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CN110151728B - 一种双载多西紫杉醇和ir780的红细胞膜复合纳米粒 - Google Patents

一种双载多西紫杉醇和ir780的红细胞膜复合纳米粒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒，它是由PCL‑PEG‑PCL三嵌段共聚物包裹多西紫杉醇和IR780组成。本发明还提供了一种双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒，它是以前述纳米粒为内核，外面包裹红细胞膜形成的纳米粒。本发明的纳米粒和复合纳米粒能够在体内稳定存在，促进抗肿瘤药物发挥长效作用，经近红外激光引发的光热效应协同化疗作用，能避免紫杉醇耐药性，具有良好的应用前景。

Description

一种双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒
技术领域
本发明涉及一种双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒的制备方法，属于医 药制剂领域。
背景技术
多西紫杉醇(DTX)是近年来研发的一种紫杉烷类衍生物，从紫杉树中提取并合成的一种广谱抗癌药。许多研究已经表明，多西紫杉醇对多种肿瘤细胞均有抑制作用，尤其是乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌。多烯紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡的机制与紫杉醇类似，均是抑制有丝分裂过程微管蛋白的解聚，使肿瘤细胞的分裂过程一直停留在G2期和M期，导致肿瘤细胞的凋亡。最近也有许多研究发现，多西紫杉醇能够通过TLR4信号转导抑制 巨噬细胞M2表型和诱导M1表型，从而抑制肿瘤的增殖。然而因为其溶解度差，生物利 用度低，毒性高，限制了临床应用。目前临床上主要剂型为注射剂，并且使用了高浓度的 吐温80来提高多西紫杉醇的溶解度，导致了更多的不良反应。因此，开发一种新的剂型 来克服多西紫杉醇的缺点已经成为迫切的需要。
作为化疗的有效补充，物理治疗方式具有局部应激治疗的特点，特别近红外激光引发 的光热(PTT)和光动力治疗(PDT)，由于近红外激光对机体正常组织几乎不产生损伤，为 肿瘤治疗提供了较为安全的物理治疗方式。光敏剂IR780是一种亲脂性小分子的碘化物，属 于近红外七甲花箐染料。IR780在近红外光的照射下，产生大量的细胞活性氧(ROS)和高 热，杀伤肿瘤细胞，可用于光热治疗和光动力治疗。但是IR780难溶于水，毒性大，游离的IR780的光稳定性差，因此限制了其在临床的使用。
PCL-PEG-PCL(聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯)是一种两亲性三嵌段高分子材料，能 够在溶剂中自组装成壳-核结构，疏水段PCL形成核包载脂溶性药物，亲水段PEG形成 外壳可以掩蔽内核，并且能够稳定内核，防止内核聚集。此外，亲水性的PEG外壳还能 阻止网状内皮系统对纳米粒的吞噬，从而延长纳米粒在体内的循环时间。用该种材料包裹 药物，可以缓慢地释放药物，提高药物在体内的分布，达到最佳的治疗效果。
目前，高分子材料包裹抗肿瘤药物得到的纳米载药颗粒具有很大的开发潜力，但同时 也面临2个问题。
首先是包封率和载药量的问题。当需要包裹的抗肿瘤药物在2种以上时，各药物与高 分子材料的相对比例会影响药物的包封率和载药量；有时候药物用量大，反而载药量低。
其次是抗肿瘤药物的体内滞留时间不够的问题。研究表明纳米颗粒在肿瘤部位的富集 主要依赖于增强的渗透性和保留(EPR)效应，并且通过修饰如PEG等亲水性分子延长纳米颗粒的循环时间，可以进一步增强纳米颗粒在肿瘤组织中的蓄积，然而抑癌效果的持续时间仍不能满足人们的需求。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种同时装载多西紫杉醇和IR780的PCL-PEG-PCL(PCEC)纳米颗粒，实现纳米粒的体内长(时间)循环效果，并以光热效应协同化疗药物，实现对 肿瘤的有效抑制。
本发明的技术方案包括：
一种双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒，其特征在于，它是由PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物包裹多西紫杉醇和IR780组成。
如前述的纳米粒，所述PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中，PCL、PEG、PCL分子量 比例为10000∶4000∶10000。
如前述的纳米粒，其中多西紫杉醇载药量和IR780的载药量分别为(0.760±0.040)％ 与(4.696±0.557)％；和/或，其平均粒径小于200nm。
一种双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒，它是以前述纳米粒为内核，外 面包裹红细胞膜形成的纳米粒。
一种制备双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)多西紫杉醇和IR780分别用乙醇溶解，PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物用二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂溶解，将两者混匀，作为油相备用；
(2)将水溶性乳化剂溶解在水中，作为水相备用；
