数据库(http://cancergenome.nih.gov)中的结直肠癌组织的RNA测序数据。该数据库中共纳入了49对结直肠癌组织及其配对的癌旁对照组织样本。结果如图1中的B图显示Twa1的mRNA 在结直肠癌组织中表达上调。图中每个点代表经log2转化后的Twa1基因相对内参基因TBP(TATA结合蛋白质)的表达水平。横坐标的N表示的是癌旁对照组织，T表示的是肿瘤组织。纵坐标表示的是经log2转化后的Twa1基因相对内参基因TBP的表达水平。黑色水平线显示的是中位值±标准差。P＜0.0001，Student’s t检验。
1.2为进一步确认Twa1基因在结直肠癌组织中表达上升，检测了Twa1的mRNA在32对配对的结直肠癌组织样本中的表达情况，该样本来自于上述的浙江大学第二附属医院。首先提取各个组织样本的总RNA，具体步骤如下：
(1)取约500mg的组织，切碎后放置于1.5ml离心管内，加入1mlTrizolReagent(Invitrogene)，在组织破碎仪中进行震荡匀浆。
(2)加20μl氯仿，剧烈摇晃15秒，室温静置5分钟。
(3)4℃，12000g离心15分钟。
(4)小心将上层水相转移至新的1.5ml离心管中。
(5)加入与上清液等体积的异丙醇，混匀后室温静置10分钟。
(6)4℃，12000g离心10分钟。
(7)弃上清，用75％乙醇洗涤1次。4℃，12000g离心5分钟。
(8)弃上清，在通风橱中室温干燥，将沉淀溶于适量无核酸酶的DEPC水中。
(9)用紫外分光光度计测量总RNA的浓度，并吸取1μl样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察抽提的总RNA质量，保存于-80℃冰箱。
随后，将提取的RNA分别逆转录合成cDNA，具体步骤如下：
(1)在0.2ml无核酸酶的离心管中先后加入以下试剂：
成份 用量
RNA模板(5μg) 9μl
Oligod(T)引物(0.5μg/μl) 1μl
(2)混匀，70℃作用10分钟，冰浴2分钟，加入以下试剂：
成份 用量
5×反应缓冲液 5μl
dNTP混合物(2.5mM) 5μl
逆转录酶 1μl
RNasin 1μl
DEPC处理后的ddH<sub>2</sub>O 补齐至25μl
(3)混匀，42℃作用1小时，72℃作用10分钟后终止反应，合成的cDNA保存于-20℃。
接着，参照NCBI数据库中人Twa1基因和人核小RNA U6基因序列，按照引物设计原则设计引物，并对所设计的引物进行评价和筛选，从中选择扩增这两个基因片段的引物，具体引物序列见下表：
实时荧光定量PCR用的引物
Figure GDA0002004871100000131
为保证实验的稳定性和可靠性，实验中选用日本Takara公司的SYBR GREEN RT-PCR 试剂盒。实时荧光定量PCR采用优化好的条件以cDNA产物为模板进行实时荧光定量PCR。其反应体系包括：
Figure GDA0002004871100000132
Figure GDA0002004871100000141
扩增条件：95℃预变性30秒，95℃变性15秒，60℃延伸30秒，40个循环。
每个样品做三个平行样，按照上述的方法进行实时定量PCR，实时定量PCR仪将根据标准曲线自动读出各个样品的Ct值，从而计算出每个样品的拷贝数，再对两个样品的定量结果取平均值，分别把各个样品基因拷贝数分别以核小RNA U6作为内参基因进行比较。
实验结果如图1中的C图显示Twa1的mRNA在结直肠癌组织中的表达显著上调。图中每个点代表经log2转化后的Twa1基因相对内参基因核小RNA(snRNA)U6的表达水平。横坐标的N表示的是癌旁对照组织，T表示的是肿瘤组织。纵坐标表示的是经log2转化后的Twa1基因相对内参基因核小RNAU6的表达水平。黑色水平线显示的是中位值±标准差。 P＜0.0001，Student’s t检验。
1.3进一步提取结直肠癌组织和癌旁对照组织的总蛋白质，检测Twa1在结直肠癌组织中的蛋白质表达水平。具体实验方法如下：
分别取约500mg的组织，用预冷的1×PBS缓冲液清洗一次，于冰上切碎，然后加入适量的RIPA裂解液，在组织破碎仪中震荡匀浆。4℃，12000g离心30分钟，收集上清，并使用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白质定量。加入4×SDS上样缓冲液，混匀并煮沸10分钟使蛋白质变性，-20℃保存。
接着，应用免疫印迹(Western blotting)实验检测Twa1多肽或蛋白质在各个组织中的表达水平，具体实验步骤如下：
1.3.1蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶制备和电泳分离
(1)配制10％分离胶；
(2)灌注制胶系统并预留灌注浓缩胶所需的空间(梳齿长1cm)；室温，静置30分钟待分离胶凝固；
(3)制备5％浓缩胶；
(4)小心插入干净的梳子，避免产生气泡；室温景致，30分钟后小心拔出梳子，把凝胶固定在电泳装置上，槽内加入Tris甘氨酸电泳缓冲液；使用注射器针头洗去未聚合的丙稀酰胺；
(5)将已经制备好的蛋白质样品于95℃，加热5分钟；
(6)按照预定程序加样，上样量根据梳孔体积和实验目的而定；
(7)开启电泳槽电源，起始电压50V，待溴酚蓝前沿进入分离胶后，加大电压至100V，待溴酚蓝达到分离胶底部边缘，即关闭电源，停止电泳；
(8)电泳完成后，拆卸凝胶夹层，标明方位。
1.3.2转膜
(1)膜的准备
PVDF膜在甲醇中充分浸泡15秒使之活化。将500ml预冷的转膜缓冲液倒入较大的托盘中，把两块海绵、六块与膜等大的滤纸和已经浸泡好的PVDF膜放入托盘中，充分的浸泡；
(2)胶的准备
将玻璃板轻轻撬开，移去玻璃板，去除浓缩胶，根据所需目的蛋白质的位置切胶；
(3)装入转膜仪器
打开转膜夹子开，使黑的一面保持水平。在上面垫一张纤维垫，用玻棒赶走里面的气泡。然后，在垫子上垫三层滤纸。小心将切好的分离胶盖于滤纸上，调整位置，使其与滤纸对齐。接着，将膜盖于胶上，盖满整个胶(不能有气泡)；在膜上再盖三层滤纸；最后盖上另一个海绵垫。(按照：夹子黑面－纤维垫－3张滤纸－凝胶－膜－3张滤纸－纤维垫－夹子白面的顺序排列。整个操作过程中，需不断赶去气泡)；
(4)转膜仪器入电泳槽进行转膜
将夹子放入转膜槽中，使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。加入转膜缓冲液至能够没过夹子，100V，冰浴，转膜100分钟；