(3)在高压均质机工作条件下，将油相缓慢滴加在水相中，均质乳化，得初乳；
(4)去除初乳中的有机溶剂，得双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液；
步骤(1)的混合溶剂中，二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的体积比是(1-3)∶(1-3)∶(4-8)。
如前述制备双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒的方法，步骤(1)中的油相含有多西紫杉醇1～5重量份，IR7801～4重量份，PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物50～100重量份；
优选地，多西紫杉醇为5重量份，IR780为1重量份，PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物 为100重量份；
和/或，步骤(2)中水溶性乳化剂为5～10重量份，水为5000～20000体积份；
优选地，乳化剂为水溶性乳化剂为6重量份，水为10000体积份；
所述1重量份为5mg时，1体积份为5μL。
如前述制备双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒的方法，步骤(1)中二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的体积比是2∶1∶7。
如前述制备双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒的方法，步骤(2)中的水溶性乳化剂是聚乙烯醇或泊洛沙姆；优选地，为泊洛沙姆。
一种制备双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒的方法，其特征在于，它是 在制备双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒的方法的基础上，增加如下步骤：
(5)将双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液与红细胞膜混悬液混合，然后使用物理挤出的方式分别过孔径为400～800nm、200～400nm和100～200nm的高分子材料膜进行挤出，来回挤出4～16次后，即得。
如前述的双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒的方法，所述高分子材料膜 是聚碳酸酯膜；
和/或，所述高分子材料膜的孔径分别为：400、200和100nm；
进一步地，所述红细胞膜的混悬液的制备方法是：取新鲜血液，离心收集红细胞，洗 涤，用0.0025M PBS缓冲液溶胀红细胞破膜，离心收集细胞膜，洗涤，用与所取血液中 血浆等体积的0.01M PBS缓冲液分散，即得；
优选地，所述纳米乳液与红细胞膜混悬液的体积比是1∶(0.5～2)；进一步优选地，体积 比是1∶1。
优选地，前述的双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒的方法中，来回挤出 次数为4次。
本发明中，“双载纳米粒”、“双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒”与“双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒”的概念是等同的；而“双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜 复合纳米粒”或“双载红细胞膜复合纳米粒”是在“双载纳米粒”基础上包被红细胞膜。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明制备双载纳米粒所用的原料比例合适，尤其是IR780、多西紫杉醇分别占纳 米材料的1％和5％时，载药量明显提高。
2.本发明的双载红细胞膜复合纳米粒中内部成分相互协同增效，可有效、持久地抗 肿瘤。仅连续3天注射本发明的双载红细胞膜复合纳米粒，就能使移植瘤体积在42天持续减小而不出现反弹。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本 发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理 解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属 于本发明的范围。
附图说明
图1是PCL-PEG-PCL聚合物材料化学式和合成方法示意图；
图2是双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒及红细胞膜复合纳米粒的TEM电镜图；
图3是双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒及红细胞膜复合纳米粒的水合平均粒 径分布图；
图4是双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒与游离药物的体外释放曲线图；
图5是多西紫杉醇和IR780的纳米粒与游离药物的体外释放曲线图；
图6是双载多西紫杉醇和IR780纳米粒与游离IR780的稳定性图；
图7是不同治疗方案下小鼠的体内肿瘤生长抑制图；
图8是不同治疗方案下小鼠的体重变化图。
具体实施方式
本申请中，纳米乳液指含有纳米粒的乳液；另外，未经特别说明时，“纳米乳液”或“纳 米粒”指的是未复合红细胞膜的纳米乳液或纳米粒。
本申请的实例中，PCL-PEG-PCL三嵌段材料按照文献Biodegradable in situgel-forming controlled drug delivery system based on thermosensitive PCL-PEG-PCL hydrogel.Part 2：Sol-gel-sol transition and drug delivery behavior.Actabiomaterialia，2009. 5(9)，pp.3358-3370.制备，PCL、PEG、PCL分子量之比为10000∶4000∶10000。
实施例1一种空白纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料500mg溶解于混合有机溶剂(二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶7)中，作为油相备用，再精密称取50mg聚乙烯醇溶于50ml超纯水中，作为水相 备用。在高压均质机工作条件下(30rpm，50MPa)，将油相缓慢滴加至50mL水相中， 连续均质乳化90s为一个循环；循环6次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转 蒸发仪进行减压浓缩(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得空白纳米乳液，定容至50mL 并于4℃条件保存。
实施例2一种单载多西紫杉醇纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料500mg溶解于10mL混合有机溶剂(二氯甲烷∶ 丙酮∶乙酸乙酯＝2∶2∶6)中，多西紫杉醇25mg溶解于4mL无水乙醇中，并将两种溶 液混合作为有机相备用。再精密称取50mg聚乙烯醇溶于50mL超纯水中，作为水相备 用。在高压均质机工作条件下(35rpm，30MPa)，将油相缓慢滴加至50ml水相中，连 续均质乳化90s为一个循环；循环6次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转蒸 发仪进行减压浓缩(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得单载多烯紫杉醇纳米乳液， 定容至50mL并于4℃条件保存。
实施例3一种单载IR780纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料500mg溶解于10mL混合有机溶剂(二氯甲烷∶ 丙酮∶乙酸乙酯＝1∶2∶7)中，IR78010mg溶解于4mL无水乙醇中，并将两种溶液混合 作为有机相备用。再精密称取50mg泊洛沙姆溶于50ml超纯水中，作为水相备用。在高 压均质机工作条件下(35rpm，30MPa)，将油相缓慢滴加至50ml水相中，连续均质乳 化90s，为一个循环；循环6次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转蒸发仪进 行减压浓缩(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得单载IR780纳米乳液，定容至50mL 并于4℃条件保存。
实施例4一种双载(多西紫杉醇和IR780)纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料500mg溶解于混合有机溶剂(二氯甲烷∶丙酮∶乙酸乙酯＝2∶1∶7)中，25mg多西紫杉醇、5mg IR780分别溶于4ml的无水乙醇中，并 将两种溶液混合作为油相备用，精密称取30mg泊洛沙姆溶于50ml超纯水中，作为水相 备用。在高压均质机工作条件下(35rpm，30MPa)，将油相缓慢滴加至50ml水相中，连 续均质乳化90s为一个循环；循环三次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转蒸 发仪进行减压抽滤(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得双载纳米乳液，定容至50mL 并于4℃条件保存。
实施例5一种双载(多西紫杉醇和IR780)纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料500mg溶解于混合有机溶剂(二氯甲烷∶丙酮∶乙酸乙酯＝1∶1∶8)中，25mg多西紫杉醇、10mg IR780分别溶于4ml的无水乙醇中， 并将两种溶液混合作为油相备用，精密称取50mg泊洛沙姆溶于50ml超纯水中，作为水 相备用。在高压均质机工作条件下(35rpm，30MPa)，将油相缓慢滴加至50ml水相中， 连续均质乳化90s为一个循环；循环三次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转 蒸发仪进行减压抽滤(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得双载纳米乳液，定容至50mL 并于4℃条件保存。
实施例6一种双载(多西紫杉醇和IR780)纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料250mg溶解于混合有机溶剂(二氯甲烷∶丙酮∶乙酸乙酯＝3∶3∶4)中，10mg多西紫杉醇、10mg IR780分别溶于4ml的无水乙醇中， 并将两种溶液混合作为油相备用，精密称取25mg泊洛沙姆溶于50ml超纯水中，作为水 相备用。在高压均质机工作条件下(35rpm，30MPa)，将油相缓慢滴加至50ml水相中， 连续均质乳化90s为一个循环；循环三次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转 蒸发仪进行减压抽滤(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得双载纳米乳液，定容至50mL 并于4℃条件保存。