1.3.3封闭
转膜结束后将PVDF膜用1×TBS轻轻漂洗，于5％BSA中室温摇床慢摇，封闭1小时；
1.3.4抗体孵育
(1)一抗孵育
按照抗体说明书用封闭液(5％BSA)稀释相应抗体，室温孵育一小时后，4℃冰箱孵育过夜；次日室温再孵育半小时。
(2)1×TBST洗膜
摇床上快速洗涤，10分钟×3次；
(3)二抗孵育
抗体稀释液(5％BSA)1:5000稀释荧光二抗，室温摇床慢摇，避光孵育1小时；
(4)1×TBST洗膜
摇床上快速洗涤，10分钟×3次；
1.3.5结果扫描
使用Odyssey荧光扫描系统，选择适当的扫描强度，扫描目标蛋白质所发的荧光。
Twa1抗体购于中国武汉三鹰公司，GAPDH抗体购于美国Sigma公司，荧光二抗购于美国LICOR公司。结果如图1中的D图显示Twa1多肽或蛋白质在结直肠癌组织中表达上调。N表示癌旁对照组织，T表示结直肠癌组织。Actin(肌动蛋白)为内参蛋白质，表示用于配对比较的N和T的总蛋白质量，若Actin条带灰度一致，表示N和T中的总蛋白质量是一致的。内参蛋白质就是内部参照蛋白质，一般是指管家基因编码表达的蛋白质，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白质的表达水平变化时常用它来做参照。利用Westernblotting实验比较不同条件下或者不同组织细胞中，目的蛋白质表达量的相对多少，前提条件是等量的组织细胞蛋白质上样，才有比较的基础，特别是表达量不高时，上样量的的差别就很有可能影响结果的分析。因此，在Western blotting试验中，进行内参的检测，可以校正蛋白质定量、上样过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。图1中的E 图为图1中的D图的定量统计图，Twa1条带的灰度由Image J软件(NIH，美国国立卫生研究院)量化和标准化。纵坐标表示的是经log2转化后的Twa1多肽或蛋白质相对内参actin 蛋白质的表达水平。P＜0.01，Student’s t检验。
以上结果表明，Twa1是一个在结直肠癌组织中高表达的基因，可能与结直肠癌发生和发展相关。
实施例2，构建用于抑制或干扰Twa1基因表达的载体和慢病毒。具体步骤如下：
(1)根据NCBI中人类Twa1mRNA序列，针对该序列设计两个不同的shRNA靶点，并合成相应的核苷酸正义链和反义链(上海生工)，共设计与合成了两条shRNA序列，所述 shRNA的序列是由以下任意一组互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsDNA：
1)正义链：
5’-GTTCCATTCGAAACTTCTCCTTCAAGAGAGGAGAAGTTTCGAATGGAACTTTTT -3’；
反义链：
5’-AAAAAAGTTCCATTCGAAACTTCTCCTCTCTTGAAGGAGAAGTTTCGAATGGAAC-3’；
2)正义链：
5’-GATTCGAAACTTCTCCGCTGTTCAAGAGACAGCGGAGAAGTTTCGAATCTTTTT -3’；
反义链：
5’-AAAAAAGATTCGAAACTTCTCCGCTGTCTCTTGAACAGCGGAGAAGTTTCGAA TC-3’。
将上述的shRNA序列分别构建至慢病毒载体pGLV-U6/GFP(Genepharma，上海)中。将构建好的shRNA表达载体命名为sh-Twa1和sh-Twa1-2。
(2)按照产品说明书提供的实验步骤，使用Lipofectamine 2000(Invitrogene)转染 HEK-293细胞。将构建好的sh-Twa1，sh-Twa1-2和sh-ctr对照载体和病毒包装质粒(Genepharma，上海)共转染HEK-293T细胞(美国ATCC细胞库)48小时，随后收集细胞上清液，过滤，与4μg/ml Polybrene(上海生工)混合后处理感染目的细胞。
(3)将包装好的慢病毒分别感染HEK-293细胞(上海中科院细胞库)48小时，提取细胞总蛋白质，进行免疫印迹实验，检测Twa1多肽或蛋白质的表达情况。
结果如图2显示含有Twa1的shRNA的慢病毒能够显著下调HEK-293细胞内Twa1的蛋白质水平。GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参蛋白质。
实施例3，Twa1下调显著抑制Wnt信号通路报告基因的活性。
由于细胞信号转导通路异常是结直肠癌发生的重要原因，为了说明Twa1是否参与调节结直肠癌发病相关的信号转导通路，开展了一系列反映信号通路活性的双荧光素酶报告基因实验(涉及Wnt，TGF-β，Hedgehog，Hippo，NF-κb，MAPK，JAK/STAT，钙信号等通路)。首先使用含有sh-Twa1或sh-ctr的慢病毒感染HEK-293细胞中，免疫印迹结果如图3中A 图显示含有sh-Twa1的慢病毒可显著下调HEK-293细胞中的Twa1多肽或蛋白质。分别转染以上信号通路的报告基因质粒以及海肾荧光素酶内参质粒，并用相应的信号通路激活剂活化相关信号通路，通过酶标仪检测这两类荧光素酶的活性，以了解Twa1参与调节哪些信号通路相关。使用美国Promega公司的双荧光素酶报告基因实验试剂盒进行该实验，具体实验方法如下：
(1)使用含有sh-Twa1或sh-ctr的慢病毒感染HEK-293细胞48小时。
(2)将所需的报告基因质粒(Promega)和内参pRL-TK(Promega)等转染至12孔板中的细胞中。
(3)转染24小时后，根据实验需求处理细胞。
(4)将200μl PLB细胞裂解液加入12孔板每孔细胞中，使细胞裂解。
(5)室温下，将12孔板放在摇床上慢摇20分钟；将细胞裂解液移入1.5ml离心管中。
(6)12000g离心30秒，沉淀细胞碎片，取上清液于新的离心管中。
(7)吸取20μl上清液置于96孔酶标板的小孔中，设定程序检测。
(8)加入20μl LARII，检测其中Firefly荧光活性。随后向小孔中加入20μl Stop&Glo Reagent，检测其中Renilla荧光活性；将Firefly荧光活性和Renilla荧光活性值相比，得到的比值即为检测结果。每次实验均重复3次。*P＜0.05，Student’s t检验。
结果如图3中的B图显示下调Twa1可特异性抑制经典Wnt信号通路报告基因活性。图中的纵坐标表示的是报告基因活性的数值。图3中的C图、D图、E图、F图、G图、H 图、I图显示下调Twa1对这些通路无明显影响。图中的纵坐标表示的是报告基因活性的数值。GLI，胶质瘤相关基因(Hedgehog信号通路)；IL-6，白介素6；LEF，淋巴增强子结合因子(Wnt/β-catenin信号通路)；Luc，荧光素酶；NF-κB、核因子-κB(TNF-α信号通路)； NFAT，T细胞核激活因子(钙信号通路)；RLA，相对荧光素酶活性(萤火虫/海肾荧光素酶)；Shh-CM，Shh条件型培养基；Smad2、SMAD家族成员2(TGF-β信号通路)；SRF，血清反应因子(MAPK信号通路)；STAT3，信号转导与转录激活因子3(JAK/STAT信号通路)；TAZ，带有PDZ结合基序的转录辅激活因子；TEAD，TEA结构域(Hippo信号通路)。 TGF-β1，转化生长因子β1；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；Wnt3a-CM，Wnt3a条件型培养基； YAP，YES相关蛋白质。
这表明Twa1参与正向调节经典Wnt信号通路。
实施例4，Twa1促进β-catenin核内积累和Wnt靶基因的表达。
4.1进一步使用两个不同靶点的Twa1shRNA下调Twa1，结果如图4中的A图显示敲低Twa1显著抑制Wnt报告基因的活性。经典Wnt信号通路主要通过调控下游靶基因的表达而发挥其生物学功能，于是检测下调Twa1对经典Wnt信号通路靶基因Axin2和CyclinD1 表达的影响。在Twa1表达下调的HEK-293细胞中，使用Wnt3a条件型培养基或对照培养基处理细胞6小时后，提取细胞总RNA并反转录为cDNA。实时荧光定量PCR实验如图4 中的B图显示，分别使用两个靶点降低Twa1的表达均导致Wnt信号通路靶基因Axin2和 CyclinD1表达下降。图中的纵坐标表示的是Axin2和CyclinD1的相对表达值。为了排除Twa1 shRNA的脱靶效应，转染不受Twa1sh-RNA攻击的Twa1表达质粒进行挽救实验。双荧光素酶报告基因实验如图4中的C图和实时荧光定量PCR实验如图4中的D图均显示，外源表达不受sh-RNA攻击的Twa1能够成功挽救Twa1下调造成的表型，证实Twa1sh-RNA的有效性和特异性，排除脱靶效应。定量数据用均值±标准误表示(至少三次独立实验)。*P ＜0.05，**P＜0.01，Student’s t检验。细胞总RNA的提取方法和该实验所用到的引物序列如下：
加1ml Trizol至35mm培养皿，裂解底面贴壁的细胞，吸取裂解液至无RNA酶的离心管中，加0.2ml的预冷氯仿混合均匀，并剧烈震荡15秒，室温静置2-3分钟，质清晰分层； 4℃，12000g离心15分钟；吸取最上层含RNA的水相，加0.5ml预冷异丙醇，混匀，静置20分钟；2-8℃，12000g离10分钟；弃上清，以1ml预冷DEPC水溶液配制的75％乙醇重悬RNA沉淀，4℃，7500g离心5分钟；室温干燥至，乙醇挥发完，加20μl无RNA 酶去离子水溶解；取3μl，1:30稀释，定量，于-80℃保存。
实时荧光定量PCR用的引物
Figure GDA0002004871100000171
4.2为了阐明Twa1调节经典Wnt信号通路的分子机制，检测该通路的关键分子β-catenin 的水平。首先使用含有sh-Twa1或sh-ctr的慢病毒感染HEK-293细胞48小时。随后使用 Wnt3a条件型培养基和对照培养基处理已感染慢病毒的HEK-293细胞6小时。免疫印迹实验如图4中的B图和图4中的D图显示下调Twa1对β-catenin总体水平并无明显影响。细胞内总蛋白质的提取方法如下：
(1)按1×106的密度接种至六孔的培养板，每孔加入2ml的含有10％胎牛血清的DMEM 培养基。
(2)每孔加入100μl RIPA buffer(包含0.1M DTT，1mM Na3VO4，1mM NaF，1mMPMSF)，用刮板刮下细胞，吸取细胞裂解液到1.5ml离心管内，4℃混匀裂解35分钟。
(3)14000g离心5分钟，吸取上清，加入4×上样缓冲液，加热煮沸5分钟。
(4)煮沸之后，立即置于冰上，于-20℃保存。
4.3由于β-catenin是从细胞质移位至细胞核中调控Wnt靶基因表达，检测下调Twa1是否影响细胞核内β-catenin的蛋白质水平。使用Nuclear Extract试剂盒(ActiveMotif公司，美国)分离细胞的细胞质与细胞核组分，检测β-catenin蛋白质在细胞核中的表达情况。具体实验方法如下：
(1)贴壁培养细胞，吸去培养基后，加入l×PBS洗两次，振摇培养皿以尽量去除培养液。用刮板刮下细胞，将细胞收集至2ml离心管中。
(2)每10ml培养皿的细胞加入0.5ml Hypotonic Buffer，冰上放置15分钟，期间轻摇混匀。
(3)加入试剂盒中的Detergent，混匀后涡旋震荡20秒，12000g离心1分钟，分别取上清和沉淀，上清于4℃14000g离心5分钟，再取上清为胞质提取物。
(4)沉淀加入1ml预冷Hypotonic Buffer洗涤，4℃14000g离心1分钟，去上清。
(5)沉淀加入0.2ml Lysis Buffer(每1ml Lysis Buffer加入1μl DTT和蛋白酶抑制剂)。震荡将沉淀悬起，4℃摇床上轻摇20分钟，4℃14000g离心10分钟，取上清为核提取物。
向制备好的细胞质与细胞核组分中加入4×SDS上样缓冲液，混匀并煮沸10分钟使蛋白质变性，-20℃保存。
免疫印迹实验如图4中E图显示Twa1下调显著降低了细胞核内β-catenin的含量。图中的Lamin B(核纤层蛋白B)和α-tubulin(α-微管蛋白)分别为细胞核和细胞质的内参蛋白质。
4.4免疫荧光实验显示Twa1下调抑制β-catenin在细胞核中的定位。首先使用含有sh-Twa1或sh-ctr的慢病毒感染HEK-293细胞48小时。随后使用Wnt3a条件型培养基和对照培养基处理已感染慢病毒的HEK-293细胞6小时，然后进行免疫荧光实验。如图4中的 F图显示，当Wnt信号未激活时，β-catenin主要定位于细胞膜上，细胞质与细胞核中的水平较低。使用Wnt3a条件性培养基激活Wnt信号，能显著增强对照组细胞中β-catenin在细胞质与细胞核中的表达和分布。但是，下调Twa1抑制了β-catenin在细胞核内的分布，对其在细胞质中的表达和定位无明显影响，表明Twa1对于β-catenin核内累积是至关重要的。图中的绿色信号表征被慢病毒感染的细胞，红色信号表征β-catenin蛋白质，DAPI指示DNA(蓝色)。标尺，10微米。具体实验步骤如下：