实施例7一种双载(多西紫杉醇和IR780)纳米乳液的制备方法
精密称取PCL-PEG-PCL三嵌段材料500mg溶解于混合有机溶剂(二氯甲烷∶丙酮∶乙酸乙酯＝2∶1∶7)中，5mg多西紫杉醇、20mg IR780分别溶于4ml的无水乙醇中，并 将两种溶液混合作为油相备用，精密称取50mg泊洛沙姆溶于50ml超纯水中，作为水相 备用。在高压均质机工作条件下(35rpm，30MPa)，将油相缓慢滴加至50ml水相中，连 续均质乳化90s为一个循环；循环三次得到初乳，将初乳转移至圆底烧瓶内，使用旋转蒸 发仪进行减压抽滤(40℃，30min)，除去有机溶剂，制得双载纳米乳液，定容至50mL 并于4℃条件保存。
实施例8红细胞膜的提取和纯化制备方法
取8～12周大小的裸鼠数只，使用真空采血管经眼底静脉取血，800-1000g/min离心5-10 min，去除上层的血清和其他细胞，收集红细胞，用预冷的0.01M PBS缓冲液洗涤3～5次。 洗至上清清澈后，用0.0025M PBS缓冲液破膜，800-1000g/min离心收集细胞膜。破膜后 再用0.01M PBS缓冲液洗涤1～2次；在收集的红细胞膜沉淀中加入等量血浆体积的0.01M PBS缓冲液分散，于4℃保存，且在48h内进行使用(以保证细胞膜具有最佳的生物活性)。
实施例9一种双载(多西紫杉醇和IR780)红细胞膜复合纳米粒的制备方法
先按实施例4～7中任一(优选实施例4)所述的方法制备得到双载纳米乳液。
将双载纳米乳液与红细胞膜混悬液按1∶1混合，然后用物理挤出的方式分别过孔径 为400nm、200nm和100nm聚碳酸酯膜进行挤出，每种大小的膜来回挤出4次后，得载 药红细胞膜复合纳米粒。
实施例10一种双载(多西紫杉醇和IR780)红细胞膜复合纳米粒的制备方法
先按实施例4～7中任一(优选实施例4)所述的方法制备得到双载纳米乳液。
将双载纳米乳液与红细胞膜混悬液按0.5∶1比例混合，然后用物理挤出的方式分别过 孔径为800nm、200nm和100nm聚碳酸酯膜进行挤出，每种大小的膜来回挤出10次后，得载药红细胞膜复合纳米粒。
实施例11一种双载(多西紫杉醇和IR780)红细胞膜复合纳米粒的制备方法
先按实施例4～7中任一(优选实施例4)所述的方法制备得到双载纳米乳液。
将双载纳米乳液与红细胞膜混悬液按1∶2.2比例混合，然后用物理挤出的方式分别 过孔径为800nm、400nm和200nm聚碳酸酯膜进行挤出，每种大小的膜来回挤出16次后，得双载红细胞膜复合纳米粒。
以下将以实验例的形式对本发明做进一步说明。
实验例1本发明双载纳米粒以及双载红细胞膜复合纳米粒的性质检测
通过以下实验(实施例4的纳米粒为例)对本发明的应用效果做进一步说明。
1.PCL-PEG-PCL(PCEC)三嵌段聚合物材料准备
准备PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物材料，其合成方法和结构如图1所示。
2.形态观察
取少量新制的双载多西紫杉醇和IR780的聚合物纳米粒以及红细胞膜复合纳米粒，经 适当稀释后，滴加适量样液在覆盖碳膜的铜网上，室温下自然干燥后用磷钨酸钠液负染， 在透射电镜(TEM)下观察纳米粒的形态，为球形粒子，粒径在50～200nm之间，结果见图2。
3.水合粒径检测
方法：取双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒以及红细胞膜复合纳米粒少量，用纯水稀释40倍后置于Zetasizer Nano S90型Malvern激光粒度仪下检测其粒径。
结果：
测得双载纳米粒平均粒径为116.0±1.948nm，双载红细胞膜复合纳米粒平均粒径为 157.0±1.95nm(图3)，与透射电镜结果基本符合。
4.包封率和载药量的测定
载药量＝载药纳米粒中药物的质量/纳米粒的总质量×100％；
包封率＝载药纳米粒中药物的质量/理论装载药物的质量×100％。
4.1高效液相色谱法测量多西紫杉醇的药物含量
方法：精密称量多西紫杉醇对照品适量于10mL容量瓶中，先用少许乙醇溶解并用乙腈定容。配置至浓度为1mg/mL的多西紫杉醇母液。精密量取适量多西紫杉醇母液，制 备系列浓度梯度的多西紫杉醇对照品溶液。以纯水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗 脱，平行进样3次，进样量为每次20μL，流速为1mL/min；在254nm波长处采用高效 液相法测定峰面积A，建立浓度-峰面积(C-A)标准曲线方程。取2mL双载多西紫杉醇和 IR780的(两亲性)纳米乳液冻干后用甲醇萃取，稀释8倍后，测定其峰面积A，通过标 准曲线方程计算双载药纳米系统中多西紫杉醇的含量。
结果：双载药纳米系统中多西紫杉醇载药量为4.696±0.557％，包封率是 93.91±11.139％。
4.2紫外分光光度法测量IR780的药物含量
方法：分别配制0.5～3.5μg/mL系列浓度梯度的IR780乙醇溶液，以乙醇为对照样品， 使用紫外分光光度仪进行全波长扫描，在最大吸收波长785nm处建立IR780的标准曲线。 将双载纳米乳液通过0.45nm滤头滤过，取1ml滤液备用。将样液预冻24h后，放于冷冻干燥机冻干48h。将冻干好的干粉用1ml 95％乙醇溶解，并置于细胞破碎仪中冰浴超声10min，使纳米粒被完全破坏，药物充分释放溶于乙醇，定容至10ml。在高速冷冻离心机(4℃，14000rpm/min，30min)中冷冻离心，取1ml离心后上清液再次定容至10ml。紫 外检测药物吸光度，并代入标准曲线计算得药物含量并计算载药率与包封率。