(1)细胞预先接种在铺放有玻片的24孔板内，经上述实验处理后，用4％甲醛固定10 分钟。
(2)PBS轻轻漂洗三次，每次5分钟，用含有10％FCS的PBS室温封闭20分钟，室温孵育对应的含有0.1％Saponin(透膜剂)的一抗(用10％FCS/PBS配制)2小时或4℃过夜。
(3)PBS轻轻漂洗三次，每次5分钟，室温避光孵育对应的含有0.1％Saponin的荧光二抗1小时。
(4)PBS轻轻漂洗三次，每次5分钟，用封片剂封片，指甲油封边。封好的玻片于4℃保存。
(5)图像采集均是利用Zeiss LSM510Meta激光共聚焦显微镜完成。图像采集使用63 倍，NA值为1.4的物镜在多通道的模式下进行。
4.5免疫共沉淀实验显示Twa1下调抑制β-catenin与转录因子TCF4的相互作用。在细胞核中，β-catenin主要通过与转录因子TCF4结合而激活下游靶基因表达。由于下调Twa1造成细胞核内β-catenin水平降低，推测Twa1的表达下降将导致与TCF4结合的β-catenin含量减少。将HEK-293细胞感染含有sh-Twa1或sh-ctr的慢病毒后，使用Wnt3a条件型培养基或对照培养基处理细胞6小时。随后提取各组细胞裂解液，使用抗β-catenin抗体或对照IgG抗体进行免疫共沉淀实验，通过免疫印迹实验检测TCF4的表达。免疫共沉淀实验结果如图4中的H图显示，Twa1下调的确造成与TCF4结合的β-catenin含量降低，进一步证实Twa1参与调控β-catenin核内累积而影响经典Wnt信号通路。免疫共沉淀的实验过程如下：
4.5.1蛋白质提取，与抗体结合
预先将细胞刮板洗净烘干，并用保鲜膜包好，冰上放置。1.5ml离心管置于冰上预冷。
(1)细胞用预冷的PBS洗2次，最后一次将PBS吸净。
(2)直径为60mm的细胞培养皿中加入300μl IP裂解液(50mM Hepes[pH 7.4]，150mM NaCl，1％Nonidet P-40，10％glycerol，10mM EGTA，1.5mM MgCl2)，使用前加入1mMPMSF和蛋白酶抑制剂cocktail，浸润2分钟，刮板刮下细胞，吸取至1.5ml离心管。
(3)漩涡震荡混匀后，于4℃旋转30分钟。
(4)15000g，4℃离心20分钟。
(5)吸取上清至预冷的离心管，同时取40μl上清至另一离心管，作为Input用。
(6)加入1μg抗体至提取的蛋白质裂解液中，4℃旋转孵育过夜。
4.5.2抗体蛋白质复合物与Protein A/G beads(Santa Cruz)结合
(1)取出适量Protein A/G beads到预冷的1.5ml离心管中。
(2)用配好的预冷洗beads的溶液(50mM Hepes[pH 7.4]，150mM NaCl，1％NP-40，10％glycerol，10mM EGTA，1.5mM MgCl2)洗beads一次。4℃离心，3000rpm，2分钟，尽量吸净液体。重复一次。
(3)将抗体蛋白质复合物吸取至洗好的Protein A/G beads中。
(4)4℃旋转孵育2小时。
(5)用含0.5％NP-40的IP裂解液洗beads 4次，最后用预冷PBS洗涤一次。
注：用Flag抗体偶联的beads进行免疫共沉淀实验时，直接在蛋白质裂解液中加入该 beads，于4℃旋转孵育4小时后进行洗涤。
4.5.3共沉淀产物进行蛋白质免疫印迹
(1)加入适量的2×上样缓冲液，涡旋振荡，充分接触beads，裂解结合在beads上的蛋白质。
(2)样品煮沸5分钟，立即冰上放置。
(3)离心，取20μl上清上样，免疫印迹法检测抗体蛋白质复合物中共沉淀的蛋白质。
实施例5，敲除Twa1抑制β-catenin核内积累和Wnt信号通路。
为了进一步验证Twa1促进β-catenin核内积累和Wnt信号通路，在HEK-293细胞中利用CRISPR/Cas9技术敲除Twa1基因，观察Twa1基因缺失对β-catenin核内积累和Wnt信号通路的影响。图5中的A图显示的是正常细胞中的Twa1基因的测序结果图，以及二株Twa1基因敲除细胞中，被CRISPR/Cas9系统编辑后的Twa1基因的测序结果图。在 Twa1-KO-1和Twa1-KO-2细胞中，被编辑后的Twa1基因其蛋白质表达提前终止，即Twa1 多肽或蛋白质被成功敲除。图5中的B图显示是正常细胞中的Twa1基因，以及Twa1-KO-1 和Twa1-KO-2细胞中的Twa1基因的大小，表明Twa1基因的确发生如图5中的A图所显示的基因编辑现象。免疫印迹实验结果如图5中的C图显示敲除Twa1基因完全抑制Twa1多肽或蛋白质的表达。进一步实验发现，如图5中的D图，E图，F图，G图，H图显示，Twa1 基因的敲除分别显著抑制β-catenin的核内积累、β-catenin的核内定位、Wnt报告基因的活性、Wnt靶基因表达以及β-catenin与TCF4的相互作用。在图5中的G图中，绿色表征β-catenin， DAPI表示DNA(蓝色)。标尺，10微米。定量数据用均值±标准误表示(至少三次独立实验)。N.S.，不显著。**P＜0.01，Student’s t检验。这些结果证实Twa1的确促进β-catenin 核内积累和Wnt信号通路。建立Twa1基因敲除细胞的具体方法如下：
(1)合成一对sgRNA序列(5’-GAGAGCAGACATGAACCGCC-3’和 5’-GGCGGTTCATGTCTGCTCTC-3’)并构建至改良后的pEP330X载体系统中。
(2)将构建后的载体转染至HEK-293细胞，并使用1μg/ml嘌呤霉素处理细胞24小时。然后将细胞种植于96孔板，让其形成单克隆细胞群。
(3)从单个菌落中提取基因组DNA。使用引物(5’-ATTCTCCGGCTCACAGCTC-3’和5’-GCTACAGCACTCCTTATGTGTT-3’)进行PCR扩增，通过基因组DNA测序和免疫印迹实验验证阳性克隆。
实施例6，Twa1通过结合β-catenin，促进β-catenin核内累积。
6.1为了说明Twa1调节β-catenin核内累积的分子机制，检测Twa1与β-catenin的相互作用。在大肠癌杆菌中表达和纯化带有GST标签的Twa1或带有His标签的β-catenin融合蛋白质用于体外GST沉降实验，结果如图6中的A图显示Twa1与β-catenin能够直接结合。通过免疫共沉淀实验检测二者在细胞内的作用情况，结果如图6中的B图显示Twa1与β-catenin存在相互作用。为了鉴定Twa1与β-catenin相互作用的结合区域，通过生物信息学方法分析Twa1含有的结构域序列。Twa1具有三个结构域：N端的LisH结构域，中部的 CTLH结构域，以及C端的CRA结构域。分别构建了各个结构域缺失的Twa1突变体：缺失LisH结构域的LisH突变体(Twa1-ΔLisH)、缺失CTLH结构域的Twa1突变体 (Twa1-ΔCTLH)，和缺失CRA结构域的突变体(Twa1-ΔCRA)，并表达和纯化了相应的突变体蛋白质。GST沉降实验如图6中的A图显示，Twa1-ΔCRA不能与β-catenin结合，而缺失LisH结构域或CTLH结构域对于二者结合无明显影响，提示CRA结构域对于Twa1与β-catenin至关重要。在细胞内表达野生型Twa1以及各个结构域缺失的突变体进行免疫共沉淀实验，结果如图6中的B图显示缺失CRA结构域的Twa1不能与β-catenin相互作用，而 Twa1-ΔLisH或Twa1-ΔCTLH能够结合β-catenin。这些结果表明Twa1通过CRA结构域与β-catenin相互作用。GST或His沉降实验如下：
6.1.1GST融合蛋白纯化
6.1.1.1质粒转化BL21菌株
(1)从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞(Vazyme公司)冰上解冻。
(2)加入构建好的质粒DNA溶液并轻轻摇匀，冰上放置30分钟。
(3)42℃水浴90秒，迅速置于冰上冷却2分钟。
(4)加入800μl预热LB液体培养基(不含抗生素)至试管中，混匀后37℃培养45 分钟哦，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
(5)吹匀菌体，涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12小时。
6.1.1.2诱导融合蛋白表达
(1)挑细菌克隆至预先加入5ml含抗生素的LB培养基的小摇管。
(2)37℃，200rpm，摇菌过夜(12小时)。
(3)取活化好的菌液5ml加入到另一200ml含抗生素的新的LB培养基的试管。200rpm，摇菌1-2.5小时。接种比例为1:25-1:100均可。
(4)在菌液OD600值在0.4-0.6时，加入1mM IPTG诱导蛋白质表达，温度为16℃，时间为16小时。
(5)4℃，5000rpm，5分钟离心，留菌体沉淀(可-20℃保存)。
6.1.1.3纯化蛋白
(1)加入预冷的PBS 60ml(包含1mM PMSF和2mM EDTA)，冰上超声，功率为 50％。超一秒，停一秒，超90次。重复3次，至液体澄清。
(2)离心，4℃，5000g，30分钟。取上清至另一干净的50ml离心管中。
(3)加入清洗后的GST-beads 500μl。(用1ml枪头取beads，枪头剪掉顶端，beads使用前用预冷PBS洗3次，去除beads储液里的酒精)。4℃摇床孵育2小时。
(4)离心3000rpm，1分钟，弃上清。
(5)加入预冷PBS(含有EDTA，PMSF)5ml，洗5次，每次5分钟。
(6)加入GSH(谷胱甘肽)洗脱液1ml，4℃旋转5分钟。离心，取上清。洗脱4-5次，收集每次洗脱的组分。
(7)吸取洗脱组分到透析袋中透析。先将透析袋放入双蒸水中浸泡，之后用夹子夹住透析袋一头，然后用双蒸水冲洗袋子里面2-3次，之后将蛋白质液加入袋中，另一头再用夹子固定住，将含有蛋白质洗脱液的透析袋放入不含GSH的透析液(含EDTA 2mM)中摇过夜。第二天换上新鲜的透析液(不含EDTA)4℃，4小时。
(8)4℃浓缩。将透析袋浸入预冷的蔗糖，每隔2小时换新鲜的蔗糖，重复3次。
6.1.2GST沉降实验
(1)向纯化好的His-β-catenin蛋白质中分别加入等摩尔量的GST-Twa1多肽或蛋白质及其突变蛋白质。
(2)4℃孵育过夜。
(3)先用PBS将GST-beads洗三次。每管加入30μl beads。4℃孵育2小时。
(4)用PBS清洗beads 5次，每次1ml，离心2500rpm，1分钟。尽量吸尽上清。加 50μl/管的2×上样缓冲液至beads沉淀，沸水煮5分钟。
(5)免疫印迹法检测目标蛋白质pull down的相应蛋白质。
6.2为了探索Twa1是否通过CRA结构域结合β-catenin而调控其核内累积，在Twa1下调的HEK-293细胞中表达野生型Twa1及其各结构域缺失的突变体进行挽救实验。如图6中的C图的免疫荧光实验显示，在Wnt信号未激活时，Twa1及其各结构域缺失的突变体主要定位于细胞质中，β-catenin主要分布于细胞膜上。而当Wnt信号活化时，Twa1，Twa1-ΔLisH，和Twa1-ΔCTLH都能够进入细胞核，β-catenin在细胞核中水平上升，表明缺失LisH结构域和CTLH结构域的Twa1突变体均能成功挽救Twa1下调的表型。但是在转染Twa1-ΔCRA的细胞中，Twa1-ΔCRA自身未响应Wnt信号进入细胞核，β-catenin也未在核内累积，这表明CRA结构域对于Twa1调节β-catenin核内累积至关重要。图中绿色表征β-catenin，红色表征Flag-Twa1或其各个突变体，DAPI指示DNA(蓝色)。标尺，10微米。
6.3检测Twa1突变体对经典Wnt信号通路靶基因表达的影响。免疫印迹实验结果如图 6中的D图显示，野生型Twa1能够挽救Twa1下调导致的β-catenin核内水平的下降，而Twa1-ΔCRA无法逆转该异常表型。图6中的E图的双荧光素酶报告基因实验和图6中的F 图的实时荧光定量PCR实验显示，野生型Twa1能够挽救Twa1下调导致的Wnt告基因活性下降以及靶基因Axin2和CyclinD1表达降低，而Twa1-ΔCRA无法逆转该异常表型，进一步证实Twa1通过CRA结构域发挥其在Wnt信号通路中的功能。
6.4Wnt信号通过提高Twa1核内水平，而帮助β-catenin核内累积，试图探讨在Wnt信号未激活时，促进Twa1入核能否增强细胞核内β-catenin的定位，且Twa1这一功能的发挥是否依赖于CRA结构域。通过在Twa1的C端添加上核定位序列(NLS-Twa1)，促进其在细胞核中的表达。在Wnt信号未激活的HEK-293细胞中，通过免疫荧光实验检测外源 GFP-β-catenin或内源β-catenin的定位情况，结果如图6中的G图和H图分别显示β-catenin 和GFP-β-catenin的核内水平在具有NLS-Twa1表达的细胞中显著上升，表明促进Twa1的入核足以增强β-catenin核内累积。缺失LisH结构域或CTLH结构的NLS-Twa1突变体对于 Twa1发挥这一功能无明显影响，β-catenin在细胞核内具有明显的定位。而缺失CRA结构域的NLS-Twa1突变体，即使能够定位于细胞核中，也仍然无法促进β-catenin在细胞核内的累积。在图6中的G图中，红色表征β-catenin，绿色表征NLS-Twa1或其各个突变体，DAPI 指示DNA(蓝色)。标尺，10微米。在图6中的H图中，绿色表征GFP-β-catenin，红色表征NLS-RFP-Twa1或其各个突变体，DAPI指示DNA(蓝色)。标尺，10微米。图6中I图的双荧光素酶报告基因实验结果和图6中的J图的实时荧光定量PCR实验结果基因不证实 NLS-Twa1促进Wnt靶基因表达，但缺失CRA结构域的NLS-Twa1不具有此功能。以上结果进一步表明，Twa1通过CRA结构域结合β-catenin，促进其在核中累积。