结果：双载药纳米系统中IR780载药量为0.760±0.040％，包封率是75.861±4.004％。
5.外释放实验
方法：配制pH7.45的0.01M磷酸缓冲液，加入0.05％的Tween 80超声混合均匀作为释放介质。将36mm的透析袋(MW：8000-14000)置于100℃水浴中活化30min后，精密 量取双载纳米粒乳液、双载红细胞膜复合纳米粒乳液以及游离多西紫杉醇各1mL装入透 析袋，用生料带密封，置于装有25mL释放介质的EP管中，平行三组。将装有透析袋的 EP管置于恒温器浴振荡器中连续释放7d(37℃，65rpm)，考察其释放行为。分别取1， 2h，4h，8h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h时的释放液进行检测，同时更换 新鲜的25ml释放介质。计算其累计释放百分率并绘制体外释放曲线(见图4)。
游离多西紫杉醇的体外释放曲线以同样方式制得。
结果：如图4可知，本发明的纳米粒能够有效延缓多西紫杉醇的释放速度。从释放50％多西紫杉醇消耗的时间来看，游离多西紫杉醇只需不到12h，双载纳米粒需要12～24h，而双载红细胞膜复合纳米粒需要48～72h。
6.室温下稳定性测试
方法：取新制备的双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液(此处稳定性不能用红细胞膜复合纳米粒检测，只能用内核的纳米粒，因为细胞膜上蛋白在体外放置过程中会变性)，分别置于4摄氏度与25摄氏度温度下，考察温度对双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液 的影响。分别取0h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h时的纳米乳液，用纯水稀 释40倍后置于Zetasizer Nano S90型Malvern激光粒度仪下检测其粒径，绘制双载多西紫 杉醇和IR780纳米乳液在不同温度下随时间变化的粒径图(见图5)。
结果：本发明双药物的纳米乳液十分稳定，其在室温下静置170h后粒径维持不变。
7.光照稳定性测试
方法：分别配制相同适宜浓度的双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒与游离IR780水溶液，同时置于相同的光照条件下，进行稳定性考察。分别取0h，24h，48h，72h，168h的样品，扫描400～900nm波长下样液的紫外吸收，根据扫描结果制得纳米粒与游离 水溶液随时间变化的紫外吸收图(见图6)。
结果：相比游离IR780，双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液在光照下相比游离IR780 降解速度更慢，有利于其在体内持续发挥作用。
实验例2 IR780和多西紫杉醇(DTX)用量对载药纳米粒中各组分载药量和包封率的影 响
方法：在实施例4的基础上，改变IR780和多西紫杉醇的用量；检测载药颗粒的大小、 Zeta电位(Zeta Potential)、药物的载药量和包封率。
结果：如表1所示，IR780和多西紫杉醇对包封率影响很大。当IR780用量1％、多西紫 杉醇用量5％时，双载纳米粒中的IR780和多西紫杉醇整体上包封率和载药量大大高于IR780用量2％和多西紫杉醇用量5％的情形，这是事先预料不到的。
表1原料用量对包封率等参数的影响
Figure BDA0002081252160000091
注：IR780或DTX的用量指制备时所加入的IR780或DTX占PCL-PEG-PCL的重量比；IR780或DTX 的载药率指最终得到的纳米颗粒中IR780或DTX占纳米颗粒的重量比。
实验例3体内肿瘤生长抑制试验
1、实验方法
选用balb/c裸鼠皮建立动物皮下瘤模型，在给药前8天接种MCF-7人源乳腺癌细胞， 待肿瘤生长至约100mm2后(0day)，将荷瘤小鼠进行以下分组并进行相应的治疗方案(每 组5只)：生理盐水组，游离多西紫杉醇组，双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒组，双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒组，多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒+ 激光组，双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒组+激光组。在第0、1、2天， 连续通过尾静脉注射给药三次(每组每次给药剂量按照10mg/kg多西紫杉醇计算)，在第 一次给药后的24h，激光治疗组的每只老鼠接受808nm的NIR激光照射5分钟(1.5W/cm2)。
2、实验结果
双载药纳米粒对MCF-7乳腺癌皮下瘤模型的治疗效果：经42天治疗后观察，以荷瘤小鼠肿瘤体积的测量计算出其变化趋势。
如图7所示，光热治疗加药物化学治疗组的肿瘤体积增加明显小于对照组(生理盐水) 和游离多西紫杉醇给药组(p＜0.01)。与游离多西紫杉醇给药组相比，双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒组并未表现出明显的治疗效果，而双载多西紫杉醇和IR780的红 细胞膜复合纳米粒治疗组肿瘤生长明显变缓慢(p＜0.05)；与单独多西紫杉醇化疗组相 比，双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒加光热治疗组表现出明显的治疗效 果，肿瘤完全消失，而双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒加光热治疗组在后期出现 肿瘤复发(p＜0.01)。进一步地，在治疗期间各组小鼠的体重变化显示，通过红细胞复 合纳米粒装载多西紫杉醇和IR780，能显著降低药物的毒副反应(小鼠的体重没有明显的 改变)，而游离多西紫杉醇以及双载多西紫杉醇和IR780的PCEC纳米粒给药，都会造成小 鼠体重一定程度地下降(如图8)。