实施例7，Twa1促进结直肠癌细胞的β-catenin核内累积和Wnt信号通路。
Wnt信号通路的异常活化是结直肠癌发生的重要原因之一，前期结果显示Twa1参与在结直肠癌组织中高表达，且参与调控Wnt信号通路。那么，Twa1是否通过调节经典Wnt信号通路而参与该病理过程。选取由于APC基因突变而导致细胞核内β-catenin组成性高表达的结直肠癌细胞系DLD1和SW480进行实验。在该细胞系中，感染Twa1sh-RNA慢病毒下调Twa1的表达，分别提取细胞质与细胞核组分，结果如图7中的A图和D图显示Twa1 的表达下降分别显著抑制DLD1和SW480的细胞核内β-catenin的水平。进一步开展双荧光素酶报告基因实验和荧光实时定量PCR实验，结果如图7中的B图和E图显示敲低Twa1 分别抑制了DLD1和SW480的Wnt报告基因的活性。图7中的C图和F图的结果显示敲低 Twa1分别抑制了DLD1和SW480的Wnt靶基因Axin2和Cyclin D1的表达。这些结果表明，在结直肠癌细胞系中，Twa1参与调节β-catenin核内累积而影响经典Wnt信号通路。
实施例8，Twa1促进结直肠癌细胞的生长和成瘤能力。
8.1经典Wnt信号通路与结直肠癌细胞的癌生物学特性密切相关，进一步说明Twa1的表达下调对结直肠癌细胞的癌生物学行为的影响。MTT实验结果如图8中的A图和C图显示，与对照组相比，下调Twa1分别显著抑制DLD1细胞和SW480细胞的增殖能力。纵坐标显示的是吸光度的数值，值的大小与细胞数量成正比。平板克隆形成实验结果如图8中的 B图和D图显示，与对照组相比，下调Twa1分别显著抑制DLD1细胞和SW480细胞的克隆形成能力。纵坐标显示的是相对的克隆形成率。这些结果表明Twa1在体外促进结直肠癌细胞的增殖。MTT实验和平板克隆形成实验的具体方法如下：
8.1.1MTT实验：
(1)收集对数期的细胞，调整细胞悬液浓度，加入100μl/孔细胞悬液至96孔板中，使待测细胞密度为1000-5000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。
(2)将铺好细胞的培养板置于培养箱中培养，培养时间根据实验需求所定。
(3)每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4小时。(4)终止培养，小心吸尽孔内培养液。每孔加入150μl DMSO溶液，置摇床上低速室温振荡10分钟，使结晶物充分溶解。
(5)在酶联免疫检测仪OD值为570nm处测量各孔的吸光值。
8.1.2克隆形成实验
(1)取对数生长期的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打至单个细胞，并把细胞悬浮在含10％血清的RPMI-1640培养液中备用。
(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含2ml培养液的6孔板中，并轻轻晃动，使细胞分散均匀。置细胞培养箱中培养2至3周，期间更换新鲜培养基数次。
(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用1×PBS 小心浸洗2次。加入4％多聚甲醛固定细胞15分钟。然后弃去固定液，加入结晶紫染色液染色5分钟，用流水缓慢洗去染色液，并空气干燥。
(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆数，或在显微镜 (低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％
8.2通过裸鼠荷瘤模型，检测Twa1在体内对于结直肠癌细胞增殖和成瘤的作用。将对照组DLD1细胞和已下调Twa1表达的DLD1细胞分别接种于裸鼠皮下，观察和测量裸鼠皮下肿瘤生长的大小。结果如图8中的E图，敲低Twa1显著抑制细胞移植瘤的生长，表明 Twa1在体内水平对于结直肠癌细胞的增殖和成瘤能力至关重要。图8中的F图显示裸鼠体内，肿瘤的生长曲线图，横坐标显示的是肿瘤接种后的天数，纵坐标显示的肿瘤体积。裸鼠体内成瘤实验具体步骤如下：
用胰酶消化细胞并制成细胞悬液，用无血清的培养基洗3次后，细胞计数，调整细胞密度为l×107个/ml。将0.2ml(含2×106个肿瘤细胞)的重悬液注射于裸鼠皮下，每组细胞接种12只，连续观察28天，每周用游标卡尺测量一次肿瘤的长度及宽度，并计算肿瘤体积。
计算肿瘤体积公式为V＝1/2×L×W2(V：体积；L：长；W：宽)
实施例9，Twa1的核内表达水平与结直肠癌细胞增殖和结直肠癌患者的预后密切相关。
为了说明核内Twa1表达水平的临床意义，共收集了106对结直肠癌组织及其癌旁对照组织样本。分别提取了这些组织的细胞核组分，并且通过免疫印迹实验检测Twa1和β-catenin 的表达情况。结果如图9中的A图显示，Twa1在结直肠癌组织中表达上升(P<0.001)。图 9中的B图为图9中的A图的定量统计图，Twa1条带的灰度由Image J软件(NIH，美国国立卫生研究院)量化和标准化。纵坐标表示的是经log2转化后的Twa1多肽或蛋白质相对内参Lamin B蛋白质的表达水平。P＜0.01，Student’s t检验。图9中的C图显示核内Twa1表达水平与核内β-catenin的表达水平呈正相关性(r2＝0.5144，P<0.0001)。更重要的是，根据 60位具有五年随访记录的结直肠癌患者的Twa1表达水平的中位值，将患者分为Twa1表达水平高的一组以及Twa1表达水平低得一组，然后比较二组患者的生存情况。统计分析结果如图9中的D图显示Twa1表达水平高的结直肠癌患者，其五年生存率更低(P<0.0001)。图中横坐标显示的是生存时间，纵坐标显示的是存活人数的比例。