实验结果说明，本发明将光热治疗与化疗联合使用，可以发挥协同增效的作用，抑瘤 作用优良，采用红细胞膜复合纳米粒装载的方式可以更有效递送这些药物，让它们在肿瘤 部位发挥作用。
综上，本发明的纳米粒载药能力强，其内部的药物与载体可以发挥协同增效作用，达 到优秀的抗肿瘤效果。

Claims (12)

1.一种双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒，其特征在于，它是以双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒为内核，外面包裹红细胞膜形成的纳米粒；
所述双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒是由PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物包裹多西紫杉醇和IR780组成；所述PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中，PCL、PEG、PCL分子量比例为10000:4000:10000；所述多西紫杉醇载药量和IR780的载药量分别为（0.760±0.040）%与（4.696±0.557）%。
2.如权利要求1所述的双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒，其特征在于：所述双载多西紫杉醇和IR780的纳米粒平均粒径小于200 nm。
3.一种制备权利要求1或2所述双载多西紫杉醇和IR780的红细胞膜复合纳米粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）多西紫杉醇和IR780分别用乙醇溶解，PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物用二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂溶解，将两者混匀，作为油相备用；
步骤（1）的混合溶剂中，二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的体积比是(1-3):(1-3):(4-8)；
（2）将水溶性乳化剂溶解在水中，作为水相备用；
（3）在高压均质机工作条件下，将油相缓慢滴加在水相中，均质乳化，得初乳；
（4）去除初乳中的有机溶剂，得双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液；
（5）将双载多西紫杉醇和IR780的纳米乳液与红细胞膜混悬液混合，然后使用物理挤出的方式分别过孔径为400~800nm、200~400nm和100~200nm的高分子材料膜进行挤出，来回挤出4~16次后，即得。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于：
步骤（1）中的油相含有多西紫杉醇1~5重量份，IR780 1~4重量份，PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物50~100重量份；
和/或，步骤（2）中水溶性乳化剂为5~10重量份，水为5000~20000体积份；
重量份和体积份的相对数量关系为：所述1重量份为5 mg时，1体积份为5 μL。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：多西紫杉醇为5重量份，IR780 为1重量份，PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物为100重量份。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：乳化剂为水溶性乳化剂为6重量份，水为10000体积份。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯的体积比是2:1:7。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的水溶性乳化剂是聚乙烯醇或泊洛沙姆。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子材料膜是聚碳酸酯膜；
和/或，所述高分子材料膜的孔径分别为：400、200和100 nm。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述红细胞膜的混悬液的制备方法是：取新鲜血液，离心收集红细胞，洗涤，用0.0025MPBS缓冲液溶胀红细胞破膜，离心收集细胞膜，洗涤，用与所取血液中血浆等体积的0.01MPBS缓冲液分散，即得。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述纳米乳液与红细胞膜混悬液的体积比是1:(0.5~2)。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述纳米乳液与红细胞膜混悬液的体积比是1:1。
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