实施例10，Twa1在人类胃癌组织中表达上调。
10.1为了说明Twa1在胃癌中的表达情况，分析了Oncomine数据库中胃癌组织的RNA 测序数据，该数据集中共纳入了39个胃癌组织样本及其30个的癌旁组织样本。结果如图 10中的A图显示Twa1的mRNA在胃癌组织中表达上调。分析了TCGA(The Cancer GenomeAtlas，癌症全基因组图谱)数据库中胃癌组织的RNA测序数据。该数据库共纳入了388个胃癌组织样本及其35个癌旁组织样本。结果如图10中的B图显示Twa1的mRNA在胃癌组织中表达上调。图中每个点代表经log2转化后的Twa1基因相对内参基因TBP(TATA结合蛋白质)的表达水平。横坐标的N表示的是癌旁对照组织，T表示的是肿瘤组织。纵坐标表示的是经log2转化后的Twa1基因相对内参基因TBP的表达水平。黑色水平线显示的是中位值±标准差。P＜0.0001，Student’s t检验。
10.2为了说明胃癌中Twa1表达水平的临床意义，分析了GSE57303数据库胃癌组织的临床相关资料。该数据库共纳入了71对胃癌组织样本及其癌旁配对组织样本。统计分析结果如图10中的C图显示Twa1表达水平高的胃癌患者，其五年生存率更低(P<0.0001)。图中横坐标显示的是生存时间，纵坐标显示的是存活人数的比例。
10.3进一步提取胃癌组织和癌旁对照组织的总蛋白质，检测Twa1在胃癌组织中的蛋白质表达水平。样本来自于上述的浙江省肿瘤医院。图10中的D图显示Twa1多肽或蛋白质在胃癌组织中表达上调。
实施例11，敲除Twa1抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。
11.1为了探究Twa1在胃癌细胞迁移和侵袭中的作用，利用CRISPR/Cas9技术在Twa1 高表达的BGC细胞株中敲除Twa1基因，图11中的A图显示的是正常BGC细胞中的Twa1基因的测序结果图，以及一株Twa1基因敲除的BGC细胞中Twa1基因的测序结果图。在 Twa1基因敲除的细胞中，Twa1多肽或蛋白质表达提前终止，即Twa1基因被成功敲除。图 11中的B图显示的是免疫印迹实验结果，显示敲除Twa1基因完全抑制Twa1多肽或蛋白质的表达。
11.2为了进一步说明Twa1对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。Transwell实验结果如图11 中的D图和E图显示，与对照组相比，下调Twa1显著抑制BGC细胞迁移和侵袭能力。Transwell实验步骤如下：
11.2.1Transwell小室制备，侵袭实验需要铺Matrigel，迁移实验不需要铺Matrigel。
(1)用无血清培养基稀释Matrigel，将Matrigel原液稀释10倍。
(2)取50μl稀释的Matrigel，均匀地铺于小室的底部
(3)将铺好Matrigel的小室置于24孔板中，将24孔板置于细胞培养箱中孵育30min。
11.2.2制备细胞悬液
(1)制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。
(2)消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬。调整细胞密度至250000个/mL。
11.2.3接种细胞
(1)取200μl细胞悬液加入Transwell小室中。
(2)24孔板中加入500μl含10％血清的培养基。
(3)将小室轻轻放入24孔板中，将24孔板置于细胞培养箱中常规培养24-48h。
11.2.4结果统计
(1)取出小室，在24孔板其他孔中，加入500μl 4％PFA，轻轻地将小室放入，固定30min以上。
(2)取出小室，在24孔板其他孔中，加入500μl 0.1％结晶紫，染色10-30min。
(3)用PBS洗去小室上的浮色，然后用棉签轻轻地擦去基质胶和上室内的细胞。
(4)用倒置显微镜进行观察和拍照，每个小室拍6张，计数后取平均值。
实施例12，过表达Twa1增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力。
为了进一步验证Twa1的表达对胃癌的癌生物学行为的影响。在Twa1低表达的AGS和 SGC细胞株中外源过表达Twa1，图12中的A图显示了免疫印迹实验结果，在AGS和SGC 细胞中转染质粒，外源过表达Twa1多肽或蛋白质。图12中的B图和C图显示了外源过表达Twa1增强AGS细胞和SGC细胞的迁移和侵袭能力。
实施例13，敲除Twa1会使胃癌细胞发生间质上皮转换(MET)。
为了进一步说明敲除Twa1对胃癌细胞迁移和侵袭能力的作用，利用免疫印迹实验，检测了敲除Twa1后细胞的上皮间质标记蛋白质的表达水平。如图13中的A图所示，Twa1敲除使BGC细胞的上皮细胞标志蛋白(E-cadherin和Cytokeratin 8)表达上调，间质细胞标志蛋白(N-cadherin和Vimentin)表达下调，即敲除Twa1会使BGC细胞发生间质上皮转换。
实施例14，Twa1在多种人类常见恶性肿瘤组织中表达上调。
为了进一步探究Twa1在人类常见恶性肿瘤组织中的表达水平，利用生物信息学方法，对多种肿瘤中Twa1的mRNA表达水平进行分析，结果显示Twa1在10种肿瘤中表达上调，分别为膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、支气管腺瘤和甲状腺癌。
实施例15，Twa1的表达水平与多种人类常见恶性肿瘤转移相关。
为了进一步研究Twa1的表达水平与人类常见恶性肿瘤转移的相关性，利用生物信息学分析，对多种肿瘤中Twa1的mRNA表达水平与患者病理特征的相关性进行分析。以胸膜癌、食管癌和肾癌为例，结果显示Twa1的高表达与肿瘤的转移相关(P<0.05)。
以上实施例说明Twa1在肿瘤细胞的生长，增殖和转移中发挥着重要的作用，以结直肠癌为例，在细胞中敲低Twa1会抑制细胞的增殖能力，以胃癌细胞为例，在细胞中过表达Twa1 会增强细胞的迁移和侵袭能力，在胃癌细胞中敲除Twa1会抑制细胞的迁移和侵袭能力。 Twa1是通过促进β-catenin核内累积从而促进细胞增殖，β-catenin核内累积在肿瘤中普遍存在的，所以Twa1促进肿瘤细胞的增殖具有普遍性，在结直肠癌细胞中已经验证了这一结果，在乳腺癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、血癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、头癌、颈癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、胃肠道间质瘤、皮肤癌、多发性骨髓瘤、神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤等各种肿瘤中，Twa1在多种肿瘤中表达上调，提示Twa1在这些肿瘤中也具有促进肿瘤细胞增殖的作用。Twa1是通过调控细胞的上皮间质转化(EMT)来促进细胞的迁移和侵袭的，EMT在许多肿瘤的发生发展中存在，所以Twa1促进肿瘤细胞的迁移和侵袭具有普遍性，在胃癌细胞中已经验证了这一结果，在乳腺癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、血癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、头癌、颈癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、胃肠道间质瘤、皮肤癌、多发性骨髓瘤、神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤等各种肿瘤中，Twa1在多种肿瘤中表达上调，且表达水平与肿瘤转移密切相关，提示Twa1在这些肿瘤中也具有促进肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。
综上，Twa1的表达水平与肿瘤的发生和发展密切相关，是一个潜在诊断和治疗靶标。因此，以本发明所述的Twa1基因及其表达产物为靶标，设计和研发所述的肿瘤检测试剂盒，建立药物筛选模型，筛选和制备所述的抗肿瘤药物，为及时筛查肿瘤和有效抑制或干扰肿瘤的发生和发展提供重要的理论和应用价值。
Figure IDA0002006218490000011
Figure IDA0002006218490000021
Figure IDA0002006218490000031

Claims (11)

1.一种用于抑制或干扰基因表达的siRNA，其特征在于：
所述siRNA的序列是由以下任意一组互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsRNA：
1）正义链：5’-GGAGAAGUUUCGAAUGGAATT-3’;
反义链：5’-UUCCAUUCGAAACUUCUCCTT-3’；
2）正义链：5’-CAGCGGAGAAGUUUCGAAUTT-3’;
反义链：5’-AUUCGAAACUUCUCCGCUGTT-3’。
2.一种用于抑制或干扰基因表达的shRNA表达载体，其特征在于：所述表达载体中包含由以下任意一组互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsDNA：
1）正义链：
5’-GGGAGAAGTTTCGAATGGAATTCAAGAGATTCCATTCGAAACTTCTCCCTTTTT-3’;
反义链：
5’-AAAAAAGGGAGAAGTTTCGAATGGAATCTCTTGAATTCCATTCGAAACTTCTCCC-3’；
2）正义链：
5’-GCAGCGGAGAAGTTTCGAATTTCAAGAGAATTCGAAACTTCTCCGCTGCTTTTT-3’;
反义链：
5’-AAAAAAGCAGCGGAGAAGTTTCGAATTCTCTTGAAATTCGAAACTTCTCCGCTGC-3’。
3.一种用于基因敲除的sgRNA表达载体，其特征在于：所述表达载体中包含由以下互补配对的核苷酸正义链和核苷酸反义链组成的dsDNA：
正义链：5’-GAGAGCAGACATGAACCGCC-3’；
反义链：5’-GGCGGTTCATGTCTGCTCTC-3’。
4.根据权利要求3所述的用于基因敲除的sgRNA表达载体，其特征在于：所述的基因编辑系统为CRISPR/Cas9系统。
5.一种蛋白质复合物，其特征在于：所述的蛋白质复合物包含β-catenin蛋白质和对肿瘤的发生和发展具有促进作用的多肽或蛋白质，所述多肽或蛋白质如序列表中的SEQ IDNO.2所示。
6.一种编码TWA1基因的DNA序列在制备抗肿瘤药物、制备肿瘤检测试剂盒中的用途，所述DNA序列选自以下二者之一：
1）序列表中的SEQ ID NO.1的DNA序列；
2）编码序列表中SEQ ID NO.2蛋白质序列的多核苷酸。
7.一种TWA1多肽或蛋白质在制备抗肿瘤药物、制备肿瘤检测试剂盒中的用途，所述的多肽或蛋白质如序列表中的SEQ ID NO.2所示。
8.权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA表达载体、权利要求3或4所述的sgRNA表达载体在制备抗肿瘤药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、肉瘤、肺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、血癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、头癌、颈癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、膀胱癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、胃肠道间质瘤、皮肤癌、多发性骨髓瘤、神经胶质母细胞瘤、黑色素瘤。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述的抗肿瘤药物包含权利要求1所述的siRNA、权利要求2所述的shRNA表达载体、权利要求3或4所述的sgRNA表达载体中的任意一种或任意多种，以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
11.根据权利要求10所述的一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述载体选自稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂，香味剂，甜味剂。
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